本發(fā)明涉及如下所述的式i的pde2抑制性化合物、它們作為藥物的用途和包含它們的藥物組合物。這些化合物可用于例如治療pde2介導(dǎo)的障礙，例如焦慮、抑郁癥、孤獨(dú)癥譜系障礙(autismspectrumdisorder)(asd)、精神分裂癥和認(rèn)知缺損。
發(fā)明背景
pde2是在各種組織和細(xì)胞類型包括腦(包括海馬、紋狀體和前額葉皮層)、心臟、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、腎上腺小球區(qū)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)的105-kda同型二聚體。雖然cgmp是這種酶的優(yōu)選底物和效應(yīng)分子，但pde2水解環(huán)腺苷酸(camp)和環(huán)鳥苷酸(cgmp)，并被認(rèn)為牽涉許多生理過程。特別地，已經(jīng)證實(shí)，減少cgmp信號傳導(dǎo)的一氧化氮合酶(nos)的抑制減弱了抗焦慮化合物苯二氮
除了有效的行為和認(rèn)知功能之外，已經(jīng)觀察到，在內(nèi)皮細(xì)胞中，pde2amrna和活性被高度誘導(dǎo)作為體外對腫瘤壞死因子-α刺激的響應(yīng)。用9-(6-苯基-2-氧代己-3-基)-2-(3，4-二甲氧基芐基)-嘌呤-6-酮(pdp)對pde2活性的選擇性抑制顯著地改變了內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，這啟示pde2在病理?xiàng)l件下可能對調(diào)節(jié)循環(huán)系統(tǒng)的流體和蛋白質(zhì)完整性起重要作用。因此，pde2可能是敗血癥或更局限化炎癥應(yīng)答中的良好藥理學(xué)靶標(biāo)。
在最近的一項(xiàng)研究中，pde2抑制也已被證明可引起肺部擴(kuò)張，預(yù)防肺血管重塑，并降低肺動脈高壓的右心室肥大特征，這啟示pde2抑制在肺動脈高壓中的治療潛力。bubb等人“inhibitionofphosphodiesterase2augmentscgmpandcampsignalingtoamelioratepulmonaryhypertension”，circulation，2014年8月5日，2014，p.496-507，doi：10.1161/circulationaha.114.009751。
盡管存在富有希望的臨床前期數(shù)據(jù)和將pde2鑒定為富有希望的藥物靶標(biāo)，但目前已知尚無pde2抑制劑處于臨床研究中，部分原因是現(xiàn)有的pde2化合物的代謝穩(wěn)定性和腦滲透性差。因此，需要選擇性抑制pde2活性、同時顯示出優(yōu)異的生物物理特性的化合物。
發(fā)明概述
本公開提供了具有強(qiáng)效和選擇性pde2抑制特性與改善的口服生物利用度和腦進(jìn)入的新化合物。因此，在第一個方面，本公開提供了式i化合物：
其中：
(i)r1和r2與氮原子一起形成雜c3-7環(huán)烷基(例如形成氮雜環(huán)丁烷-1-基)；
(ii)r3是h或c1-4烷基(例如甲基)；
(iii)r4是雜芳基或芳基(例如苯基)，其任選地被一個或多個選自c1-4烷基(例如乙基)、c3-7環(huán)烷基(例如環(huán)丙基)、c1-4烷氧基(例如甲氧基)和鹵代c1-4烷基(例如三氟甲基)的基團(tuán)取代；
(iv)r6是h或c1-4烷基(例如甲基)；
該化合物為游離或鹽形式。
本公開還提供了如下的式i化合物：
1.1式i，其中r1和r2與氮原子一起形成雜c3-7環(huán)烷基(例如氮雜環(huán)丁烷-1-基)；
1.2式1.1，其中r1和r2與氮原子一起形成氮雜環(huán)丁烷-1-基；
1.3式i或1.1-1.2的任一項(xiàng)，其中r3是h或c1-4烷基(例如甲基)；
1.4式i或1.1-1.2的任一項(xiàng)，其中r3是c1-4烷基(例如甲基)；
1.5式i或1.1-1.4的任一項(xiàng)，其中r4是雜芳基或芳基(例如苯基)，其任選地被一個或多個選自c1-4烷基(例如乙基)、c3-7環(huán)烷基(例如環(huán)丙基)、c1-4烷氧基(例如甲氧基)和鹵代c1-4烷基(例如三氟甲基)的基團(tuán)取代；
1.6式i或1.1-1.4的任一項(xiàng)，其中r4是被一個或多個選自c1-4烷基(例如乙基)、c3-7環(huán)烷基(例如環(huán)丙基)、c1-4烷氧基(例如甲氧基)和鹵代c1-4烷基(例如三氟甲基)的基團(tuán)取代的芳基(例如苯基)；
1.7式i或1.1-1.4的任一項(xiàng)，其中r4是被c1-4烷基(例如乙基)取代的芳基(例如苯基)；
1.8式i或1.1-1.4的任一項(xiàng)，其中r4是被c3-7環(huán)烷基(例如環(huán)丙基)取代的芳基(例如苯基)；
1.9式i或1.1-1.4的任一項(xiàng)，其中r4是被c1-4烷氧基(例如甲氧基)取代的芳基(例如苯基)；
1.10式i或1.1-1.4的任一項(xiàng)，其中r4是被鹵代c1-4烷基(例如三氟甲基)取代的芳基(例如苯基)；
1.11式i或1.1-1.10的任一項(xiàng)，其中r6是h或c1-4烷基(例如甲基)；
1.12式i或1.1-1.10的任一項(xiàng)，其中r6是c1-4烷基(例如甲基)；
1.13上述式的任一項(xiàng)，其中該化合物選自：
7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-3-甲基-1-(1-甲基-5-(4-(三氟甲基)苯基)-1h-吡唑-4-基)-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶；
7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-1-(5-(4-甲氧基-2-甲基苯基)-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶；
7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-1-(5-(4-環(huán)丙基苯基)-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶；
7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-1-(5-(4-乙基苯基)-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶；
1.14上述式的任一項(xiàng)，其中該化合物抑制磷酸二酯酶-介導(dǎo)的(例如pde2-介導(dǎo)的)cgmp水解，例如其中在固定化-金屬親和離子試劑pde測定中，ic50小于1μm，更優(yōu)選小于或等于250nm，更優(yōu)選小于或等于10nm，例如如實(shí)施例5中所述，
所述化合物為游離或鹽形式。
在第二個方面，本公開提供了藥物組合物，其包含本公開的化合物，即式i或式1.1-1.14的任一項(xiàng)的游離或藥學(xué)上可接受的鹽形式的化合物與藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。
本公開還提供了使用本公開的化合物治療pde2介導(dǎo)的障礙、例如如下舉出的障礙(特別是焦慮、抑郁癥、孤獨(dú)癥譜系障礙(asd)、精神分裂癥、認(rèn)知缺損)的方法。預(yù)期該清單不是詳盡的，并且可以包括如下舉出的其它疾病和障礙。
因此，在第三個方面，本公開提供了治療pde2介導(dǎo)的障礙的方法，包含向有此需要的個體施用治療有效量的本文公開的本公開的化合物，即，式i或式1.1-1.14的任一項(xiàng)的為游離或藥學(xué)上可接受的鹽形式的化合物或本文公開的藥物組合物。
在第三個方面的另一個實(shí)施方案中，本公開提供了用于治療個體的以下障礙的方法：
神經(jīng)性障礙(例如偏頭痛；癲癇癥；阿爾茨海默??；帕金森??；腦損傷；中風(fēng)；腦血管疾病(包括腦動脈硬化癥、腦淀粉樣蛋白血管病、遺傳性腦出血和腦缺氧缺血)；脊髓性肌萎縮；側(cè)索硬化；多發(fā)性硬化；
認(rèn)知障礙(包括健忘癥、老年性癡呆、hiv相關(guān)性癡呆、阿爾茨海默病相關(guān)性癡呆、亨廷頓病相關(guān)性癡呆、lewy體癡呆、血管性癡呆、藥物相關(guān)性癡呆、譫妄和輕度認(rèn)知障礙)；與帕金森病和抑郁癥相關(guān)的認(rèn)知功能障礙；
心理缺陷(包括唐氏綜合征和脆性x染色體綜合征)；
睡眠障礙(包括睡眠過度、晝夜節(jié)律睡眠障礙、失眠癥、深眠狀態(tài)和睡眠剝奪)；
精神紊亂(例如焦慮(包括急性應(yīng)激障礙、廣泛性焦慮癥、社交焦慮障礙、驚恐障礙、創(chuàng)傷后精神緊張性障礙(ptsd)、強(qiáng)迫性障礙、特異恐怖、社交恐怖癥、慢性焦慮癥和強(qiáng)迫性障礙)；
造作性障礙(包括急性幻覺性躁狂)；
沖動控制障礙(包括病理性賭博、病理性縱火、病理性偷竊和間歇性暴躁障礙)；
情緒障礙(包括i型雙相性精神障礙、ii型雙相性精神障礙、躁狂、混合型情感狀態(tài)、嚴(yán)重抑郁、慢性抑郁、季節(jié)病性抑郁癥、精神病性抑郁癥和產(chǎn)后抑郁癥)；
精神運(yùn)動性障礙(錐體外系病和運(yùn)動障礙，例如帕金森綜合病、lewy體病、震顫、藥物誘發(fā)的震顫、藥物誘發(fā)的遲發(fā)性運(yùn)動障礙、l-多巴-誘發(fā)的運(yùn)動障礙和腿多動綜合征)；
精神病(包括精神分裂癥(例如連續(xù)性或發(fā)作性、偏執(zhí)型、青春型、緊張型、分化不良型和殘留型精神分裂性障礙)、情感性分裂癥、精神分裂癥樣精神病和妄想癥；
藥物依賴(包括麻醉品依賴、酒精中毒、安非他明依賴、可卡因成癮、尼古丁依賴和戒藥綜合征)；
進(jìn)食障礙(包括厭食癥、食欲亢進(jìn)、暴食癥、攝食過度和食冰癖)；
兒科精神病(包括注意缺陷障礙、注意力不足/活動過度癥、行為障礙(例如抽搐性運(yùn)動障礙，例如暫時性、慢性、運(yùn)動或發(fā)聲抽動障礙)、孤獨(dú)癥和孤獨(dú)癥譜系障礙(asd))；
因精神活性物質(zhì)應(yīng)用導(dǎo)致的精神和行為失常；
心血管障礙(例如肺性高血壓和肺動脈高壓)；和
疼痛(例如骨和關(guān)節(jié)疼痛(骨關(guān)節(jié)炎)、反復(fù)性運(yùn)動性疼痛、牙痛、癌痛、肌盤膜痛(肌損傷、纖維肌痛)、圍手術(shù)期疼痛(普通外科手術(shù)、婦科)、慢性痛和神經(jīng)性疼痛)，
所述個體優(yōu)選哺乳動物，優(yōu)選人，該方法包含對所述個體施用治療有效量的本文公開的本公開的化合物，即，式i或式1.1-1.14的任一項(xiàng)的為游離或藥學(xué)上可接受的鹽形式的化合物或本文公開的藥物組合物。
在一個實(shí)施方案中，所述疾病或障礙選自焦慮、抑郁癥、孤獨(dú)癥譜系障礙和精神分裂癥，例如孤獨(dú)癥和/或精神分裂癥患者的焦慮和/或抑郁癥。在另一個實(shí)施方案中，所述疾病或障礙是與精神分裂癥或癡呆相關(guān)的認(rèn)知缺損。
在第四個方面，本公開提供了本文公開的化合物，即式i化合物或式1.1-1.14任一項(xiàng)的游離或藥學(xué)上可接受的鹽形式的化合物(用于制備藥物)，其用于治療如本文公開的pde2介導(dǎo)的障礙。
在第五個方面，本公開提供了藥物組合物，其包含本文公開的化合物，即游離或藥學(xué)上可接受的鹽形式的式i化合物或式1.1-1.14任一項(xiàng)的化合物與與藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，該藥物組合物用于治療如本文公開的pde2介導(dǎo)的障礙。
發(fā)明詳述
如果沒有另外指定或從上下文中清楚地指定，則本文中的以下術(shù)語具有如下含義：
(a)本文所用的“烷基”是飽和或不飽和的烴部分，優(yōu)選飽和的，優(yōu)選具有1至6個碳原子，優(yōu)選具有1至4個碳原子，其可以是直鏈或支鏈的，并且可以任選地被例如鹵素(例如氯或氟)、羥基或羧基單取代、二取代或三取代。
(b)本文所用的“芳基”是單環(huán)或雙環(huán)芳族烴，優(yōu)選苯基，其任選地被取代，例如被烷基(例如甲基)、鹵素(例如氯或氟)、鹵代烷基(例如三氟甲基)或羥基取代。
(c)本文所用的“雜芳基”是芳族部分，其中構(gòu)成芳環(huán)的一個或多個原子是硫或氮而不是碳，例如吡啶基或噻二唑基，其可以任選地被取代，例如被烷基、鹵素、鹵代烷基或羥基取代。
本公開的化合物，例如式i化合物或式1.1-1.14任一項(xiàng)的化合物可以以游離或鹽形式存在，例如作為酸加成鹽。在本說明書中，除非另有說明，否則例如“本公開的化合物”的語言應(yīng)被理解為涵蓋任意形式的化合物，例如游離或酸加成鹽形式，或其中化合物含有酸性取代基，為堿加成鹽形式。本公開的化合物旨在用作藥物，因此優(yōu)選藥學(xué)上可接受的鹽。不適用于藥物用途的鹽可能是有用的，例如，用于分離或純化游離的本公開的游離化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，因此也包括在內(nèi)。
本公開的化合物在一些情況下也可以以前藥形式存在。前藥形式是在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化成本公開的化合物的化合物。例如當(dāng)本公開的化合物包含羥基或羧基取代基時，這些取代基可以形成生理上可水解和可接受的酯類。如本文所用，“生理上可水解和可接受的酯”是指本公開的化合物的酯，它們在生理?xiàng)l件下可水解以產(chǎn)生酸(在具有羥基取代基的本公開的化合物的情況下)或醇(在具有羧基取代基的本公開的化合物的情況下)，其本身在待施用的劑量下在生理學(xué)上是可耐受的。因此，如果本公開的化合物包含羥基，例如化合物-oh，則一方面這類化合物的?；デ八幖椿衔?o-c(o)-c1-4烷基可在體內(nèi)水解形成生理上可水解的醇(化合物-oh)，而另一方面是酸(例如hoc(o)-c1-4烷基)。或者，如果本公開的化合物包含羧酸，例如化合物-c(o)oh，則這類化合物的酸酯前藥化合物-c(o)o-c1-4烷基可以水解形成化合物-c(o)oh和ho-c1-4烷基。正如可以理解的，該術(shù)語由此涵蓋常規(guī)藥物前藥形式。
本公開的化合物包括它們的對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體和外消旋體及其多晶型物、水合物、溶劑合物和復(fù)合物。在本發(fā)明范圍內(nèi)的一些單個化合物可以包含雙鍵。本發(fā)明中雙鍵的表示旨在包括該雙鍵的e和z異構(gòu)體。此外，本發(fā)明范圍內(nèi)的一些化合物可以包含一個或多個不對稱中心。本發(fā)明包括任意的光學(xué)純立體異構(gòu)體以及立體異構(gòu)體的任意組合的用途。
還預(yù)期本公開的化合物涵蓋其穩(wěn)定和不穩(wěn)定的同位素。穩(wěn)定的同位素是與相同種類(即元素)豐富的核素相比包含一個額外的中子的非放射性同位素。預(yù)期包含這類同位素的化合物的活性將被保留，并且這類化合物也可以具有用于測量非同位素類似物的藥代動力學(xué)的用途。例如，可以用氘(非放射性的穩(wěn)定同位素)代替本公開的化合物上某一位置的氫原子。已知的穩(wěn)定同位素的實(shí)例包括、但不限于氘、13c、15n、18o?；蛘撸c相同種類(即元素)的豐富核素相比，包含額外中子的放射性同位素的不穩(wěn)定同位素，例如123i、131i、125i、11c、18f可以替代相應(yīng)的i、c和f的豐富的種類。本發(fā)明化合物的有用同位素的另一個實(shí)例是11c同位素。這些放射性同位素可用于本發(fā)明化合物的放射成像和/或藥代動力學(xué)研究。通常可以通過用同位素標(biāo)記的試劑替代非同位素標(biāo)記的試劑來制備同位素標(biāo)記的式i化合物。
術(shù)語“本公開的化合物”或“本公開的pde2抑制劑”涵蓋本文公開的任意和全部化合物，例如如上文所述的式i化合物或式1.1-1.14任一項(xiàng)的化合物，其為游離或鹽形式。
因此，措詞“治療”應(yīng)當(dāng)被理解為涵蓋治療或改善疾病癥狀以及治療疾病的原因。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療本文公開的疾病或障礙的方法。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防本文公開的疾病或障礙的方法。
對于治療方法，措詞“有效量”旨在涵蓋治療特定疾病或障礙的治療有效量。
術(shù)語“肺性高血壓”旨在涵蓋肺動脈高壓。
術(shù)語“個體”包括人或非人(即動物)。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括人和非人類。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括非人類。在另外的實(shí)施方案中，該術(shù)語包括人。
本公開中使用的術(shù)語“包含”旨在是開放式的，并且不排除附加的未示出的要素或方法步驟。
術(shù)語“認(rèn)知障礙”是指包含認(rèn)知缺陷癥狀的任意障礙(即相對于同一普通年齡人群中的其他個體而言在一個或多個認(rèn)知方面例如記憶、智力、學(xué)習(xí)、邏輯、注意力或執(zhí)行功能(工作記憶)中的次正?；虼蝺?yōu)功能)。因此，認(rèn)知障礙包括、但不限于健忘癥、老年性癡呆、hiv相關(guān)性癡呆、阿爾茨海默病相關(guān)性癡呆、亨廷頓病相關(guān)性癡呆、lewy體癡呆、血管性癡呆、藥物相關(guān)性癡呆、譫妄和輕度認(rèn)知障礙。認(rèn)知障礙也可能是主要但不完全與精神病(精神分裂癥)、情緒障礙、雙相情感障礙、中風(fēng)、額顳癡呆、進(jìn)行性核上性麻痹、腦創(chuàng)傷和藥物濫用、阿斯伯格綜合征和年齡相關(guān)記憶缺陷相關(guān)的障礙。
本公開的化合物，例如上文所述的式i或任何式1.1-1.14的任一項(xiàng)的化合物以游離或藥學(xué)上可接受的鹽形式可以用作唯一治療劑，但也可以組合使用或與另外的活性劑的共同施用。
用于實(shí)施本發(fā)明的劑量當(dāng)然會根據(jù)例如待治療的具體疾病或病癥、所使用的本公開的特定化合物、施用方式和期望的療法的不同而改變。本公開的化合物可以通過任意合適的途徑施用，包括口服、腸胃外、經(jīng)皮或通過吸入，但優(yōu)選口服施用。通常，顯示例如用于治療如上所述疾病令人滿意的結(jié)果是以約0.01至2.0mg/kg的劑量口服施用獲得的。在較大的哺乳動物例如人類中，用于口服施用的指定日劑量由此在約0.75至150mg的范圍內(nèi)，便利地每日1次施用，或以每日2至4次分開劑量施用，或以緩釋形式施用。因此，例如，用于口服施用的單位劑型可以包含約0.2至75或150mg，例如約0.2或2.0至50、75或100mg的本公開的化合物與其藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。
可以使用蓋侖領(lǐng)域已知的常規(guī)稀釋劑或賦形劑和技術(shù)制備包含本公開的化合物的藥物組合物。藥學(xué)上可接受的載體可以包含任意常規(guī)的藥用載體或賦形劑。適合的藥用載體包括惰性稀釋劑或填充劑、水和各種有機(jī)溶劑(例如水合物和溶劑合物)。如果期望，則所述藥物組合物可以包含另外的成分，例如矯味劑、粘合劑、賦形劑等。因此，對于口服施用，包含各種賦形劑、例如檸檬酸的片劑可與各種崩解劑例如淀粉、藻酸和某些復(fù)合硅酸鹽以及粘合劑例如蔗糖、明膠和阿拉伯膠一起使用。此外，潤滑劑例如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉和滑石粉通?？捎糜趬浩康摹Ｏ嗨祁愋偷墓腆w組合物也可用于軟和硬填充的明膠膠囊中。因此，材料的非限制性實(shí)例包括乳糖或奶糖和高分子量聚乙二醇類。當(dāng)期望水性懸浮液或酏劑口服施用時，其中的活性化合物可與各種甜味劑或矯味劑、著色劑或染料合并，且如果期望，則可與乳化劑或助懸劑、稀釋劑例如水、乙醇、丙二醇、甘油或其組合合并。例如，所述藥物組合物可以適合作為片劑、膠囊、丸劑、粉末、緩釋制劑、溶液或懸浮液用于口服施用的形式，作為無菌溶液、懸浮液或乳液用于腸胃外注射的形式，作為軟膏或霜劑用于局部施用的形式或作為栓劑的用于直腸施用的形式。
本公開的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽可以使用本文所述和本文示例的方法并且通過與之類似的方法和化學(xué)領(lǐng)域已知的方法制備。這類方法包括、但不限于下述那些。如果不是商業(yè)上可獲得的，則用于這些方法的原料可以通過使用與已知化合物的合成相似或類似的技術(shù)從化學(xué)領(lǐng)域中選擇的方法制備。本文引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用整體并入本文作為參考。
實(shí)施例1
7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-3-甲基-1-(1-甲基-5-(4-(三氟甲基)苯基)-1h-吡唑-4-基)-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
(a)5-氯-1-甲基-4-硝基-1h-吡唑
在25℃將在thf中的雙(三甲基甲硅烷基)氨基鋰(1.0m，65ml，65mmol)滴加到1-甲基-4-硝基-1h-吡唑(5.50g，43.3mmol)和六氯乙烷(10.54g，44.5mmol)在二氯甲烷(120ml)中的溶液中。將該反應(yīng)混合物在25℃攪拌60min，然后用水(1ml)猝滅。將該混合物蒸發(fā)至干。依次用水(50ml)、飽和nahco3×2(2×30ml)和鹽水(30ml)洗滌殘余物，然后真空干燥，得到6.50g產(chǎn)物(93％收率)。ms(esi)m/z162.0[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)δ8.15(s，1h)，3.92(s，3h)。
(b)5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-胺鹽酸鹽
向5-氯-1-甲基-4-硝基-1h-吡唑(6.50g，40.2mmol)在12nhcl(15ml)和乙醇(15ml)中的混懸液中加入氯化錫(ii)(35.5g，160.9mmol)。將該反應(yīng)混合物在90℃攪拌至反應(yīng)完成。將該反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干。用12nhcl(25ml)處理殘余物，然后在5℃冷卻2h。過濾后，用6nhcl(2x25ml)洗滌濾餅，然后真空干燥，得到6.08g產(chǎn)物(收率：90％)。ms(esi)132.0[m+h]+。1hnmr(500mhz，cd3od)δ7.66(s，1h)，3.89(s，3h)。
(c)5-氯-4-肼基-1-甲基-1h-吡唑鹽酸鹽
在0℃向攪拌的5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-胺鹽酸鹽(6.08g，36.2mmol)在hcl(12n，35ml)中的溶液中加入nano2水溶液(5.50g，80.0mmol)。將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌45min，然后加入氯化錫(ii)(22.8g，120mmol)。添加完成后，將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌30min，然后在室溫攪拌過夜。用冰浴將得到的混合物冷卻2h，然后過濾。用hcl(12n，20ml)洗滌濾餅，然后真空干燥，得到7.77g粗產(chǎn)物(收率：98％)，不經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步反應(yīng)。ms(esi)m/z147.0[m+h]+。
(d)5-溴-4-氯-6-(1-乙氧基乙烯基)嘧啶
用氬氣給5-溴-4，6-二氯嘧啶(5.00g，21.9mmol)和三丁基(1-乙氧基乙烯基)錫烷(7.92g，21.9mmol)在dmf(20ml)中的混懸液脫氣，然后加入四(三苯膦)鈀(0)(1.27mg，1.10mmol)。再給該混懸液脫氣，然后在110℃在氬氣氣氛中加熱8h。減壓除去溶劑后，通過硅膠柱色譜法純化殘余物，用0-40％在己烷中的乙酸乙酯梯度洗脫，歷時30min，得到2.72g產(chǎn)物(收率：47％)。ms(esi)m/z263.0[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)δ8.85(s，1h)，4.71(d，j＝3.1hz，1h)，4.60(d，j＝3.1hz，1h)，3.98(q，j＝7.0hz，2h)，2.67(s，0h)，1.42(t，j＝7.0hz，3h)。
(e)5-溴-4-氯-6-(1-(2-(5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-基)腙基)乙基)嘧啶
將5-溴-4-氯-6-(1-乙氧基乙烯基)嘧啶(1.60g，6.07mmol)和5-氯-4-肼基-1-甲基-1h-吡唑鹽酸鹽(3.11g，12.1mmol)在乙酸(32ml)中的混懸液在60℃攪拌6h。減壓除去溶劑后，用飽和nahco3(40ml)處理殘余物，然后用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。用鹽水(70ml)洗滌合并的有機(jī)相，然后蒸發(fā)至干。真空干燥殘余物，得到1.0g粗產(chǎn)物(收率：45％)，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步。ms(esi)m/z362.9[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)δ8.79(s，1h)，7.66(s，1h)，7.05(s，1h)，3.83(s，3h)，2.32(s，3h)。
(f)7-氯-1-(5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
將5-溴-4-氯-6-(1-(2-(5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-基)腙基)乙基)嘧啶(334mg，0.92mmol)、1，10-菲咯啉(497mg，2.76mmol)和k2co3(127mg，0.92mmol)在甲苯(4ml)中的混合物在密封試管中在100℃加熱1.5h。冷卻至室溫后，用甲苯(3ml)稀釋該反應(yīng)混合物，然后過濾。用甲苯將固體洗滌2次(2×3ml)。用飽和feso4·7h2o洗滌合并的濾液3次(3×4ml)，然后蒸發(fā)至干。再真空干燥得到的殘余物，得到147mg粗產(chǎn)物(收率：57％)，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步。ms(esi)m/z283.0[m+h]+。
(g)7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-1-(5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
將7-氯-1-(5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶(147mg，0.52mmol)、氮雜環(huán)丁烷鹽酸鹽(64mg，0.68mmol)和et3n(105mg，1.04mmol)在甲苯(1.5ml)中的混合物在密封試管中在室溫加熱至反應(yīng)完成。將該混合物傾入2nnaoh(18ml)，然后用ch2cl2萃取3次(3×25ml)。用鹽水(20ml)洗滌合并的有機(jī)相，然后蒸發(fā)至干。再真空干燥得到的殘余物，得到181g粗產(chǎn)物，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步。ms(esi)304.1[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)δ8.51(s，1h)，7.66(s，1h)，3.95(s，3h)，3.87(t，j＝7.8hz，4h)，2.61(s，3h)，2.33-2.25(m，2h)。
(h)7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-3-甲基-1-(1-甲基-5-(4-(三氟甲基)苯基)-1h-吡唑-4-基)-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
將7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-1-(5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶(58mg，0.19mmol)、4-(三氟甲基)-苯基硼酸(51mg，0.27mmol)和磷酸三鉀(92mg，0.43mm0l)在乙醇(0.70ml)和水(0.080ml)中的混懸液在70℃在氬氣氣氛中加熱10min，然后加入四(三苯膦)鈀(0)(19mg，0.017mmol)。再次給該混懸液脫氣，然后在微波中在130℃加熱2h。再加入四(三苯膦)鈀(0)(9mg，0.0079mmol)。將該混合物在微波中在140℃加熱7h。除去溶劑后，用半-制備型hplc、應(yīng)用0-33％在包含0.1％甲酸的水中的乙腈梯度純化殘余物，歷時16min，得到12mg終產(chǎn)物，為黃白色固體(hplc純度：98％；收率：15％)。ms(esi)m/z414.2[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)δ8.43(s，1h)，7.71(s，1h)，7.63(d，j＝8.1hz，2h)，7.50(d，j＝8.1hz，2h)，3.96(s，3h)，3.81(t，j＝7.8hz，4h)，2.59(s，3h)，2.32-2.21(m，2h)。
實(shí)施例2
7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-1-(5-(4-甲氧基-2-甲基苯基)-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
按照與實(shí)施例1合成中所述方法類似的方式制備標(biāo)題化合物，其中在最終的步驟中分別加入4-甲氧基-2-甲基苯基硼酸和k2co3，而不是4-(三氟甲基)苯基硼酸和k3po4。得到終產(chǎn)物，為黃白色固體(hplc純度：99％；收率：32％)。ms(esi)m/z390.2[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)δ8.37(s，1h)，7.77(s，1h)，7.06(d，j＝8.4hz，1h)，6.68(d，j＝2.5hz，1h)，6.64(dd，j＝8.5，2.6hz，1h)，4.04-3.82(m，4h)，3.74(s，3h)，3.71(s，3h)，2.55(s，3h)，2.35-2.26(m，2h)，2.08(s，3h)。
實(shí)施例3
7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-1-(5-(4-環(huán)丙基苯基)-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
按照與實(shí)施例1合成中所述方法類似的方式制備標(biāo)題化合物，其中在最終的步驟中分別加入環(huán)丙基苯基-硼酸和na2co3，而不是4-(三氟甲基)苯基硼酸和k3po4。ms(esi)m/z386.2[m+h]+。
實(shí)施例4
7-(氮雜環(huán)丁烷-1-基)-1-(5-(4-乙基苯基)-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
按照與實(shí)施例1合成中所述方法類似的方式制備標(biāo)題化合物，其中在最終的步驟中分別加入4-乙基苯基-硼酸和cs2co3，而不是4-(三氟甲基)苯基硼酸和k3po4。ms(esi)m/z374.2[m+h]+。
實(shí)施例5
體外pde2抑制的測定
r-hpde2a(登記號nm_002599，人類磷酸二酯酶2a，cgmp-刺激的，轉(zhuǎn)錄變體1)具有該基因的重組cdna拷貝的哺乳動物表達(dá)克隆載體購自origene。通過瞬時轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)。在轉(zhuǎn)染后48小時收獲細(xì)胞，用tbs緩沖液(50mmtris-hcl，ph7.5，150mmnacl)洗滌1次，然后通過在冷勻化緩沖液(50mmtris-hcl，ph7.5，5mmmgcl2，1x蛋白酶抑制劑混合物)中超聲處理裂解。將勻化物在4℃下以15,000g離心30min以獲得可溶性細(xì)胞溶質(zhì)級分。使用以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品的bca蛋白測定試劑盒(pierce)測定胞質(zhì)溶膠的蛋白質(zhì)濃度。
測定：以fl-camp作為底物測定pde2a。首先進(jìn)行酶滴定以確定pde的工作濃度。在不存在抑制劑的情況下，提供活性為100δmp的酶的濃度被認(rèn)為是針對pde適合的工作濃度。
根據(jù)滴定曲線，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液(10mmtris-hclph7.2，10mmmgcl2，0.1％bsa，0.05％nan3)中稀釋pde酶。對于pde2測定，給反應(yīng)緩沖液補(bǔ)充1μmcgmp以完全活化酶。將99μl稀釋的酶溶液加入到平底96-孔聚苯乙烯板中的每個孔中，且然后加入溶解在100％dmso中的1μl測試化合物?；旌匣衔锊⑶以谑覝叵屡c酶一起預(yù)溫育10min。
fl-cnmp轉(zhuǎn)化反應(yīng)通過加入底物(終濃度為45nm)引發(fā)。將酶和抑制劑混合物(16μl)和底物溶液(4μl，0.225μm)在384-孔微量滴定板中合并。將該反應(yīng)體系在室溫下在黑暗中溫育15min。通過在384-孔板的每個孔中加入60μl結(jié)合試劑(在補(bǔ)充有1∶1800稀釋消泡劑的結(jié)合緩沖液的結(jié)合緩沖液中按1∶400稀釋的imap珠粒)停止反應(yīng)。將板在室溫下溫育1小時以使imap結(jié)合進(jìn)行完成，且然后置于envision多模式微量培養(yǎng)板讀出器(perkinelmer，shelton，ct)中以測量熒光偏振(δmp)。
測量為減少的δmp的camp濃度的降低指示pde活性的抑制。通過在0.00037nm至80,000nm的范圍內(nèi)的8至16個化合物濃度的存在下測量酶活性，且然后繪制藥物濃度對δmp的關(guān)系的示意圖來測定ic50值。將測試孔值歸一化以控制在相同板上運(yùn)行的反應(yīng)(轉(zhuǎn)化成％對照的值)。使用非線性回歸軟件估計ic50值，擬合四參數(shù)單-點(diǎn)劑量響應(yīng)模型(xlfit；idbs，cambridge，ma)。曲線下部固定為對照的0％。
質(zhì)量控制：為了確定抑制劑的ic50，選擇給出100-200毫偏振單位的最佳信號范圍的酶濃度。測量每個樣品孔的總熒光強(qiáng)度以計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。如果任何樣品孔的總熒光強(qiáng)度不在平均值±3sd的范圍內(nèi)，則棄去該特定孔的mp值。
使用上述或類似于上述描述的imap方法，我們篩選了專有的以pde為重點(diǎn)的化合物文庫，以鑒定具有納摩爾pde2抑制活性的新化合物。測試本公開的示例性化合物(例如實(shí)施例1-4的化合物)并證實(shí)它們在納摩爾濃度下是有活性的，例如如下：實(shí)施例1：ic5023.1nm；實(shí)施例2：ic5092nm；實(shí)施例3：ic509.5nm；實(shí)施例4，ic5018.5nm。此外，化合物對pde2具有選擇性；測試實(shí)施例4的化合物，并證實(shí)對pde2的選擇性超過對pde1、pde3、pde4d、pde5、pde6、pde7b、pde8a、pde9a、pde10a和pde11a20倍。
實(shí)施例6
小鼠中的藥代動力學(xué)研究
給予小鼠單一口服劑量的待測化合物(10mg/kg，po)，并使用hplc和lc-ms、應(yīng)用與zhao等人，j.chromatogr.b.analyt.technol.biomed.lifesci.(2005)819(1)：73-80和appels，n.m.等人，rapidcommun.massspec.2005.19(15)：p.2187-92中所述類似的方法測量血漿和腦的利用度(0.25-4h)。本實(shí)驗(yàn)表明實(shí)施例1化合物具有良好的腦部進(jìn)入，如圖1所示。
實(shí)施例7
在目標(biāo)認(rèn)知任務(wù)中使用pde2抑制劑治療對wistar大鼠記憶性能的作用
在認(rèn)知的動物模型即目標(biāo)認(rèn)知任務(wù)中測試實(shí)施例1的化合物的記憶增強(qiáng)作用。參見ennaceur，a.，delacour，j.，1988.anewone-trialtestforneurobiologicalstudiesofmemoryinrats.1：behavioraldata.behav.brainres.31，47-59。在一個小時之后測試它們時，大鼠記得在以前的試驗(yàn)中探索的目標(biāo)。然而，當(dāng)使用24小時的試驗(yàn)間隔時，它們不能記住在第一次試驗(yàn)中哪個目標(biāo)被呈現(xiàn)給它們。測試實(shí)施例1的化合物在第一次試驗(yàn)前2小時給予時是否會減弱這種時間誘發(fā)的目標(biāo)記憶缺陷。將所述化合物給予2-3個月齡的雄性wistar大鼠。
在學(xué)習(xí)前2小時，以0、0.3、1、3和10mg/kg的劑量通過口腔注射實(shí)施例1的化合物(2ml/kg)。沒有一個測試劑量對探索行為有影響。本研究表明實(shí)施例1的化合物能夠以1.0mg/kg的劑量完全阻止時間依賴性遺忘。對于0.3和3.0mg/kg，發(fā)現(xiàn)中等的記憶改善。
實(shí)施例8
新型pde2抑制劑對海馬細(xì)胞和腦中cgmp信號傳導(dǎo)的影響
我們提出，ht-22細(xì)胞(從其親代ht-4細(xì)胞亞克隆的無限增殖化小鼠海馬-神經(jīng)元前體細(xì)胞)是理解與海馬依賴性情緒變化相關(guān)的細(xì)胞和分子過程的有價值的模型。我們預(yù)期在基于細(xì)胞的測定中目標(biāo)1將產(chǎn)生10-20種新型pde2抑制劑用于功能評估。僅在基于細(xì)胞的ht-22細(xì)胞測定中誘導(dǎo)cgmp蓄積顯著性增加的化合物將進(jìn)入行為評估?；诩?xì)胞的測定數(shù)據(jù)將是對具有潛在用于cns適應(yīng)征的任意pde2抑制劑的最低要求，并將為行為測試的劑量選擇提供指導(dǎo)。