專利名稱：：靶向肺癌的肽及其應(yīng)用的制作方法靶向肺癌的肽及其應(yīng)用優(yōu)先權(quán)本申請要求2007年2月13日提交的美國臨時(shí)申請60/900，973、2007年2月14日提交的美國臨時(shí)申請60/901，085、以及2007年4月13日提交的美國申請11/783，927的優(yōu)先權(quán)，這些申請都全文引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
：肺癌是全世界與癌癥有關(guān)的死亡率的主要原因。晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的5年存活率不到15%。缺乏腫瘤特異性仍然是化療中的主要問題，化療的副作用妨礙了運(yùn)送的藥物劑量達(dá)到消除大部分癌細(xì)胞所需的水平。而配體介導(dǎo)的靶向療法使得化療具有更好的腫瘤特異性和更低的毒性，也許可以用于開發(fā)新的癌癥療法。盡管制藥業(yè)已成功發(fā)現(xiàn)了多種新的細(xì)胞毒性藥物具有潛在的癌癥治療效果，這種危及生命的疾病每年仍奪去全球7百萬以上的人的生命，而且這個(gè)數(shù)字還在上升(Mantyh，2006)。大多數(shù)常規(guī)化療藥物的臨床應(yīng)用常常因不能將足夠濃度的治療藥物運(yùn)送到腫瘤靶組織、或因?qū)φＦ鞴俚膰?yán)重有害毒副作用而受到限制。因此開發(fā)可用于對腫瘤定向輸送藥物、并因此改進(jìn)所運(yùn)載藥物的治療指數(shù)的新的微生物載體技術(shù)顯得尤為重要。噬菌體展示是一種選擇技術(shù)，其中肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白作為融合體形式進(jìn)行表達(dá)，從而將該融合肽或蛋白展示在病毒體的表面。被噬菌體展示的隨機(jī)肽文庫提供了以下機(jī)會(huì)對B細(xì)胞表位(D'Melloetal.，1997；Fuetal.，1997；ScottandSmith,1990；ffuetal.,2001；ffuetal.,2003)以及蛋白-蛋白接觸(Atwelletal.，1997;Bottgeretal.，1996；Nordetal.，1997；Smithetal.，1999)進(jìn)行定位作圖，選擇與受體結(jié)合的生物活性肽(Koivunenetal.，1999；Lietal.，1995Brightonetal.，1996)或蛋白(Bottgeretal.，1996；Castanoetal.，1995；DeLeoetal.，1995；Kraftetal.，1999；Pasqualinietal.，1995)，尋找疾病特異性抗原模擬物(Folgorietal.，1994；Liuetal.,2004；Prezzietal.，1996)，以及確定細(xì)胞特異性(Barryetal.,1996；Leeetal.,2004；Mazzucchellietal.，1999)和器官特異性(Arapetal.,1998；EsslerandRuoslahti,2002；Pasqualinietal.,1995；PasqualiniandRuoslahti,1996)月太。有人提議用脂質(zhì)體作為癌癥化療的藥物載體(Gregoriadisetal.，1974)。自此，對脂質(zhì)體的興趣增加，脂質(zhì)體系統(tǒng)如今被當(dāng)作藥物載體而被深度研究。在用脂質(zhì)體向癌組織特異性運(yùn)送藥物方面，有三個(gè)基本要求(i)血液循環(huán)時(shí)間要長，(ii)腫瘤部位積累的量要大，(iii)要能控制藥物的釋放和腫瘤細(xì)胞對藥物的攝取，這種釋放動(dòng)態(tài)譜要與該藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征相吻合。最初，對脂質(zhì)體藥物運(yùn)送系統(tǒng)的研究遭遇被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelialsystem,RES)極快速清除的問題。人們認(rèn)識(shí)到，顆粒大小、表面電荷(Weinstein，1984)、以及脂質(zhì)體組成都對清除譜有強(qiáng)烈影響(例如，摻入磷脂酰肌醇或單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂延長了脂質(zhì)體在血液中循環(huán)的時(shí)間)(AllenandChonn,1987；GabizonandPapahadjopoulos,1988;Senior,1987)該攝入可能可以通過“秘密(stealth)”脂質(zhì)體來規(guī)避，這里提到的“秘密”脂質(zhì)體經(jīng)滲漏的毛細(xì)血管而優(yōu)先退出循環(huán)系統(tǒng)、且預(yù)計(jì)在表現(xiàn)出深度新血管化的腫瘤中累積導(dǎo)致高濃度并增強(qiáng)抗腫瘤活性(Wuetal.，1993)。然而，脂質(zhì)體是唯一被充分認(rèn)識(shí)的成功的藥物運(yùn)送候選者，這還是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體外覆合成聚合物聚乙二醇(PEG)后顯著增加血液中半衰期(Allenetal.,1991；BlumeandCevc,1990；Klibanovetal.，1990；Papahadjopoulosetal.，1991；Senioretal.，1991)。PEG化的脂質(zhì)體由于高度水化、且受保護(hù)的脂質(zhì)體表面而具有較長的循環(huán)時(shí)間，這抑制了對脂質(zhì)體進(jìn)行的蛋白吸收和調(diào)理作用(WoodleandLasic，1992)。解決了快速調(diào)理和清除的問題后，脂質(zhì)體在血液中的半衰期最長達(dá)到72小時(shí)(Drummondetal.，1999)，接下來要解決的問題是，通過主動(dòng)導(dǎo)向，使脂質(zhì)體在腫瘤中積累。使用靶向性脂質(zhì)體有可能顯著增強(qiáng)腫瘤靶點(diǎn)處的藥物釋放、并增加療效(Leeetal.，2004；Parketal.，2002)。藥物運(yùn)送研究領(lǐng)域已成功構(gòu)建了循環(huán)時(shí)間較長的脂質(zhì)體，它們在腫瘤組織中積累，在沒有主動(dòng)觸發(fā)機(jī)制的情況下，通過被動(dòng)擴(kuò)散而將內(nèi)含的藥物滲出到腫瘤組織中。使用能在患病組織特異性地釋放藥物的位點(diǎn)特異性觸發(fā)劑是一種增加藥物在腫瘤靶點(diǎn)處的生物利用度的方法。另一種優(yōu)化藥物的生物利用度的方法是，通過主動(dòng)導(dǎo)向，使脂質(zhì)體的累積程度達(dá)到較高水平。此外，將主動(dòng)導(dǎo)向與主動(dòng)觸發(fā)聯(lián)用，很可能導(dǎo)致藥物在腫瘤靶點(diǎn)處的特異性釋放顯著增強(qiáng)(Leeetal.，2004；Parketal.,2002)使用單克隆抗體靶向癌癥的一個(gè)主要限制是，抗體分子相對較大，分子量(MW)為150,000。此分子到達(dá)供血不足的較大腫瘤實(shí)體內(nèi)部有困難(Dvoraketal.,1991Jain,1997；Shockleyetal.，1991)。為克服該問題，一些研究者目前正在開發(fā)抗腫瘤的單鏈Fv(scFv)抗體，它們分子量較小，只有MW25，000(AdamsandSchier,1999；Halletal.，1998；Wongetal.，2001)。單克隆抗體療法的另一主要問題是，抗體分子被非特異地?cái)z入網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)如肝、脾臟、和骨髓中。放射性標(biāo)記的或與毒素偶聯(lián)的抗體受劑量限制的毒性作用是肝臟和骨髓的毒性(Neumeisteretal.,2001；Thomasetal.，1995)。與此相比，肽可以被認(rèn)為比單克隆抗體分子小，它們通常不結(jié)合網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(Ainaetal.，2005)。它們的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，相對較容易生產(chǎn)。此外，合成的短肽能有效穿透組織、以及它們被癌細(xì)胞選擇性結(jié)合和內(nèi)化的能力，使得它們成為運(yùn)送治療藥物如細(xì)胞毒藥物、寡核苷酸、毒素、以及放射活性分子的理想候選者。與病毒運(yùn)送載體和單克隆抗體不同，肽幾乎不被免疫系統(tǒng)注意，預(yù)計(jì)引起的副作用最小或甚至沒有副作用(LevyandHyman，2005)。因此，目前急需鑒定靶向性配體、并開發(fā)由配體靶向的脂質(zhì)體。我們相信，有前途的NSCLC新療法需要靶向腫瘤的高特異性、小毒性方法。在此，我們描述了對一些肽的分離和鑒定，所述肽包括SP5-2，它能特異性結(jié)合一些NSCLC細(xì)胞系和肺癌患者的活檢標(biāo)本。當(dāng)與含有長春瑞賓(vinorelbine)或多柔比星(doxorubicin)的脂質(zhì)體偶聯(lián)時(shí)，這種靶向性肽SP5-2在SCID小鼠中提高這些藥物抗人類肺癌異種移植物的治療指數(shù)。我們的結(jié)果表明，這種靶向性肽，以及我們的研究中鑒定的其它肽，都極有可能在臨床治療肺癌方面成為藥物運(yùn)送物。針對特異性靶組織篩選噬菌體展示文庫因此也就成為鑒定靶向藥物、基因運(yùn)送載體或其它治療藥物所用的肽序列的直接、快速方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及多方面，包括以下單獨(dú)各項(xiàng)或它們的聯(lián)合本發(fā)明提供了多核苷酸及其變體，包括SEQIDNO1,SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7,SEQIDNO-.9,SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO17，和SEQIDNO:190本發(fā)明提供了肽及其變體，包括SEQIDN0:2，SEQIDNO:4，SEQIDN0:6，SEQIDNO:8,SEQIDNO:10，SEQIDNO-.12,SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，和SEQIDNO:20。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽包含SEQIDNO:2，或其變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽包含SEQIDN0:2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽包含融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽包含一或多個(gè)標(biāo)記。所述標(biāo)記可包括FITC，生物素，以及放射性同位素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽與一或多種藥物偶聯(lián)。所述藥物可包括多柔比星，長春瑞賓，寡核苷酸，毒素，抗-VEGF適體(aptamer)，以及放射活性分子。本發(fā)明提供了與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體或其變體，所述肽包括SEQIDN02,SEQIDNO:4,SEQIDN0:6，SEQIDN0:8，SEQIDNO10,SEQIDN012,SEQIDNO14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18，和SEQIDNO:20。本發(fā)明提供了包含一或多種本發(fā)明肽的脂質(zhì)體，包括含有SEQIDNO2,SEQIDNO4,SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO-.12,SEQIDNO:14，SEQIDNO=16,SEQIDN0:18，或SEQIDNO:20的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體包含含SEQIDNO:2的肽，或其變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體包含含SEQIDNO:2的肽。所述脂質(zhì)體可包含一或多種藥物。所述藥物可包括多柔比星，長春瑞賓，寡核苷酸，毒素，抗-VEGF適體，以及放射活性分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物是多柔比星。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物是長春瑞賓。多柔比星的量可以是約110-130yg/iimol磷脂。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體直徑約65-75nm。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)脂質(zhì)體中的肽分子數(shù)為約300-500。所述脂質(zhì)體可包含可藥用載體。本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，包括使受試者與脂質(zhì)體接觸，所述脂質(zhì)體含有一或多種化療藥，并含有選自下組的肽或其變體SEQIDNO2,SEQIDNO:4，SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10，SEQIDNO-.12,SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO18，和SEQIDN0:20。所述化療藥可選自多柔比星，長春瑞賓，寡核苷酸，毒素，以及放射活性分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化療藥是多柔比星。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述化療藥是長春瑞賓。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是選自NSCLC和SCLC的肺癌。本發(fā)明提供了檢測標(biāo)本中癌細(xì)胞的方法，包括將標(biāo)本與權(quán)利要求2的肽在允許該肽與該標(biāo)本中的癌細(xì)胞結(jié)合的條件下接觸，并用權(quán)利要求8的抗體檢測所述多肽與所述標(biāo)本中的癌細(xì)胞的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽是含有表位的融合蛋白，該融合蛋白用針對該融合蛋白的表位的抗體來檢測。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽帶有標(biāo)記，通過該標(biāo)記可以檢測所述肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)記包括FITC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)記包括生物素。本發(fā)明提供了鑒定與本發(fā)明肽結(jié)合的生物分子的方法，包括將細(xì)胞提取物與本發(fā)明肽在允許形成包含所述肽與靶蛋白在內(nèi)的復(fù)合物的條件下接觸，和分析所述復(fù)合物以鑒定所述靶蛋白。本發(fā)明提供了多核苷酸，其與權(quán)利要求1的多核苷酸或其變體的互補(bǔ)體在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。本發(fā)明提供了含有權(quán)利要求1的多核苷酸的載體。本發(fā)明提供了宿主細(xì)胞，其含有包含權(quán)利要求1的多核苷酸的載體。本發(fā)明提供了多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸與權(quán)利要求1的多核苷酸或其變體的互補(bǔ)體在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。圖表的說明圖的簡要說明圖1.用體外噬菌體展示技術(shù)分離NSCLC細(xì)胞特異性噬菌體。圖2.鑒定與NSCLC細(xì)胞結(jié)合的特異性噬菌體克隆。(A)觀察CL1-5和PC13肺癌細(xì)胞中PC5-2的結(jié)合。比例尺10iim。(B)PC5-2顯示與CL1-5細(xì)胞結(jié)合、并被SP5-2合成肽抑制。比例尺10ym。(C)經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測量PC5-2與CL1-5細(xì)胞表面的結(jié)合譜。圖3.靶向性肽與NSCLC細(xì)胞和人肺癌活檢標(biāo)本結(jié)合的活性。(A)FITC_標(biāo)記的SP5-2結(jié)合五種NSCLC細(xì)胞系但不結(jié)合正常上皮細(xì)胞(NNM)。比例尺10ym。(B)FITC-標(biāo)記的SP5-2結(jié)合NSCLC細(xì)胞系。(C)PC5-2和SP5-2結(jié)合肺癌患者的肺腺癌活檢標(biāo)本。比例尺25ym。圖4.驗(yàn)證PC5-2在體內(nèi)的腫瘤歸巢能力。(A)回收腫瘤中的PC5-2，與腦、肺和心臟的結(jié)果進(jìn)行比較。(B)PC5-2對腫瘤組織的靶向性被SP5-2競爭性抑制，但不被對照肽抑制。(C)PC5-2在CL1-5衍生的異種移植物中的定位。比例尺25iim。圖5.用SP5-2-Lipo-Vin和SP5-2-Lipo_Dox治療攜有人肺癌異種移植物的SCID小鼠。(A)經(jīng)SP5-2-Lipo-Vin治療的小鼠腫瘤大小的改變。(B)接受治療的小鼠的體重變化。(C)經(jīng)SP5-2-Lipo-Vin治療的小鼠的存活曲線。(D)經(jīng)SP5-2-Lipo_Dox治療的小鼠腫瘤大小的變化。表的說明表1提供從NSCLC異種移植物選出的噬菌體所展示的肽序列。發(fā)明詳述肺癌是發(fā)達(dá)國家最常見的惡性腫瘤，在發(fā)展中國家也是日益突出的問題(Boyleetal.，2000)。肺癌主要有兩類小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非-小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。其中，NSCLC占約80%，SCLC接近20%(Schiller，2001)。來自AmericanCancerSociety的數(shù)據(jù)表明，NSCLC患者的5年存活率不到15%。已證實(shí)NSCLC特別難治(Fryetal.，1999；Ihde,1992)。肺部惡性腫瘤在全世界引起超過1百萬例死亡，現(xiàn)已變成大流行病(Jemaletal.，2002)。肺癌是致命的疾病，因?yàn)楹茈y診斷，也缺乏有效療法。外科手術(shù)是推薦的治療措施，化療和放療則可以作為治療策略的一個(gè)組成部分用以治愈局部的晚期疾病或作為轉(zhuǎn)移性腫瘤的治標(biāo)性療法(Thongprasertetal.，1999)。然而，缺乏細(xì)胞毒性藥物特異性和最終產(chǎn)生毒性副作用(尤其當(dāng)給予高劑量時(shí))常常限制了這種治療形式的應(yīng)用。因此，非常需要了解造成預(yù)后差的分子變化，并運(yùn)用該信息改進(jìn)診斷和對患者的管理，本領(lǐng)域也需要更有效的癌癥治療。癌癥療法的主要目標(biāo)是徹底根除癌細(xì)胞但使正常組織免于傷害。要實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，需要在惡病質(zhì)部位選擇性靶向癌細(xì)胞?？拱┧幬锏倪x擇性毒性可通過增加該藥物抵達(dá)患病組織的劑量、或通過降低該藥物抵達(dá)正常組織的劑量來實(shí)現(xiàn)，理想的情況是兩者都能實(shí)現(xiàn)。因此，有人研究抗癌藥物經(jīng)配體介導(dǎo)的靶向性(Allen，2002)。配體靶向療法的基本原理是，將化療藥運(yùn)送到癌細(xì)胞或與癌有關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。通過將與僅在靶細(xì)胞上特有表達(dá)或過表達(dá)而不在正常組織中如此表達(dá)的抗原、或受體、或其它分子結(jié)合的分子與藥物相連，可以增強(qiáng)對癌細(xì)胞及其微環(huán)境的選擇性靴向(AllenandCullis,2004；Arapetal.，1998;HuandKavanagh,2003；RosenkildeandSchwartz，2004)。該策略允許將藥物特異性運(yùn)送到癌細(xì)胞、并增加抗癌治療的療效(AllenandCullis,2004；Arapetal.,1998；HuandKavanagh,2003；RosenkildeandSchwartz,2004)。細(xì)胞毒藥物，如環(huán)膦酰胺(cyclophosphamide)、多柔比星、順鉬(cisplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、長春瑞賓、以及其它眾多此類藥物，都已用于治療多種癌癥，因?yàn)樗鼈兊闹滤佬栽谶B續(xù)增殖的細(xì)胞中是最高的，而多種常見腫瘤中的細(xì)胞都活躍地進(jìn)行分裂。一般最易受細(xì)胞毒效應(yīng)攻擊的正常組織包括那些頻繁分裂的組織如骨髓、胃腸道上皮內(nèi)襯、和毛囊(HerbstandSandler，2004)。眾所周知，化療可延長NSCLC患者的存活期。近期報(bào)道的晚期NSCLC化療臨床試驗(yàn)使用了1990年代開發(fā)出的藥物如紫杉醇、多西紫^(docetaxel)(gemcitabine)、i王g貞、禾口(irinotecan)(Lynchetal.，2004)。相應(yīng)地，目前對老年晚期NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)化療是用長春瑞賓進(jìn)行單一藥物化療(Kellyetal.，2001)。長春瑞賓是一種干擾微管裝配的長春花生物堿(vincaalkaloid)。據(jù)認(rèn)為，長春瑞賓的抗腫瘤活性主要?dú)w因于其在有絲分裂中期與微管蛋白相互作用而抑制分裂(Ramalingam，2005)。盡管細(xì)胞毒化療對一些癌癥的治療有主要影響，其對大多數(shù)實(shí)體腫瘤的效力是有限的(Parkinetal.，2001)。我們用噬菌體展示技術(shù)鑒定能特異性結(jié)合NSCLC細(xì)胞系的噬菌體克隆。這些肽也根據(jù)它們歸入或靶向癌細(xì)胞的能力來描述。術(shù)語“歸巢(home)”、“歸入(homing)”或“靶向(target，targeting)”可互換使用。在第五輪生物淘選(biopanning)中，選出的噬菌體克隆的結(jié)合活性比第一輪生物淘選的提高40倍。在CL1-5細(xì)胞上用ELISA篩選特異性結(jié)合的噬菌體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個(gè)被稱為PC5-2的噬菌體克隆是最高產(chǎn)的(多達(dá)所選噬菌體的90%)結(jié)合CL1-5細(xì)胞的噬菌體(表1)。免疫組化研究進(jìn)一步證實(shí)，PC5-2對NSCLC細(xì)胞有特異性結(jié)合活性(圖2A)。為驗(yàn)證PC5-2展示的肽能特異性結(jié)合NSCLC細(xì)胞，我們用其同類(cognate)合成肽SP5-2來競爭細(xì)胞表面相同的PC5-2結(jié)合位點(diǎn)。熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，SP5-2能抑制PC5-2與NSCLC細(xì)胞的結(jié)合(圖2B和圖2C)。這些結(jié)果表明，PC5-2通過其展示的肽而不是通過噬菌體顆粒上的其它部分來與癌細(xì)胞相互作用。為檢驗(yàn)有多少NSCLC細(xì)胞系表達(dá)能被SP5-2識(shí)別的靶分子，我們合成了FITC-標(biāo)記的SP5-2，以鑒定其結(jié)合特性。通過用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析5種不同類型的NSCLC細(xì)胞系，我們確定，這些細(xì)胞系的細(xì)胞表面與SP5-2結(jié)合的程度差別很大(圖3A和B)。很明顯，這5種NSCLC細(xì)胞系的漿膜(plasmamembrane)表達(dá)能被SP5-2識(shí)別的未知分子。當(dāng)我們測量SP5-2與NSCLC細(xì)胞系的結(jié)合比時(shí)，SP5-2在每一細(xì)胞系中可檢測到20.1%-45.8%的NSCLC細(xì)胞(圖3B)。為檢驗(yàn)SP5-2是否有作為NSCLC診斷和治療的藥物運(yùn)送劑的潛力，我們合成了生物素_標(biāo)記的PC5-2，用它通過免疫組化來檢測肺癌患者的肺腺癌活檢標(biāo)本。PC5-2和生物素_標(biāo)記的SP5-2能檢測NSCLC活檢標(biāo)本(圖3C)。來自10位患者的肺腺癌有50%(5/10)表達(dá)能被所述肽檢測到的靶分子。為檢驗(yàn)PC5-2歸入腫瘤的能力，我們用攜有人肺癌異種移植物的小鼠作為模型。體內(nèi)歸巢實(shí)驗(yàn)顯示，PC5-2對腫瘤組織有較高親和力，但未發(fā)現(xiàn)該噬菌體特異性結(jié)合正常器官如肺、心臟和腦(圖4A)。當(dāng)進(jìn)行肽競爭抑制試驗(yàn)時(shí)，PC5-2與腫瘤組織結(jié)合的活性被合成肽SP5-2抑制(圖4B)。這些結(jié)果提示，該合成肽能特異性結(jié)合與相應(yīng)噬菌體相同的結(jié)合位點(diǎn)。為鑒定歸巢噬菌體在腫瘤實(shí)體和正常器官中的位置，將PC5-2靜脈(i.v.)注射到攜有肺癌的SCID小鼠中，然后在組織切片上用抗-M13單克隆抗體對這些噬菌體進(jìn)行定位。PC5-2免疫組化定位證實(shí)，這些噬菌體位于腫瘤組織中，不在腦、肺、以及心臟組織中(圖4C)，這進(jìn)一步支持我們的結(jié)論，即PC5-2能特異性結(jié)合異種移植的腫瘤細(xì)胞而不是正常組織和細(xì)胞。我們的結(jié)果表明，PC5-2，以及其它通過生物淘選分離到的肽，能用作配體靶向療法的藥物運(yùn)送劑或用作肺癌或其它癌癥的診斷劑。為開發(fā)配體靶向療法，我們制備了與SP5-2相連的脂質(zhì)體，它們攜有化療藥長春瑞賓(SP5-2-Lipo-Vin)或多柔比星(SP5-2-Lipo_Dox)。在攜有NSCLC異種移植物的SCID小鼠中，SP5-2-Lipo-Vin顯示治療效力提高，對這些動(dòng)物不具有特異性副作用(圖5A和B)，且未發(fā)現(xiàn)器官毒性的組織學(xué)證據(jù)。比較SP5-2-Lipo-Vin和Lipo-Vin對腫瘤生長的影響，我們發(fā)現(xiàn)，治療后第42天時(shí)腫瘤大小有明顯差異(P<0.05)，但Lipo-Vin治療也能部分地抑制腫瘤生長(圖5A)。Lipo-Vin的這種部分抑制作用可歸因于腫瘤組織中“滲漏(leaky)”微脈管系統(tǒng)所致的脂質(zhì)體非特異性吸附的累積、以及支持該腫瘤區(qū)域的淋巴系統(tǒng)的受損(Huangetal.，1992Jain,1996；MatsumuraandMaeda,1986)。該效應(yīng)常被稱作增強(qiáng)的透性和滯留效應(yīng)(MatsumuraandMaeda，1986)。被動(dòng)靶向脂質(zhì)體Lipo-Vin可用于治療癌癥，但它可因配體靶向療法可能導(dǎo)致的更高、且更具選擇性的抗癌活性而被增強(qiáng)，這有時(shí)稱為'主動(dòng)'靶向。此外，為增強(qiáng)抗腫瘤效力，SP5-2-Lipo-Vin的副作用也比Lipo-Vin降低(圖5B)。我們比較了分別用SP5-2-Lipo-Vin、Lipo-Vin和PBS溶液治療后的動(dòng)物存活率，對動(dòng)物進(jìn)行了102天的觀察。SP5-2-Lipo-Vin治療組有80%存活率，Lipo-Vin治療組僅有40%存活率，PBS治療組的荷瘤小鼠無一存活(0%存活率)(圖5C)。這些現(xiàn)象提示，將Lipo-Vin與SP5-2肽偶聯(lián)，可以在攜有NSCLC異種移植物的SCID小鼠中，更有效抑制腫瘤生長并顯著延長壽命。SP5-2肽不僅增強(qiáng)所述藥物抗SCID小鼠中NSCLC異種移植物的效力，還降低其毒性。經(jīng)Lipo-Vin治療的小鼠的體重變化比經(jīng)SP5-2-Lipo-Vin和PBS治療的小鼠減少60%(圖5B)。SP5-2-Lipo-Vin的治療指數(shù)增加表明該靶向藥物運(yùn)送系統(tǒng)對NSCLC的顯著臨床潛力(圖5)。這些結(jié)果表明，我們的腫瘤特異性歸巢肽不僅能作為靶向療法的治療劑，還可以作為靶向NSCLC腫瘤組織的分子工具用作成像探針。這種靶配體還可用于鑒定NSCLC漿膜表面的靶蛋白或其它分子?？傊?，通過用噬菌體展示的肽文庫篩選NSCLC細(xì)胞，我們鑒定出一些新肽，包括SP5-2，它們能在體外和體內(nèi)與NSCLC細(xì)胞表面特異性結(jié)合。這些靶向肽可以與包含長春瑞賓、多柔比星或其它試劑的脂質(zhì)體相連，使治療效力和存活率增加而無系統(tǒng)性副作用。SP5-2肽看來是給NSCLC細(xì)胞運(yùn)送藥物的優(yōu)秀試劑，而且在NSCLC治療中具有很強(qiáng)的作為藥物運(yùn)送系統(tǒng)的臨床潛力。參考文獻(xiàn)Adams，G.P.，andSchier，R.(1999).Generatingimprovedsingle-chainFvmoleculesfortumortargeting.Journalofimmunologicalmethods231,249-260.Aina，0.H.，Marik，J.，Liu,R.，Lan，D.H.，andLam,K.S.(2005).Identificationofnoveltargetingpeptidesforhumanovariancancercellsusing“one-beadone-compound“combinatoriallibraries.Molecularcancertherapeutics4，806-813.Allen，T.M.(2002).Ligand-targetedtherapeuticsinanticancertherapy.Naturereviews2,750-763.Allen，T.M.，andChonn，A.(1987).Largeunilamellarliposomeswithlowuptakeintothereticuloendothelialsystem.FEBSletters223,42-46.Allen，T.M.,andCullis，P.R.(2004).Drugdeliverysystems:enteringthemainstream.Science303，1818-1822.Allen，T.M.，Hansen，C.，Martin，F(xiàn).，Redemann，C.，andYau-Young,A.(1991).Liposomescontainingsyntheticlipidderivativesofpoly(ethyleneglycol)showprolongedcirculationhalf-livesinvivo.Biochimicaetbiophysicaacta1066，29-36.Arap，W.，Pasqualini，R.，andRuoslahti，E.(1998).Cancertreatmentbytargeteddrugdeliverytotumorvasculatureinamousemodel.Science279，377-380.Atwell，S.，Ultsch，M.，DeVos，A.M.，andWells,J.A.(1997).Structuralplasticityinaremodeledprotein-proteininterface.Science278，1125—1128.Barry,M.A.，Dower,W.J.，andJohnston,S.A.(1996).Towardcell-targetinggenetherapyvectors:selectionofcell—bindingpeptidesfromrandompeptide-presentingphagelibraries.NatMed2,299-305.Blume，G.，andCevc,G.(1990).Liposomesforthesustaineddrugreleaseinvivo.Biochimicaetbiophysicaacta1029，91—97.Bottger，V.，Bottger，A.，Howard,S.F.，Picksley，S.M.，Chene，P.，Garcia-Echeverria，C.，Hochkeppel，H.K.，andLane，D.P.(1996).Identificationofnovelmdm2bindingpeptidesbyphagedisplay.Oncogene13,2141-2147.Boyle,P.，Gandini，S.，andGray,N.(2000).Epidemiologyoflungcancer:acenturyofgreatsuccessandignominiousfailure.,(London:MartinDunitz).Castano，A.R.，Tangri，S.，Miller，J.E.，Hoicombe,H.R.，Jackson，M.R.，Huse，W.D.，Kronenberg，M.，andPeterson，P.A.(1995).PeptidebindingandpresentationbymouseCD1.Science269,223-226.Chu，Y.W.，Yang，P.C.，Yang，S.C.，Shyu，Y.C.，Hendrix,M.J.，Wu，R.，andWu，C.W.(1997).Selectionofinvasiveandmetastaticsubpopulationsfromahumanlungadenocarcinomacellline.Americanjournalofrespiratorycellandmolecularbiology17，353-360.D丨Mello，F(xiàn).，Partidos，C.D.，Steward,M.W.，andHoward,C.R.(1997).DefinitionoftheprimarystructureofhepatitisBvirus(HBV)pre~Shepatocytebindingdomainusingrandompeptidelibraries.Virology237，319—326.DeLeo，F(xiàn).R.，Yu，L，Buritt，J.B.，Loetterle，L.R.，Bond，C.W.，Jesaitis，A.J.，andQuinn，M.T.(1995).Mappingsitesofinteractionofp47-phoxandflavocytochromebwithrandom—sequencepeptidephagedisplaylibraries.ProcNatlAcadSciUSA92，7110-7114.Drummond,D.C.，Meyer,0.，Hong,K.，Kirpotin，D.B.，andPapahadjopoulos,D.(1999).Optimizingliposomesfordeliveryofchemotherapeuticagentstosolidtumors.Pharmacologicalreviews51，691—743.Dvorak，H.F.，Nagy，J.A.，andDvorak,A.M.(1991).Structureofsolidtumorsandtheirvasculatureimplicationsfortherapywithmonoclonalantibodies.CancerCells3,77-85.Essler，M.，andRuoslahti，E.(2002).Molecularspecializationofbreastvasculatureabreast-homingphage-displayedpeptidebindstoaminopeptidasePinbreastvasculature.ProcNatlAcadSciUSA99,2252-2257.Folgori,A.，Tafi，R.，Meola，A.，F(xiàn)elici，F(xiàn).，Galfre，G.,Cortese,R.，Monaci，P.，andNicosia，A.(1994).Ageneralstrategytoidentifymimotopesofpathologicalantigensusingonlyrandompeptidelibrariesandhumansera.EmboJ13,2236-2243.Fry,W.A.，Phillips，J.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y(ethyleneglycol)-graftedliposomeswitholigopeptideoroligosaccharideligandsappendedtotheterminiofthepolymerchains.Bioconjugatechemistry8,111—118.定義本文所用術(shù)語采用其普通含義，詳見下文所述，還可按照說明書上下文進(jìn)一步加以理解。術(shù)語〃多核苷酸〃、“核苷酸〃、“核酸〃、“核酸分子〃、“核酸序列〃、“多核苷酸序列"以及"核苷酸序列"在本文互換使用，是指多個(gè)核苷酸聚合成任何長度的形式。所述多核苷酸可包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、和/或它們的類似物或衍生物。本文所示核苷酸序列按照5'-3'方向列出。術(shù)語"多肽"、“肽"和"蛋白"在本文互換使用，是指多個(gè)氨基酸聚合成任何長度的形式，可包括天然氨基酸，編碼和非編碼氨基酸，化學(xué)或生化修飾的氨基酸，衍生化的氨基酸，或設(shè)計(jì)者氨基酸(designeraminoacid)，氨基酸類似物，肽模擬物，以及縮肽(cbpsip印tide)，以及具有修飾的、環(huán)狀的、雙環(huán)的、縮環(huán)的、或縮雙環(huán)的肽骨架的多肽。該術(shù)語包括單鏈蛋白以及多聚體(multimer)。該術(shù)語還包括與標(biāo)記偶聯(lián)的蛋白，所述標(biāo)記如FITC、生物素、以及放射性同位素(包括但不限于64CU，67CU，9°Y，99mTC，mIn，124I，125I，131I，137CS，186Re，211At，212Bi，213Bi，223Ra，241Am，和244Cm)；具有可檢測的產(chǎn)物的酶(如螢光素酶(luciferase)、過氧化物酶、堿性磷酸酶、0-半乳糖苷酶等)；熒光物質(zhì)(fluorescer)，以及熒光標(biāo)記，發(fā)射熒光的金屬例如152Eu，或其它稀土元素系列(lanthanideseries)，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluniescent)化合物，化學(xué)發(fā)光(chemiluminescent)化合物如魯米諾(luminol)、異魯米諾(isoluminol)、或吖啶鐺鹽(acridiniumsalt)；特異性結(jié)合分子如磁性顆粒、微球體(microsphere)、納米球體(nanospheres)等。該術(shù)語還包括與治療劑(therapeuticagent)f禹■白勺月太。該術(shù)語還包括融合蛋白，其包括但不限于，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白，與異源氨基酸序列(如生物發(fā)光(bioluminescent)蛋白，例如，螢光素(luciferin)，或水母發(fā)光蛋白(aequorin)(綠色熒光蛋白))、與異源和同源前導(dǎo)序列的融合蛋白，有或無N端甲硫氨酸殘基的融合蛋白，PEG化蛋白，免疫學(xué)標(biāo)記的蛋白，或組氨酸(his)標(biāo)記的蛋白。這類融合蛋白還包括與表位的融合。這類融合蛋白可包含本發(fā)明肽的多聚體，如同二聚體或同多聚體，以及異二聚體和異多聚體。該術(shù)語還包括肽適體。本發(fā)明的肽包括所述肽的生物活性變體，其中所述變體在結(jié)構(gòu)上實(shí)質(zhì)相似。與主體多肽相比，多肽序列的變體可包括插入、添加、缺失或取代。多肽序列的變體可包括生物(polymorphicvariant)。本發(fā)明的肽可包括天然和非天然的氨基酸。肽可包含D-氨基酸，D-氨基酸和L-氨基酸的組合，以及各種"設(shè)計(jì)者(designer)"或"合成的"氨基酸(例如，0_甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，和Na-甲基氨基酸等)，以傳送(convey)特定性質(zhì)。此外，肽可以是環(huán)狀的。肽可包括非典型氨基酸，以便引入特定的構(gòu)象基元。任何已知的非典型氨基酸都可以使用。氨基酸類似物和肽模擬物可以摻入肽中，以便引入或促成特異性二級結(jié)構(gòu)，包括但不限于，LL-Acp(LL-3-氨基-2-二丙烯酮(propenidone)-6-羧酸)，一種誘導(dǎo)0-轉(zhuǎn)角的二肽類似物；誘導(dǎo)0“折疊的類似物；誘導(dǎo)0-轉(zhuǎn)角的類似物；誘導(dǎo)a-螺旋的類似物；誘導(dǎo)轉(zhuǎn)角的類似物；Gly-Ala轉(zhuǎn)角類似物；酰胺鍵等排物(isostere)；或四唑(tretrazol),可以在所述肽的末端摻入脫氨基(desamino)或脫羧基(descarboxy)，使得不存在末端氨基或羧基，從而降低對蛋白酶的易感性或限制構(gòu)象。C末端功能基團(tuán)包括酰胺，酰胺低級烷基，酰胺二(低級烷基)，低級烷氧基，羥基，和羧基，以及它們的低級酯衍生物，以及它們的可藥用鹽。術(shù)語"脂質(zhì)體"是指含有包繞內(nèi)部水性空間的外部脂質(zhì)雙層或多層膜的組合物。該術(shù)語包括多層脂質(zhì)體，其通常具有約l-io微米的直徑，并在任何部位包含兩個(gè)直至數(shù)百個(gè)同心脂質(zhì)雙層，間以多個(gè)水相層。該術(shù)語包括單層囊泡(unilamellarvesicle)，其由單個(gè)脂質(zhì)層組成，通常具有約20-400納米(nm)、約50_300nm、約300_400nm、或約100_200nm的直徑。該術(shù)語還包括直徑約65nm-75nm的脂質(zhì)體。術(shù)語"抗體"和"免疫球蛋白"是指能識(shí)別并結(jié)合特異性抗原的蛋白，例如，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白，合成的蛋白，或重組制得的蛋白?？贵w是本領(lǐng)域已知的，可通過本領(lǐng)域已知的方法制備?！氨砦?是被抗體結(jié)合的分子，其可以是或不是多肽中氨基酸殘基的連續(xù)序列，而且其可包含糖和/或具有其它化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子。在多核苷酸上下文中的術(shù)語"特異性結(jié)合"是指在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。增強(qiáng)DNA/DNA和DNA/RNA兩種雜交反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)度的條件是本領(lǐng)域眾所周知的，已有文獻(xiàn)記載。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的例子包括，在4X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約65-70°C雜交，或在4XSSC加50%甲酰胺中約42-50°C雜交，之后在IXSSC中約65-70°C洗一或多次。術(shù)語"配體"是指一種分子，其與另一種分子(包括受體)結(jié)合。“宿主細(xì)胞"是指可以或者已經(jīng)接納了任何一或多個(gè)重組載體或分離的多核苷酸的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞包括單個(gè)宿主細(xì)胞的后代，而且由于自然的、偶然的、或有意的突變和/或改變，所述后代無需與最初的親本細(xì)胞完全相同(在形態(tài)或總DNA定額(complement)方面)。宿主細(xì)胞包括體外或體內(nèi)用本發(fā)明重組載體或多核苷酸轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。包含本發(fā)明重組載體的宿主細(xì)胞可稱為"重組宿主細(xì)胞"。“標(biāo)本(specimen)“是來自患者的生物學(xué)標(biāo)本；該術(shù)語包括但不限于，生物液體如血液、血清、血漿、尿液、腦脊液、淚液、唾液、淋巴液、透析液(dialysisfluid)、灌洗液(lavagefluid)、精液(semen)，和其它液體樣品，以及生物來源的細(xì)胞和組織。該術(shù)語還包括細(xì)胞或從其衍生的細(xì)胞及其后代，包括培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞上清液，和細(xì)胞裂解物。它還包括器官或組織培養(yǎng)物衍生的液體，組織活檢樣品，腫瘤活檢樣品，便樣(stoolsample)，和從生理組織抽取的液體，以及從實(shí)體組織剝離的細(xì)胞，組織切片，以及細(xì)胞裂解物。該定義涵蓋了獲取后經(jīng)任何方式操作過的樣品，如用試劑處理過，經(jīng)溶解，經(jīng)富集某些成分如多核苷酸或多肽。該術(shù)語還包括患者樣品的衍生物和分級分離物(fraction)。患者樣品可用于診斷、預(yù)后、或其它監(jiān)控分析。所述標(biāo)本可來自人類患者或非人哺乳動(dòng)物。本文中“治療(Treatment)“包括在哺乳動(dòng)物(包括人)中對疾病施用或應(yīng)用任何治療法(remedies)，包括抑制該疾病，阻止其發(fā)展，或緩解該疾病，例如，通過引起消退，或者恢復(fù)或修補(bǔ)損失、丟失或缺陷的功能；或?qū)Φ托У倪^程進(jìn)行刺激。該術(shù)語包括獲得所需藥理效應(yīng)和/或生理效應(yīng)，其涵蓋對哺乳動(dòng)物(包括人)病理紊亂的任何治療。所述效應(yīng)可以是預(yù)防性的，即完全或部分地防止疾病或其癥狀，和/或可以是治療性的，即部分或完全地治愈疾病和/或引起該疾病的負(fù)面影響。因此，本發(fā)明提供了治療和預(yù)防兩者。其包括(1)在可能對該疾病易感、但尚未有癥狀的受試者中防止疾病發(fā)生或復(fù)發(fā)，(2)抑制該疾病，如阻止其發(fā)展，(3)終止該疾病或至少終止與其有關(guān)的癥狀，使該宿主不再遭受疾病或其癥狀的折磨，如引起該疾病或其癥狀的消退，例如，通過恢復(fù)或修補(bǔ)損失、丟失或缺陷的功能，或者對低效的過程進(jìn)行刺激，或者(4)緩解、減輕、改善該疾病或與其有關(guān)的癥狀，這里的改善用其廣義的含義，是指至少將參數(shù)(如炎癥、疼痛、和/或腫瘤大小)的數(shù)量級降低?！翱伤幱幂d體"是指任何傳統(tǒng)形式的無毒性固體、半固體或液體填充物、稀釋劑、封裝材料(encapsulatingmaterial)、配藥助劑(formulationauxiliary),或賦形劑(excipient)0可藥用載體在所用劑型(dosage)和濃度對受者無毒性，并能與配制劑中的其它成分相容?！八幬锝M合物"在本文指混合物，其通常含有本領(lǐng)域常規(guī)的、適于為治療、診斷、或預(yù)防目的而對受試者施用的載體如可藥用載體或賦形劑。它可包括細(xì)胞培養(yǎng)物，其中在細(xì)胞或培養(yǎng)基中存在多肽或多核苷酸。例如，口服組合物可形成溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑(sustainedreleaseformulation)、漱口水(oralrinse)，或粉劑。丨‘疾病〃是指任何需要或希望醫(yī)療干預(yù)(medicalintervention)的疾病、感染、紊亂、或癥狀。所述醫(yī)療干預(yù)可包括治療、診斷、和/或預(yù)防?！鞍┌Y"是指任何異常的細(xì)胞生長或組織生長，例如，腫瘤，不管它是惡性的、前惡性的、或非惡性的。其特征在于細(xì)胞增殖失控，可能侵入或不侵入周圍組織，并因此可能轉(zhuǎn)移或不轉(zhuǎn)移到新的機(jī)體部位。癌癥涵蓋癌(carcinomas)，這是上皮細(xì)胞的癌癥；癌包括鱗狀細(xì)胞癌，腺癌，黑素瘤，和肝細(xì)胞瘤(h印atomas)。癌癥還涵蓋肉瘤(sarcomas)，這是間質(zhì)來源(mesenchymalorigin)的腫瘤；肉瘤包括骨源性肉瘤(osteogenicsarcomas)，白血病，和淋巴瘤。癌癥可涉及一或多種成瘤細(xì)胞類型。術(shù)語癌癥包括肺癌，結(jié)腸癌，乳腺癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，和口腔癌。細(xì)胞系可用的細(xì)胞系包括人肺鱗狀細(xì)胞癌系A(chǔ)549，高轉(zhuǎn)移人肺腺癌系CL1-5，人肺腺癌系H23，人肺大細(xì)胞癌系H460，人肺癌系PC13，人鼻咽癌系NPC-TW01，人口腔鱗狀細(xì)胞癌系SAS，人胰腺癌PaCa，人正常鼻粘膜上皮NNM，和成纖維細(xì)胞。A549、H23、H460、PC13、PaCa、和SAS都可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)獲得。CL1-5禾口NPC-TW01細(xì)胞系分別由(Chuetal.，1997)禾口(Linetal.，1990)創(chuàng)建。肽的制備本發(fā)明的肽可用本領(lǐng)域已知方法表達(dá)?；诩?xì)胞的方法和無細(xì)胞的方法都適于制備本發(fā)明的肽?；诩?xì)胞的方法一般涉及在體外將核酸構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞，在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)基和/或從該宿主細(xì)胞(例如，通過破壞該宿主細(xì)胞)收獲所述肽。本發(fā)明還提供了用無細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯方法制備肽的方法，這些方法都是本領(lǐng)域熟知的。合適的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括，例如，細(xì)菌，酵母，真菌，植物，昆蟲，和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。通常，可以將修飾的或未修飾的異源肽以其原本的形式表達(dá)(如上述)，或作為融合蛋白進(jìn)行表達(dá)，而且不僅可包括分泌信號(hào)，還可包括分泌前導(dǎo)序列。本發(fā)明的分泌前導(dǎo)序列可將一些蛋白引導(dǎo)至ER。ER將膜結(jié)合蛋白與其它蛋白分開。蛋白一旦到達(dá)ER，可進(jìn)一步被引導(dǎo)至高爾基體，以便分配至小泡(vesicle)；包括分泌泡；漿膜，溶酶體，以及其它細(xì)胞o此外，可在所述肽上添加肽組分(moieties)和/或純化標(biāo)簽。這類區(qū)域可在最終制得所述多肽之前除去。給多肽添加肽組分以造成分泌或排泄、提高穩(wěn)定性、和促進(jìn)純化等等，都是本領(lǐng)域熟悉并且常規(guī)的技術(shù)。合適的純化標(biāo)簽包括，例如，V5，聚組氨酸，親和素(avidin)，以及生物素。肽與生物素之類的化合物的偶聯(lián)可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)實(shí)現(xiàn)(Hermansoned.(1996)BioconjugateTechniques；AcademicPress)。也可以用本令頁域已知技術(shù)，將肽與放射性同位素、毒素、酶、熒光標(biāo)記、膠體金、核酸、長春瑞賓、以及多柔比星偶聯(lián)(Hermansoned.(1996)BioconjugateTechniques；AcademicPress；Stefanoetal.(2006)Aconjugateofdoxorubicinwithlactosaminatedalbuminenhancesthedrugconcentrationsinalltheformsofrathepatocellularcarcinomasindependentlyoftheirdifferentiationgrade.LiverInt.26726-33)。毒素本領(lǐng)域已知的那些。KreitmanandPastan,Immunotoxinsinthetreatmentofhematologicmalignancies.CurrDrugTargets.71301-11(2006)。適用于本發(fā)明的融合配對物包括，例如，胎球蛋白(fetuin)，人血清清蛋白，F(xiàn)c，和/或它們的一或多種片段。本發(fā)明還提供了偶聯(lián)的蛋白，如聚乙二醇偶聯(lián)物。本發(fā)明的肽還可用本領(lǐng)域已知技術(shù)進(jìn)行化學(xué)合成(例如，參見Hunkapilleretal.,Nature,310105111(1984)；Granted.(1992)SyntheticP印tides，AUsersGuide,ff.H.FreemanandCo.；美國專利6，974，884))。例如，與多肽片段對應(yīng)的多肽可用肽合成儀合成，或用本領(lǐng)域已知的固相方法合成。此外，需要時(shí)，可將非典型氨基酸或氨基酸的化學(xué)類似物作為取代或添加而引入多肽序列。非典型氨基酸包括但不限于，常見氨基酸的D-異構(gòu)體，2，4_二氨基丁酸，a_氨基異丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e_Ahx，6-氨基己酸，Aib，2_氨基異丁酸，3-氨基丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸(sarcosine)，瓜氨酸(citrulline)，同瓜氨酸，半胱磺酸(cysteicacid)，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，環(huán)己基丙氨酸，b-丙氨酸，氟-氨基酸，設(shè)計(jì)者氨基酸如b-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸，和普通的氨基酸類似物。此外，所述氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)形。本發(fā)明的多肽可用標(biāo)準(zhǔn)方法從化學(xué)合成和重組細(xì)胞培養(yǎng)中回收并純化，所述方法包括但不限于，硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水相互作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析和凝集素(lectin)層析。最優(yōu)選，用高效液相層析(“HPLC")進(jìn)行純化。當(dāng)多肽在分離和/或純化過程中變性時(shí)，可以用熟知的蛋白再折疊技術(shù)來再生活性構(gòu)象。本發(fā)明的肽或肽模擬物可以用廣泛多種親水聚合物中的一或多種進(jìn)行修飾或與其共價(jià)結(jié)合，以提高該肽的溶解度和循環(huán)半衰期。適于與肽結(jié)合的非蛋白性質(zhì)的親水聚合物包括但不限于，聚烷基醚如聚乙二醇和聚丙二醇，聚乳酸，聚乙醇酸，聚氧烯(polyoxyalkene)，聚乙烯醇(polyvinylalcohol)，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素和纖維素衍生物，葡聚糖(dextran)，和葡聚糖衍生物。一般的，這類親水聚合物平均分子量為約500-100，000道爾頓，約2，000-40,000道爾頓，或約5，000-20,000道爾頓。肽可以用這類聚合物衍生化，或與這類聚合物偶聯(lián)，所用方法參見(Zallipsky，S.(1995)BioconjugateChem.,6150-165；Monfardini,C.,etal.(1995)BioconjugateChem.662-69；美國專利4，640，835；4，496，689；4，301，144；4，670，417；4，791，192，4，179，337，或TO95/34326)。脂質(zhì)體的制備本領(lǐng)域已知多種制備脂質(zhì)體的方法，其中一些可參見LichtenbergandBarenholz,MethodsofBiochemicalAnalysis,Volume33,337—462(1988)。小單層月旨質(zhì)體(Smallunilamellarvesicles，SUV，大小<lOOnm)可聯(lián)用前人記載(Tsengetal.，1999)的薄膜水合(thin-filmhydration)和反復(fù)擠壓(r印eatedextrusion)的標(biāo)準(zhǔn)方法來制備。那些特別涉及脂質(zhì)體封裝DNA的制備方法，以及直接應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的方法，已由HugandSleightetal(1991)描述。脂質(zhì)體制備方法也可參見美國專利6，355，267和6，663，885。特別有用的脂質(zhì)體可通過用含有磷脂酰膽堿、膽固醇、和PEG化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物進(jìn)行反向蒸發(fā)(reverse-phaseevaporation)來創(chuàng)建。擠壓脂質(zhì)體，使其穿過指定孔徑的濾器，可產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體也可以從市場上購買，來源例如臺(tái)灣臺(tái)北的臺(tái)灣脂質(zhì)體公司(TaiwanLiposomeCompany)。其它可購買到的脂質(zhì)體包括TLC-D99，Lipo-Dox，Doxil,DaunoXome,AmBisome,ABELCET,transfectace(DDAB/D0PE)，禾口D0TAP/D0PE以及Lipofectin。本發(fā)明的脂質(zhì)體最主要從磷脂制得，但也可以用具有相似分子形狀和尺度、且既有親水組分又有疏水組分的其它分子。為了本發(fā)明的目的，所有這類合適的能形成脂質(zhì)體的分子在本文中都稱為脂質(zhì)。一或多種天然和/或合成的脂質(zhì)化合物可以用于制備脂質(zhì)體。脂質(zhì)體根據(jù)所選的親水基團(tuán)的不同，可以為陰離子型、陽離子型、或?yàn)橹行?。例如，?dāng)采用帶有磷酸根或硫酸根的化合物時(shí)，所得脂質(zhì)體為陰離子型。當(dāng)采用含氨基的脂質(zhì)時(shí)，所述脂質(zhì)體帶有正電荷，為陽離子脂質(zhì)體。適于形成本發(fā)明所用原始脂質(zhì)體的代表性磷脂或脂質(zhì)化合物包括但不限于，磷脂相關(guān)物質(zhì)如磷脂酰膽堿(卵磷脂)，溶血卵磷脂，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇，鞘磷脂，磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)，心磷脂，磷脂酸(phosphatidicacid),腦苷脂(cerebrosides)、雙十六烷基磷酸(dicetylphosphate)，磷脂酰膽堿，和二棕櫚酰-磷脂酰甘油(dipalmitoyl-phosphatidylglycerol).其它含有非磷基團(tuán)的脂質(zhì)包括但不限于，硬脂酰基胺(stearylamine)，十二烷基胺(dodecylamine)，十六碳烷基胺(hexadecyl-amine)，乙酰基棕櫚酸酯(acetylpalmitate)，甘油蓖麻醇酸酯(glycerolricinoleate)，十六碳烷基硬脂酸酯(hexadecylsterate)，異丙基肉豆蔻酸酯(isopropylmyristate)，兩性丙烯酸聚合物(amphotericacrylicpolymers)，脂肪酸，脂肪酸酰胺(fattyacidamides)，膽固醇，膽固醇酯，甘油二酯(diacylglycerol)，二酰基甘油琥珀酸酉旨(diacylglycerolsuccinate)，等等。用于本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑包括陽離子型(帶正電)，陰離子型(帶負(fù)電)，以及中性的制劑。脂質(zhì)體主動(dòng)裝載(Remoteloading)化合物利用了跨膜梯度的形成(CehandLasic，1995)。該方法包括，將需要裝載到脂質(zhì)體中的化合物、硼酸化合物與懸浮脂質(zhì)體一起保溫，從而使該化合物在脂質(zhì)體中積累(CehB.andLasicD.D.，1995；U.S.PatentNo.6，051,251)。磷酸分析(phosphateassay)可用于確定脂質(zhì)體濃度。一種磷酸分析基于鉬酸鹽(molybdate)與孔雀綠染料(malachitegreendye)的相互作用。主要原理涉及無機(jī)磷酸與鉬酸鹽反應(yīng)，形成無色非還原型鉬酸磷復(fù)合物，該復(fù)合物在酸性條件下還原，變成藍(lán)色復(fù)合物。鉬酸磷當(dāng)與孔雀綠復(fù)合時(shí)，色度增強(qiáng)20或30倍。終產(chǎn)物為還原型綠色可溶性復(fù)合物，通過620nm處的吸收值測量，其直接反映溶液中無機(jī)磷酸的水平。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)體與可藥用載體、賦形劑、和稀釋劑一起配制。這類可藥用載體、賦形劑和稀釋劑有廣泛多種是本領(lǐng)域已知的，包括列在USPpharmaceuticalexcipientslisting(可藥用賦形劑列表)中的那些。USPandNFExcipients,ListedbyCategories,p.2404-2406,USP24NF19,UnitedStatesPharmacopeialConventionInc.，Rockville,Md.(ISBN1-889788-03-1)可藥用賦形劑，如載劑(vehicle),助劑(adjuvant)，載體(carrier)，或稀釋劑都是公眾很容易獲得的。而且，可藥用輔助物質(zhì)，如PH調(diào)節(jié)和緩沖劑，滲透壓調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定劑，增濕劑等等，都是公眾很容易獲得的。合適的載體包括但不限于，水(water)，葡萄糖(dextrose)，甘油，鹽水，乙醇，以及它們的組合。載體可包含額外的試劑如增濕或乳化劑，PH緩沖劑，或增強(qiáng)該配制劑效果的助劑。表面局部型載體(Topicalcarriers)包括液體石蠟(liquidpetroleum),異丙基棕櫚酸酯，聚乙二醇，乙醇(95%)，聚氧乙烯單月桂酸酯(polyoxyethylenemonolaurate)(5%)水溶液，或十二烷基硫酸鈉(5%)水溶液。其它物質(zhì)如抗氧化劑，保濕劑(humectant)，粘度穩(wěn)定劑(viscositystabilizer)，和類似的試劑可以根據(jù)需要添加。透皮增強(qiáng)劑如氮酮(Azone)也可以包括在內(nèi)。在藥物劑型(pharmaceuticaldosageform)中，本發(fā)明的組合物可以以它們的可藥用鹽形式施用，或者它們也可以單獨(dú)施用或與其它藥物活性化合物適當(dāng)關(guān)聯(lián)來用、以及與其它藥物活性化合物組合施用。主題組合物按照可能施用的模式進(jìn)行配制。治療方法本發(fā)明含有治療藥物的肽或脂質(zhì)體可以對需要治療的受試者施用，方式是系統(tǒng)性注射如靜脈注射；或在相關(guān)部位注射或施用，如直接向腫瘤中注射，或當(dāng)所述部位在外科手術(shù)中暴露時(shí)直接施用在該部位；或表面局部施用，如當(dāng)疾病位于皮膚上時(shí)。本發(fā)明的肽或脂質(zhì)體可以作為單一療法來用?；蛘撸景l(fā)明的肽或脂質(zhì)體可以與治療癌癥的標(biāo)準(zhǔn)化療或放療方案組合施用。本發(fā)明的肽可以用于將抗體靶向需要治療的癌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，對需要治療的受試者施用本發(fā)明的肽，接著施用與該肽特異性結(jié)合的抗體。被靶向的抗體可以介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用，或者可以改變目標(biāo)分子的根本功能(underlyingfunction)。這類抗體可以以抗體偶聯(lián)物的形式來用，以便直接將有治療效果的試劑運(yùn)送至目標(biāo)組織。這類試劑包括放射性核素、毒素、化療藥、和抗血管新生化合物?？梢圆捎枚喾N方式來用藥，包括經(jīng)口(oral)，面頰(buccal)，鼻(nasal)，直腸(rectal),φ(parenteral),Mfix.(intraperitoneal),f^J(intradermal),(transdermal)，T"(subcutaneous)，(intravenous)，l/Jc內(nèi)(intra-arterial)，心內(nèi)(intracardiac)，心室內(nèi)(intraventricular)，盧頁內(nèi)(intracranial)，氣管內(nèi)(intratracheal)，和鞘內(nèi)(intrathecal)用藥等，或通過植入或吸入方式來用藥。因此，本發(fā)明的組合物可以配制成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，如片劑(tablet)、膠囊劑(capsule)、粉劑(powder)、粒劑(granule)、膏劑(ointment)、溶液、栓劑(suppositories)、注射劑、吸入劑、和氣霧劑(aerosol)。以下方法和賦形劑僅為舉例說明，無論如何都不能視為限制。合適的賦形劑載劑例如是，水，鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇等，以及它們的組合。此外，需要時(shí)，載劑可含有小量輔助物質(zhì)如增濕或如乳化劑或PH緩沖劑。制備這類藥劑形式(dosageform)的真正方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或顯而易見的。在任何時(shí)候，將要施用的組合物或配制劑都可以包含所述試劑，且其量足以在所治受試者中實(shí)現(xiàn)所需狀態(tài)。本發(fā)明的脂質(zhì)體或肽可以配制成注射制劑，方法是，將它們?nèi)芙?、懸浮或乳化在水性或非水性溶劑中，所述溶劑如植物油或其它類似的油，合成的脂肪酸甘油酯，高級脂肪酸的酯或丙二醇；需要時(shí)，可含有常規(guī)添加劑如增溶劑，等滲劑，懸浮劑，乳化劑，穩(wěn)定劑，和保存劑。其它口服或非胃腸道運(yùn)送的配制劑也可以用，象本領(lǐng)域常規(guī)的那樣。本發(fā)明的脂質(zhì)體或肽可包含廣泛多種已用于治療癌癥和抑制血管新生的藥物中的一或多種，包括但不限于，長春瑞賓，順鉬，吉西他賓，紫杉醇，依托泊苷(etoposide)，Novantrone(米托蒽醌)，放線菌素D，喜樹堿(camptothecin)(或其水溶性衍生物)，氨甲蝶呤，絲裂霉素(例如，絲裂霉素C)，達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)，環(huán)膦酰胺，和抗-瘤形成抗生素(anti-neoplasticantibiotics)如多柔比星禾口道諾霄素(daunomycin),或其它，例如DeVitaetal.，2001中所述。脂質(zhì)體或肽可包含細(xì)胞毒藥物、寡核苷酸、毒素、和放射活性分子。脂質(zhì)體或肽還可包含(Ngetal.2006)中所述化合物如抗-VEGF適體。癌癥療法中用的藥物可對癌細(xì)胞有細(xì)胞毒作用或細(xì)胞抑制作用(cytostaticeffect)，或者可以減少惡性細(xì)胞的增生。癌癥治療中用的藥物也可以是肽。本發(fā)明的脂質(zhì)體或肽可以與放療聯(lián)用。本發(fā)明的脂質(zhì)體或肽施用時(shí)可以輔以(DeVita,etal.,(2001))中所述的治療方法。在那些由本發(fā)明的脂質(zhì)體或肽與第二種抗癌劑賦予抵抗癌細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)的聯(lián)用中，所述第二種試劑的劑量(dosage)可以比其單獨(dú)施用時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)劑量減少。增加癌細(xì)胞敏感性的方法包括，將本發(fā)明的脂質(zhì)體或肽與有效增加癌細(xì)胞敏感性的量的化療抗癌藥共同施用。這種共同施用可以是同時(shí)施用或者不同時(shí)施用。本發(fā)明的脂質(zhì)體或肽可以在治療方案實(shí)施過程中與其它多種治療劑一起施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的脂質(zhì)體或肽和其它多種治療劑先后施用?？梢杂舍t(yī)師根據(jù)諸如患者疾病性質(zhì)和患者情況等因素來選擇合適的時(shí)間過程(timecourse)。診斷方法對疾病特異性生物標(biāo)志物的檢測提供了有效的篩選策略。早期檢測不僅實(shí)現(xiàn)早期診斷，而且在癌癥的情況中，可以提供篩選多形性(polymorphism)以及檢測術(shù)后殘余腫瘤細(xì)胞和良性轉(zhuǎn)移(occultmetastases)的能力，后者是腫瘤復(fù)發(fā)的早期指標(biāo)。對疾病特異性生物標(biāo)志物的早期檢測因此可以在診斷前、治療期間、以及好轉(zhuǎn)期(inremission)改善患者的存活。本發(fā)明的肽可以用于疾病的診斷或預(yù)后。所述肽可以作為診斷劑用于多方面，包括但不限于ELISA、Western印跡、熒光、免疫熒光、免疫組化、或放射自顯影。本發(fā)明的抗體也可以與本發(fā)明的肽組合用于檢測癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)是結(jié)合試驗(yàn)，其檢測抗體與結(jié)合至癌細(xì)胞的本發(fā)明肽的結(jié)合。所述多肽或抗體可以是固相化的，所述多肽和/或抗體可以帶有能被檢測的標(biāo)記。例如，所述抗體可以被直接標(biāo)記或被帶有標(biāo)記的第二抗體標(biāo)記。這就是說，適用于抗體的可檢測標(biāo)記包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記，直接標(biāo)記是對抗目標(biāo)蛋白的抗體進(jìn)行標(biāo)記，間接標(biāo)記是對識(shí)別該抗目標(biāo)蛋白之抗體的抗體進(jìn)行標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽包含標(biāo)記(label)，該肽與組織的結(jié)合通過分析該標(biāo)記的存在來檢測。篩詵方法本發(fā)明提供了鑒定與本發(fā)明的肽結(jié)合的生物配體的方法。在一個(gè)方法中，本發(fā)明的肽可作為"誘餌蛋白"用于雙雜交試驗(yàn)(two-hybridassay)或三方雜交試驗(yàn)(three-hybridassay)(參見例如，美國專利5，283，317；Zervosetal.(1993)Cell72223-232；Maduraetal.(1993)J.Biol.Chem.268:12046_12054；Barteletal.(1993)Biotechniques14920-924；Iwabuchietal.(1993)Oncogene81693-1696；andSuteretal.(2006)Biotechniques40:625-44)以鑒定其它與本發(fā)明肽結(jié)合或相互作用的蛋白。在另一方法中，本發(fā)明的肽與細(xì)胞提取物一起保溫，由此鑒定出與本發(fā)明肽結(jié)合的分子。在一個(gè)方法中，本發(fā)明的肽被固定在固體支持物如HPLC柱上，在有利于本發(fā)明的肽與靶分子結(jié)合的條件下，使細(xì)胞提取物暴露于被固定的肽。洗脫并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如質(zhì)譜鑒定所結(jié)合的分子。靶蛋白的親和純化從肺癌細(xì)胞提取蛋白，采用裂解緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.4,150mMNaCl,30ug/mlDNase,1%NonidetP-40，和蛋白抑制劑(Completetabs；RocheMolecularBiochemicals)4°C作用30min。將蛋白裂解物在15，000Xg離心20min，清除殘?jiān)?。所述裂解物先在含有對照肽?-ml柱上進(jìn)行預(yù)清除(precleare)，將過柱液直接加載至第二個(gè)1-ml柱，其是固定了SP5-52或SP5-2肽的親和柱。洗柱并進(jìn)行洗脫。分離的蛋白的純度通過SDS-PAGE(8%聚丙烯酰胺)監(jiān)控，用銀染色來觀察。從凝膠上切取所需蛋白帶，以備用胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)消化(in-geldigestion)。所得多肽進(jìn)一步用質(zhì)譜進(jìn)行分析。實(shí)施例這些實(shí)施例只為舉例說明本發(fā)明，不應(yīng)被理解為以任何形式限制本發(fā)明，它們還描述和詳細(xì)說明了上文所述本發(fā)明的各個(gè)方面和實(shí)施方式。實(shí)施例1.通過噬菌體展示進(jìn)行生物淘選A549，CL1-5，H23，和H460細(xì)胞都在補(bǔ)加了2g碳酸氫鹽，40mg/L卡那霉素，2mML_谷氨酰胺，和10%胎牛血清的RPMI1640中37°C、潮濕的95%空氣和5%C02(v/v)氣氛中培養(yǎng)。NPC-TW01，PC13，SAS，PaCa，NNM，和成纖維細(xì)胞都在含3.7g碳酸氫鹽，40mg/L卡那霉素，2mML-谷氨酰胺，和10%胎牛血清的DMEM中、且37°C、潮濕的90%空氣和10%C02(v/v)氣氛中培養(yǎng)。NSCLC細(xì)胞CL1-5用不含血清的RPMI洗滌，然后用封閉緩沖液(不含血清、含BSA的RPMI)在4°C封閉30分鐘。將細(xì)胞與經(jīng)UV處理而滅活的對照輔助噬菌體(無插入子的噬菌體)在4°C保溫lh。抑制非特異性結(jié)合后，添加噬菌體展示肽文庫(NewEnglandBioLabs，MA，USA)，4°C保溫lh。結(jié)合的噬菌體用裂解緩沖液(150mMNaCl,50mMTris-HClpH8.0,ImMEDTApH7.5，1%NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS)在冰上洗脫。該洗脫的噬菌體集合物經(jīng)擴(kuò)增后，在大腸桿菌(Escherichiacoli)ER2738培養(yǎng)物(NewEnglandBioLabs,MA,USA)中確定滴度。用回收的噬菌體作為后續(xù)多輪淘選的起始物(input)。第5輪選擇后洗脫的噬菌體在LB/IPTG/X-Gal平板上確定滴度。為確定噬菌體的滴度，在5mlLB中接種ER2738單菌落，保溫振蕩培養(yǎng)直至對數(shù)期中期(0D·0.5)。一旦培養(yǎng)物達(dá)到對數(shù)期中期，取200μ1培養(yǎng)物分散至多個(gè)微量離心管，其中每管加一種稀釋物10μ1，然后將這些離心管快速渦旋，室溫保溫5分鐘。感染的細(xì)胞一個(gè)個(gè)地轉(zhuǎn)移至含有AgaroseTop(CambrexBioScienceRockland,Inc.,ME,USA)的培養(yǎng)管中，迅速混合，并馬上傾入預(yù)熱的LB/IPTG/X-Gal平板中。在96孔ELISA板(Falcon，CA，USA)上分別接種癌細(xì)胞和對照細(xì)胞。將細(xì)胞用不含血清的DMEM洗滌后，用封閉緩沖液封閉。將單個(gè)的噬菌體顆粒加至包被了細(xì)胞的板中，4°C保溫2h，再與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的小鼠抗-M13單克隆抗體(Pharmacia，Sweden)保溫，然后與該過氧化物酶的底物二氫氯酸鄰苯二胺(0PD;Sigma，Germany)保溫。該反應(yīng)用微滴板讀取儀在490nm讀取結(jié)果。選出的噬菌體克隆進(jìn)一步用DNA測序進(jìn)行分析。純化的噬菌體的DNA序列按照雙脫氧核苷酸鏈終止法用自動(dòng)DNA測序儀(ABIPRISM377,Perkin-Elmer,CA,USA)確定。測序用對應(yīng)于PlII基因序列的引物5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3‘[SEQIDNO:21]進(jìn)行。將噬菌體展示肽序列翻譯出，用GeneticsComputerGroup(GCG)程序進(jìn)行比對。經(jīng)4輪生物淘選，從NSCLC細(xì)胞CL1-5洗脫的噬菌體的滴度比第1輪增加30倍，到第5輪增加至40倍(圖1)。隨機(jī)選取第3-5輪生物淘選富集的噬菌體進(jìn)行測序。我們還對具有較高的CL1-5結(jié)合活性的噬菌體克隆進(jìn)行了測序。噬菌體PC3-1，PC4-1，PC4-5，PC5-2和PC5-4展示共有基元色氨酸(W)-蘇氨酸(T)/酪氨酸(Y)-酪氨酸(Y)(表1)。有趣的是，PC5-2出現(xiàn)在第3輪(PC3-1)、第4輪(PC4-1)、以及第5輪(PC5-2)生物淘選中。PC5-2在各輪生物淘選中的頻率從第3輪的20%(1/5)增加到第5輪的90%(27/30)(表1)。我們的后續(xù)研究集中在肽TDSILRSYDffTY(SP5-2)上。實(shí)施例2.用免疫組化鑒定與癌細(xì)胞結(jié)合的噬菌體為研究PC5-2是否特異性結(jié)合NSCLC細(xì)胞，我們用免疫組化定位不同類型細(xì)胞中的噬菌體顆粒。將所有癌細(xì)胞系，NNM和成纖維細(xì)胞鋪在蓋玻片上，長至約80%鋪滿。將這些蓋玻片與封閉緩沖液一起保溫，用過氧化氫加0.1%NaN3處理，以封閉內(nèi)源過氧化物酶活性，然后與每種選出的噬菌體4°C保溫lh。蓋玻片洗后，與HRP-標(biāo)記的小鼠抗-M13單克隆抗體4°C保溫lh。將玻片(slide)用3%甲醛固定lOmin，加過氧化物酶底物，用50%甘油的PBS液封藏。結(jié)果顯示，PC5-2與NSCLC細(xì)胞系包括CL1-5和PC13特異性結(jié)合(圖2A，箭頭)。不展示該肽的對照輔助噬菌體不與CL1-5細(xì)胞結(jié)合。PC5-2也不能與其它癌細(xì)胞系如口腔24癌細(xì)胞(SAS)和鼻咽癌細(xì)胞(NPC-TW01)結(jié)合或與鼻粘膜的正常上皮細(xì)胞(NNM)結(jié)合(圖2A)。比例尺10iim。為研究該合成肽與選出的噬菌體克隆是否競爭相同的結(jié)合位點(diǎn)，用免疫熒光染色法進(jìn)行肽競爭抑制試驗(yàn)。合成目標(biāo)肽10511^5￥011￥(55-2)[5￡0IDNO:2]和對照肽(RLLDTNRPLLPY)[SEQIDN0:22]，用Invitrogene，Inc.(CA，USA)的反相高效液相層析純化至純度>95%。由該公司將這些肽與FITC或生物素偶聯(lián)，具體是將FITC或生物素添加到肽的NH2末端。CL1-5細(xì)胞在蓋玻片上培養(yǎng)過夜，然后與經(jīng)UV處理滅活的對照噬菌體在封閉液中預(yù)保溫，以封閉非特異性結(jié)合。將噬菌體與不同濃度的合成肽混合，與細(xì)胞在4°C保溫lh。這些玻片再與小鼠抗-M13單克隆抗體(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)保溫，之后與FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(JacksonImmunoResearch)保溫。玻片洗后，用封固劑(Vector,CA,USA)封固。然后在Leica多用途顯微鏡(Universalmicroscope)下對玻片進(jìn)行檢查。圖像用SimplePCI(C-IMAGING,PA,USA)軟件合并。結(jié)果顯示，CL1-5細(xì)胞與PC5-2噬菌體結(jié)合的活性被SP5-2合成肽以劑量依賴方式抑制。27ug/mlSP5-2能徹底抑制PC5-2結(jié)合活性(圖2B)，對照肽無此效果。在該試驗(yàn)中，對照噬菌體不能結(jié)合CL1-5細(xì)胞，PC5-2不能結(jié)合NPC-TW01(圖2B)。比例尺:10umo此外，為研究CL1-5細(xì)胞表面表達(dá)的靶分子，我們用流式細(xì)胞術(shù)測量了PC5-2結(jié)合細(xì)胞。肺癌細(xì)胞系和其它癌細(xì)胞系培養(yǎng)過夜后，在含50mMEDTA的PBS中懸浮，用封閉緩沖液4°C封閉30分鐘。細(xì)胞用流過緩沖液(flowbuffer,PBS含胎牛血清)洗2次，與噬菌體或FITC標(biāo)記肽一起保溫。為進(jìn)行肽競爭抑制試驗(yàn)，將噬菌體與不同濃度的合成肽混合，將混合物與細(xì)胞一起保溫。用冷的流過緩沖液洗2次后，結(jié)合噬菌體的細(xì)胞與抗-M13單克隆抗體4°C保溫lh，再用FITC偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG抗體處理。將細(xì)胞用冷的流過緩沖液洗2次后，加載至流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)。結(jié)果顯示，42.6%的CL1-5細(xì)胞能被PC5-2結(jié)合(圖2C，c)，結(jié)合的噬菌體被SP5-2肽徹底抑制(圖2C，d)。PC5-2不結(jié)合SAS或正常上皮細(xì)胞(NNM)(圖2C，e和f)。在該試驗(yàn)中，PC5-2也不結(jié)合NPC-TW01(圖2C，b)。這些結(jié)果表明，部分CL1-5細(xì)胞表達(dá)能被PC5-2上展示的肽配體識(shí)別的未知蛋白或其它分子。實(shí)施例3.目標(biāo)肽與NSCLC細(xì)胞和肺癌活檢標(biāo)本結(jié)合為確定展示在PC5-2上的肽序列確實(shí)與NSCLC細(xì)胞相互作用，我們用FITC-標(biāo)記的SP5-2肽代替PC5-2噬菌體，進(jìn)行用免疫熒光染色法實(shí)施的肽結(jié)合試驗(yàn)。結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC-標(biāo)記的SP5-2特異性結(jié)合不同NSCLC細(xì)胞系，包括CL1-5，H460,A549，PC13和H23，但不結(jié)合正常上皮細(xì)胞(NNM)。FITC標(biāo)記的對照肽未顯示這類結(jié)合活性(圖3A)。比例尺10um。為進(jìn)一步確認(rèn)FITC-標(biāo)記的SP5-2能結(jié)合這些NSCLC細(xì)胞系，我們還用流式細(xì)胞術(shù)測量了被SP5-2結(jié)合的細(xì)胞。樣品按實(shí)施例2所述來制備。流式細(xì)胞術(shù)測量的直方圖顯示與各種NSCLC細(xì)胞系結(jié)合的FITC-標(biāo)記的SP5-2(藍(lán))以及作為本底的FITC-標(biāo)記的對照肽(紅)。CL1-5，H460,A549,PC13和H23的結(jié)合活性比分別為43%，45.8%，44.3%，20.和44%(圖3B)。這些結(jié)果表明，PC5-2和SP5-2能靶向NSCLC細(xì)胞。為進(jìn)一步鑒別這種靶向性配體是否對人肺癌活檢標(biāo)本有親和力，我們用免疫組化測試了PC5-2和SP5-2與肺癌患者肺腺癌的反應(yīng)性。制備人肺腺癌切片，將其在封閉緩沖液中保溫30min，再用3%過氧化氫加0.1%NaN3的甲醇液處理，以封閉內(nèi)源過氧化物酶活性，然后與噬菌體克隆或經(jīng)生物素標(biāo)記的肽一起保溫。PC5-2用HRP偶聯(lián)抗-M13抗體以常規(guī)免疫組化染色來檢測。結(jié)果揭示，PC5-2和生物素-標(biāo)記的SP5-2能識(shí)別NSCLC活檢標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞(圖3C，a和b，箭頭)。而對照噬菌體以及經(jīng)生物素標(biāo)記的對照肽不能結(jié)合NSCLC活檢標(biāo)本(圖3C，c和d)。這些數(shù)據(jù)表明，SP5-2識(shí)別NSCLC細(xì)胞系以及肺癌患者癌細(xì)胞表面表達(dá)的未知分子。比例尺25iim。實(shí)施例4.驗(yàn)證PC5-2的體內(nèi)腫瘤歸巢能力為研究PC5-2的體內(nèi)靶向能力，將噬菌體注射至攜有CL1-5衍生腫瘤的小鼠的尾靜脈，灌注后進(jìn)行回收。SCID小鼠背外側(cè)(dorsolateralflank)皮下注射1X107癌細(xì)胞。攜有同樣大小的肺癌衍生腫瘤(腫瘤大小約500mm3)的小鼠從尾靜脈注射靶向性噬菌體或?qū)φ帐删w。注射完8分鐘后，小鼠用二乙醚處理使其進(jìn)入深度麻醉。然后給小鼠灌注50mlPBS以洗去未結(jié)合的噬菌體。取出對照器官(腦、心臟和肺)以及腫瘤實(shí)體，稱重，用冷PBS-PI(蛋白酶抑制劑混合物片劑；Roche，Germany)洗3次。將器官和腫瘤樣品勻漿。之后，添加0.5mlER2738細(xì)菌37°C保溫30分鐘，以便挽救(rescue)與腫瘤實(shí)體或?qū)φ掌鞴俳Y(jié)合的噬菌體。在有l(wèi)mg/LIPTG/X-Gal存在時(shí)，在瓊脂平板上對洗脫的噬菌體顆粒進(jìn)行滴定。在肽競爭抑制試驗(yàn)中，將噬菌體與100yg合成肽一起注射。我們還用到對照肽。器官和腫瘤實(shí)體在Bouin液中固定2h，再將樣品包埋在石蠟塊中。將石蠟切片脫蠟，再水化，用M13單克隆抗體如上述進(jìn)行免疫染色。我們測定了腫瘤實(shí)體和正常對照器官(腦、肺和心臟)中的噬菌體滴度。結(jié)果顯示，PC5-2向腫瘤實(shí)體特異性歸巢，其歸巢濃度比向?qū)φ掌鞴?包括腦、心臟和肺)歸巢的濃度高4-13倍(圖4A)。對照輔助噬菌體不顯示對腫瘤組織的任何特異性靶向性(圖4A)。PC5-2的腫瘤歸巢能力進(jìn)一步通過肽競爭抑制試驗(yàn)來驗(yàn)證，在該試驗(yàn)中，合成肽SP5-2與PC5-2共同注射顯著抑制了從腫瘤實(shí)體回收噬菌體(圖4B)。100微克SP5-2抑制92%的PC5-2與腫瘤實(shí)體結(jié)合，但相同濃度的對照肽(Con-P)無此抑制效果(圖4B)。PC5-2的組織分布也通過免疫染色來研究。攜有NSCLC異種移植物的SCID小鼠靜脈注射PC5-2，取出該異種移植物和對照器官，固定后，定位噬菌體結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果顯示，PC5-2定位在腫瘤組織中(圖4C，d)。在高倍放大下，抗噬菌體的免疫反應(yīng)性可見于腫瘤細(xì)胞的胞漿膜，并向周圍胞質(zhì)中擴(kuò)散(圖4C，e)。正常器官如腦、心臟、以及肺組織上無反應(yīng)產(chǎn)物(圖4C，a-c)，對照噬菌體處理過的腫瘤組織上也無反應(yīng)產(chǎn)物(圖4C，i)。在體內(nèi)歸巢試驗(yàn)中，PC5-2特異性靶向NSCLC異種移植物的能力被合成肽SP5-2抑制(圖4C，j)。比例尺25ym。實(shí)施例5.用SP5-2-Lipo-Vin和SP5-2-Lipo-DoX治療攜有人肺癌異種移植物的SCID小鼠目前對老齡晚期NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)化療方法是用長春瑞賓進(jìn)行單藥化療(Kellyetal.，2001)。為確定是否肺癌歸巢肽SP5-2能用于改進(jìn)該癌癥治療的化療效果，我們將該肽與含長春瑞賓的脂質(zhì)體偶聯(lián)(SP5-2-Lipo-Vin)。將肽以11.5的摩爾比偶聯(lián)至NHS-PEG-DSPE[N-羥基琥珀酰亞氨基-羰基-聚乙二醇(PEG；平均分子量3000)衍生的二硬脂?；字Ｒ掖及?NOFCorporation，Tokyo,Japan)]。該偶聯(lián)利用該肽N端的唯一游離氨基來進(jìn)行，以產(chǎn)生肽基-PEG-DSPE。完成該反應(yīng)，通過定量剩余氨基來證實(shí)反應(yīng)的完成。氨基用TNBS(三硝基苯磺酸)試劑(HabeebAFSA,1966)來測量。由DSPC(二硬脂酰基磷脂酰膽堿)、膽固醇、PEG-DSPE組成的脂質(zhì)體在硫酸銨溶液(250mM(NH4)2S04，pH=5.0，530m0s)中55°C水化，用高壓擠壓設(shè)備(LipexBiomembranes，Vancouver,BC,Canada)在60°C擠壓穿過孔徑為0.1Pm禾P0.05iim的聚碳酸酯濾膜(Costar,Cambridge,MA,USA)；將抗癌藥長春瑞賓或多柔比星用主動(dòng)裝載法包裹在這些脂質(zhì)體中，濃度為lmg藥/lOymol磷脂。脂質(zhì)體的終濃度用磷酸分析確定。將lml酸性異丙醇(81mMHC1)添加到0.2ml經(jīng)稀釋、并裝載了藥物的脂質(zhì)體中，包裹到所述脂質(zhì)體內(nèi)的多柔比星的量用熒光分光光度計(jì)(HitachiF-4500,Hitachi,Ltd,東京，日本)以470nm的激發(fā)光波長和582nm的發(fā)射光波長來測定。囊的大小用超微粒子分析儀(submicronparticleanalyzer)(型號(hào)Mplus;CoulterElectronics,Hialeah,FL,USA)ilil云力H^Ht身寸(dynamiclaserscattering)HiJ胃。將肽基-PEG-DSPE與預(yù)制的脂質(zhì)體在脂質(zhì)雙層的轉(zhuǎn)變溫度(transitiontemperature)以上的溫度共保溫之后，使肽基-PEG-DSPE轉(zhuǎn)移至所述脂質(zhì)體(Zalipskyetal.，1997)。每個(gè)脂質(zhì)體有300-500個(gè)肽分子，按文獻(xiàn)所述算得(Kirpotinetal.，1997)。4-6周齡小鼠背外側(cè)皮下(s.c.)注射人NSCLC癌細(xì)胞。具有同樣大小(約50100mm3)的腫瘤的小鼠隨機(jī)分配至不同治療組，用含長春瑞賓的SP5-2偶聯(lián)脂質(zhì)體(SP5-2-Lipo-Vin)或含多柔比星的SP5-2偶聯(lián)脂質(zhì)體(SP5-2-Lipo_Dox)、以及Lipo-Vin或Lipo-Dox通過尾靜脈進(jìn)行治療。這些小鼠用所述藥物治療8次(lmg/kg，一周兩次)。每周兩次用測徑器(calipers)測量小鼠體重和腫瘤大小。腫瘤體積用等式長X(寬)2X0.52來計(jì)算。腫瘤體積均值的差異用方差分析(AN0VA)進(jìn)行評價(jià)。攜有同樣大小的NSCLC異種移植物(100mm3)的SCID小鼠，以長春瑞賓總量為48mg/kg(12次，2mg/kg,一周兩次)的水平，分別用SP5-2-Lipo-Vin、Lipo-Vin和PBS通過靜脈注射進(jìn)行治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接受SP5-2-Lipo-Vin的荷瘤小鼠組(圖5A，組a)腫瘤大小顯著小于Lipo-Vin組和PBS組(圖5A，組b和組c)(P<0.005)。Lipo-Vin(LV)組的腫瘤增大，比SP5-2-Lipo-Vin(SP5-2-LV)組的大6.75倍。對照PBS組小鼠的腫瘤增大，比SP5-2-Lipo-Vin組的大25倍(n=6；*P<0.01)(圖5A)。為評估化療藥可能引起的副作用，每周兩次給小鼠稱重。數(shù)據(jù)顯示，SP5-2-Lipo-Vin治療組的體重變化(增加1.37g)與PBS組的體重變化(增加1.33g)相似。但Lipo-Vin治療組的體重增長較小(僅增加0.58g)(n=6；*p<0.05)(圖5B)。為進(jìn)一步確定靶向性脂質(zhì)體的療效，我們比較了分別經(jīng)SP5-2-Lipo-Vin、Lipo-Vin或PBS治療102天后的動(dòng)物存活率。PBS治療組的所有動(dòng)物都死亡(存活率0%)。Lipo-Vin治療組死3只(存活率40%)，SP5-2-Lipo-Vin治療組的存活率顯著增加，當(dāng)試驗(yàn)在第102天終止時(shí)，其存活率達(dá)到80%(n=5；圖5C)。為測試是否SP5-2能增加肺癌治療力，我們將這種靶向性配體與另一種抗癌藥多柔比星相連(SP5-2-Lipo-DoX)，用于治療另一種NSCLC，即H460。多柔比星是最常用的抗癌藥之一。已知這種化療藥除了對癌細(xì)胞有細(xì)胞毒作用以外，還具有抗血管新生活性(Arapetal.，1998)。數(shù)據(jù)顯示，SP5-2-Lipo_Dox(SP5-2-LD)也比Lipo-Dox(LD)療效好(n=6*p27<0.05)(圖5D)。與PBS治療組小鼠相比，靶向性脂質(zhì)體SP5-2-Lipo-Dox顯著抑制H460衍生腫瘤的生長(圖5D)。這些結(jié)果表明，將Lipo-Vin或Lipo-Dox與靶向性配體SP5-2偶聯(lián)增強(qiáng)了這些藥物在動(dòng)物模型中抑制人肺癌異種移植物的效力。表1.a噬菌體展示的共有氨基酸序列用粗體顯示。PC3-UPC4-1和PC5-2展示相同的氨基酸序列。PC4-5和PC5-4展示相同的氨基酸序列。權(quán)利要求多核苷酸或其變體，選自SEQIDNO1，SEQIDNO3，SEQIDNO5，SEQIDNO7，SEQIDNO9，SEQIDNO11，SEQIDNO13，SEQIDNO15，SEQIDNO17，和SEQIDNO19。2.肽或其變體，選自SEQIDNO:2,SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10,SEQIDNO-.12,SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，和SEQIDNO:20。3.權(quán)利要求2的肽，其中所述肽包含SEQIDNO:2，或其變體。4.權(quán)利要求3的肽，其中所述肽包含SEQIDNO:2。5.融合肽，含有第一肽且該第一肽與第二肽融合，其中所述第一肽包含權(quán)利要求2的肽。6.權(quán)利要求3的融合肽，其中所述第二肽含有表位。7.權(quán)利要求2的肽，其中所述肽包含一或多種標(biāo)記。8.權(quán)利要求7的肽，其中所述標(biāo)記選自FITC，生物素，以及放射性同位素。9.權(quán)利要求2的肽，其中所述肽與一或多種選自下組的藥物偶聯(lián)多柔比星，長春瑞賓，寡核苷酸，毒素，抗-VEGF適體，以及放射活性分子。10.抗體，其與權(quán)利要求2的肽結(jié)合。11.脂質(zhì)體，其含有至少一種按照權(quán)利要求2所述的肽。12.權(quán)利要求11的脂質(zhì)體，其中所述肽包含SEQIDNO:2，或其變體。13.權(quán)利要求12的脂質(zhì)體，其中所述肽包含SEQIDN0:2。14.權(quán)利要求11的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體還包含至少一種選自下組的藥物多柔比星，長春瑞賓，寡核苷酸，毒素，抗-VEGF適體，以及放射活性分子。15.權(quán)利要求14的脂質(zhì)體，其中所述藥物包含多柔比星。16.權(quán)利要求14的脂質(zhì)體，其中所述藥物包含長春瑞賓。17.權(quán)利要求14的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體包含可藥用載體。18.治療哺乳動(dòng)物的疾病的方法，包括給需要治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求9所述肽。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。20.治療哺乳動(dòng)物的癌癥的方法，包括給需要治療的哺乳動(dòng)物施用脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體包含一或多種化療藥物以及一或多種含權(quán)利要求2所述肽的多肽或其變體。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。22.權(quán)利要求20的方法，其中所述肽包含SEQIDNO:2，或其變體。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述肽包含SEQIDNO:2。24.權(quán)利要求20的方法，其中所述化療藥物選自多柔比星，長春瑞賓，寡核苷酸，毒素，以及抗-VEGF適體，以及放射活性分子。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述化療藥物是多柔比星。26.權(quán)利要求24的方法，其中所述化療藥物是長春瑞賓。27.權(quán)利要求20的方法，其中所述癌癥是選自NSCLC和SCLC的肺癌。28.29.檢測標(biāo)本中的癌細(xì)胞的方法，包括a)在允許權(quán)利要求2的肽與所述標(biāo)本中的癌細(xì)胞結(jié)合的條件下，將所述標(biāo)本與權(quán)利要求2的肽接觸；以及b)用權(quán)利要求10的抗體檢測所述肽與所述標(biāo)本中的所述癌細(xì)胞的結(jié)合。30.檢測標(biāo)本中的癌細(xì)胞的方法，包括a)在允許權(quán)利要求6的融合肽與所述標(biāo)本中的癌細(xì)胞結(jié)合的條件下，將所述標(biāo)本與權(quán)利要求6的融合肽接觸；以及b)用特異于所述融合肽的表位的抗體檢測所述融合肽與所述標(biāo)本的結(jié)合。31.檢測標(biāo)本中的癌細(xì)胞的方法，包括a)在允許權(quán)利要求7的肽與所述標(biāo)本中的癌細(xì)胞結(jié)合的條件下，將所述標(biāo)本與權(quán)利要求7的肽接觸；以及b)檢測所述肽的標(biāo)記。32.鑒定與權(quán)利要求2的肽結(jié)合的生物分子的方法，包括a)在允許形成含權(quán)利要求2所述肽以及配體的復(fù)合物的條件下，將細(xì)胞提取物與權(quán)利要求2的肽接觸；以及b)分析該復(fù)合物，以便鑒定該配體。33.多核苷酸，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與權(quán)利要求1所述多核苷酸或其變體的互補(bǔ)體雜交。34.載體，其含有權(quán)利要求1的多核苷酸。35.宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求34的載體。36.肽，其由權(quán)利要求33的多核苷酸編碼。全文摘要本發(fā)明提供核酸、肽、和抗體用于診斷和治療。所述肽靶向肺癌，可通過噬菌體展示技術(shù)來鑒定。靶向性噬菌體PC5-2以及合成肽SP5-2都能識(shí)別肺癌患者的人肺腫瘤標(biāo)本。在攜帶NSCLC異種移植物的SCID小鼠中，該靶向性噬菌體能特異性靶向腫瘤實(shí)體。當(dāng)所述肽與含有抗癌藥物長春瑞賓或多柔比星的脂質(zhì)體偶聯(lián)時(shí)，改進(jìn)了這些藥物抗人肺癌癥異種移植物的效力，增加了存活率，減少了藥物毒性。文檔編號(hào)A61K9/127GK101878023SQ200880011890公開日2010年11月3日申請日期2008年2月12日優(yōu)先權(quán)日2007年2月13日發(fā)明者吳漢忠,張德寬,林欽塘申請人:中央研究院;臺(tái)灣大學(xué)