一種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù)合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù)合物及其制備方法，本發(fā)明合成了膽甾醇基和四亞乙基五胺修飾的聚乙二醇聚天冬氨酸PEG-P[Asp(TEP)-chole]；通過靜電吸附作用與基因復(fù)合；采用極具臨床應(yīng)用前景的RVG29與Tet1功能肽修飾載體材料，制備形成前述的腦靶向給藥系統(tǒng)。本發(fā)明能使載基因給藥系統(tǒng)透過血腦屏障并特異性的靶向于神經(jīng)細(xì)胞，提高基因的轉(zhuǎn)染效率，為腦部給藥提供一種無創(chuàng)傷給藥方式。
【專利說明】一種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù)合物及 其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因 遞釋復(fù)合物。

【背景技術(shù)】：
[0002] 中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的危害逐年增加，已經(jīng)成為危害人類健康的最嚴(yán)重的疾病之 一。基因藥物，由于其分子靶點(diǎn)的高特異性等特點(diǎn)，已成為目前研究較為廣泛的大分子藥 物。但是，由于血腦屏障的限制，基因藥物無法自主通過血腦屏障，需要通過腦室或鞘內(nèi)注 射等給藥方式，這種侵入性的給藥方式給臨床給藥造成限制。因此，開發(fā)具有經(jīng)血管給藥的 新型基因藥物傳遞系統(tǒng)，具有很重要的研究價(jià)值。
[0003] 連接特異性配體的聚合物載體可靶向至相應(yīng)受體高表達(dá)的組織和細(xì)胞。腦主 動(dòng)靶向研究較廣泛的受體有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、胰島素受體、低密度脂蛋白受體、葉酸等。但 有研究認(rèn)為轉(zhuǎn)鐵蛋白并不是理想的腦部導(dǎo)向分子，轉(zhuǎn)鐵蛋白導(dǎo)向的藥物與受體結(jié)合存在 競爭抑制，受體基本被內(nèi)源性轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和，導(dǎo)致導(dǎo)向效率偏低（Qian ZM，Li H，Sun H，et al. Targeted drug delivery via the transferring receptor-mediated endocytosis pathway [J]· Pharmaco Rev，2002, 54(4) :561-587.)。
[0004] RVG29是一種來源于狂犬病毒糖蛋白的29個(gè)氨基酸形成的多肽，（Kumar P，mi Hj McBride J Lj et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system[J]. Nature，2007, 448(7149) :39-43.)相關(guān)機(jī)制研究表明，RVG 可能與 BBB 上的乙酰膽堿受體和Y-氨基丁酸受體結(jié)合后，可實(shí)現(xiàn)高效的腦轉(zhuǎn)運(yùn)。Tetl是由12個(gè)氨基 酸構(gòu)成的小肽與神經(jīng)元細(xì)胞GTlB受體具有高度的親和性（Kwon E J, Lasiene J, Jacobson B Ej et al. Targeted nonviral delivery vehicles to neural progenitor ceils in the mouse subventricular zone [J] · Biomaterials，2010, 31 (8) : 2417-2424.)。
[0005] 聚乙二醇聚天冬氨酸（PEG-PBLA)是一種生物可降解、生物相容性較好、毒性較低 的高分子材料，結(jié)構(gòu)的特殊性解決了化學(xué)修飾的問題。PEG-PBLA是一種電中性的聚合物，無 法與電負(fù)性的基因復(fù)合，因此經(jīng)含有氨基的四亞乙基五胺修飾，使高分子材料帶正電性，能 有效與基因復(fù)合。同時(shí)，四亞乙基五胺具有一定的緩沖能力，增強(qiáng)內(nèi)涵體逃逸效果，提高轉(zhuǎn) 染效率。端基修飾膽留醇基能增強(qiáng)基因與高分子載體之間的相互作用，提高復(fù)合物的穩(wěn)定 性。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù)合物， 本發(fā)明的另一目的在于提供該靶向基因遞釋復(fù)合物的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是，提供一種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋 復(fù)合物，也稱遞釋系統(tǒng)，本發(fā)明首先合成了膽留醇基和四亞乙基五胺修飾的聚乙二醇聚天 冬氨酸PEG-P [Asp (TEP)-chole];然后通過靜電吸附作用與基因復(fù)合；之后采用RVG29與 Tetl等腦祀向功能肽修飾載體材料，制備形成前述的腦祀向給藥系統(tǒng)。
[0008] 本發(fā)明是將兩種腦功能肽連接，形成雙功能肽，與高分子復(fù)合物共同靶向于腦。本 發(fā)明能使載基因給藥系統(tǒng)透過血腦屏障并特異性的靶向于神經(jīng)細(xì)胞，提高基因的轉(zhuǎn)染效 率，為腦部給藥提供一種無創(chuàng)傷給藥方式。
[0009] 本發(fā)明的第一方面，是提供一種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù)合 物（遞釋系統(tǒng)），該遞釋復(fù)合物由遞釋載體和帶負(fù)電的基因組成：
[0010] 所述的遞釋載體，包括PEG(聚乙二醇）化的陽離子聚合物、陽離子聚合物的端基 連接RVG29或者Tetl ;
[0011] 所述的帶負(fù)電的基因與所述的遞釋載體中的陽離子聚合物通過正負(fù)電荷靜電吸 引。
[0012] 所述的陽離子聚合物，優(yōu)選經(jīng)四亞乙基五胺修飾的聚天冬氨酸。
[0013] 本發(fā)明的一種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù)合物的結(jié)構(gòu)如圖19 所示。
[0014] 所述的RVG29來源于具有腦轉(zhuǎn)運(yùn)特性的狂犬病毒糖蛋白，由29個(gè)氨基酸構(gòu)成，末 端添加半胱氨酸，其序列為：YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKR ASNGC(SEQ ID NO :1)。
[0015] 所述的Tetl與神經(jīng)元細(xì)胞表面的GTlB具有高度的親和性，可特異性的結(jié)合GTlB 受體。Tetl由12個(gè)氨基酸構(gòu)成，末端添加半胱氨酸，其序列為：HLNILSTLWKYRC(SEQ IDNO : 2)。
[0016] 所述的帶負(fù)電的基因選自有治療作用的干擾序列，將其構(gòu)建于所述的陽離子聚合 物的 PEG 末端。優(yōu)選 BACEl 干擾序列，序列為：GCTTTGTGGAGATGGTGGA(SEQ ID NO :3)。
[0017] 本發(fā)明的第二方面，是提供一種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù)合 物的制備方法，該方法包括如下步驟：
[0018] A、陽離子聚合物載體的制備
[0019] 將天冬氨酸節(jié)酯與三光氣按照分子比1:1?5溶于四氫呋喃中，加熱至50? 80°C，磁力攪拌至溶解，正己烷沉淀，得天冬氨酸芐酯羧酸酐；末端含有氨基的PEG衍生物 和天冬氨酸芐酯羧酸酐，溶于CH 2Cl2, 25?50°C反應(yīng)24?72h，乙醚沉淀得聚乙二醇聚天冬 氨酸（PEG-PBLA);
[0020] 利用陽離子聚合物中PEG末端的乙縮醛，在醋酸緩沖液中脫水形成乙醛基，與半 胱氨酸中的巰基通過共價(jià)連接。
[0021] B、遞釋系統(tǒng)的制備
[0022] 步驟A制備得到的陽離子聚合物載體與帶負(fù)電的基因溶于pH7. 4的PBS緩沖液， 等體積渦旋混合30s，形成80?300納米大小的遞釋系統(tǒng)，其中陽離子聚合物載體與帶負(fù)電 的基因的N/P比為2?16。
[0023] 所述的帶負(fù)電的基因，優(yōu)選質(zhì)粒DNA。
[0024] 本發(fā)明的第三方面，是提供上述的雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù) 合物在制備治療阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明構(gòu)建的陽離子聚合物PEG-PAsp (TEP) -chole，生物相容性較好，且細(xì)胞和組 織毒性較低。
[0026] 本發(fā)明采用的PEG-PAsp(TEP)-Chole與基因復(fù)合形成的polyplex，能促進(jìn)內(nèi)涵體 逃逸，顯著提高神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。
[0027] 本發(fā)明采用的兩種多肽RVG29和Tetl，能使載基因的載體系統(tǒng)通過血腦屏障，同 時(shí)特異性靶向于神經(jīng)細(xì)胞，提高體內(nèi)腦靶向性。
[0028] 本發(fā)明選用BACEl干擾序列構(gòu)建于質(zhì)粒中，與雙配體修飾的陽離子聚合物形成復(fù) 合物，能有效下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞Neur〇-2a中的BACEl蛋白水平。
[0029] 本發(fā)明選用BACEl干擾序列構(gòu)建于質(zhì)粒中，與雙配體修飾的陽離子聚合物形成復(fù) 合物，經(jīng)尾靜脈注射后，能顯著改善阿爾茨海默病模型鼠的空間記憶能力。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0030] 圖 1 為 Ace-PEG-P [Asp (TEP) ] -chloe 的核磁氫譜圖；
[0031] 圖 2 為 RVG29-PEG-P[Asp (TEP) ]-chloe 的核磁氫譜圖；
[0032] 圖3為不同N/P的復(fù)合物溶液的粒徑及zeta電位測(cè)定結(jié)果；
[0033] 圖4為N/P16的復(fù)合物溶液的粒徑及zeta電位測(cè)定結(jié)果，其中，A為粒徑圖，B為 zeta電位圖；
[0034] 圖5為瓊脂糖凝膠電泳考察不同N/P的基因包封情況，其中，pDNA為裸質(zhì)粒。
[0035] 圖6為透射電鏡下觀察N/P16時(shí)復(fù)合物的形態(tài)；
[0036] 圖7為MTT法考察不同N/P復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性，其中，A圖為Neur〇-2a細(xì)胞的 生存率，B圖為b. End3細(xì)胞的生存率；
[0037] 圖8為⑶68免疫組化考察聚合物對(duì)組織的毒性，其中，1?7分別為大腦、小腦、心 臟、肝臟、脾臟、腎臟，A?C分別為生理鹽水組、給藥7天后的24h、給藥7天后的72h ;
[0038] 圖9為激光共聚焦觀察b. End3細(xì)胞對(duì)cy3-pDNA的攝取情況；
[0039] 圖10為流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)b. End3細(xì)胞對(duì)不同F(xiàn)ITC-polyplex的攝取量；
[0040] 圖11為不同F(xiàn)ITC-polyplex在不同時(shí)間，透過b.End3細(xì)胞單層膜的滲透率；
[0041] 圖12為綠色熒光蛋白在Neuro_2a細(xì)胞中的表達(dá)量；
[0042] 圖13為蟲熒光素酶在Neur〇-2a細(xì)胞中的表達(dá)量；
[0043] 圖14為小動(dòng)物活體成像考察載DiR熒光染料的聚合物在小鼠體內(nèi)分布，從左至右 依次為 PEG-PAsp (TEP) -chole/DiR 組，
[0044] Tetl-PEG-PAsp (TEP) -chole/DiR 組，
[0045] RVG29-PEG-PAsp (TEP) -chole/DiR 組，
[0046] RVG29/Tetl-PEG_PAsp (TEP) -chole/DiR 組；
[0047] 圖15為balb/c小鼠尾靜脈注射載蟲突光素梅報(bào)告質(zhì)粒的不同polyplex在小鼠 體內(nèi)的表達(dá)量；
[0048] 圖 16 為 western blot 檢測(cè)施加載 pGPU6/GFP/Neo/BACEl 質(zhì)粒的不同 polyplex 組 后，Neur〇-2a細(xì)胞中的蛋白含量；
[0049] 圖17為采用Morris水迷宮評(píng)價(jià)雙轉(zhuǎn)基因 APP/PS1鼠在訓(xùn)練期的潛伏期；
[0050] 圖18為雙轉(zhuǎn)基因 APP/PS1鼠在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間所占比例；
[0051] 圖19為本發(fā)明的遞釋復(fù)合物的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，A為載體PEG-PAsp(TEP)-Ch0I e 的結(jié)構(gòu)式，B為多肽連接于載體后的結(jié)構(gòu)式。

【具體實(shí)施方式】：
[0052] 以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于 說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0053] 實(shí)施例1 :
[0054] 稱取4. 46g的天冬氨酸芐酯（購自天津希恩思生化科技有限公司）然后在攪拌下 加入6g三光氣，正己烷沉淀，得天冬氨酸芐酯羧酸酐（BLA-NCA)。
[0055] 稱取Ace-PEGltl3-NH2(購自廈門賽諾邦格生物科技有限公司）0. 5g加入250ml三 口瓶，加入50ml左右CH2Cl2，磁力攪拌溶解后，再加入BLA-NCA2. 25g，在30°C下氮?dú)獗Ｗo(hù) 反應(yīng)72h。濃縮反應(yīng)液，用10倍乙醚沉淀，過濾，真空干燥，即得聚乙二醇-b-聚天冬氨酸 (Ace-PEG-PBLA)〇
[0056] 稱取Ace-PEG-PBLAO. 5g，量取四亞乙基五胺（購自阿拉丁試劑）10mL，力口 入DMF中，油浴恒溫40°C，攪拌24h。濃鹽酸調(diào)pH至中性，透析48h，冷凍干燥，即得 Ace-PEG-P[Asp (TEP)]-chloe。
[0057] 稱取 0· Ig 的 Ace-PEG-P [Asp (TEP) ] -chloe，加入 DMSO 中溶解，按修飾度 15 % 加入氯甲酸膽甾醇酯（購自百靈威生物科技有限公司）（預(yù)先用DMSO溶解），加入三 乙胺，35 °C油浴，加熱12?24h，調(diào)pH至中性，透析24?48h，冷凍干燥，即得終產(chǎn)物 Ace-PEG-P[Asp (TEP)]-chloe。
[0058] 實(shí)施例2 :
[0059] Ace-PEG-P [Asp (TEP) ] -chloe 分別與多肽 RVG29、Tetl (購自杭州中肽生化 有限公司）以摩爾比1:5溶于醋酸緩沖液（0. 2M，pH = 4.0)中，室溫磁力攪拌3? 5d。PBS透析24?48h，然后更換餾水繼續(xù)透析48h，除游離多肽，冷凍干燥分別得產(chǎn)物 RVG29-PEG-P[Asp (TEP)]-chloe 和 Tetl-PEG-P[Asp (TEP)]-chloe。
[0060] 實(shí)施例3 :
[0061] 將實(shí)施例 1 中合成的 Ace-PEG-P [Asp (TEP) ]-chloelOmg 溶于 0· 5mL 氘代 DMS0,經(jīng) 核磁氫譜表征，結(jié)果顯示，S 5.1處為膽甾醇基的質(zhì)子峰，δ 3. 5處明顯的峰為TOG的質(zhì)子 峰，說明聚合物合成成功，見圖1。
[0062] 將實(shí)施例 2 中合成的 RVG29-PEG-P [Asp (TEP) ] -chloelOmg 溶于 0· 5mL 重水， 經(jīng)核磁氫譜表征，結(jié)果顯示，S 7. 0附近的質(zhì)子峰為多肽上含苯環(huán)的氨基酸的質(zhì)子峰， RVG中含苯環(huán)的氨基酸為苯丙氨酸（Phenylalanine, F)、酪氨酸（Tyrosine, Y)、色氨酸 (Tryptophane, W), δ L 〇附近的質(zhì)子峰消失，以上說明多肽連接成功，見圖2。
[0063] 實(shí)施例4 :
[0064] 稱取實(shí)施例 1 中制備的 Ace-PEG-P[Asp(TEP)]_cholelmg，溶于 0· 5mLPBS 緩沖 液（pH = 7.4)，備用。將？6--/6--/他〇綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒0嫩（購自于上海吉瑪 制藥技術(shù)有限公司）溶于適量的PBS緩沖液中，配成100 μ g/mL溶液。精密量取上述 陽離子聚合物儲(chǔ)備液，并稀釋至〇. 5mL，分別滴加到等體積pDNA溶液中，渦旋30s，即得 Ace-PEG-P [Asp (TEP) ] -chole/pDNA (polyplex)遞釋系統(tǒng)。
[0065] 實(shí)施例5 :
[0066] 將實(shí)施例 2 中合成的 RVG29-PEG-P [Asp (TEP) ]-chole 和 Tetl-PEG-P [Asp (TEP) ]-chl〇e分別溶于一定量的PBS緩沖液中，配成2mg/mL的溶液。將 pGFP/GFP/Neo綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒DNA分別溶于上述緩沖液中，配成IOO μ g/mL溶 液。將兩者按照不同N/P，等體積混合渦旋30s，制成陽離子復(fù)合物RVG29-p〇lyple X和 Tetl-polyplex〇
[0067] 實(shí)施例6 :
[0068] 稱取實(shí)施例 1 中制備的 Ace-PEG-P [Asp (TEP)]-cholelmg，溶于 0· 5mLPBS 緩沖液 (pH = 7. 4)，備用。將pGL3蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒DNA(購自于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公 司）溶于適量的PBS緩沖液中，配成100 μ g/mL溶液。精密量取不同體積的上述陽離子聚 合物儲(chǔ)備液，并稀釋至〇. 5mL，分別滴加到等體積pDNA溶液中，渦旋30s，即得不同N/P的 Ace-PEG-P [Asp (TEP) ]-chole/pDNA 遞釋系統(tǒng)。
[0069] 實(shí)施例7 :
[0070] 將實(shí)施例 2 中合成的 RVG29-PEG-P [Asp (TEP) ]-chole 和 Te11-PEG-P [Asp (TEP) ]-chIoe分別溶于一定量的PBS緩沖液中，配成2mg/mL的溶液。將 PGL3蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒DNA分別溶于上述緩沖液中，配成100 μ g/mL溶液。將兩者按照 不同N/P，等體積混合潤旋30s，制成陽離子復(fù)合物RVG29-polyplex和Tetl-polyplex。
[0071] 實(shí)施例8:
[0072] 稱取實(shí)施例 1 中制備的 Ace-PEG-P [Asp (TEP)]-cholelmg，溶于 0· 5mLPBS 緩沖液 (pH = 7. 4)，備用。選用重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo/BACEl (購自于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公 司），其中 BACEl 序列為 GCTTTGTGGAGATGGTGGA。
[0073] 將pGPU6/GFP/Neo/BACEl溶于適量的PBS緩沖液中，配成100 μ g/mL溶液。精密 量取不同體積的上述陽離子聚合物儲(chǔ)備液，并稀釋至〇. 5mL，分別滴加到等體積pDNA溶液 中，渦旋 30s，即得不同 N/P 的 Ace-PEG-P [Asp (TEP) ]-chole/pDNA 遞釋系統(tǒng)。
[0074] 實(shí)施例9 :
[0075] 將實(shí)施例 2 中合成的 RVG29-PEG-P [Asp (TEP) ]-chole 和 Tetl-PEG-P [Asp (TEP) ]-chloe分別溶于一定量的PBS緩沖液中，配成2mg/mL的溶液。將重 組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo/BACEl分別溶于上述緩沖液中，配成100 μ g/mL溶液。將兩者按照 不同N/P，等體積混合潤旋30s，制成陽離子復(fù)合物RVG29-polyplex和Tetl-polyplex。
[0076] 實(shí)施例10 :
[0077] 分別稱取 IOmg PEG-PAsp (TEP)-chole、Tetl-PEG-PAsp(TEP)-chole、 RVG29-PEG-PAsp (TEP)-chole、RVG29/Tetl-PEG-PAsp (TEP)-chole 溶于 2mL DMSO 溶劑中， 然后加入含100 μ g DiR溶液，攪拌滴加于6mL去離子水水中，透析除有機(jī)溶劑。4000r離心 40min，除去游離的DiR染料。
[0078] 實(shí)施例11 :
[0079] 按照實(shí)施例4法分別制備不同N/P的載基因的Ace-PEG-P[ASp (TEP) ]-ch〇le/DNA， 分別稀釋至lmL，動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定粒徑及zeta電位。結(jié)果顯示，在研究范圍內(nèi)，隨N/P比的 增加，粒徑逐漸減小，zeta電位逐漸增加，見圖3,其中N/P16的粒徑及電位結(jié)果見圖4。
[0080] 實(shí)施例12 :
[0081] 按照實(shí)施例4法分別制備不同N/P的載基因的Ace-PEG-P[ASp (TEP) ]-ch〇le/DNA ; 稱取0. 2g瓊脂糖于三角燒瓶中，加入20mL TAE電泳液，微波中高火加熱使瓊脂糖完全溶解， 室溫放置至約60°C，加入5 μ L溴乙錠，晃勻，緩慢倒入電泳槽中，靜置使成凝膠狀。將上述 不同polyplex加入上樣孔中，150V下泳動(dòng)約20min，紫外燈下觀察并拍照。
[0082] 結(jié)果顯示，pDNA能被完全滯留在上樣孔，即pDNA能夠完全被包載，結(jié)果見圖5。
[0083] 實(shí)施例13 :
[0084] 按照實(shí)施例4法分別制備N/P16的載基因的polyplex，磷鎢酸染色，投射電鏡下觀 察粒子的形態(tài)，結(jié)果見圖6,粒子呈球形，分散均勻，粒徑約70nm。
[0085] 實(shí)施例14 :
[0086] 按實(shí)施例4的方法制備不同N/P的載基因的polyplex，將腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 (b. End3細(xì)胞）（藥理教研室芮耀誠教授贈(zèng)）和小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞（Neur〇-2a細(xì)胞）（購自 ATCC細(xì)胞庫）分別以5X IO3個(gè)/孔接種于96孔板，并將細(xì)胞置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中 孵育24h至貼壁，用PBS漂洗3遍，將上述不同polyplex施加于不同孔中，并設(shè)置空白對(duì)照 組和Lipofectamine-2000陽性對(duì)照組。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h，更換新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù) 培養(yǎng)48h。
[0087] 采用MTT法測(cè)定不同組對(duì)細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示，施加不同N/P的polyplex的兩 種細(xì)胞生存率都在85%以上，說明，細(xì)胞毒性較小，見圖7。
[0088] 實(shí)施例15 :
[0089] Balb/c 小鼠尾靜脈注射 Ace-PEG-PAsp (TEP) _chole30mg/kg，連續(xù)給藥 7d，給藥結(jié) 束后24h、72h，脫頸處死，取大腦、小腦、心、肝、脾、肺、腎，經(jīng)⑶68免疫組化染色后，顯微鏡 觀察并拍照。
[0090] 結(jié)果所示，在心臟、肝臟和腎臟中，有少量的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。在有炎癥的情況下，會(huì) 產(chǎn)生大量的腎小球血管系膜細(xì)胞，使腎小球的吞噬和清除作用增強(qiáng)。但這種反應(yīng)僅發(fā)生在 給藥后的24h。聚合物材料可能產(chǎn)生一過性的毒性，經(jīng)過72h，慢慢減少直至與對(duì)照組無顯 著差異，見圖8。
[0091] 實(shí)施例16 :
[0092] 按實(shí)施例4的方法制備N/P16的載Cy3_pDNA的polyplexAEnd. 3細(xì)胞以5. OX IO5 細(xì)胞/孔接種于confocal專用培養(yǎng)皿中，孵育24h至細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)基，將含2 μ g pDNA 的復(fù)合物加入于培養(yǎng)皿中，添加 Iml不含血清的培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2h后 取出，用冰冷的PBS終止攝取，漂洗3次，然后4%的多聚甲醛固定20mim，PBS洗滌3次，再 加入DiO細(xì)胞膜染料，室溫孵育10min，PBS漂洗3次，DAPI溶液進(jìn)行細(xì)胞核染色，抗熒光淬 滅劑封片后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。
[0093] 結(jié)果顯示，polyplex_RVG29組和polyplex_Tetl/RVG29組顯示了最強(qiáng)的突光強(qiáng) 度，見圖9。
[0094] 實(shí)施例17 :
[0095] 稱取 Ace-PEG-P[Asp(TEP)]_chole、Tet卜PEG-P[Asp(TEP)]_chole、 RVG29-PEG-P[Asp(TEP)]-chole、Tetl/RVG29-PEG-P[Asp(TEP)]-chole 各 20mg，分別溶于 5ml碳酸鹽緩沖液（pH = 9. 0)，將500 μ g的水溶性異硫氰酸突光素（購自Sigma-Aldrich 公司）加入上述碳酸鹽緩沖液中，避光攪拌12h，去離子水透析，除去游離水溶性異硫氰酸 熒光素。
[0096] 按照實(shí)施例4和實(shí)施例5的方法制備N/P16的polyplex。取對(duì)數(shù)期生長的bEnd. 3 細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以I. ox IO6個(gè)/孔接種于confocal專用培養(yǎng)皿中，孵育過夜至細(xì) 胞貼壁。將含2 μ g pDNA的復(fù)合物加入培養(yǎng)皿中，添加 Iml不含血清的培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培 養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2h后取出，用冰冷的PBS終止攝取，胰酶消化細(xì)胞，含血清的培養(yǎng)基終止消 化，IOOOr離心3min，PBS漂洗，然后加500 μ L PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0097] 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，Tetl/RVG29_polyplex和RVG29_polyplex在細(xì)胞中的攝取率與 polyplex、Tetl的polyplex相比，具有顯著性差異，其中細(xì)胞對(duì)的RVG29_polyplex攝取量 是 polyplex 的 2. 8 倍，bEnd. 3 細(xì)胞 Tetl/RVG29_polyplex 孵育后，與 polyplex 相比，突光 強(qiáng)度增加了 1. 4倍。在細(xì)胞中的聚集量要比RVG29修飾的polyplex少，見圖10。
[0098] 實(shí)施例18 :
[0099] 將 b. End3 細(xì)胞以 5X IO5 個(gè) / 孔接種于 Tranwell (12 孔板，3 μ m，內(nèi)膜 I. 12cm2) 上層，并添加0. 5mL培養(yǎng)液，同時(shí)下層加入I. 5mL培養(yǎng)液，2d后更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù) 培養(yǎng)，大約培養(yǎng)5?7d。每天測(cè)定跨內(nèi)皮細(xì)胞膜阻（transendothelial electrical resistance, TEER)待其穩(wěn)定后，提示單層膜已經(jīng)形成。分別將標(biāo)記了 FITC的polyplex,置 于Tranwell的上層，并添加培養(yǎng)基至500 μ L。
[0100] 分別于給藥后的1，2,4,6,8h后，取樣500 μ L，置于4°C冰箱，待測(cè)（選用突光分光 光度計(jì)測(cè)定），并添加500 μ L新鮮培養(yǎng)基。樣品的測(cè)定結(jié)果顯示，給藥后2h后，四種復(fù)合物 的透過效率基本一致，當(dāng)給藥4h后，未經(jīng)任何修飾的polypex和Tetl-polyplex組的滲透 率基本不再升高，而RVG29_polyplex和Tetl/RVG29_polyplex的滲透率都有大幅度升高， 見圖11。
[0101] 實(shí)施例19 :
[0102] 按照實(shí)施例6和實(shí)施例7的方法制備N/P16的polyplex、Tetl-polyplex、 RVG29-polyplex、Tetl/RVG29-polyplex。Neur〇-2a 細(xì)胞以 5. OX IO4 個(gè) / 孔接種于 24 孔板 中，孵育過夜至細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)基，將上述含1 μ g PDNA的復(fù)合物加入于培養(yǎng)皿中，添加 ImL不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，放入37°C，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，期間更換培養(yǎng)基。 培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)基，PBS漂洗三次，然后加入4%的多聚甲醛固定20mim，置于熒光顯 微鏡下觀察。
[0103] 結(jié)果顯示，空白polyplex的突光強(qiáng)度較弱，而Tetl-polyplex組和 RVG29-p〇lypleX組的熒光強(qiáng)度都比較強(qiáng)，肉眼觀察沒有明顯的差異，雙配體修飾組在細(xì)胞 中表現(xiàn)出最強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，說明雙配體修飾后有利于粒子內(nèi)吞入胞，有更高的轉(zhuǎn)染效率，見 圖12。
[0104] 實(shí)施例20 :
[0105] 按實(shí)施例6和實(shí)施例7的方法制備N/P16的polyplex、Tetl-polyplex、 RVG29-polyplex、Tetl/RVG29-polyplex。Neur〇-2a 細(xì)胞以 I. OX IO4 個(gè) / 孔接種于 96 孔板 中，孵育過夜至細(xì)胞貼壁。將上述含0. 5μ gpDNA的復(fù)合物加入于培養(yǎng)皿中，添加 ImL培養(yǎng) 基，放入37°C，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，期間更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后，CCLR 裂解細(xì)胞，IOOOOr離心取上清，采用蟲熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定，BCA法測(cè)定蛋白含量。
[0106] 結(jié)果顯示，空白polyplex的突光強(qiáng)度較弱，而Tetl-polyplex組是未修飾組突光 強(qiáng)度的3. 3倍，雙配體修飾組在細(xì)胞中表現(xiàn)出最強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，是為修飾組的4. 6倍，這也 與定性檢測(cè)的結(jié)果相一致，見圖13。
[0107] 實(shí)施例21 :
[0108] 采用蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3作為熒光探針。分別按實(shí)施例5制備N/P16的 polyplex、Tetl-polyplex、RVG29-polyplex、Tetl/RVG29_polyplex。Balb/c 雄性小鼠經(jīng)尾 靜脈給藥，劑量為PDNA50 μ g。給藥48h后，脫頸處死，冰上分別取腦組織，用冰PBS沖洗掉 殘留的血液，取部分組織加裂解液CCLR，研缽研磨，IOOOOr離心取上清，采用蟲熒光素酶檢 測(cè)系統(tǒng)測(cè)定，BCA法測(cè)定蛋白含量。
[0109] 結(jié)果所示，Tetl/RVG29-p〇lypleX給藥組中的腦內(nèi)熒光素酶活性顯著高于 polyplex 組，見圖 14。
[0110] 實(shí)施例22:
[0111] 按照實(shí)施例8制備不同載DiR熒光染料的粒子，裸鼠尾靜脈分別注射含 DiR(0. 5mg/kg)的不同復(fù)合物粒子，一定時(shí)間后水合氯醒麻醉，采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀 察并拍照，結(jié)果顯示，經(jīng)雙配體修飾的復(fù)合物在裸鼠腦部的熒光最強(qiáng)，且肝臟部位的熒光強(qiáng) 度相對(duì)于其它組的弱，說明經(jīng)雙配體修飾后有利于粒子富集于腦部，而減少其它非靶部位 的聚集，見圖15。
[0112] 實(shí)施例23:
[0113] 取對(duì)數(shù)期Neur〇-2a細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以5X IO5個(gè)/孔細(xì)胞接種于6孔板， 細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育過夜。棄掉培養(yǎng)基，分別施加 P〇lyplex、polyplex-Tetl、polyplex-RVG29、 polyplex-Tetl/RVG29,以空白細(xì)胞作為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48h。然后，加入含PMSF的細(xì)胞裂 解液，冰上裂解30min，收集蛋白，4°C條件下IOOOOr離心lOmin，取上清液。取部分上清液 用于蛋白含量測(cè)定，另一部分加入protein loading buffer沸水浴變性5min。取30 μ g蛋 白，按照western blot的方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0114] 檢測(cè)結(jié)果顯示，polyplex組與空白組蛋白水平接近，polyplex-Tetl組和 polyplex-RVG29的蛋白水平相近，但與空白組相比都有所下降，polyplex-Tetl/RVG29組 的蛋白水平最低，見圖16。
[0115] 實(shí)施例24:
[0116] 選取雙轉(zhuǎn)基因 APP/PS1鼠（購自北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司）北京6個(gè)月時(shí) 開始給藥。尾靜脈給藥不同復(fù)合物（含IOOyg重組質(zhì)粒），以生理鹽水組和非轉(zhuǎn)基因鼠為 對(duì)照，隔周給藥，連續(xù)給藥4次，給藥后的一周，進(jìn)行水迷宮行為學(xué)評(píng)價(jià)。
[0117] 航行學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠隨訓(xùn)練天數(shù)的增加，潛伏期逐漸縮短。訓(xùn)練第四 天時(shí)，給藥P〇lyplex-Tetl/RVG29組與生理鹽水組相比，潛伏期明顯縮短，具有顯著性差 異，且p〇lyplex-Tetl/RVG29.組與polyplex組小鼠的潛伏期也有一定程度的降低，但與 p〇lypleX-Tetl/RVG29組相比，潛伏期較長且具有顯著性差異，見圖17。
[0118] 訓(xùn)練四天后，第五天進(jìn)行的探索實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，給藥組小鼠在第三象限所占時(shí) 間比例都較生理鹽水組有一定程度的改善，但沒有給藥p〇lyplex_RVG29、polyplex-Tetl/ RVG29組小鼠在平臺(tái)所在象限的時(shí)間比例高，其中p〇lyplex-Tetl/RVG29組所占比例最高。 說明，經(jīng)給藥Po I yp I ex-Te 11 /RVG29后，小鼠記憶力有一定程度的改善，見圖18。
[0119] 以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述 實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù)合物，其特征在于，該遞釋復(fù)合 物由遞釋載體和帶負(fù)電的基因組成： 所述的遞釋載體，包括聚乙二醇化的陽離子聚合物、陽離子聚合物的端基連接RVG29 和 Tetl ; 所述的RVG29,其序列如SEQ ID NO :1所示； 所述的Tetl，其序列如SEQ ID NO :2所示； 所述的帶負(fù)電的基因與所述的遞釋載體中的陽離子聚合物通過正負(fù)電荷靜電吸引。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù)合物，其 特征在于，所述的陽離子聚合物，為經(jīng)四亞乙基五胺修飾的聚天冬氨酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù)合物，其 特征在于，所述的帶負(fù)電的基因選自有治療作用的干擾序列，將其構(gòu)建于所述的陽離子聚 合物的PEG末端。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù)合物，其 特征在于，所述的帶負(fù)電的基因?yàn)锽ACE1干擾序列，其序列如SEQ ID NO :3所示。
5. -種雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù)合物的制備方法，其特征在于， 該方法包括如下步驟： A、 陽離子聚合物載體的制備 將天冬氨酸芐酯與三光氣按照分子比1:1?5溶于四氫呋喃中，加熱至50?80°C， 磁力攪拌至溶解，正己烷沉淀，得天冬氨酸芐酯羧酸酐；末端含有氨基的PEG衍生物和天冬 氨酸芐酯羧酸酐，溶于CH2C12,25?50°C反應(yīng)24?72h，乙醚沉淀得聚乙二醇聚天冬氨酸 PEG-PBLA ； 利用陽離子聚合物中PEG末端的乙縮醛，在醋酸緩沖液中脫水形成乙醛基，與半胱氨 酸中的巰基通過共價(jià)連接； B、 遞釋復(fù)合物的制備 步驟A制備得到的陽離子聚合物載體與帶負(fù)電的基因溶于pH7. 4的PBS緩沖液，等體 積渦旋混合30s，形成80?300納米大小的遞釋系統(tǒng)，其中陽離子聚合物載體與帶負(fù)電的基 因的N/P比為2?16。
6. -種如權(quán)利要求1至4任一所述的雙功能肽修飾的阿爾茨海默病靶向基因遞釋復(fù)合 物在制備治療阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104368009SQ201410293229
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】俞媛, 鐘延強(qiáng), 賈婷婷, 魯瑩, 鄒豪, 耿雯倩, 陳琰, 張翮, 孫治國, 劉俊杰, 何文婷 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)