本發(fā)明涉及一種用于注射給藥治療腫瘤藥物的組合物納米制劑，尤其涉及一種復(fù)方棕櫚?？箟难狨ズ桶⒚顾氐慕M合物納米粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：阿霉素(Doxorubicin，DOX)是目前臨床上的一線廣譜抗腫瘤藥，抗腫瘤機(jī)制明確，主要是抑制RNA和DNA的合成。1974年即在美國獲準(zhǔn)臨床應(yīng)用，用于治療各種惡性腫瘤，如乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤、神經(jīng)細(xì)胞瘤、急慢性白血病等。注射后廣泛分布于心、肝、脾、肺、腎中，在血漿中消失迅速，且其不良反應(yīng)較多，最嚴(yán)重的是劑量依賴性心臟毒性和神經(jīng)毒性，不僅影響了患者的生存質(zhì)量，而且使阿霉素的應(yīng)用受到限制，這也一直是化學(xué)結(jié)構(gòu)改造和新劑型研發(fā)工作的焦點(diǎn)。。棕櫚?？箟难狨ナ强箟难岬囊环N脂溶性衍生物，與抗壞血酸相比，其穩(wěn)定性更強(qiáng)，具備更好的理化性質(zhì)。脂溶性增強(qiáng)后，棕櫚?？箟难崤c抗壞血酸相比進(jìn)入細(xì)胞的能力增強(qiáng)，藥效增強(qiáng)。前期研究已經(jīng)表明抗壞血酸可以增強(qiáng)阿霉素的抗腫瘤作用及安全性。因此其與抗壞血酸、阿霉素或它們的組合物比較，經(jīng)靜脈、動(dòng)脈、肌肉、皮下、腹腔等給藥，特別是瘤內(nèi)注射、介入給藥等給藥方式可以更加顯著的增強(qiáng)阿霉素的抗腫瘤作用及安全性。而與抗壞血酸相似的是，棕櫚酰抗壞血酸可以選擇性的在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效，對(duì)正常細(xì)胞毒性小，因此毒副作用較小?？鼓[瘤藥物在發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞作用的同時(shí)，亦可損傷正常細(xì)胞藥物。治療的一個(gè)關(guān)鍵問題是如何把藥物定向輸送到癌癥細(xì)胞而又不損傷正常細(xì)胞。納米粒因其超微小體積，日益受到人們的關(guān)注。載藥納米控釋系統(tǒng)用于抗腫瘤藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)有望通過延緩藥物釋放速度，減慢其轉(zhuǎn)化為代謝物，從而減輕其毒性作用，是一種很有前途的抗腫瘤藥物載體。納米技術(shù)是將宏觀物體細(xì)分成超微顆粒，在納米尺寸范圍內(nèi)，通過直接操縱單個(gè)原子、分子束組裝和創(chuàng)造具有特定功能的新物質(zhì)，使其物理、化學(xué)及生物活性產(chǎn)生意想不到的巨變?？缮锝到饩酆衔镏瞥傻募{米級(jí)微粒的研究日益受到生物醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的重視，這種聚合物包括天然和合成類聚合物，前者主要有葡聚糖、白蛋白、甲殼素及其衍生物、卵磷脂、膽固醇等，后者主要有聚酯類如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸羥基乙酸(PLGA)、聚酸酐類、半固態(tài)聚原酸酯類等。近年來，將可生物降解的聚合物制成納米粒，這種聚合物的納米?？煽蒯屗幬?，避免藥物降解或泄漏，改變可降解單體的比例和聚合反應(yīng)條件來調(diào)節(jié)聚合物在體內(nèi)降解，提高療效，降低不良反應(yīng)；將這種聚合物進(jìn)行表面修飾可以使藥物在體內(nèi)靶向分布。PLGA是美國FDA批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)的可生物降解高分子聚合物，由兩種單體--乳酸和羥基乙酸隨機(jī)聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域。在體內(nèi)代謝終產(chǎn)物為CO2和H2O，對(duì)人體無毒副作用。所形成的兩親多糖衍生物可有效避免藥物載體本身可能的毒副作用，可用作醫(yī)用手術(shù)防粘連膜，注射用微膠囊、微球、納米粒及埋植劑等緩釋制劑的輔料，同時(shí)可用作組織工程細(xì)胞培養(yǎng)的多孔支架。PLGA-磷脂-PEG-biotin納米粒具備極其顯著的優(yōu)勢(shì)，磷脂的加入可以增加PLGA納米粒的包封率和載藥量，并且磷脂上豐富的活性基團(tuán)可用于各種小分子靶頭的鍵合，用于主動(dòng)靶向；本組合物可加入DSPE-PEG-BIOTIN(二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-生物素)，是一種新型的靶頭，其不僅可以通過BIOTIN靶向于腫瘤細(xì)胞上的SMVT(Na+依賴的多維生素轉(zhuǎn)運(yùn)體)通道，還可以通過PEG的加入起到在體內(nèi)長循環(huán)的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)方棕櫚?？箟难狨ズ桶⒚顾氐慕M合物納米粒及其制備方法。本發(fā)明的復(fù)方棕櫚?？箟难狨ズ桶⒚顾氐慕M合物納米粒具有良好的包封率、載藥量和穩(wěn)定性；粒徑分布集中，大小分布均勻：本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明涉及一種復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素的組合物納米粒，包括各組分和組分之間的質(zhì)量百分比如下：阿霉素∶棕櫚?？箟难狨ァ酶叻肿硬牧稀帽砻婊钚詣昧字愇镔|(zhì)＝3～30∶0.024～2.4∶30～120∶0～600∶0～144本發(fā)明所述高分子材料可為天然高分子材料和生物可降解合成高分子材料中的一種或幾種材料混合。天然高分子材料可為明膠、海藻酸鹽、殼聚糖、葡聚糖、甲殼素、白蛋白；生物可降解合成高分子材料可為PLA(聚乳酸)、PCL(聚己內(nèi)酯酸)、PLGA(聚乳酸羥基乙酸)、PVA(聚乙烯醇)、PGA(聚羥基乙酸)。優(yōu)選為白蛋白和PLGA。白蛋白可為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、驢血清白蛋白、馬血清白蛋白、兔血清白蛋白、豬血清白蛋白、酪蛋白；PLGA分子量為500～100000長鏈高分子，其乳酸與羥基乙酸的比例為15∶85～85∶15中的一種或幾種材料混合。本發(fā)明所述表面活性劑可為聚乙二醇-十二羥基硬脂酸鋰、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338、泊洛沙姆407、吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、吐溫-85、司盤-80、脫氧膽酸鹽、膽酸鹽、脫氧膽酸、膽酸、牛黃膽酸鹽中的一種或幾種材料混合。優(yōu)選為聚乙二醇-十二羥基硬脂酸鋰、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、脫氧膽酸鹽。本發(fā)明所述磷脂類物質(zhì)可為磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、二月桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰、二棕櫚酰磷脂酸、二油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、大豆磷脂、心磷脂、天然或合成的腦磷脂及其混合物。優(yōu)選為卵磷脂、大豆磷脂、腦磷脂、心磷脂。本發(fā)明所述凍干保護(hù)劑可為乳糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖、蔗糖中的一種或幾種材料混合。粒徑為80-200nm，包封率為70％以上，阿霉素的載藥量為0.02％～1.59％，棕櫚酰抗壞血酸酯的載藥量為3.38％～26.47％。制劑評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：粒徑：100～200nm，包封率：＞80％，PA載藥量：1％～20％為合格制劑本發(fā)明還涉及一種上述復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素的組合物納米粒的制備方法，可以采用下述不同方法制備：方法一：A、將生物可降解合成高分子材料溶解于有機(jī)溶劑中形成高分子材料有機(jī)溶液；B、棕櫚?？箟难狨ヅc阿霉素加入高分子材料有機(jī)溶液中渦旋形成的溶液作為油相；C、將磷脂類物質(zhì)溶于4％的有機(jī)水溶液中，加入表面活性劑，水浴除去有機(jī)溶劑，作為水相；D、將油相滴加入磁力恒溫?cái)嚢柚乃嘀?；E、滴加完后繼續(xù)攪拌2小時(shí)以除去有機(jī)溶劑；F、將除去有機(jī)溶劑的納米粒溶液加入透析袋中透析過夜后，加入凍干保護(hù)劑冷凍干燥，即得。優(yōu)選地，本發(fā)明所述復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸酯/阿霉素的組合物納米粒制備方法一，其特征在于，步驟A中，所述生物可降解合成高分子材料濃度為2.5mg/mL～20mg/mL；有機(jī)溶劑可為二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇；優(yōu)選地，本發(fā)明所述復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸酯/阿霉素的組合物納米粒制備方法一，其特征在于，步驟B中，棕櫚?？箟难崤c生物可降解合成高分子材料的質(zhì)量比為0.024～2.4∶30～120，棕櫚?？箟难崤c阿霉素的質(zhì)量比為0.024～2.4∶3～30；優(yōu)選地，本發(fā)明所述復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸酯/阿霉素的組合物納米粒制備方法一，其特征在于，步驟C中，所使用的有機(jī)溶劑可為二氯甲烷、丙酮、乙醇、異丙醇；表面活性劑其濃度為0mg/mL～30mg/mL；磷脂類物質(zhì)與生物可降解合成高分子材料的質(zhì)量比為0～144∶30～120；水浴溫度設(shè)定為35℃～80℃；優(yōu)選地，本發(fā)明所述復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素的組合物納米粒制備方法一，其特征在于，步驟D中，油相與水相的體積比為1∶2～1∶15，油相滴加速度為0.5mL/min～4mL/min；磁力攪拌時(shí)攪拌速度為200rpm～4000rpm，溫度設(shè)定為15℃～70℃。方法二：A、將處方量的棕櫚酰抗壞血酸酯與阿霉素溶解于有機(jī)溶劑中，形成的溶液作為油相；B、將處方量的天然高分子材料溶解于蒸餾水中，恒溫水浴后得到的溶液作為水相；C、將油相滴加入磁力恒溫?cái)嚢柚乃嘀校籇、加入2％戊二醛水溶液，繼續(xù)攪拌固化；E、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑；F、過0.22μm微孔濾膜，加入凍干保護(hù)劑冷凍干燥，即得。方法二的步步驟A中棕櫚酰抗壞血酸與阿霉素的質(zhì)量比為0.024～2.4∶3～30；優(yōu)選的有機(jī)溶劑可為二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇；優(yōu)選的有機(jī)溶劑選自丙酮。方法二的步步驟B中，優(yōu)選的天然高分子材料選自牛白蛋白；天然高分子材料濃度為0.5mg/mL～5mg/mL；水浴溫度設(shè)定為30℃～100℃；優(yōu)選的水浴溫度設(shè)定為35℃～50℃；更優(yōu)選的水浴溫度設(shè)定為40℃；水浴時(shí)間3h水浴時(shí)間設(shè)定為1～5h；優(yōu)選的水浴時(shí)間設(shè)定為2～4h；更優(yōu)選的水浴時(shí)間設(shè)定為3h；方法二的步步驟C中，油相與水相的體積比為1∶2～15，油相滴加速度為0.5mL～5mL/min；磁力攪拌時(shí)攪拌速度為200rpm～5000rpm，恒溫的溫度溫度設(shè)定為15℃～80℃；方法二的步驟D中，戊二醛水溶液中戊二醛的濃度優(yōu)選是2％。繼續(xù)攪拌的時(shí)間：12h方法二的步驟E中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度設(shè)定為25℃～80℃。將棕櫚酰抗壞血酸酯和阿霉素溶解于丙酮中，作為油相；將牛白蛋白溶解于30mL蒸餾水中，40℃水浴3h后得到的溶液作為水相；將油相以2mL/min的速度滴加入500rpm，80℃恒溫?cái)嚢柚乃嘀校患尤?％戊二醛水溶液，繼續(xù)攪拌12h；30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑；過0.22μm微孔濾膜，加入100g乳糖冷凍干燥，即得。有益技術(shù)效果本發(fā)明的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素的組合物納米粒具有良好的包封率、載藥量和穩(wěn)定性。本發(fā)明的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素的組合物納米粒與棕櫚?？箟难狨畏郊{米粒及阿霉素的單方納米粒相比，藥效明顯增強(qiáng)，可以顯著提高阿霉素的抗腫瘤效果，且毒性降低，安全性高。提高了阿霉素臨床用藥的安全性及有效性，具有重要的實(shí)際應(yīng)用前景。本發(fā)明的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素的組合物納米粒制備方法具有工藝簡便、制備成本低、工藝重現(xiàn)性好、實(shí)驗(yàn)處方和工藝可放大到生產(chǎn)應(yīng)用等特點(diǎn)，因而對(duì)產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。附圖說明圖1.阿霉素水溶液與阿霉素納米粒的在4T1細(xì)胞內(nèi)的體外藥效實(shí)驗(yàn)圖2.PA納米粒和維生素C在4T1細(xì)胞內(nèi)的的體外藥效實(shí)驗(yàn)圖3.DOX∶PA＝1∶50，1∶100，1∶200時(shí)，復(fù)方納米粒以及PA單方納米粒在4T1細(xì)胞中的體外藥效實(shí)驗(yàn)圖4.DOX∶PA＝1∶50，1∶100，1∶200時(shí)，復(fù)方納米粒以及DOX單方納米粒在4T1細(xì)胞中的體外藥效實(shí)驗(yàn)圖5.DOX∶PA＝1∶200時(shí)，復(fù)方納米粒以及DOX單方納米粒在HepG2細(xì)胞中的體外藥效實(shí)驗(yàn)圖6.DOX∶PA＝1∶200時(shí)，復(fù)方納米粒以及PA單方納米粒在HepG2細(xì)胞中的體外藥效實(shí)驗(yàn)圖7.荷瘤小鼠給予a.DOX納米粒，b.PA納米粒，c.復(fù)方納米粒，d.生理鹽水，e.阿霉素水溶液后，各組的體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)圖8.荷瘤小鼠給予a.DOX納米粒，b.PA納米粒，c.復(fù)方納米粒，d.生理鹽水，e.阿霉素水溶液后，各組的體重變化圖9.納米粒的電鏡圖圖10為靜注2mg/kg給藥后阿霉素溶液組與納米粒組在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線具體實(shí)施方式納米粒評(píng)價(jià)方法：納米粒的粒徑的測(cè)定：采用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定。包封率以及載藥量的測(cè)定：0.3mL的復(fù)方納米粒過葡聚糖凝膠柱，用生理鹽水為洗脫液，分開游離的藥物和納米粒后，收集納米粒組分，用甲醇破乳定容后用HPLC進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得復(fù)方納米粒濃度C1。另取0.3mL復(fù)方納米粒用甲醇定容到與上柱后納米粒組分相同體積，然后進(jìn)樣并計(jì)算得復(fù)方納米粒破乳后總濃度C0。根據(jù)以下公式計(jì)算包封率(EncapsulationEfficiency，EE％)以及載藥量(DrugLoadingEfficiency，DLE％)：EE%=C1C0×100%]]>實(shí)施例1：一種復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素的組合物納米粒配方及其制備如下：所述的復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸酯/阿霉素的組合物納米粒制備工藝為：A、將PLA溶解于6mL丙酮中形成PLA丙酮溶液；B、將棕櫚?？箟难狨ヅc阿霉素加入PLA丙酮溶液中渦旋形成溶液，作為油相；C、將卵磷脂溶于10％的乙醇溶液中，加入泊洛沙姆188和DSPE-PEG-BIOTIN(DPB)后，其中卵磷脂∶DPB＝10∶1，(w/w)，30℃水浴除去乙醇作為水相；D、將油相以1mL/min的速度滴加入1000rpm，30℃恒溫?cái)嚢柚乃嘀?；E、滴加完后繼續(xù)攪拌2小時(shí)以除去丙酮；F、將除去丙酮的納米粒溶液加入透析袋中透析過夜后，加入500g甘露醇冷凍干燥，即得。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表1.實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果阿霉素：DOX，棕櫚?？箟难狨ィ篜A，DSPE-PEG-BIOTIN：DPB，卵磷脂∶DPB＝10∶1，(w/w).制劑評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：粒徑：100～200nm，包封率：＞80％，PA載藥量：1％～20％為合格制劑實(shí)施例2：一種復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素的組合物納米粒配方及其制備如下：所述的復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸酯/阿霉素的組合物納米粒制備工藝為：A、將PGA溶解于4mL丙酮中形成PGA丙酮溶液；B、將棕櫚?？箟难狨ヅc阿霉素加入PGA丙酮溶液中渦旋形成溶液，作為油相；C、將卵磷脂溶于20％的二氯甲烷溶液中，加入聚乙二醇-十二羥基硬脂酸鋰(PEG-12-OH-Li)后，30℃水浴除去二氯甲烷作為水相；D、將油相以1mL/min的速度滴加入1000rpm，30℃恒溫?cái)嚢柚乃嘀?；E、滴加完后繼續(xù)攪拌2小時(shí)以除去丙酮；F、將除去丙酮的納米粒溶液加入透析袋中透析過夜后，加入100g海藻糖冷凍干燥，即得。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表2.實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果阿霉素：DOX，棕櫚?？箟难狨ィ篜A，聚乙二醇-十二羥基硬脂酸鋰：PEG-12-OH-Li制劑評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：粒徑：100～200nm，包封率：＞80％，PA載藥量：1％～20％為合格制劑實(shí)施例3：一種復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素的組合物納米粒配方及其制備如下：所述的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素的組合物納米粒制備工藝為：A、將PLGA溶解于5mL丙酮中形成PLGA丙酮溶液；B、將棕櫚?？箟难狨ヅc阿霉素加入PLGA丙酮溶液中渦旋形成溶液，作為油相；C、將大豆磷脂溶于20％的二氯甲烷溶液中，加入吐溫-80后，30℃水浴除去二氯甲烷作為水相；D、將油相以1mL/min的速度滴加入1200rpm，30℃恒溫?cái)嚢柚乃嘀?；E、滴加完后繼續(xù)攪拌2小時(shí)以除去丙酮；F、將除去丙酮的納米粒溶液加入透析袋中透析過夜后，加入100g海藻糖冷凍干燥，即得。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表3.實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果阿霉素：DOX，棕櫚?？箟难狨ィ篜A。制劑評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：粒徑：100～200nm，包封率：＞80％，PA載藥量：1％～20％為合格制劑實(shí)施例4：一種復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素的組合物納米粒配方及其制備如下：所述的復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸酯/阿霉素的組合物納米粒制備工藝為：將棕櫚?？箟难狨ズ桶⒚顾厝芙庥诒?，作為油相；將牛白蛋白溶解于30mL蒸餾水中，40℃水浴3h后得到的溶液作為水相；將油相以2mL/min的速度滴加入500rpm，80℃恒溫?cái)嚢柚乃嘀校患尤?％戊二醛水溶液，繼續(xù)攪拌12h；30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑；過0.22μm微孔濾膜，加入100g乳糖冷凍干燥，即得。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表4.實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果阿霉素：DOX，棕櫚?？箟难狨ィ篜A。制劑評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：粒徑：100～200nm，包封率：＞80％，PA載藥量：1％～20％為合格制劑藥理實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)例1：體外腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)11.選用對(duì)數(shù)生長期的貼壁腫瘤細(xì)胞(鼠乳腺癌細(xì)胞，4T1)，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基配成2.5*104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200μl，37℃，5％CO2培養(yǎng)24h。2.空白組鋪板時(shí)加不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，加藥時(shí)加不含藥的培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)組換新的含不同濃度被測(cè)樣品的培養(yǎng)基，對(duì)照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)平行孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)2天。實(shí)驗(yàn)組分為阿霉素溶液組，維生素C溶液組，阿霉素納米粒組，棕櫚酰抗壞血酸酯納米粒組和復(fù)方棕櫚?？箟难?阿霉素納米粒組(200∶1，100∶1，50∶1)。阿霉素組的阿霉素濃度梯度為：阿霉素溶液組為：0.234～30μg/ml，維生素C溶液組0.5～64mM，阿霉素納米粒組0.117～15μg/ml，棕櫚?？箟难狨ゼ{米粒組：0.016～2mg/ml和復(fù)方棕櫚?？箟难?阿霉素納米粒(50∶1)中復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸：0.004～0.5mg/ml，阿霉素：0.0008～0.01mg/ml；復(fù)方棕櫚?？箟难?阿霉素納米粒(100∶1)中復(fù)方棕櫚?？箟难幔?.001～0.2mg/ml，阿霉素：3.13*10^5～0.02mg/ml；復(fù)方棕櫚?？箟难?阿霉素納米粒(200∶1)中復(fù)方棕櫚?？箟难幔?.001～0.2mg/ml，阿霉素：1.6*10^5～0.01mg/ml；3.棄去上清液，用PBS清洗2～3次，每孔加入200μl新鮮配制的含0.5mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄上清，并加入150μlDMSO，用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以波長為490nm測(cè)定光密度值。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見附圖1～4及表5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，如圖1所示，與阿霉素溶液相比，阿霉素納米粒的IC50值明顯降低，如圖2所示與維生素C相比，棕櫚酰抗壞血酸酯納米粒的IC50值明顯降低，如圖3和圖4及表1所示，當(dāng)阿霉素與PA的比例為200∶1和100∶1時(shí)，與阿霉素納米粒組，棕櫚?？箟难狨ゼ{米粒組相比，復(fù)方棕櫚?？箟难?阿霉素納米粒組的IC50值顯著降低，協(xié)同系數(shù)(CI)小于1，抗腫瘤效果明顯增強(qiáng)。表5.PA-NPS，DOX-NPS以及不同比例復(fù)方在4T1細(xì)胞中的IC50值，以及CI值組別PA-NPSDOX-NPS1∶2001∶1001∶50IC50-PA(mg/ml)0.219--0.00950.0400.281IC50-DOX(μg/ml)--8.840.04790.4345.61CI值----0.04920.2321.92協(xié)同/拮抗----協(xié)同協(xié)同拮抗CI=(D)1(DX)1+(D)2(ΦX)2]]>(D)1，(D)2代表PA和DOX在復(fù)方納米粒中的IC50值，(Dx)1，(Dx)2代表PA和DOX在單方納米粒中的IC50值，CI值＞1，兩藥聯(lián)用產(chǎn)生拮抗作用CI值＜1，兩藥聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)例2：體外腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)21.選用對(duì)數(shù)生長期的貼壁腫瘤細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞，HepG2)，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成2.5*104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200μl，37℃，5％CO2培養(yǎng)24h。2.空白組鋪板時(shí)加不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，加藥時(shí)加不含藥的培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)組換新的含不同濃度被測(cè)樣品的培養(yǎng)基，對(duì)照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)平行孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)2天。實(shí)驗(yàn)組分為阿霉素納米粒組，棕櫚?？箟难狨ゼ{米粒組和復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸/阿霉素納米粒組。阿霉素組的阿霉素濃度梯度為：阿霉素納米粒組0.117～15μg/ml；棕櫚?？箟难狨ゼ{米粒組：0.016～2mg/ml；復(fù)方棕櫚?？箟难?阿霉素納米粒(200∶1)中復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸：0.001～0.2mg/ml，阿霉素：1.6*10^5～0.01mg/ml。3.棄去上清液，用PBS清洗2～3次，每孔加入200μl新鮮配制的含0.5mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄上清，并加入150μlDMSO，用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以波長為490nm測(cè)定光密度值。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見附圖5～6及表6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5和圖6及表2所示，與阿霉素納米粒組，棕櫚?？箟难狨ゼ{米粒組相比，復(fù)方棕櫚?？箟难?阿霉素納米粒組的IC50值顯著降低，協(xié)同系數(shù)小于1，抗腫瘤效果明顯增強(qiáng)。表6.PA-NPS，DOX-NPS以及復(fù)方納米粒在HepG2細(xì)胞中的IC50值，以及CI值組別PA-NPSDOX-NPSCO-NPSIC50-PA(mg/ml)0.2032--0.02022IC50-DOX(μg/ml)--2.3380.1011CI值----0.0492協(xié)同/拮抗----協(xié)同CI=(D)1(DX)1+(D)2(ΦX)2]]>(D)1，(D)2代表PA和DOX在復(fù)方納米粒中的IC50值，(Dx)1，(Dx)2代表PA和DOX在單方納米粒中的IC50值，CI值＞1，兩藥聯(lián)用產(chǎn)生拮抗作用CI值＜1，兩藥聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)例3：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，荷瘤小鼠試驗(yàn)：取本發(fā)明實(shí)施2所得制劑，與阿霉素注射液進(jìn)行核瘤小鼠試驗(yàn)。動(dòng)物模型的建立采用昆明種雄性ICR小白鼠，無菌抽取第三次傳代第8天的小鼠的腹水，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，調(diào)細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/ml，將小鼠迅速乙醚麻醉后，背部皮膚消毒，每只小鼠接種約0.2mlHeps腫瘤細(xì)胞懸液于背部皮下，整個(gè)接種過程在2小時(shí)內(nèi)完成。試驗(yàn)方案：采用尾靜脈注射給藥方式，生理鹽水組(NormalSaline)，復(fù)方納米粒組，阿霉素納米粒組，棕櫚?？箟难狨ゼ{米粒組，阿霉素溶液組。在第1天，第4天，第7天各給藥一次，每三天測(cè)量小鼠腫瘤的大小和小鼠體重，并觀察小鼠的身體狀況和死亡情況。抑制腫瘤效果(見附圖7)結(jié)論：如圖7所示，與生理鹽水組相比，復(fù)方納米粒組，阿霉素納米粒組，棕櫚?？箟难狨ゼ{米粒組均能產(chǎn)生藥效，其中復(fù)方納米粒的藥效最強(qiáng)，說明復(fù)納米粒相較單方納米粒存在優(yōu)勢(shì)。小鼠體重變化(見附圖8)結(jié)論：給藥后，各組荷瘤小鼠的體重變化均不是很明顯，說明復(fù)方納米粒毒性較小。納米粒的電鏡示意圖見圖9.藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)例1：復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素的納米粒與阿霉素溶液的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)比較取大鼠6只，按體重隨機(jī)分成兩組，每組三只大鼠，按2mg/kg劑量靜注給予0.5mg/mL阿霉素溶液(大鼠編號(hào)為No.1、No.2、No.3)、復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素納米粒(棕櫚?？箟难狨ァ冒⒚顾兀?∶1，其中阿霉素濃度為0.5mg/mL，大鼠編號(hào)為No.4、No.5、No.6)，分別于給藥前約0.25h和給藥后0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h取血，約200μL至肝素化試管中，于8000rpm離心5min，分離出血漿，于-80℃保存供測(cè)試。表7.大鼠靜注給予2mg/kg阿霉素溶液后的血藥濃度(μg/L)表8.大鼠靜注給予2mg/kg阿霉素溶液后大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)表9.大鼠靜注給予2mg/kg復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素納米粒后的血藥濃度(μg/L)表10.大鼠靜注給予2mg/kg復(fù)方棕櫚?？箟难狨?阿霉素納米粒后大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7-10和圖10：藥動(dòng)參數(shù)表明，靜注給予大鼠同樣劑量的阿霉素溶液和復(fù)方納米粒后，脂質(zhì)體組的AUC為溶液組的1.37倍，表明納米粒增強(qiáng)了藥效。當(dāng)前第1頁1 2 3