相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2014年11月26日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/084,754的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，所述美國臨時專利申請的整個公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及脂肪酸半胱胺綴合物、包含脂肪酸半胱胺綴合物的組合物和使用所述綴合物和組合物來治療疾病諸如由自噬調(diào)節(jié)異常引起的疾病的方法。

背景

自噬是一種用以實(shí)質(zhì)上自我消化一些細(xì)胞組分的在進(jìn)化上保守的溶酶體降解途徑(參見levine和kroemer(2008)cell,132,第27-42頁)。這個自我消化過程幫助細(xì)胞移除外來或受損細(xì)胞器、缺陷性或錯誤折疊蛋白質(zhì)以及甚至侵襲性微生物。已推測在許多疾病例如囊性纖維化中，自噬被下調(diào)(luciani等(2011)autophagy,7,第104-106頁)。

囊性纖維化(cf)已被描述為一種在白種人群體中最常見的使壽命縮短的常染色體隱性遺傳性疾病。它是一種在美國影響約30,000名兒童和成人(全世界70,000名)的罕見疾??；并且每年有約1,000例新病例被診斷。所述疾病的特征在于囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子(cftr)中具有突變，此導(dǎo)致由肺、胰腺、肝和腸中各種分泌和吸收上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)氯離子的能力喪失或受損(參見例如derichs(2013)eur.resp.rev,22,第58-65頁)。所引起的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)降低和流體體內(nèi)平衡失調(diào)在肺中產(chǎn)生稠密和粘稠粘液，粘液可阻塞氣道，從而導(dǎo)致慢性炎癥和感染。這導(dǎo)致進(jìn)行性肺功能衰退以及患有更重度形式的所述疾病的患者的預(yù)期壽命受限。

cftr是一種camp活化的atp門控離子通道，由約1,480個氨基酸組成。所述蛋白質(zhì)由5個結(jié)構(gòu)域組成：兩個跨膜結(jié)構(gòu)域，各自含有6次跨越的α螺旋。各跨膜結(jié)構(gòu)域連接于核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(nbd)。第一nbd通過調(diào)節(jié)性“r”結(jié)構(gòu)域連接于第二跨膜結(jié)構(gòu)域。編碼cftr的基因在1989年被報道(參見rommens等(1989)science,245,第1059-1065頁)。從那時起，已鑒定cftr基因的超過1900種序列變化形式，其中大多數(shù)屬于以下6個類別中的一個：i類突變由使cftr的量降低的無義和框移突變所致；ii類突變具有導(dǎo)致過早降解的折疊缺陷；iii類突變導(dǎo)致通道門控受限；iv類突變具有傳導(dǎo)缺陷；v類突變具有導(dǎo)致所產(chǎn)生的cftr的量降低的轉(zhuǎn)錄缺陷；vi類突變具有在通道表面處的cftr高周轉(zhuǎn)(參見例如rowntree和harris(2003)ann.hum.genet.,67,第471-485頁；zielenski(2000)respiration,67,第117-133頁；以及macdonald等(2007)paediatricdrugs,9,第1-10頁)。

為顯現(xiàn)致衰弱性cf疾病，個體遺傳得到兩個缺陷性cftr等位基因，單個等位基因來自各親代。在cftr的已被鑒定的超過1900種序列變化形式之中，以下4種突變各自具有約1-3％的全世界普遍率：g551d、w1282x、g542x和n1303k。具有在全世界約90％的等位基因頻率的最普遍的cftr突變是δf508突變(ii類突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤折疊和過早降解的苯丙氨酸缺失)。δf508缺失突變可以純合或雜合形式顯現(xiàn)。

關(guān)于治療干預(yù)的研究已鑒定適用于控制cf的某些致衰弱性癥狀的若干消炎和抗感染療法(參見例如nichols等(2008)clinicrev.allerg.immunol.,35,第135-153頁)。更新近地，已引入疾病改進(jìn)療法來處理缺陷性cftr。cftr“增效劑”被設(shè)計以增加在膜處可用但具有門控(iii類)和傳導(dǎo)(iv類)突變的cftr通道的開放概率。依伐卡托(ivacaftor)(vx-770)是一種受到fda核準(zhǔn)用于治療具有包括g551d、g178r、s549n、s549r、g551s、g124e、s1251n、s1255p和g1349d的門控突變的cf患者的cftr增效劑(參見例如vangoor等(2009)pnas,106,第18825-18830頁)。然而，具有這些門控突變的患者僅占全世界cf患者的較小百分比。

除cftr增效劑之外，已報道評估cftr“校正劑”增加可向細(xì)胞膜遞送的cftr的量的潛力的臨床開發(fā)。vx-809(魯瑪卡托(lumacaftor))是一種新近已由fda核準(zhǔn)，當(dāng)與依伐卡托組合使用時，在具有純合δf508突變的cf患者中使用的cftr校正劑(參見例如vangoor等(2011)pnas,108,第18843-18848頁；以及ren等(2013)mol.biol.cell,24,第3016-3024頁)。

盡管迄今為止作出各種努力，但仍然對用于治療與自噬調(diào)節(jié)異常相關(guān)的病癥(例如cf，并且特別是難以使用現(xiàn)有療法治療的與突變相關(guān)的某些形式的cf)的另外的組合物和方法存在持續(xù)需要。

概述

本發(fā)明提供用于活化自噬和治療與自噬調(diào)節(jié)異常相關(guān)的各種醫(yī)學(xué)疾病的方法和組合物，所述疾病特別是其中自噬的水平相對于不患有病癥的受試者被降低的病癥。本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)脂肪酸半胱胺綴合物適用于活化自噬，并且脂肪酸半胱胺綴合物可用于治療多種人疾病諸如cf。本文所述的脂肪酸半胱胺綴合物具有不能通過單獨(dú)施用半胱胺或脂肪酸或施用個別組分的組合來實(shí)現(xiàn)的治療作用。半胱胺和脂肪酸例如ω-3脂肪酸的共價連接允許向細(xì)胞內(nèi)位置同時遞送兩種組分，據(jù)此個別組分通過裂解(例如酶促裂解)而在所述位置處并且在相同時間得以釋放。

本發(fā)明的一個益處是相比于可通過個別施用組分來實(shí)現(xiàn)的自噬活化水平，施用脂肪酸半胱胺綴合物導(dǎo)致所述水平更高。此外，相比于單獨(dú)或與未綴合脂肪酸組合施用的半胱胺，施用脂肪酸半胱胺綴合物可在低得多的濃度下導(dǎo)致協(xié)同性炎癥減輕。因此，脂肪酸半胱胺綴合物提供不能通過分開施用被綴合以產(chǎn)生脂肪酸半胱胺綴合物的個別組分(單獨(dú)或共同施用)來實(shí)現(xiàn)的多個益處。

本文使用通用化學(xué)式和特定化學(xué)式描述示例性脂肪酸半胱胺綴合物。舉例來說，本發(fā)明提供一族由式i包括的脂肪酸半胱胺綴合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中變量如以下詳細(xì)描述中所定義。

類似地，本發(fā)明提供一族由式ia包括的脂肪酸半胱胺綴合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中變量如以下詳細(xì)描述中所定義。

類似地，本發(fā)明提供一族由式ib包括的脂肪酸半胱胺綴合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中變量如以下詳細(xì)描述中所定義。

類似地，本發(fā)明提供一族由式iii包括的脂肪酸半胱胺綴合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中變量如以下詳細(xì)描述中所定義。

類似地，本發(fā)明提供一族由式iv包括的脂肪酸半胱胺綴合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其中變量如以下詳細(xì)描述中所定義。

另外的通式和特定脂肪酸胱胺綴合物描述于詳細(xì)描述和實(shí)施例中。

本發(fā)明的另一方面提供一種治療本文所述的疾病的方法，所述疾病諸如cf、特發(fā)性肺纖維化(ipf)、神經(jīng)變性疾病、炎性疾病、肝病、肌肉疾病、感染、線粒體疾病或免疫疾病。方法包括向有此需要的受試者施用治療有效量的本文所述的脂肪酸半胱胺綴合物諸如式i化合物以治療疾病。示例性神經(jīng)變性疾病包括亨廷頓氏病(huntington’sdisease)、帕金森氏病(parkinson’sdisease)、阿爾茨海默氏病(alzheimer’sdisease)和傳染性海綿狀腦病變。在某些實(shí)施方案中，待治療的疾病是cf。在某些實(shí)施方案中，待治療的疾病是ipf。

本發(fā)明的另一方面提供一種在受試者中活化自噬的方法。方法包括向有此需要的受試者施用有效量的本文所述的脂肪酸半胱胺綴合物諸如式i、式i-a、式i-b、式ii、式iii或式iv化合物以在所述受試者中活化自噬。在某些實(shí)施方案中，受試者罹患cf、神經(jīng)變性疾病或炎性疾病。

提供包含脂肪酸半胱胺綴合物(例如式i、式i-a、式i-b、式ii、式iii、式iv綴合物)和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。組合物適用于通過活化自噬來治療疾病。

以下更詳細(xì)描述本發(fā)明的各個方面和實(shí)施方案。盡管與本文所述的那些方法和材料類似或等效的方法和材料可用于實(shí)施或測試本發(fā)明，但現(xiàn)時描述說明性方法和材料。本發(fā)明的其它特征、目標(biāo)和優(yōu)勢將根據(jù)描述和權(quán)利要求而顯而易知。在說明書和隨附權(quán)利要求中，除非上下文另外明確規(guī)定，否則單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)形式。

附圖簡述

圖1a是當(dāng)用化合物ii-2處理時，huh-7細(xì)胞的免疫印跡。圖1b是顯示當(dāng)用化合物ii-2在25μm的濃度下處理huh-7細(xì)胞時，lc3-ii/lc3-i的比率的柱狀圖。

圖2a是在暴露于胱胺、二十碳五烯酸(“epa”)、胱胺和epa的組合、或化合物ii-22小時之后，huh-7細(xì)胞的免疫印跡。圖2b是顯示當(dāng)用胱胺、epa、胱胺和epa的組合、或化合物ii-2處理huh-7細(xì)胞時，lc3-ii/lc3-i的比率的柱狀圖。圖2c是顯示當(dāng)使ht-29細(xì)胞與媒介物或化合物ii-3一起孵育24小時時，根據(jù)lc3-ii/lc3-i的比率得出的自噬增加的柱狀圖。圖2d是顯示當(dāng)使ht-29細(xì)胞與媒介物或化合物ii-3一起孵育24小時時，相應(yīng)細(xì)胞表面cftr增加的柱狀圖。圖2e是顯示當(dāng)使ht-29細(xì)胞與媒介物、iv-1或iv-1一起孵育24小時時，相應(yīng)細(xì)胞表面cftr增加的柱狀圖。

圖3a是免疫印跡，并且圖3b是顯示當(dāng)用胱胺(250μm)、epa(250μm)、胱胺和epa(各自250μm)的組合或化合物ii-2(50μm)處理huh-7細(xì)胞時，lc3-ii/lc3-i的比率的柱狀圖。

圖4是顯示當(dāng)用：(1)媒介物對照組；(2)化合物ii-3(25μm)；(3)胱胺(25μm)；(4)dha(25μm)；(5)胱胺(25μm)和dha的組合；(6)胱胺(250μm)；(7)dha(250μm)；和(8)胱胺(250μm)和dha(250μm)的組合處理ht-29細(xì)胞24小時時，lc3-ii/lc3-i的比率的柱狀圖。

圖5a是顯示在與：1)媒介物+vx-770(100nm)；2)vx-809(3μm)+vx-770(100nm)的組合；3)化合物ii-3(25μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)的組合；4)化合物ii-3(10μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)的組合一起孵育24小時之后，原代cf細(xì)胞(δf508純合性)的cftr條帶c數(shù)據(jù)的柱狀圖。

圖5b是顯示在與(1)媒介物+vx-770(100nm)；(2)vx-809(3μm)+vx-770(100nm)的組合；(3)化合物i-1(25μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)的組合；和(4)化合物i-1(10μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)的組合一起孵育24小時之后，原代cf細(xì)胞(δf508純合性)的cftr條帶c數(shù)據(jù)的柱狀圖。

圖5c是顯示當(dāng)原代cf細(xì)胞(純合δf508)在與：(1)媒介物對照組；(2)胱胺(25μm)；(3)dha(25μm)；(4)胱胺(25μm)和dha(25μm)的組合；(5)胱胺(250μm)；(6)dha(250μm)；(7)胱胺(250μm)和dha(250μm)的組合；和(8)化合物ii-3(25μm)一起孵育24小時之后時，lc3-ii/lc3-i的比率的柱狀圖。

圖5d是顯示當(dāng)原代cf細(xì)胞(純合δf508)在與：(1)媒介物對照組；(2)胱胺(25μm)；(3)dha(25μm)；(4)胱胺(25μm)和dha(25μm)的組合；(5)胱胺(250μm)；(6)dha(250μm)；(7)胱胺(250μm)和dha(250μm)的組合；和(8)化合物i-1(25μm)一起孵育24小時之后時，cftr條帶c/肌動蛋白的比率的柱狀圖。

圖5e是顯示當(dāng)用：(1)媒介物+vx-770(100nm)；(2)化合物ii-3(25μm)+vx-770(100nm)；(3)vx-809(3μm)+vx-770(100nm)；和(4)化合物ii-3(25μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)處理原代cf細(xì)胞(純合δf508)時，lc3-ii/lc3-i的比率的柱狀圖。

圖5f是顯示當(dāng)用：(1)媒介物+vx-770(100nm)；(2)化合物ii-3(25μm)+vx-770(100nm)；(3)vx-809(3μm)+vx-770(100nm)；和(4)化合物ii-3(25μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)處理原代cf細(xì)胞(純合δf508)時，自噬蛋白-1/肌動蛋白的比率的柱狀圖。

圖5g是顯示當(dāng)用：(1)媒介物+vx-770(100nm)；(2)化合物ii-3(25μm)+vx-770(100nm)；(3)vx-809(3μm)+vx-770(100nm)；和(4)化合物ii-3(25μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)處理原代cf細(xì)胞(純合δf508)時，p62/肌動蛋白的比率的柱狀圖。

圖5h是顯示當(dāng)用：(1)媒介物+vx-770(100nm)；(2)化合物ii-3(25μm)+vx-770(100nm)；(3)vx-809(3μm)+vx-770(100nm)；和(4)化合物ii-3(25μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)處理原代cf細(xì)胞(純合δf508)時，cftr條帶c數(shù)據(jù)的柱狀圖。

圖6是顯示當(dāng)用10μm化合物ii-2處理細(xì)胞4小時(用3μmvx-809作為陽性對照)時，fisher大鼠甲狀腺(frt)/δf508cftr上皮響應(yīng)的圖。

圖7a是顯示當(dāng)用：(1)媒介物+vx-770(100nm)；(2)化合物ii-3(10μm)+vx-770(100nm)；(3)陽性對照組，vx-809(3μm)+vx-770(100nm)；和(4)化合物ii-3(10μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)處理frt細(xì)胞24小時時產(chǎn)生的短路電流(iisc)跡線的圖。在尤斯室(ussingchamber)測定中產(chǎn)生短路電流。

圖7b是顯示對圖7a中所示的跡線的在添加毛喉素(forskolin)后的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)的定量的柱狀圖，如通過δisc(μa/cm²)所測量；圖7c是顯示對圖7a中所示的跡線的在添加毛喉素后的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)的定量的柱狀圖，表示為對照％；

圖7d是顯示對圖7a中所示的跡線的在添加cftrinh-172后的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)的定量的柱狀圖，如通過δisc(μa/cm²)所測量；

圖7e是顯示對圖7a中所示的跡線的在添加cftrinh-172后的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)的定量的柱狀圖，表示為對照％。

圖8a是顯示當(dāng)使原代cf細(xì)胞(純合δf508)與：(1)媒介物+vx-770(100nm)；(2)陽性對照組，vx-809(3μm)+vx-770(100nm)；和(3)化合物ii-3(1μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)一起孵育24小時時產(chǎn)生的短路電流(iisc)跡線的圖。在尤斯室測定中產(chǎn)生短路電流。

圖8b是顯示對圖8a中所示的跡線的在毛喉素添加后的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)的定量的柱狀圖，如通過δisc(μa/cm²)所測量；并且

圖8c是顯示對圖8a中所示的跡線的總響應(yīng)的定量的柱狀圖，如通過曲線下面積(auc)所測量，表示為對照％。

圖9a是顯示當(dāng)使原代cf細(xì)胞(純合δf508)與：(1)媒介物+vx-770(100nm)；(2)陽性對照組，vx-809(3μm)+vx-770(100nm)；(3)化合物i-1(1μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)一起孵育24小時時產(chǎn)生的短路電流(iisc)跡線的圖。在尤斯室測定中產(chǎn)生短路電流。

圖9b是顯示對圖9a中所示的跡線的在毛喉素添加后的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)的定量的柱狀圖，如通過δisc(μa/cm²)所測量；圖9c是顯示對圖9a中所示的跡線的總響應(yīng)的定量的柱狀圖，如通過曲線下面積(auc)所測量，表示為對照％。

圖10是顯示當(dāng)在用銅綠假單胞菌(pseudomonaaeruginosa)感染之前用化合物ii-3(25μm)預(yù)處理人支氣管上皮細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌水平(以菌落形成單位(“cfu”)/ml計)降低的柱狀圖。陽性對照是細(xì)胞內(nèi)抗生素細(xì)胞松弛素-d(cytochalasin-d)。

圖11a是顯示在0、0.5、1和2小時之后，大鼠或小鼠血漿中在孵育之后剩余的母體化合物ii-2％的柱狀圖；圖11b是顯示在0、0.5、1和2小時之后，大鼠或小鼠血漿中在孵育之后剩余的母體化合物ii-3％的柱狀圖。

圖12是顯示當(dāng)用化合物ii-3治療天然balb/c小鼠3.5天(100mg/kg，每日兩次，口服)時，肺組織中自噬活化水平(增加22％)的柱狀圖。

圖13a是顯示當(dāng)在pbs或tgfβ刺激下用化合物ii-3(25μm)或i-1(25μm)處理正常人肺纖維母細(xì)胞(nlf)或特發(fā)性肺纖維化細(xì)胞(ll29和ll79a)時，膠原蛋白1a1(col1a1)的mrna水平的柱狀圖；圖13b是顯示當(dāng)在pbs或tgfβ刺激下用化合物ii-3(25μm)或i-1(25μm)處理正常人肺纖維母細(xì)胞(nlf)或特發(fā)性肺纖維化細(xì)胞(ll29和ll79a)時，纖維結(jié)合蛋白1(fibronectin1，fn1)的mrna水平的柱狀圖；并且圖13c是顯示當(dāng)在pbs或tgfβ刺激下用化合物ii-3(25μm)或i-1(25μm)處理正常人肺纖維母細(xì)胞(nlf)或特發(fā)性肺纖維化細(xì)胞(ll29和ll79a)時，timp-2的mrna水平的柱狀圖。

圖14a是顯示當(dāng)用媒介物或化合物ii-3(25μm)處理nlf、ll29或ll97a細(xì)胞時，timp-2的基礎(chǔ)水平(pbs處理)的柱狀圖；并且圖14b是顯示當(dāng)在tgfβ刺激下用媒介物或化合物ii-3(25μm)處理nlf、ll29或ll97a細(xì)胞時，timp-2的水平的柱狀圖。

圖15a是顯示當(dāng)用媒介物或化合物ii-3(25μm)處理nlf、ll29或ll97a細(xì)胞時，mmp-2的基礎(chǔ)水平(pbs處理)的柱狀圖；并且圖15b是顯示當(dāng)在tgfβ刺激下用媒介物或化合物ii-3(25μm)處理nlf、ll29或ll97a細(xì)胞時，mmp-2的水平的柱狀圖。

圖16a是顯示當(dāng)用媒介物或化合物ii-3(25μm)處理thp-1細(xì)胞時，tnf-αmrna水平的柱狀圖；圖16b是顯示當(dāng)用媒介物或化合物ii-3(25μm)處理thp-1細(xì)胞時，il-1βmrna水平的柱狀圖；并且圖16c是顯示當(dāng)用媒介物或化合物ii-3(25μm)處理thp-1細(xì)胞時，ccl2mrna水平的柱狀圖。

圖17是顯示當(dāng)用媒介物或各自25μm的化合物ii-2和ii-3處理原代cf細(xì)胞時，cftr條帶c/肌動蛋白的比率的柱狀圖。

詳述

本發(fā)明提供用于活化自噬和治療各種醫(yī)學(xué)疾病的方法和組合物，所述疾病特別是與自噬調(diào)節(jié)異常相關(guān)的疾病。本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)脂肪酸半胱胺綴合物適用于活化自噬，并且可用于治療或預(yù)防多種人疾病例如cf。本文所述的脂肪酸半胱胺綴合物具有不能通過單獨(dú)施用半胱胺或脂肪酸或以個別組分的組合形式進(jìn)行施用來實(shí)現(xiàn)的治療作用。半胱胺和ω-3脂肪酸的共價連接允許向某一位置同時遞送兩種組分，據(jù)此個別組分通過裂解(例如酶促裂解)而在所述位置處并且在相同時間得以釋放。本發(fā)明的益處是相比于可通過個別施用組分來實(shí)現(xiàn)的自噬活化水平，施用脂肪酸半胱胺綴合物導(dǎo)致所述水平更高。此外，相比于單獨(dú)或與未綴合脂肪酸組合施用的半胱胺，施用脂肪酸半胱胺綴合物可在低得多的濃度下導(dǎo)致協(xié)同性炎癥減輕。因此，脂肪酸半胱胺綴合物提供不能通過分開施用被綴合以產(chǎn)生脂肪酸半胱胺綴合物的個別組分(單獨(dú)或共同施用)來實(shí)現(xiàn)的多個益處。預(yù)期本文所述的脂肪酸半胱胺綴合物和治療方法在治療cf方面具有特定優(yōu)勢。

cf是一種在美國影響大約30,000名患者的罕見疾病。它是一種與導(dǎo)致缺陷性cftr(即跨越上皮細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)氯離子的離子通道)的遺傳突變相關(guān)的致衰弱性疾病。已顯示cf患者具有缺陷性和降低的自噬水平，所述自噬是一種有助于細(xì)胞移除外來或受損細(xì)胞器、缺陷性或錯誤折疊蛋白質(zhì)以及甚至侵襲性微生物的在進(jìn)化上保守的溶酶體降解途徑。已顯示使自噬活化潛在適用于使缺陷性cftr恢復(fù)功能。

預(yù)期使自噬活化也適用于治療除cf以外的多種疾病，例如與細(xì)胞、組織、細(xì)胞器、器官中的自噬降低相關(guān)的疾病。所述疾病包括例如特發(fā)性肺纖維化(ipf)、肺高血壓(ph)、神經(jīng)變性疾病、肝病、肌肉疾病、心臟疾病、代謝疾病、感染、免疫和炎性疾病。肺高血壓包括肺動脈高血壓(whoi組，特發(fā)性、可遺傳和藥物/毒素誘發(fā)的ph)、歸因于收縮或舒張功能異常瓣膜性心臟病的肺高血壓(whoii組)和其它類別(包括來自whoiii-v組的那些)的肺高血壓。肝病包括非酒精性脂肪肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、nash肝硬化和肝細(xì)胞癌(hcc)?？捎弥舅岚腚装肪Y合物治療的代謝疾病的實(shí)例包括通常在cf患者之中觀察到的2型糖尿病。神經(jīng)變性疾病包括亨廷頓氏病、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病和傳染性海綿狀腦病變。自噬恢復(fù)療法也可適用于諸如維西綜合征(vicisyndrome)、肌肉減少癥和肌營養(yǎng)不良的疾病。存在多種形式的肌營養(yǎng)不良，并且這些形式包括最常見的杜興肌營養(yǎng)不良(duchennemusculardystrophy)。其它形式的肌營養(yǎng)不良包括貝克爾肌營養(yǎng)不良、肢帶肌營養(yǎng)不良、先天性肌營養(yǎng)不良、面肩胛肱型肌營養(yǎng)不良、肌強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、眼咽性肌營養(yǎng)不良、遠(yuǎn)端性肌營養(yǎng)不良和艾梅-德萊富斯(emery-dreifuss)肌營養(yǎng)不良。具有缺陷性自噬的其它疾病包括年齡相關(guān)的黃斑變性、danon病、x連鎖性肌病變、嬰兒自噬空泡肌病變、成人發(fā)作型空泡肌病變、蓬佩病(pompedisease)、偶發(fā)性包涵體肌炎、2b型肢帶肌營養(yǎng)不良和三好氏肌病變(miyoshimyopathy)。脂肪酸半胱胺綴合物也可適用于治療線粒體疾病，諸如leigh氏綜合征、糖尿病和耳聾(dad)、利伯氏遺傳性視神經(jīng)病變(leber’shereditaryopticneuropathy)、神經(jīng)病變-共濟(jì)失調(diào)-色素性視網(wǎng)膜炎和下垂癥(narp)、肌神經(jīng)源性胃腸腦病變(mngie)、肌陣攣性癲癇伴破碎紅纖維(merrf)和線粒體肌病變-腦肌病變-乳酸酸中毒-中風(fēng)樣癥狀(melas)。因?yàn)榘腚装吩诩?xì)胞內(nèi)釋放，所以本發(fā)明化合物也可用于治療溶酶體病癥腎病變性胱氨酸貯積癥。

除非另外指示，否則本發(fā)明的實(shí)施采用常規(guī)有機(jī)化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、藥理學(xué)、配制和藥物遞送技術(shù)。為明晰起見，以下在各章節(jié)中闡述本發(fā)明的各個方面；然而，應(yīng)了解一個特定章節(jié)中所述的本發(fā)明的方面將不限于任何特定章節(jié)。

i.定義

為有助于理解本發(fā)明，以下定義許多術(shù)語和短語。

冠詞“一(a/an)”在本公開中用于指代冠詞的一個或多于一個(即至少一個)語法對象，除非所述情形不適當(dāng)。舉例來說，“一個要素”意指一個要素或多于一個要素。

除非另外指示，否則術(shù)語“和/或”在本公開中用于意指“和”或“或”。

如本文所用的術(shù)語“烷基”是指飽和直鏈或支鏈烴，諸如具有1-12、1-10或1-6個碳原子的直鏈或支鏈基團(tuán)，在本文中分別稱為c1-c12烷基、c1-c10烷基和c1-c6烷基。示例性烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等。

術(shù)語“c1-c3烷基”是指含有1-3個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴。c1-c3烷基的實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、丙基和異丙基。術(shù)語“c1-c4烷基”是指含有1-4個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴。c1-c4烷基的實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、異丁基、仲丁基和叔丁基。術(shù)語“c1-c5烷基”是指含有1-5個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴。c1-c5烷基的實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、仲丁基以及叔丁基、異戊基和新戊基。術(shù)語“c1-c6烷基”是指含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴。c1-c6烷基的實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、異戊基和新戊基。

術(shù)語“環(huán)烷基”是指環(huán)狀飽和烴，諸如含有3-6個碳原子的環(huán)狀飽和烴。環(huán)烷基可含有3-12、3-8、4-8或4-6個環(huán)碳原子，在本文中例如稱為“c4-8環(huán)烷基”。環(huán)烷基的實(shí)例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。除非另外指定，否則應(yīng)了解環(huán)烷基上任何可取代氫都可被鹵素基團(tuán)、c1-c3烷基、羥基、烷氧基和氰基取代。在某些實(shí)施方案中，環(huán)烷基未被取代。

除非另外指示，否則術(shù)語“芳基”是指具有1至2個芳族環(huán)的碳環(huán)芳族烴基團(tuán)，包括單環(huán)或雙環(huán)基團(tuán)，諸如苯基、聯(lián)苯或萘基。當(dāng)含有兩個芳族環(huán)(雙環(huán)等)時，芳基的芳族環(huán)可在單個點(diǎn)處連接(例如聯(lián)苯)，或可加以稠合(例如萘基)。芳基可任選在任何連接點(diǎn)處被一個或多個取代基例如1至5個取代基取代，所述取代基包括例如鹵素、疊氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、烷氧基、氨基、硝基、硫氫基、亞氨基、酰氨基、羧酸、-c(o)烷基、-co2烷基、羰基、羧基、烷硫基、磺?；喕酋０被?、磺酰胺、酮、醛、酯、雜環(huán)基、芳基或雜芳基部分、-cf3、-cn等。在某些其它實(shí)施方案中，芳族環(huán)未被取代，即它是未取代的。在某些實(shí)施方案中，芳基是6-10元環(huán)結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，芳基是6-10元碳環(huán)結(jié)構(gòu)。

術(shù)語“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。

術(shù)語“雜環(huán)基”和“雜環(huán)基團(tuán)”是本領(lǐng)域公知的，并且是指其環(huán)結(jié)構(gòu)包括1至4個雜原子諸如氮、氧和硫的飽和、部分不飽和或芳族3至10元環(huán)結(jié)構(gòu)，或者3至7元環(huán)。雜環(huán)基中環(huán)原子的數(shù)目可使用cx-cx命名法來指定，其中x是指定環(huán)原子的數(shù)目的整數(shù)。舉例來說，c3-c7雜環(huán)基是指含有1至4個雜原子諸如氮、氧和硫的飽和或部分不飽和3至7元環(huán)結(jié)構(gòu)。標(biāo)號“c3-c7”指示雜環(huán)含有總計3至7個環(huán)原子，包括占據(jù)環(huán)原子位置的任何雜原子。c3雜環(huán)基的一個實(shí)例是氮雜環(huán)丙烯基。雜環(huán)也可為單環(huán)、雙環(huán)或其它多環(huán)系統(tǒng)。雜環(huán)可稠合于一個或多個芳基部分不飽和或飽和環(huán)。雜環(huán)基包括例如生物素基、色烯基、二氫呋喃基、二氫吲哚基、二氫吡喃基、二氫噻吩基、二噻唑基、高哌啶基、咪唑烷基、異喹啉基、異噻唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、氧雜環(huán)戊烷基、噁唑烷基、吩呫噸基、哌嗪基、哌啶基、吡喃基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯烷-2-酮基、吡咯啉基、四氫呋喃基、四氫異喹啉基、四氫吡喃基、四氫喹啉基、噻唑烷基、硫雜環(huán)戊烷基、硫代嗎啉基、噻喃基、呫噸基、內(nèi)酯、內(nèi)酰胺諸如氮雜環(huán)丁酮和吡咯烷酮、磺內(nèi)酰胺、磺內(nèi)酯等。除非另外指定、否則雜環(huán)任選在一個或多個位置處被取代基取代，所述取代基諸如烷?；?、烷氧基、烷基、烯基、炔基、酰氨基、脒基、氨基、芳基、芳基烷基、疊氮基、氨基甲酸酯基、碳酸酯基、羧基、氰基、環(huán)烷基、酯、醚、甲?；Ⅺu素、鹵代烷基、雜芳基、雜環(huán)基、羥基、亞氨基、酮、硝基、氧代、磷酸酯基、膦酸根、次膦酸根、硫酸酯基、硫化物、亞磺酰氨基、磺?；土虼驶?。在某些實(shí)施方案中，雜環(huán)基未被取代，即它是未取代的。

術(shù)語“雜芳基”是本領(lǐng)域公知的，并且是指包括至少一個環(huán)雜原子的芳族基團(tuán)。在某些情況下，雜芳基含有1、2、3或4個環(huán)雜原子。雜芳基的代表性實(shí)例包括吡咯基、呋喃基、苯硫基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、噠嗪基和嘧啶基等。除非另外指定，否則雜芳基環(huán)可在一個或多個環(huán)位置處被例如鹵素、疊氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、烷氧基、氨基、硝基、硫氫基、亞氨基、酰氨基、羧酸、-c(o)烷基、-co2烷基、羰基、羧基、烷硫基、磺酰基、亞磺酰氨基、磺酰胺、酮、醛、酯、雜環(huán)基、芳基或雜芳基部分、-cf3、-cn等取代。術(shù)語“雜芳基”也包括具有兩個或更多個環(huán)的多環(huán)系統(tǒng)，其中兩個或更多個碳為兩個鄰接環(huán)(所述環(huán)是“稠環(huán)”)所共有，其中至少一個環(huán)是雜芳族，例如其它環(huán)可為環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基和/或芳基。在某些實(shí)施方案中，雜芳基環(huán)在一個或多個環(huán)位置處被鹵素、烷基、羥基或烷氧基取代。在某些其它實(shí)施方案中，雜芳基環(huán)未被取代，即它是未取代的。在某些實(shí)施方案中，雜芳基是其環(huán)結(jié)構(gòu)包括1、2、3或4個雜原子諸如氮、氧和硫的5至10元環(huán)結(jié)構(gòu)，或者5至6元環(huán)結(jié)構(gòu)。

如本文所用的術(shù)語“烯基”是指具有至少一個碳-碳雙鍵的不飽和直鏈或支鏈烴，諸如具有2-12、2-10或2-6個碳原子的直鏈或支鏈基團(tuán)，在本文中分別稱為c2-c12烯基、c2-c10烯基和c2-c6烯基。示例性烯基包括乙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基、2-乙基己烯基、2-丙基-2-丁烯基、4-(2-甲基-3-丁烯)-戊烯基等。

如本文所用的術(shù)語“炔基”是指具有至少一個碳-碳三鍵的不飽和直鏈或支鏈烴，諸如具有2-12、2-10或2-6個碳原子的直鏈或支鏈基團(tuán)，在本文中分別稱為c2-c12炔基、c2-c10炔基和c2-c6炔基。示例性炔基包括乙炔基、丙-1-炔-1-基和丁-1-炔-1-基。

術(shù)語“胺”和“氨基”是本領(lǐng)域公知的，并且是指未取代的胺與取代的胺兩者，例如由通式–n(r⁵⁰)(r⁵¹)表示的部分，其中r⁵⁰和r⁵¹各自獨(dú)立地表示氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烯基、芳基、芳烷基或-(ch2)m-r⁶¹；或r⁵⁰和r⁵¹連同它們所連接的n原子一起完成在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有4至8個原子的雜環(huán)；r⁶¹表示芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)或多環(huán)；并且m是零或在1至8的范圍內(nèi)的整數(shù)。在某些實(shí)施方案中，r⁵⁰和r⁵¹各自獨(dú)立地表示氫、烷基、烯基或-(ch2)m-r⁶¹。

術(shù)語“烷氧基(alkoxyl/alkoxy)”是本領(lǐng)域公知的，并且是指具有與其連接的氧基團(tuán)的如上定義的烷基。代表性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙基氧基、叔丁氧基等?！懊选笔莾蓚€通過氧共價連接的烴。因此，烷基的致使那個烷基成為醚的取代基是烷氧基或類似于烷氧基，諸如可由-o-烷基、-o-烯基、-o-炔基、-o-(ch2)m-r61中的一個表示，其中m和r61如上所述。

如本文所用的術(shù)語“氨基甲酸酯基”是指具有形式-rgoc(o)n(rh)-、-rgoc(o)n(rh)ri-或-oc(o)nrhri的基團(tuán)，其中rg、rh和ri各自獨(dú)立地是烷氧基、芳基氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺、氨基、芳基、芳基烷基、羧基、氰基、環(huán)烷基、酯、醚、甲?；?、鹵素、鹵代烷基、雜芳基、雜環(huán)基、羥基、酮、硝基、硫化物、磺?；蚧酋０贰Ｊ纠园被姿狨セǚ蓟被姿狨セ碗s芳基氨基甲酸酯基，例如其中rg、rh和ri中的至少一個獨(dú)立地是芳基或雜芳基諸如苯基和吡啶基。

符號指示連接點(diǎn)。

本公開化合物可含有一個或多個手性中心和/或雙鍵，并且因此以諸如幾何異構(gòu)體、對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體的立體異構(gòu)體形式存在。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“立體異構(gòu)體”由所有幾何異構(gòu)體、對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體組成。視圍繞立體碳原子的取代基的構(gòu)型而定，這些化合物可由符號“r”或“s”指定。本發(fā)明涵蓋這些化合物的各種立體異構(gòu)體及其混合物。立體異構(gòu)體包括對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體。對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體的混合物可在命名時指定為“(±)”，但熟練技術(shù)人員將認(rèn)識到結(jié)構(gòu)可隱含地指示手性中心。應(yīng)了解除非另外指示，否則對化學(xué)結(jié)構(gòu)例如通用化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖示描繪涵蓋指定化合物的所有立體異構(gòu)形式。

本發(fā)明化合物的個別立體異構(gòu)體可由可商購獲得的含有不對稱或立體中心的起始物質(zhì)合成制備，或通過制備外消旋混合物，隨后采用為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的拆分方法來制備。這些拆分方法由(1)使對映異構(gòu)體的混合物連接于手性助劑，通過重結(jié)晶或色譜法來分離所得非對映異構(gòu)體混合物，以及使光學(xué)純產(chǎn)物從助劑釋放，(2)采用光學(xué)活性拆分劑形成鹽，或(3)在手性色譜柱上直接分離光學(xué)對映異構(gòu)體的混合物例示。也可通過熟知方法來將立體異構(gòu)混合物拆分成它們的組成立體異構(gòu)體，所述方法諸如手性相氣相色譜法、手性相高效液相色譜法、使化合物以手性鹽絡(luò)合物形式結(jié)晶、或使化合物在手性溶劑中結(jié)晶。此外，可通過熟知不對稱合成方法來從立體異構(gòu)純中間體、試劑和催化劑獲得立體異構(gòu)體。

幾何異構(gòu)體也可存在于本發(fā)明化合物中。符號表示可為如本文所述的單鍵、雙鍵或三鍵的鍵。本發(fā)明涵蓋由取代基圍繞碳-碳雙鍵排列或取代基圍繞碳環(huán)排列產(chǎn)生的各種幾何異構(gòu)體及其混合物。圍繞碳-碳雙鍵的取代基被指定為呈“z”或“e”構(gòu)型，其中術(shù)語“z”和“e”根據(jù)iupac標(biāo)準(zhǔn)加以使用。除非另外規(guī)定，否則描繪雙鍵的結(jié)構(gòu)涵蓋“e”異構(gòu)體與“z”異構(gòu)體兩者。

或者，圍繞碳-碳雙鍵的取代基可被稱為“順式”或“反式”，其中“順式”表示取代基在雙鍵的同側(cè)，而“反式”表示取代基在雙鍵的對側(cè)。取代基圍繞碳環(huán)排列被指定為“順式”或“反式”。術(shù)語“順式”表示取代基在環(huán)平面的同側(cè)，而術(shù)語“反式”表示取代基在環(huán)平面的對側(cè)。其中取代基安置在環(huán)平面的同側(cè)與對側(cè)兩者上的化合物的混合物被指定為“順式/反式”。

本發(fā)明也包括同位素標(biāo)記的本發(fā)明化合物，其與本文敘述的那些化合物相同，例外之處是一個或多個原子被原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同于通常在自然界中所見的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)的原子替換?？刹⑷氡景l(fā)明化合物中的同位素的實(shí)例包括氫、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，諸如分別是²h、³h、¹³c、¹⁴c、¹⁵n、¹⁸o、¹⁷o、³¹p、³²p、³⁵s、¹⁸f和³⁶cl。

某些同位素標(biāo)記的公開化合物(例如用³h和¹⁴c標(biāo)記的化合物)適用于化合物和/或基質(zhì)組織分布測定中。氚化(即³h)和碳-14(即¹⁴c)同位素由于它們?nèi)菀字苽浜涂蓹z測而是特別優(yōu)選的。此外，用諸如氘(即²h)的重同位素取代可提供某些由較大代謝穩(wěn)定性所致的治療優(yōu)勢(例如體內(nèi)半衰期增加或劑量需求降低)，并且因此在一些情況下可為優(yōu)選的。同位素標(biāo)記的本發(fā)明化合物可通常通過遵循與例如本文實(shí)施例中公開的程序類似的程序，用同位素標(biāo)記的試劑替代非同位素標(biāo)記的試劑來制備。

術(shù)語“脂肪酸半胱胺衍生物”和“脂肪酸半胱胺綴合物”包括本文所述的脂肪酸胱胺衍生物和脂肪酸半胱胺綴合物的任何和所有可能異構(gòu)體、立體異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物和溶劑合物。

術(shù)語“天然存在的氨基酸的任何側(cè)鏈”是指任一以下氨基酸的側(cè)鏈：異亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、纈氨酸、脯氨酸、精氨酸、絲氨酸、組氨酸和酪氨酸。

如本文所用的術(shù)語“脂肪酸”意指ω-3脂肪酸和在體內(nèi)代謝成ω-3脂肪酸的脂肪酸。脂肪酸的非限制性實(shí)例是全順式-7,10,13-十六碳三烯酸、α-亞麻酸(ala或全順式-9,12,15-十八碳三烯酸)、十八碳四烯酸(std或全順式-6,9,12,15-十八碳四烯酸)、二十碳三烯酸(ete或全順式-11,14,17-二十碳三烯酸)、二十碳四烯酸(eta或全順式-8,11,14,17-二十碳四烯酸)、二十碳五烯酸(epa或全順式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)、二十二碳五烯酸(dpa、鰶魚酸(clupanodonicacid)或全順式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸)、二十二碳六烯酸(dha或全順式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸)、二十四碳五烯酸(全順式-9,12,15,18,21-二十二碳六烯酸)或二十四碳六烯酸(尼生酸或全順式-6,9,12,15,18,21-二十四碳烯酸)。

術(shù)語“半胱胺”是指具有式的分子(也稱為2-氨基乙烷-1-硫醇)，其可由胱胺獲得。胱胺是含硫醇化合物半胱胺(也稱為2-氨基乙烷-1-硫醇)的二硫化物形式。當(dāng)二硫化物形式胱胺在細(xì)胞內(nèi)部被攝取時，它通過硫醇還原酶的作用而被還原成硫醇化合物半胱胺(參見arunachalam等(2000)pnas,97,第745-750頁)。硫醇化合物半胱胺被視為細(xì)胞中胱胺的活性組分?？稍诩?xì)胞內(nèi)部遞送活性硫醇化合物半胱胺的胱胺分子的非限制性實(shí)例列于以下流程a中。

流程a

術(shù)語“囊性纖維化”或“cf”是指涉及缺陷性cftr的病癥、疾病和綜合征。存在超過1900種可導(dǎo)致cf的突變。這些突變被進(jìn)一步分成6個不同類別(i-vi類)。cf可涉及可存在于6個不同類別中的任一個中的任何可能突變。

如本文所用，術(shù)語“受試者”和“患者”是指待通過本發(fā)明方法來治療的生物體。所述生物體優(yōu)選是哺乳動物(例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、貓、馬、母牛、豬或非人靈長類動物諸如猴、黑猩猩、狒狒、恒河猴等)，并且更優(yōu)選是人。

如本文所用，術(shù)語“有效量”是指化合物(例如本發(fā)明化合物)足以實(shí)現(xiàn)對受試者有益或?yàn)槭茉囌咚璧慕Y(jié)果的量。有效量可以一次或多次施用、施加或劑量加以施用，并且不意圖限于特定制劑或施用途徑。

如本文所用，術(shù)語“藥物組合物”是指活性劑與使得組合物尤其適于體內(nèi)或離體診斷或治療用途的惰性或活性載體的組合。

如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是指任何標(biāo)準(zhǔn)藥物載體，諸如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳液(例如像油/水或水/油乳液)和各種類型的濕潤劑。組合物也可包括穩(wěn)定劑和防腐劑。對于載體、穩(wěn)定劑和佐劑的實(shí)例，參見martin,remington'spharmaceuticalsciences,第15版,mackpubl.co.,easton,pa[1975]。

如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指本發(fā)明化合物的任何藥學(xué)上可接受的鹽(例如酸鹽或堿鹽)，其在向受試者施用后能夠提供本發(fā)明化合物或其活性代謝物或殘余物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，本發(fā)明化合物的“鹽”可由無機(jī)或有機(jī)酸和堿獲得。酸的實(shí)例包括但不限于鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、丁二酸、甲苯對磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。諸如草酸的其它酸盡管本身不是藥學(xué)上可接受的，但可用于制備在獲得本發(fā)明化合物和它們的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽時適用作中間體的鹽。

堿的實(shí)例包括但不限于堿金屬(例如鈉)氫氧化物、堿土金屬(例如鎂)氫氧化物、氨和其中w是c1-4烷基的式nw4⁺化合物等。

鹽的實(shí)例包括但不限于：乙鹽酸、己二酸鹽、海藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、果糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽(palmoate)、果膠酸鹽(pectinate)、過硫酸鹽、苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一酸鹽等。鹽的其它實(shí)例包括本發(fā)明化合物的陰離子與適合陽離子諸如na⁺、nh4⁺和nw4⁺(其中w是c1-4烷基)等化合。對于治療用途，預(yù)期本發(fā)明化合物的鹽是藥學(xué)上可接受的。然而，非藥學(xué)上可接受的酸和堿的鹽也可例如適用于制備或純化藥學(xué)上可接受的化合物。

術(shù)語“載體”是指賦形劑和稀釋劑，并且意指向受試者施用藥物制劑或?qū)⑺幬镏苿氖茉囌叩囊粋€器官或身體部分運(yùn)載或運(yùn)送至另一器官或身體部分中涉及的物質(zhì)、組合物或媒介物，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或囊封物質(zhì)。

如本文所用，術(shù)語“治療(treat/treating)”包括導(dǎo)致病狀、疾病、病癥等的改善，或改善其癥狀的任何作用，例如減輕、減弱、調(diào)節(jié)、改善或消除。治療可為治愈、改善或至少部分改善病癥。在某些實(shí)施方案中，治療是治愈疾病。

術(shù)語“病癥”是指術(shù)語疾病、病狀或毛病，并且可與所述術(shù)語互換使用。

術(shù)語“前藥”是指可在體內(nèi)通過代謝手段(例如通過水解)轉(zhuǎn)化成脂肪酸半胱胺綴合物的化合物。

以下縮寫在本文中使用，并且具有所指示定義：boc和boc是叔丁氧基羰基，boc2o是二碳酸二叔丁酯，bsa是牛血清白蛋白，cdi是1,1'-羰基二咪唑，dcc是n,n'-二環(huán)己基碳二亞胺，diea是n,n-二異丙基乙胺，dmap是4-二甲基氨基吡啶，dmem是杜貝卡氏改良依格培養(yǎng)基(dulbecco’smodifiedeaglemedium)，dmf是n,n-二甲基甲酰胺，doss是丁二酸二辛酯磺酸鈉，edc和edci是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，elisa是酶聯(lián)免疫吸附測定，etoac是乙酸乙酯，fbs是胎牛血清，hr是小時，hatu是2-(7-氮雜-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽，hiv是人免疫缺陷病毒，hpmc是羥丙基甲基纖維素，oxone是過氧單硫酸鉀，pd/c是鈀碳，tfa是三氟乙酸，tgps是生育酚丙二醇丁二酸酯，并且thf是四氫呋喃。

除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與由本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。

在整個描述中，當(dāng)將組合物和試劑盒描述為具有、包括或包含特定組分時，或當(dāng)將過程和方法描述為具有、包括或包含特定步驟時，預(yù)期另外存在基本上由所述組分組成或由所述組分組成的本發(fā)明的組合物和試劑盒，以及存在基本上由所述處理步驟組成或由所述處理步驟組成的本發(fā)明的過程和方法。

一般來說，除非另外規(guī)定，否則列舉百分比的組成以重量計。此外，如果變量未附有定義，那么以所述變量的先前定義為準(zhǔn)。

ii.脂肪酸半胱胺綴合物

以下描述用于治療應(yīng)用和藥物組合物中的示例性脂肪酸半胱胺綴合物。

式i

本發(fā)明的一個方面提供由以下表示的式i化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物；其中：

r^i-1、r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5和r^i-6對于每次出現(xiàn)各自獨(dú)立地表示氫或c1-c3烷基；

y^i-1是任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代的6元雜芳基：烷基、羥基、烷氧基、鹵素和酰基；

n*和m*獨(dú)立地是1、2或3；

z*是其中：

r1和r2獨(dú)立地是氫、c1-c4烷基或鹵素；

r是2、3或7；

s是3、5或6；

t是0或1；并且

v是1、2或6。

以上式i中的變量的定義涵蓋多個化學(xué)基團(tuán)。本申請涵蓋以下實(shí)施方案，其中例如i)變量的定義是選自以上闡述的那些化學(xué)基團(tuán)的單個化學(xué)基團(tuán)，ii)定義是兩個或更多個選自以上闡述的那些化學(xué)基團(tuán)的化學(xué)基團(tuán)的集合，和iii)化合物通過變量的組合來定義，其中所述變量通過(i)或(ii)來定義。

在某些實(shí)施方案中，化合物是式i化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在某些實(shí)施方案中，r^i-1、r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5和r^i-6對于每次出現(xiàn)各自獨(dú)立地表示氫或甲基。在某些實(shí)施方案中，r^i-1、r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5和r^i-6是氫。

在某些實(shí)施方案中，r^i-2和r^i-3各自獨(dú)立地是c1-c3烷基，例如甲基。在某些實(shí)施方案中，r^i-4和r^i-5各自獨(dú)立地是c1-c3烷基，例如甲基。

在某些實(shí)施方案中，n*是2。在某些實(shí)施方案中，m*是2。在某些實(shí)施方案中，n*是2，并且m*是2。在某些實(shí)施方案中，n*和m*獨(dú)立地是2或3。

在某些實(shí)施方案中，鍵合于相同碳原子的r^i-2與r^i-3兩者各自是c1-c3烷基，例如甲基。在某些實(shí)施方案中，n*是2，并且至少一對鍵合于相同碳原子的r^i-2和r^i-3各自是c1-c3烷基，例如甲基。

在某些實(shí)施方案中，鍵合于相同碳原子的r^i-4與r^i-5兩者各自是c1-c3烷基，例如甲基。在某些實(shí)施方案中，m*是2，并且至少一對鍵合于相同碳原子的r^i-4和r^i-5各自是c1-c3烷基，例如甲基。

在某些實(shí)施方案中，y^i-1是任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代的6元雜芳基：烷基、羥基和烷氧基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是吡啶基或嘧啶基，其各自任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代：烷基、羥基和烷氧基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代的吡啶基：烷基、羥基和烷氧基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是吡啶基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代的烷基、羥基和烷氧基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是

在某些實(shí)施方案中，z*是其中r1和r2是氫或甲基。在某些實(shí)施方案中，r1和r2是氫。在某些實(shí)施方案中，z*是以下中的一個：

以上描述是描述與式i化合物相關(guān)的多個實(shí)施方案。本專利申請明確涵蓋所述實(shí)施方案的所有組合。

式i-a

本發(fā)明的一個方面提供由以下表示的式i-a化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物；其中：

r^i-1、r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5和r^i-6對于每次出現(xiàn)各自獨(dú)立地表示氫或c1-c3烷基；

y^i-1是任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代的6元雜芳基：烷基、羥基、烷氧基、鹵素和?；?；

n*和m*獨(dú)立地是2或3；

z*是其中：

r1和r2獨(dú)立地是氫、c1-c4烷基或鹵素；

r是2、3或7；

s是3、5或6；

t是0或1；并且

v是1、2或6；

前提是當(dāng)z是時，那么r^i-1、r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5或r^i-6中的至少一個是c1-c3烷基，n*或m*中的至少一個是1或3，或y^i-1不同于3-吡啶基。

以上式i-a中的變量的定義涵蓋多個化學(xué)基團(tuán)。本申請涵蓋以下實(shí)施方案，其中例如i)變量的定義是選自以上闡述的那些化學(xué)基團(tuán)的單個化學(xué)基團(tuán)，ii)定義是兩個或更多個選自以上闡述的那些化學(xué)基團(tuán)的化學(xué)基團(tuán)的集合，和iii)化合物通過變量的組合來定義，其中所述變量通過(i)或(ii)來定義。

在某些實(shí)施方案中，化合物是式i-a化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在某些實(shí)施方案中，r^i-1、r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5和r^i-6對于每次出現(xiàn)各自獨(dú)立地表示氫或甲基。在某些實(shí)施方案中，r^i-1、r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5和r^i-6是氫。

在某些實(shí)施方案中，r^i-2和r^i-3各自獨(dú)立地是c1-c3烷基，例如甲基。在某些實(shí)施方案中，r^i-4和r^i-5各自獨(dú)立地是c1-c3烷基，例如甲基。

在某些實(shí)施方案中，n*是2。在某些實(shí)施方案中，m*是2。在某些實(shí)施方案中，n*是2，并且m*是2。

在某些實(shí)施方案中，鍵合于相同碳原子的r^i-2與r^i-3兩者各自是c1-c3烷基，例如甲基。在某些實(shí)施方案中，n*是2，并且至少一對鍵合于相同碳原子的r^i-2和r^i-3各自是c1-c3烷基，例如甲基。

在某些實(shí)施方案中，鍵合于相同碳原子的r^i-4與r^i-5兩者各自是c1-c3烷基，例如甲基。在某些實(shí)施方案中，m*是2，并且至少一對鍵合于相同碳原子的r^i-4和r^i-5各自是c1-c3烷基，例如甲基。

在某些實(shí)施方案中，y^i-1是任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代的6元雜芳基：烷基、羥基和烷氧基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是吡啶基或嘧啶基，其各自任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代：烷基、羥基和烷氧基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代的吡啶基：烷基、羥基和烷氧基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是吡啶基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代的烷基、羥基和烷氧基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是

在某些實(shí)施方案中，z*是其中r1和r2是氫或甲基。在某些實(shí)施方案中，r1和r2是氫。在某些實(shí)施方案中，z*是以下中的一個：

以上描述是描述與式i-a化合物相關(guān)的多個實(shí)施方案。本專利申請明確涵蓋前述實(shí)施方案的所有組合。

式i-b

本發(fā)明的另一方面提供由以下表示的式i-b化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽；其中：

r^i-1、r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5和r^i-6對于每次出現(xiàn)各自獨(dú)立地表示氫或c1-c3烷基；

y^i-1是任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代的6元雜芳基：烷基、羥基、烷氧基、鹵素和?；?；

s是3、5或6；并且

v是1或2。

以上式i-b中的變量的定義涵蓋多個化學(xué)基團(tuán)。本申請涵蓋以下實(shí)施方案，其中例如i)變量的定義是選自以上闡述的那些化學(xué)基團(tuán)的單個化學(xué)基團(tuán)，ii)定義是兩個或更多個選自以上闡述的那些化學(xué)基團(tuán)的化學(xué)基團(tuán)的集合，和iii)化合物通過變量的組合來定義，其中所述變量通過(i)或(ii)來定義。在某些實(shí)施方案中，化合物是式i-b化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在某些實(shí)施方案中，r^i-1、r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5和r^i-6對于每次出現(xiàn)各自獨(dú)立地表示氫或甲基。在某些實(shí)施方案中，r^i-1、r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5和r^i-6是氫。

在某些實(shí)施方案中，鍵合于相同碳原子的r^i-2與r^i-3兩者各自是c1-c3烷基，例如甲基。在某些實(shí)施方案中，n*是2，并且至少一對鍵合于相同碳原子的r^i-2和r^i-3各自是c1-c3烷基，例如甲基。

在某些實(shí)施方案中，鍵合于相同碳原子的r^i-4與r^i-5兩者各自是c1-c3烷基，例如甲基。在某些實(shí)施方案中，m*是2，并且至少一對鍵合于相同碳原子的r^i-4和r^i-5各自是c1-c3烷基，例如甲基。

在某些實(shí)施方案中，y^i-1是任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代的6元雜芳基：烷基、羥基和烷氧基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是吡啶基或嘧啶基，其各自任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代：烷基、羥基和烷氧基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代的吡啶基：烷基、羥基和烷氧基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是吡啶基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是任選被1、2或3個獨(dú)立地選自由以下組成的組的取代基取代的烷基、羥基和烷氧基。在某些實(shí)施方案中，y^i-1是

以上描述是描述與式i-b化合物相關(guān)的多個實(shí)施方案。本專利申請明確涵蓋前述實(shí)施方案的所有組合。

另外的脂肪酸半胱胺綴合物

本發(fā)明的另一方面提供一種包含半胱胺通過接頭共價連接于脂肪酸的分子綴合物，其中所述脂肪酸選自由ω-3脂肪酸和在體內(nèi)代謝成ω-3脂肪酸的脂肪酸組成的組。綴合物能夠細(xì)胞內(nèi)水解以產(chǎn)生游離半胱胺和游離脂肪酸。

在某些實(shí)施方案中，脂肪酸選自由以下組成的組：全順式-7,10,13-十六碳三烯酸、α-亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸(epa)、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸(dha)、二十四碳五烯酸和二十四碳六烯酸。在其它實(shí)施方案中，脂肪酸選自二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。在其它實(shí)施方案中，脂肪酸選自二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。在一些實(shí)施方案中，脂肪酸是二十碳五烯酸(epa)。在其它實(shí)施方案中，脂肪酸是二十二碳六烯酸(dha)。在一些實(shí)施方案中，水解是酶促水解。

式ii

本發(fā)明的另一方面提供式ii化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物；其中：

z是

其中

各t獨(dú)立地是0或1；

各r獨(dú)立地是2、3或7；

各s獨(dú)立地是3、5或6；

各v獨(dú)立地是1、2或6；

r1和r2獨(dú)立地選自由以下組成的組：-h、-d、-c1-c4烷基、-鹵素、-oh、-c(o)c1-c4烷基、-o-芳基、-o-苯甲基、-oc(o)c1-c4烷基、-c2-c3烯基、-c2-c3炔基、-c(o)c1-c4烷基、-nh2、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、-nh(c(o)c1-c3烷基)、-n(c(o)c1-c3烷基)2、sh、-s(c1-c3烷基)、-s(o)c1-c3烷基和-s(o)2c1-c3烷基；

r3和r4獨(dú)立地是h或前提是r3和r4中的至少一個是

各r獨(dú)立地是任選被1、2、3、4或5個選自以下的基團(tuán)取代的雜芳基：oh、cn、鹵素、-co2r6、-conhr6、-conr6r6、-s(o)2nr6r6、-nr6r6、-nr6cor6或-(och2ch2)m-och3；

各r6獨(dú)立地是-h、c1-c3烷基、或任選被oh或鹵素取代的直鏈或支鏈c1-c4烷基；并且

m是1或2。

在式ii中，也應(yīng)了解甲基取代基可被c1-c6烷基取代。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中r是2，并且s是6。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中r是3，并且s是5。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中r是7，并且s是3。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中t是1，并且

r是3，并且s是5，或

r是2，并且s是6，或

r是7，并且s是3。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中v是1，并且s是6。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中v是2，并且s是5。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中v是6，并且s是3。

在某些實(shí)施方案中，z通過一個以上實(shí)施方案來定義，其中r1和r2是氫。

式iii

本發(fā)明的另一方面提供式iii化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物；其中

w1和w2獨(dú)立地是nr；

各r獨(dú)立地是h、-c1-c3烷基、苯基、苯甲基、-ch2co2r3、-ch2conr3r3或任選被oh或鹵素取代的直鏈或支鏈c1-c4烷基；

r5獨(dú)立地選自由以下組成的組：-h、-d、-cl、-f、-cn、-nh2、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、-nh(c(o)c1-c3烷基)、-n(c(o)c1-c3烷基)2、-c(o)h、-c(o)c1-c3烷基、-c(o)oc1-c3烷基、-c(o)nh2、-c(o)nh(c1-c3烷基)、-c(o)n(c1-c3烷基)2、-c1-c3烷基、-o-c1-c3烷基、-s(o)c1-c3烷基和-s(o)2c1-c3烷基；

各a、b、c和d獨(dú)立地是h、-d、-ch3、-och3、-och2ch3、-c(o)or或苯甲基，或a、b、c和d中的兩個可連同它們所結(jié)合的單個碳一起形成環(huán)烷基或雜環(huán)；

各n、o、p和q獨(dú)立地是0或1；

各z獨(dú)立地是

各r獨(dú)立地是2、3或7；

各s獨(dú)立地是3、5或6；

各t獨(dú)立地是0或1；

各v獨(dú)立地是1、2或6；

r1和r2各自獨(dú)立地是h、d、-c1-c4烷基、-鹵素、-oh、-c(o)c1-c4烷基、-o-芳基、-o-苯甲基、-oc(o)c1-c4烷基、-c2-c3烯基、-c2-c3炔基、-c(o)c1-c4烷基、-nh2、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、-nh(c(o)c1-c3烷基)、-n(c(o)c1-c3烷基)2、-sh、-s(c1-c3烷基)、-s(o)c1-c3烷基、-s(o)2c1-c3烷基；

各r3獨(dú)立地是h或c1-c6烷基，或兩個r3基團(tuán)在連同它們所連接的氮一起時可形成雜環(huán)；前提是當(dāng)z是

時，那么a、b、c或d中的至少一個是c1-c3烷基，(i)n和o的總數(shù)或(ii)p和q的總數(shù)中的至少一個是1或3，或含n雜環(huán)不同于3-吡啶基。

式iii-a

本發(fā)明的另一方面提供式iii-a化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物；其中

w1和w2獨(dú)立地是nr；

各r獨(dú)立地是h、-c1-c3烷基、苯基、苯甲基、-ch2co2r3、-ch2conr3r3或任選被oh或鹵素取代的直鏈或支鏈c1-c4烷基；

r5獨(dú)立地選自由以下組成的組：-h、-d、-cl、-f、-cn、-nh2、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、-nh(c(o)c1-c3烷基)、-n(c(o)c1-c3烷基)2、-c(o)h、-c(o)c1-c3烷基、-c(o)oc1-c3烷基、-c(o)nh2、-c(o)nh(c1-c3烷基)、-c(o)n(c1-c3烷基)2、-c1-c3烷基、-o-c1-c3烷基、-s(o)c1-c3烷基和-s(o)2c1-c3烷基；

各a、b、c和d獨(dú)立地是h、-d、-ch3、-och3、-och2ch3、-c(o)or或苯甲基，或a、b、c和d中的兩個可連同它們所結(jié)合的單個碳一起形成環(huán)烷基或雜環(huán)；

各n、o、p和q獨(dú)立地是0或1；

各z獨(dú)立地是

各r獨(dú)立地是2、3或7；

各s獨(dú)立地是3、5或6；

各t獨(dú)立地是0或1；

各v獨(dú)立地是1、2或6；

r1和r2各自獨(dú)立地是h、d、-c1-c4烷基、-鹵素、-oh、-c(o)c1-c4烷基、-o-芳基、-o-苯甲基、-oc(o)c1-c4烷基、-c2-c3烯基、-c2-c3炔基、-c(o)c1-c4烷基、-nh2、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、-nh(c(o)c1-c3烷基)、-n(c(o)c1-c3烷基)2、-sh、-s(c1-c3烷基)、-s(o)c1-c3烷基、-s(o)2c1-c3烷基；

各r3獨(dú)立地是h或c1-c6烷基，或兩個r3基團(tuán)在連同它們所連接的氮一起時可形成雜環(huán)。

以上式iii或式iii-a中的變量的定義涵蓋多個化學(xué)基團(tuán)。本申請涵蓋以下實(shí)施方案，其中例如i)變量的定義是選自以上闡述的那些化學(xué)基團(tuán)的單個化學(xué)基團(tuán)，ii)定義是兩個或更多個選自以上闡述的那些化學(xué)基團(tuán)的化學(xué)基團(tuán)的集合，和iii)化合物通過變量的組合來定義，其中所述變量通過(i)或(ii)來定義。對于各式iii和式iii-a化合物，各以下實(shí)施方案都同等適用。

在某些實(shí)施方案中，至少一個r5是cl或f。在某些實(shí)施方案中，各r5獨(dú)立地是-h。

在某些實(shí)施方案中，w1的r是h或c1-c4烷基。

在某一實(shí)施方案中，w2的r是h或c1-c4烷基。

在某些實(shí)施方案中，a和c各自獨(dú)立地是h、ch3、-och3、-och2ch3或c(o)or。

在某些實(shí)施方案中，n、o、p和q各自是1。在某些實(shí)施方案中，n、o、p和q中的兩個各自是1。在某些實(shí)施方案中，n、o、p和q中的三個各自是1。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中r是2，并且s是5。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中r是3，并且s是5。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中r是7，并且s是3。在某些實(shí)施方案中，z是

其中t是1，并且

r是3，并且s是5，或

r是2，并且s是6，或

r是7，并且s是3。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中v是1，并且s是6。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中v是2，并且s是5。在某些實(shí)施方案中，z是

其中v是6，并且s是3。

式iv

本發(fā)明的另一方面提供式iv化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物；其中

w1是nr；

r獨(dú)立地是h、-c1-c3烷基、苯基、苯甲基、-ch2co2r3、-ch2conr3r3或任選被oh或鹵素取代的直鏈或支鏈c1-c4烷基；

r⁵獨(dú)立地選自由以下組成的組：-h、-d、-cl、-f、-cn、-nh2、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、-nh(c(o)c1-c3烷基)、-n(c(o)c1-c3烷基)2、-c(o)h、-c(o)c1-c3烷基、-c(o)oc1-c3烷基、-c(o)nh2、-c(o)nh(c1-c3烷基)、-c(o)n(c1-c3烷基)2、-c1-c3烷基、-o-c1-c3烷基、-s(o)c1-c3烷基和-s(o)2c1-c3烷基；

r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5和r^i-6對于每次出現(xiàn)各自獨(dú)立地表示氫或c1-c3烷基；

z*是其中：

r1和r2獨(dú)立地是氫、c1-c4烷基或鹵素；

r是2、3或7；

s是3、5或6；

t是0或1；并且

v是1、2或6；

m*是2或3；

o*是1或2；

p*是1或2；

r^i-7和r^i-8各自獨(dú)立地是h或

任選地，前提是當(dāng)z是時，那么r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5或r^i-6中的至少一個是c1-c3烷基，或r^i-7和r^i-8不是氫，或(i)m*或(ii)o*和p*的總數(shù)中的至少一個是1或3，或含n雜環(huán)不同于3-吡啶基。在例如與本文涵蓋的用途關(guān)聯(lián)的某些情況下，前述前提是不必要的。

以上式iv中的變量的定義涵蓋多個化學(xué)基團(tuán)。本申請涵蓋以下實(shí)施方案，其中例如i)變量的定義是選自以上闡述的那些化學(xué)基團(tuán)的單個化學(xué)基團(tuán)，ii)定義是兩個或更多個選自以上闡述的那些化學(xué)基團(tuán)的化學(xué)基團(tuán)的集合，和iii)化合物通過變量的組合來定義，其中所述變量通過(i)或(ii)來定義。

在某些實(shí)施方案中，至少一個r5是cl或f。在某些實(shí)施方案中，各r5獨(dú)立地是-h。

在某些實(shí)施方案中，w1的r是氫或c1-c4烷基。

在某些實(shí)施方案中，r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5和r^i-6對于每次出現(xiàn)各自獨(dú)立地表示氫或甲基。在某些實(shí)施方案中，r^i-2、r^i-3、r^i-4、r^i-5和r^i-6是氫。

在某些實(shí)施方案中，m*是2。在某些實(shí)施方案中，p*是2，并且o*是0。在某些實(shí)施方案中，p*是1，并且o*是1。

在某些實(shí)施方案中，鍵合于相同碳原子的r^i-2與r^i-3兩者各自是c1-c3烷基，例如甲基。在某一實(shí)施方案中，p*是1或2，并且至少一對鍵合于相同碳原子的r^i-2和r^i-3各自是c1-c3烷基，例如甲基。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中r是2，并且s是6。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中r是3，并且s是5。在某些實(shí)施方案中，z是

其中r是7，并且s是3。在某些實(shí)施方案中，z是

其中t是1，并且

r是3，并且s是5，或

r是2，并且s是6，或

r是7，并且s是3。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中v是1，并且s是6。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中v是2，并且s是5。

在某些實(shí)施方案中，z是

其中v是6，并且s是3。

在各式i、ia、ib、ii、iii、iii-a或iv中，任何一個或多個h原子都可被氘取代。

示例性特定化合物

在某些實(shí)施方案中，化合物是以下中的一個或其藥學(xué)上可接受的鹽：

n-(2-((2-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(ii-2)，

n-(2-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)煙酰胺(ii-3)，

n-(2-((2-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)煙酰胺(ii-4)，

n-(2-((1-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(ii-5)，

n-(2-((1-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(ii-6)，

n-((r)-1-(((r)-2,3-二羥基丙基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)煙酰胺(iv-1)，

n-((r)-1-((1,3-二羥基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)煙酰胺(iv-2)，

((r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(煙酰氨基)丁基)氨基甲酸(s)-2,3-二羥基丙酯(iv-3)，

((r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(煙酰氨基)丁基)氨基甲酸1,3-二羥基丙烷-2-基酯(iv-4)，

((r)-2,3-二羥基丙基)氨基甲酸(r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(煙酰氨基)丁酯(iv-5)，

(1,3-二羥基丙烷-2-基)氨基甲酸(r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(煙酰氨基)丁酯(iv-6)，

n-((r)-1-(((r)-2,3-二羥基丙基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)煙酰胺(iv-7)，

n-((r)-1-((1,3-二羥基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)煙酰胺(iv-8)，

n-((r)-1-((s)-2,3-二羥基丙氧基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)煙酰胺(iv-9)，

n-((r)-1-((1,3-二羥基丙烷-2-基)oxy)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)煙酰胺(iv-10)，

n-((r)-1-(((r)-2,3-二羥基丙基)氨基)-3-((2-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)煙酰胺(iv-11)，

n-((r)-1-((1,3-二羥基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)煙酰胺(iv-12)，

((r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(煙酰氨基甲基)丁基)氨基甲酸(s)-2,3-二羥基丙酯(iv-13)，

((r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(煙酰氨基甲基)丁基)氨基甲酸1,3-二羥基丙烷-2-基酯(iv-14)，

n-((r)-1-(((r)-2,3-二羥基丙基)氨基)-4-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-4-甲基-1-氧代戊烷-3-基)煙酰胺(iv-15)，

n-((r)-1-((1,3-二羥基丙烷-2-基)氨基)-4-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-4-甲基-1-氧代戊烷-3-基)煙酰胺(iv-16)，

n-((s)-1-(((r)-2,3-二羥基丙基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)煙酰胺(iv-17)，

n-((s)-1-((1,3-二羥基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)煙酰胺(iv-18)，

(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-巰基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(i-1)，和

(5z,8z,11z,14z,17z)-n-(2-巰基乙基)二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰胺(i-2)。

在某些實(shí)施方案中，化合物是以下化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

n-(2-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(ii-1)。

在某些實(shí)施方案中，化合物是以下化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

n-(2-((2-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(ii-2)。

在某些實(shí)施方案中，化合物是以下化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

n-(2-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)煙酰胺(ii-3)。

在某些實(shí)施方案中，化合物是以下化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

n-(2-((2-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)煙酰胺(ii-4)。

在某些實(shí)施方案中，化合物是以下化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

n-(2-((1-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(ii-5)。

在某些實(shí)施方案中，化合物是以下化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

n-(2-((1-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(ii-6)。

在某些實(shí)施方案中，化合物是：

n-(2-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(ii-1)。

在某些實(shí)施方案中，化合物是：

n-(2-((2-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(ii-2)。

在某些實(shí)施方案中，化合物是：

n-(2-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)煙酰胺(ii-3)。

在某些實(shí)施方案中，化合物是：

n-(2-((2-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)煙酰胺(ii-4)。

在某些實(shí)施方案中，化合物是：

n-(2-((1-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(ii-5)。

在某些實(shí)施方案中，化合物是：

n-(2-((1-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(ii-6)。

如上所指示，本發(fā)明提供一種包含本文所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。

應(yīng)了解本發(fā)明的脂肪酸半胱胺綴合物可通過一般性程序諸如實(shí)施例中所述的那些來合成。

iii.脂肪酸半胱胺綴合物的治療應(yīng)用

如上所指示，本發(fā)明部分地基于脂肪酸半胱胺綴合物適用于活化自噬的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的脂肪酸半胱胺綴合物具有不能通過單獨(dú)或組合施用半胱胺或脂肪酸來實(shí)現(xiàn)的治療作用，并且提供一種以不能通過施用個別組分或個別組分的組合來重現(xiàn)的方式使自噬活化以治療或預(yù)防cf的優(yōu)異方式。半胱胺和ω-3脂肪酸的共價連接允許向某一位置同時遞送兩種組分，據(jù)此個別組分通過裂解例如酶促裂解而在所述位置處并且在相同時間得以釋放。以下描述示例性治療方法和治療應(yīng)用的另外的特征。

示例性治療方法

本發(fā)明的一個方面提供一種治療本文所述的疾病(例如選自由以下組成的組的疾?。篶f、神經(jīng)變性疾病、炎性疾病、肝病、肌肉疾病、感染和免疫疾病)的方法。方法包括向有此需要的受試者施用治療有效量的本文所述的脂肪酸半胱胺綴合物，諸如式i、ia、ib、ii、iii、iii-a或iv化合物以治療疾病。

在某些實(shí)施方案中，疾病是cf。在某些實(shí)施方案中，疾病是神經(jīng)變性疾病(例如亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病或帕金森氏病)。在某些實(shí)施方案中，疾病是炎性疾病。在某些實(shí)施方案中，疾病是神經(jīng)變性疾病、肝病、肌肉疾病、感染、免疫或炎性疾病。神經(jīng)變性疾病包括亨廷頓氏病、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病和傳染性海綿狀腦病變。在某些實(shí)施方案中，疾病是特發(fā)性肺纖維化。在某些實(shí)施方案中，疾病是年齡相關(guān)的黃斑變性。在其它實(shí)施方案中，疾病是心臟疾病。

在某些實(shí)施方案中，在治療疾病的方法中，施用式i化合物使受試者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或100％。在某些實(shí)施方案中，在治療疾病的方法中，施用式i-a化合物使受試者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或100％。在某些實(shí)施方案中，在治療疾病的方法中，施用式i-b化合物使受試者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或100％。在某些實(shí)施方案中，在治療疾病的方法中，施用式iii化合物使受試者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或100％。在某些實(shí)施方案中，在治療疾病的方法中，施用式iii-a化合物使受試者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或100％。在某些實(shí)施方案中，在治療疾病的方法中，施用式iv化合物使受試者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或100％。

預(yù)期使用本文所述的方法治療的另外的疾病包括例如被理解為具有缺陷性自噬的以下疾病，包括不限于danon病、x連鎖性肌病變、嬰兒自噬空泡肌病變、成人發(fā)作型空泡肌病變、蓬佩病、偶發(fā)性包涵體肌炎、2b型肢帶肌營養(yǎng)不良和三好氏肌病變。

本文所述的脂肪酸半胱胺綴合物也可適用于治療線粒體疾病，包括不限于leigh氏綜合征、糖尿病和耳聾(dad)、利伯氏遺傳性視神經(jīng)病變、神經(jīng)病變-共濟(jì)失調(diào)-色素性視網(wǎng)膜炎和下垂癥(narp)、肌神經(jīng)源性胃腸腦病變(mngie)、肌陣攣性癲癇伴破碎紅纖維(merrf)、和線粒體肌病變-腦肌病變-乳酸酸中毒-中風(fēng)樣癥狀(melas)、克亞姆-塞爾綜合征(keam-sayresyndrome)、亞急性壞死性腦病變(leigh氏綜合征)以及線粒體心肌病變和歸因于多種線粒體dna缺失的其它綜合征。另外的線粒體疾病包括不限于神經(jīng)源性肌無力、進(jìn)行性眼外肌麻痹(peo)、以及與oxphos復(fù)合物的功能異常相關(guān)的復(fù)合物i疾病、復(fù)合物ii疾病、復(fù)合物iii疾病、復(fù)合物iv疾病和復(fù)合物v疾病、和megdel綜合征(iv型3-甲基戊烯二酸尿癥伴感覺神經(jīng)性耳聾、腦病變和利樣綜合征。

在某些實(shí)施方案中，患者是人。

本發(fā)明的另一方面提供在受試者中活化自噬的方法。方法包括向有此需要的受試者施用有效量的本文所述的脂肪酸半胱胺綴合物諸如式i-a、式iii、式iii-a或式iv化合物以在所述受試者中活化自噬。在某些實(shí)施方案中，受試者罹患cf、神經(jīng)變性疾病或炎性疾病。在某些實(shí)施方案中，受試者是人。

在某些實(shí)施方案中，在治療疾病的方法中，施用例如式ia的化合物使受試者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或至少100％。在某些實(shí)施方案中，在治療疾病的方法中，施用例如式iii的化合物使受試者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或至少100％。在某些實(shí)施方案中，在治療疾病的方法中，施用例如式iii-a的化合物使受試者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或至少100％。在某些實(shí)施方案中，在治療疾病的方法中，施用例如式iv的化合物使受試者的自噬增加至少5％、10％、25％、50％或至少100％。

在某些實(shí)施方案中，自噬的活化可根據(jù)某些生物標(biāo)志物的量的變化來表征。一種示例性生物標(biāo)志物是微管相關(guān)蛋白1a/1b輕鏈3(lc3)，其是一種具有約17kda的分子質(zhì)量，遍及許多哺乳動物組織和培養(yǎng)細(xì)胞存在的可溶性蛋白質(zhì)。在細(xì)胞中，胞質(zhì)形式的lc3(lc3-i)變得綴合于磷脂酰乙醇胺以形成lc3-磷脂酰乙醇胺綴合物(lc3-ii)。參見例如tanida等(2008)methodsmol.biol.,第445卷,第77-88頁。lc3-ii相對于lc3-i的量可用于分析自噬的量的變化。因此，在某些實(shí)施方案中，施用一種或多種前述化合物使受試者中l(wèi)c3-ii與lc3-i的比率增加，諸如受試者中l(wèi)c3-ii與lc3-i的比率增加至少約10％、25％、50％、75％或100％。

另一示例性生物標(biāo)志物是p62蛋白，也稱為隔離體1(sqstm1)，其是一種已被報道與泛素化蛋白質(zhì)聚集物共定位的泛素結(jié)合骨架蛋白質(zhì)。參見例如bjorkoy等(2009)methodsenzymol.,第452卷,第181-197頁。因此，在某些實(shí)施方案中，施用一種或多種前述化合物使受試者中p62蛋白的量降低，諸如受試者中p62蛋白的量降低至少約1％、5％、10％、15％、25％、50％、75％或90％w/w。

在某些實(shí)施方案中，在用于增加自噬的方法中，受試者已被診斷為患有cf。在某些實(shí)施方案中，在用于增加自噬的方法中，受試者已被診斷為患有神經(jīng)變性疾病。

此外，并且更一般地，本發(fā)明的另一方面提供一種增加自噬的方法，其中所述方法包括向有此需要的受試者施用有效量的分子綴合物，所述分子綴合物包含通過接頭與脂肪酸共價連接的半胱胺，其中所述脂肪酸選自由ω-3脂肪酸和在體內(nèi)代謝成ω-3脂肪酸的脂肪酸組成的組。

此外，本發(fā)明提供治療患者的疾病的方法，所述疾病選自患者中由以下組成的組：特發(fā)性肺纖維化、線粒體疾病、leigh氏綜合征、糖尿病和耳聾(dad)、利伯氏遺傳性視神經(jīng)病變、神經(jīng)病變-共濟(jì)失調(diào)-色素性視網(wǎng)膜炎和下垂癥(narp)、肌神經(jīng)源性胃腸腦病變(mngie)、肌陣攣性癲癇伴破碎紅纖維(merrf)、和線粒體肌病變-腦肌病變-乳酸酸中毒-中風(fēng)樣癥狀(melas)。方法包括向有此需要的患者施用治療有效量的：

(i)化合物

(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-巰基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(i-1)；

(ii)化合物

(5z,8z,11z,14z,17z)-n-(2-巰基乙基)二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰胺(i-2)；或

(iii)化合物(i)或(ii)的組合，由此以治療疾病。在一個實(shí)施方案中，疾病是特發(fā)性肺纖維化。

自噬、半胱胺和綴合物的另外的特征

自噬是一種用以實(shí)質(zhì)上自我消化一些細(xì)胞組分的在進(jìn)化上保守的溶酶體降解途徑(參見levine和kroemer(2008)cell,132,第27-42頁)。這個自我消化過程充當(dāng)幫助細(xì)胞移除外來或受損細(xì)胞器、缺陷性或錯誤折疊蛋白質(zhì)以及甚至侵襲性微生物的手段。已知自噬在cf患者中下調(diào)(luciani等(2011)autophagy,7,第104-106頁)。自噬也代表一種用于從受感染組織諸如肺移除病原體諸如銅綠假單胞菌的重要細(xì)胞機(jī)制。自噬的活化可潛在幫助cf患者從他們的長期受感染的肺清除銅綠假單胞菌(junkins等(2013)plosone,8,e72263)。

在cf中，缺陷性cftr導(dǎo)致活性氧物質(zhì)上調(diào)，這使作為促進(jìn)蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)的酶的組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tg2)的活性增加。tg2活性增加誘導(dǎo)作為調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的自噬蛋白-1(自噬蛋白-1)的交聯(lián)。自噬蛋白-1的交聯(lián)過程使它從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移，下調(diào)自噬，并且因此導(dǎo)致p62(也稱為sqstm1)的積累。增加的p62可將錯誤折疊的cftr隔離到聚集體中，其接著被蛋白酶體靶向以達(dá)成降解。已觀察到當(dāng)用高濃度的胱胺(250μm)處理來自具有純合δf508突變的cf患者的人上皮細(xì)胞時，存在自噬上調(diào)和cftr恢復(fù)至質(zhì)膜(luciani等(2012)autophagy,8,第1657-1672頁；luciani等(2010)nat.cellbiol.,12,第863-875頁)?；驹硎请装房梢种苩g2活性，此使becn1的交聯(lián)降低。這個過程導(dǎo)致p62水平降低，這接著使錯誤折疊的cftr逃脫被隔離到聚集體中，并且定位在高爾基體(golgi)中以向膜運(yùn)送。盡管有希望，但使缺陷性cftr恢復(fù)活性的這個方法具有一個主要缺點(diǎn)，即誘導(dǎo)各種上皮細(xì)胞系中自噬需要高濃度的胱胺(250μm)。預(yù)期這個高濃度的胱胺將需要可不切實(shí)際以及對于患者來說可能是非順應(yīng)的人劑量，因?yàn)橐阎装?半胱胺在高劑量下可誘導(dǎo)顯著水平的胃腸不適(kan等(1984)brit.j.exp.pathology,65,第759-765頁)。

脂肪酸半胱胺綴合物已被設(shè)計以使半胱胺類似物和ω-3脂肪酸集合成單個分子綴合物。脂肪酸半胱胺綴合物的活性實(shí)質(zhì)上大于分子綴合物的個別組分的總和，表明由脂肪酸胱胺綴合物誘導(dǎo)的活性具有協(xié)同性。本發(fā)明的脂肪酸半胱胺綴合物的另一益處是它們顯示極低或不顯示外周毒性。

iv.藥物組合物

本發(fā)明提供包含脂肪酸半胱胺綴合物諸如式i、i-a、i-b、ii、iii、iii-a或iv化合物的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物優(yōu)選包含治療有效量的一種或多種連同一種或多種藥學(xué)上可接受的載體一起配制的上述脂肪酸半胱胺綴合物。如以下所詳述，本發(fā)明的藥物組合物可以固體或液體形式特別配制以進(jìn)行施用，包括適合于以下的那些形式：(1)口服施用，例如灌服劑(水性或非水性溶液或混懸液)、片劑(例如為達(dá)成經(jīng)頰、舌下和/或全身性吸收目標(biāo)的片劑)、大丸劑、粉劑、顆粒劑、用于向舌部施加的糊劑；(2)通過例如以例如無菌溶液或混懸液或持續(xù)釋放制劑形式皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或硬膜外注射進(jìn)行的胃腸外施用；(3)表面施加，例如以乳膏劑、軟膏劑或控制釋放貼片或噴霧劑形式向皮膚施加；(4)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)，例如以陰道栓劑、乳膏劑或泡沫劑形式；(5)舌下；(6)經(jīng)眼；(7)經(jīng)皮；或(8)經(jīng)鼻。

短語“藥學(xué)上可接受”在本文中用于指代在合理醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)適用于與人和動物的組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏應(yīng)答或其它問題或并發(fā)癥，與合理益處/風(fēng)險比相稱的那些化合物、物質(zhì)、組合物和/或劑型。

本發(fā)明制劑包括適于口服、經(jīng)鼻、經(jīng)表面(包括經(jīng)頰和舌下)、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道和/或胃腸外施用的制劑。制劑可合宜地以單位劑型呈現(xiàn)，并且可通過制藥領(lǐng)域中熟知的任何方法制備。可與載體物質(zhì)組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將視所治療宿主、特定施用模式而變化。

本發(fā)明的藥物組合物的片劑和其它固體劑型諸如糖衣片、膠囊、丸劑和顆粒劑可任選加以刻痕或制備有包衣和殼體，諸如腸溶包衣和藥物配制領(lǐng)域中熟知的其它包衣。它們也可使用例如用以提供所需釋放概況的不同比例的羥丙基甲基纖維素、其它聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球體來配制以便提供其中活性成分的緩慢或控制釋放。它們可被配制以達(dá)成快速釋放，例如冷凍干燥。它們可通過例如經(jīng)細(xì)菌截留過濾器過濾，或通過并有可在使用之前即刻溶解于無菌水或某一其它無菌可注射介質(zhì)中的呈無菌固體組合物形式的滅菌劑來滅菌。這些組合物也可任選含有遮光劑，并且可具有它們僅或優(yōu)先在胃腸道的某一部分中任選以延遲方式釋放活性成分的組成?？墒褂玫陌窠M合物的實(shí)例包括聚合物質(zhì)和蠟?；钚猿煞忠部沙饰⒛曳庑问剑m當(dāng)時，連同一種或多種上述賦形劑一起。

用于口服施用本發(fā)明化合物的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳液、微乳液、溶液、混懸液、糖漿和酏劑。除活性成分之外，液體劑型可含有通常用于本領(lǐng)域中的惰性稀釋劑，諸如水或其它溶劑；增溶劑和乳化劑，如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙脂、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃甲醇、聚乙二醇以及脫水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。

可通過任何適于治療劑的施用模式來實(shí)現(xiàn)脂肪酸半胱胺綴合物的施用。這些模式包括全身性或局部施用，諸如口服、經(jīng)鼻、胃腸外、經(jīng)皮、皮下、經(jīng)陰道、經(jīng)頰、經(jīng)直腸或經(jīng)表面施用模式。

視預(yù)定施用模式而定，組合物可呈固體、半固體或液體劑型，諸如可注射劑、片劑、栓劑、丸劑、定時釋放膠囊、酏劑、酊劑、乳液、糖漿、粉劑、液體、混懸液等，有時呈單位劑量形式并且符合常規(guī)藥物規(guī)范。同樣，它們也可以靜脈內(nèi)(團(tuán)注與輸注兩者)、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)形式施用，所述形式全都使用為藥物領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的形式。

說明性藥物組合物是包含脂肪酸半胱胺綴合物和藥學(xué)上可接受的載體的片劑和明膠膠囊，所述載體諸如：a)稀釋劑，例如純化水、甘油三酯油，諸如氫化或部分氫化植物油或其混合物、玉米油、橄欖油、葵花油、紅花油、魚油諸如epa或dha、或它們的酯或甘油三酯或其混合物；b)潤滑劑，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、它的鎂鹽或鈣鹽、油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉和/或聚乙二醇；對于片劑，也包含c)粘合劑，例如硅酸鎂鋁、淀粉糊、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、碳酸鎂、天然糖諸如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味劑、天然和合成膠諸如阿拉伯膠、黃蓍膠或海藻酸鈉、蠟和/或聚乙烯吡咯烷酮；必要時，包含d)崩解劑，例如淀粉、瓊脂、甲基纖維素、膨潤土、黃原膠、海藻酸或它的鈉鹽、或泡騰混合物；e)吸附劑、著色劑、調(diào)味劑和甜味劑；f)乳化劑或分散劑，諸如吐溫80(tween80)、labrasol、hpmc、doss、caproyl909、labrafac、labrafil、peceol、transcutol、capmulmcm、capmulpg-12、captex355、gelucire、維生素etgps或其它可接受的乳化劑；和/或g)增強(qiáng)化合物的吸收的試劑，諸如環(huán)糊精、羥丙基–環(huán)糊精、peg400、peg200。

液體(特別是可注射)組合物可例如通過溶解、分散等來制備。舉例來說，將脂肪酸半胱胺綴合物溶解于藥學(xué)上可接受的溶劑中或與所述溶劑混合以由此形成可注射等張溶液或混懸液，所述溶劑諸如水、鹽水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等。諸如白蛋白、乳糜微?；蜓宓鞍踪|(zhì)的蛋白質(zhì)可用于使脂肪酸半胱胺綴合物溶解。

也可使用聚亞烷基二醇諸如丙二醇作為載體，將脂肪酸半胱胺綴合物配制成可由脂肪乳液或混懸液制備的栓劑。

也可以諸如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡的脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的形式施用脂肪酸半胱胺綴合物。脂質(zhì)體可由多種含有膽固醇、硬脂胺或磷脂酰膽堿的磷脂形成。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)組分的薄膜用藥物水溶液水合以形成囊封藥物的脂質(zhì)層，如美國專利號5,262,564中所述。

胃腸外可注射施用通常用于皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射和輸注?？勺⑸鋭┛梢猿Ｒ?guī)形式制備成液體溶液或混懸液，或適于在注射之前溶解于液體中的固體形式。

組合物可分別根據(jù)常規(guī)混合、?；虬卜椒ㄖ苽洌⑶乙灾亓炕蝮w積計，本發(fā)明藥物組合物可含有約0.1％至約80％、約5％至約60％、或約1％至約20％的脂肪酸半胱胺綴合物。

根據(jù)多種因素選擇利用脂肪酸半胱胺綴合物的劑量方案，所述因素包括患者的類型、物種、年齡、重量、性別和醫(yī)學(xué)狀況；待治療的病狀的嚴(yán)重性；施用途徑；患者的腎功能或肝功能；采用的特定脂肪酸半胱胺綴合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)醫(yī)師或獸醫(yī)可易于確定并指定用于防止、對抗或遏止病狀進(jìn)展所需的藥物的有效量。

當(dāng)用于達(dá)成所指示作用時，本發(fā)明的有效劑量在每天約20mg至約5,000mg的脂肪酸半胱胺綴合物的范圍內(nèi)。用于體內(nèi)或體外使用的組合物可含有約20、50、75、100、150、250、500、750、1,000、1,250、2,500、3,500或5,000mg的脂肪酸半胱胺綴合物。脂肪酸半胱胺綴合物的有效血漿水平可在每天約5ng/ml至5000ng/ml的范圍內(nèi)。脂肪酸半胱胺綴合物的適當(dāng)劑量可如goodman,l.s.；gilman,a.(1975)thepharmacologicalbasisoftherapeutics,第5版；macmillan:newyork,第201-226頁中所闡述來確定。脂肪酸半胱胺綴合物可以單次每日劑量施用，或總體每日劑量可以每日兩次、三次或四次分次劑量施用。

組合療法

脂肪酸半胱胺綴合物也可與其它治療劑諸如cftr調(diào)節(jié)劑、上皮鈉通道(enac)抑制劑、消炎劑、抗纖維化劑和抗細(xì)菌劑一起施用。在一些實(shí)施方案中，其它治療劑是cftr調(diào)節(jié)劑。cftr調(diào)節(jié)劑的非限制性實(shí)例包括依伐卡托(vx-770)、魯瑪卡托(vx-809)、vx-661、奧卡比(orkambi)(vx-770和vx-809的組合)、vx-152、vx-440、vx-661和vx-770的組合、vx-152/vx-809和vx-770的組合、vx-440/vx-809和vx-770的組合、p-1037、利奧西呱(riociguat)、n91115、qbw251、qr-010、glpg1837、glpg2222、glp2665、染料木黃酮(genistein)、黃岑黃素(baicalein)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)、三甲基當(dāng)歸根素(trimethylangelicin)和阿塔魯任(ataluren)。

在一些實(shí)施方案中，其它治療劑是消炎劑。消炎劑的非限制性實(shí)例包括布洛芬(ibuprofen)、潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、氫化可的松(hydrocortisone)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、倍氯米松(beclometasone)、布地縮松(budesonide)、氟替卡松(fluticasone)、莫米松(mometasone)、施立泰(seretide)(氟替卡松加沙美特羅(salmeterol))、symbicort(布地縮松加福莫特羅(formoterol))和n91115。

在一些實(shí)施方案中，其它治療劑是抗細(xì)菌劑?？辜?xì)菌劑的非限制性實(shí)例包括阿奇霉素(azithromycin)、妥布霉素(tobramycin)、賴氨酸氨曲南(aztreonamlysine)、粘菌素(colistin)、氨基糖苷(aminoglycoside)、萬古霉素(vancomycin)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)和磺酰胺(sulfonamide)。

在一些實(shí)施方案中，其它治療劑是上皮鈉通道(enac)抑制劑。enac抑制劑的非限制性實(shí)例包括阿米洛利(amiloride)、ba-39-9437、gs-9411和p-1037。

在一些實(shí)施方案中，其它治療劑是抗纖維化劑?？估w維化劑的非限制性實(shí)例包括吡非尼酮(pirfenidone)、尼達(dá)尼布(nintedanib)、int-767、stx-100、am152、己酮可可堿(pentoxyphilline)、fg-3019、cnto888、曲洛奇單抗(tralokinumab)、sar156597、gs-6624、bms-986020、勒比奇單抗(lebrikizumab)、gsk2126458、act-064992、維莫德吉(vismodegib)、prm-151、iw001和弗利索利木單抗(fresolimumab)。

v.用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的試劑盒

本發(fā)明的另一方面提供一種用于治療病癥的試劑盒。所述試劑盒包括：i)治療醫(yī)學(xué)病癥諸如cf的說明書；和ii)本文所述的脂肪酸半胱胺綴合物。試劑盒可包括一個或多個含有一定量的本文所述的脂肪酸半胱胺綴合物的單位劑型。

以上描述是描述本發(fā)明的多個方面和實(shí)施方案，包括脂肪酸半胱胺綴合物、包含脂肪酸半胱胺綴合物的組合物、使用脂肪酸半胱胺綴合物的方法以及試劑盒。本專利申請明確涵蓋各個方面和實(shí)施方案的所有組合和排列。

實(shí)施例

本公開進(jìn)一步通過以下實(shí)施例來說明，所述實(shí)施例不應(yīng)解釋為在范圍或精神方面將本公開限于本文所述的特定程序。應(yīng)了解提供實(shí)施例以說明某些實(shí)施方案，并且不意圖由此限制本公開的范圍。

實(shí)施例1

制備n-(2-((2-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(ii-2)：

在典型操作中，將(5z,8z,11z,14z,17z)-n-(2-((2-氨基乙基)二硫烷基)乙基)二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰胺(1mmol，根據(jù)wo2012/115695中概述的程序制備)連同煙酸(1mmol)、hatu(1.1mmol)和et3n(1.5mmol)一起溶解于25mlch2cl2中。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物8小時，并且用飽和nh4cl水溶液稀釋。分離兩層，并且有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(na2so4)并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(95％ch2cl2，5％meoh)純化以提供n-(2-((2-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)乙基)煙酰胺。ms(ei)：c30h43n3o2s2的計算值：541.28；實(shí)測值：542[m+h]⁺。

實(shí)施例2

制備n-(2-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)煙酰胺(ii-3)：

在室溫下逐滴添加于meoh(200ml)中含有1,2-二(吡啶-2-基)二硫烷(26g，0.227mmol)的溶液至于meoh(200ml)中含有半胱胺(50g，0.227mmol)的溶液中。在室溫下在惰性氮?dú)夥諊聰嚢杷梅磻?yīng)混合物2小時，接著在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(ch2cl2/meoh＝10/1)純化以提供2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙烷-1-胺(39g，92％產(chǎn)率)。將含有2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙烷-1-胺(5g，26.8mmol)、dha(9.2g，26.8mmol)和hatu(10.2g，26.8mmol)的混合物溶解于ch2cl2(100ml)中，并且在室溫下攪拌。接著在室溫下逐滴添加三乙胺(18ml，40.3mmol)。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物18小時，其接著用水稀釋并用ch2cl2萃取。合并的有機(jī)層用水(3×100ml)、鹽水(100ml)洗滌，經(jīng)無水na2so4干燥，并且在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(戊烷/etoac)純化以提供呈淺棕色油狀的(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(10g，75％產(chǎn)率)。

在室溫下逐滴添加1-氨基-2-甲基丙烷-2-硫醇(1.14g，8mmol)至于1:1meoh/dmf混合物(10ml)中含有(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(4g，8mmol)的溶液中。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物18小時，其接著用水稀釋并用etoac萃取。合并的有機(jī)層用水(2×50ml)、鹽水(50ml)洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并且在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(戊烷/etoac)純化以提供呈淺棕色油狀的(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-((1-氨基-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(3.2g，81％產(chǎn)率)。

將(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-((1-氨基-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(3.2g，6.5mmol)和煙酰氯(1.8g，13mmol)溶解于ch2cl2(30ml)中。在0℃下逐滴添加三乙胺(3ml，19.5mmol)。在室溫下攪拌所得混合物18小時，其接著用水稀釋并用ch2cl2萃取。合并的有機(jī)層用水(2×50ml)、鹽水(50ml)洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并且在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(戊烷/etoac)純化以提供呈淺棕色油狀的n-(2-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)煙酰胺(2.2g，57％產(chǎn)率)。ms：c34h49n3o2s2的計算值：595.3；實(shí)測值：596.3[m+h]⁺。

實(shí)施例3

制備n-(2-((2-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)煙酰胺(ii-4)：

使用實(shí)施例2中n-(2-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-2-甲基丙基)煙酰胺的制備中概述的程序，用epa替代dha來制備這個化合物。ms：c32h47n3o2s2的計算值：569.3；實(shí)測值：570[m+h]⁺。

實(shí)施例4

制備n-(2-((1-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(ii-6)：

在室溫下攪拌于dmf(100ml)中含有2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙烷-1-胺(8g，40mmol，1當(dāng)量)和煙酸(5.3g，40mmol)的混合物。接著添加hatu(18.3g，48mmol，1.2當(dāng)量)和et3n(4.58g，48mmol)。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物18小時，其接著用etoac稀釋并用水和鹽水洗滌。干燥(na2so4)有機(jī)層并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(ch2cl2/meoh)純化以提供呈黃色油狀的n-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)煙酰胺(5.5g，45％產(chǎn)率)。在室溫下攪拌于naoh/h2o(1.5g/15ml)中含有n-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)煙酰胺(5.5g，0.019mol)的混合物直至物質(zhì)被溶解。接著添加1-氨基-2-甲基丙烷-2-硫醇(2.1g，0.019mol)，隨后添加另一份naoh/h2o(1.5g/15ml)。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物2小時，接著用etoac稀釋。有機(jī)層用水、鹽水洗滌，干燥(na2so4)并在減壓下濃縮。所得粗制固體不經(jīng)進(jìn)一步純化即直接用于下一步驟中。在室溫下攪拌于dmf(40ml)中含有n-(2-((1-氨基-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(2.5g，8.77mmol)和epa(2.65g，8.77mmol)的混合物。接著添加hatu(4g，10.5mmol)和et3n(1.065mg，10.5mmol)。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物18小時，接著用etoac稀釋。有機(jī)層用水、鹽水洗滌，干燥(na2so4)并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(meoh/ch2cl2＝15/1)純化以提供呈黃色油狀的n-(2-((1-((5z,8z,11z,14z,17z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)-2-甲基丙烷-2-基)二硫烷基)乙基)煙酰胺(1.6g，33％產(chǎn)率)。ms：c32h47n3o2s2的計算值：569.3；實(shí)測值：570.3[m+h]⁺。

實(shí)施例5

制備n-((s)-1-(((r)-2,3-二羥基丙基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)煙酰胺(iv-17)：

逐滴添加于甲醇(100ml)中含有半胱胺鹽酸鹽(7.87g，69.3mmol)的溶液至2,2’-二硫代吡啶(25.0g，113.6mmol)于甲醇(300ml)中的溶液中。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物18小時。緩慢添加二碳酸二叔丁酯(15.1g，69.3mmol)和氫氧化鈉水溶液(5m，30ml)。在室溫下再攪拌反應(yīng)混合物4小時。混合物接著用乙酸乙酯(300ml×2)萃取。合并的有機(jī)層用鹽水(300ml)洗滌，經(jīng)na2so4干燥并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(己烷/乙酸乙酯＝10:1至5:1)純化以提供呈黃色油狀的2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基氨基甲酸叔丁酯(8.3g，42.3％產(chǎn)率)。

將2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基氨基甲酸叔丁酯(5.8g，25.6mmol)溶解于1,4-二噁烷(30ml)中，并且冷卻溶液至0℃。接著逐滴添加hcl于1,4-二噁烷中的溶液(5m，20ml)。攪拌所得反應(yīng)混合物2小時，接著在減壓下濃縮以提供2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙胺(5.6g，100％產(chǎn)率，鹽酸鹽)。

冷卻2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙胺(12.0g，64.5mmol)、dha(51.6mmol)和hatu(29.3g，77mmol)于dcm(150ml)中的混合物至0℃，并且添加許尼希氏堿(hunig’sbase)(25g，190mmol)。使所得反應(yīng)混合物升溫至室溫，并且攪拌18小時。添加飽和nh4cl水溶液(200ml)以淬滅反應(yīng)，并且用ch2cl2(300ml×2)萃取所得混合物。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(甲醇/ch2cl2＝0.5％至2.0％)純化以提供呈黃色油狀的(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺。

在室溫下攪拌(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(4.8g，9.6mmol)和(s)-2-氨基-3-巰基-3-甲基丁酸(1.44g，9.6mol)于meoh(100ml)中的混合物18小時。接著添加二碳酸二叔丁酯(2.1g，9.6mmol)，隨后緩慢添加3m氫氧化鈉水溶液(30ml)。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物4小時，接著用etoac(100ml×2)萃取。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(甲醇/ch2cl2＝0％至1.5％)純化以提供呈黃色油狀的(r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁酸(5.4g，88.2％產(chǎn)率)。

冷卻(r)-3-氨基丙烷-1,2-二醇(0.17g，1.9mmol)、(r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁酸(1.2g，1.9mmol)和hatu(0.86g，2.2mmol)于ch2cl2(20ml)中的混合物至0℃，并且添加許尼希氏堿(0.73g，5.6mmol)。使反應(yīng)混合物升溫至室溫，并且攪拌18小時。添加飽和nh4cl水溶液(20ml)，并且用ch2cl2(50ml×2)萃取所得混合物。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(甲醇/dcm＝0.5％至2.5％)純化以提供呈黃色油狀的((r)-1-(((r)-2,3-二羥基丙基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.9g，67.7％產(chǎn)率)。

冷卻于1,4-二噁烷(5ml)中含有((r)-1-(((r)-2,3-二羥基丙基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1.05g，1.48mmol)的混合物至0℃，并且逐滴添加于1,4-二噁烷中含有5mhcl的溶液(8ml)。攪拌所得反應(yīng)2小時，接著在減壓下濃縮以提供(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-(((r)-3-氨基-4-(((r)-2,3-二羥基丙基)氨基)-2-甲基-4-氧代丁烷-2-基)二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺的鹽酸鹽。

冷卻(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-(((r)-3-氨基-4-(((r)-2,3-二羥基丙基)氨基)-2-甲基-4-氧代丁烷-2-基)二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(鹽酸鹽，0.95g，1.47mmol)、煙酸(0.18g，1.5mmol)和hatu(0.67g,1.76mmol)于ch2cl2(20ml)中的混合物至0℃，并且添加許尼希氏堿(0.76g，5.9mmol)。使反應(yīng)混合物升溫至室溫，并且攪拌18小時。添加飽和nh4cl水溶液(30ml)，并且用ch2cl2(80ml×2)萃取所得混合物。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(甲醇/ch2cl2＝1.0％至3.5％)純化以提供呈黃色固體狀的n-((s)-1-(((r)-2,3-二羥基丙基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)煙酰胺(0.28g，26.9％產(chǎn)率)。ms(ei)：c38h56n4o5s2的計算值：712.37；實(shí)測值：713.15[m+h]⁺。

實(shí)施例6

制備n-((s)-1-((1,3-二羥基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)煙酰胺(iv-18)：

使用化合物iv-17(實(shí)施例5)的制備中概述的相同實(shí)驗(yàn)程序，例外之處是用2-氨基丙烷-1,3-二醇替代(r)-3-氨基丙烷-1,2-二醇。ms(ei)：c38h56n4o5s2的計算值：712.37；實(shí)測值：713.15[m+h]⁺。

實(shí)施例7

制備(1,3-二羥基丙烷-2-基)氨基甲酸(r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(煙酰氨基)丁酯(iv-6)：

根據(jù)實(shí)施例5中概述的程序，使用(r)-2-氨基-3-巰基-3-甲基丁酸作為適當(dāng)起始物質(zhì)來制備(r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁酸。將(r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁酸(8.0g，12.6mmol)溶解于thf(100ml)中，并且接著冷卻溶液至-15℃，同時依次添加n-甲基嗎啉(1.3g，13mmol)和氯甲酸異丁酯(1.8g，13mmol)。攪拌所得反應(yīng)混合物30分鐘。接著使它升溫至室溫并過濾。冷卻濾液至-20℃，小心添加硼氫化鈉(0.96g，25mmol)于水(2ml)中的混懸液。攪拌所得反應(yīng)混合物2小時，接著用水(200ml)淬滅。用ch2cl2(200ml×4)萃取所得混合物。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(甲醇/ch2cl2＝0.5％至1.2％)純化以提供呈黃色油狀的((r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-1-羥基-3-甲基丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(5.6g，71.8％產(chǎn)率)。將這個物質(zhì)(5.6g，9.03mmol)溶解于1,4-二噁烷(10ml)中，并且冷卻溶液至0℃，同時逐滴添加5mhcl/1,4-二噁烷(15ml)。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物30分鐘，接著在減壓下濃縮以提供(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-(((r)-3-氨基-4-羥基-2-甲基丁烷-2-基)二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺的鹽酸鹽。

將(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-(((r)-3-氨基-4-羥基-2-甲基丁烷-2-基)二硫烷基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺的鹽酸鹽(1mmol)連同煙酸(1mmol)、hatu(1.1mmol)和許尼希氏堿(1.5mmol)一起溶解于ch2cl2(10ml)中。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物4小時，并且用飽和nh4cl水溶液稀釋。分離兩層，并且有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(na2so4)并在減壓下濃縮。通過色譜法(ch2cl2/meoh9:1)純化提供n-((r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-1-羥基-3-甲基丁烷-2-基)煙酰胺。將這個物質(zhì)(0.5mmol)溶解于thf(5ml)中，并且接著冷卻溶液至0℃，同時添加吡啶(1.5mmol，3當(dāng)量)和氯甲酸4-硝基苯酯(0.6mmol)。使所得反應(yīng)混合物升溫至室溫，并且攪拌18小時。接著將它用飽和nh4cl水溶液稀釋，并且用ch2cl2萃取。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(na2so4)并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(meoh/ch2cl2＝0.5％至1.2％)純化以提供(1,3-二羥基丙烷-2-基)氨基甲酸(r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(煙酰氨基)丁酯。冷卻2-氨基丙烷-1,3-二醇(0.5mmol)、(1,3-二羥基丙烷-2-基)氨基甲酸(r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(煙酰氨基)丁酯(0.5mmol)于dmf(5ml)中的混合物至0℃，并且添加許尼希氏堿(1mmol)。使反應(yīng)混合物升溫至室溫，并且攪拌18小時。添加飽和nh4cl水溶液(20ml)，并且用ch2cl2萃取所得混合物。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(na2so4)并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(meoh/ch2cl2＝1.0％至3.5％)純化以提供(1,3-二羥基丙烷-2-基)氨基甲酸(r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(煙酰氨基)丁酯。

實(shí)施例8

制備n-((r)-1-((1,3-二羥基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)煙酰胺(iv-8)：

將n-((r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-1-羥基-3-甲基丁烷-2-基)煙酰胺(3.0mmol；可如實(shí)施例7中所述制備)溶解于ch2cl2(50ml)中，接著冷卻溶液至0℃，同時添加戴斯-馬丁(dess-martin)過碘烷(1.9g，4.5mmol)。使所得反應(yīng)混合物升溫至室溫，并且攪拌2小時。接著將它用鹽水稀釋，并且用ch2cl2(2×80ml)萃取。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(na2so4)并在減壓下濃縮以提供n-((r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)煙酰胺。將所得物質(zhì)(1mmol)連同2-氨基丙烷-1,3-二醇(1.2mmol)一起溶解于10mlch2cl2中，接著添加氰基硼氫化鈉(1.5mmol)。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物18小時，接著在減壓下濃縮?？赏ㄟ^硅膠色譜法純化n-((r)-1-((1,3-二羥基丙烷-2-基)氨基)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)煙酰胺。

實(shí)施例9

制備((r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(煙酰氨基)丁基)氨基甲酸1,3-二羥基丙烷-2-基酯(iv-14)：

冷卻于thf(50ml)中含有n-((r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-1-羥基-3-甲基丁烷-2-基)煙酰胺(3.6mmol；可如實(shí)施例7中所述制備)、鄰苯二甲酰亞胺(5.3mmol)和三苯基膦(5.3mmol)的混合物至0℃，并且添加偶氮二甲酸二異丙酯(diad，17mmol)。使反應(yīng)混合物升溫至室溫，并且攪拌2小時。添加飽和nh4cl(20ml)，并且用ch2cl2(2×50ml)萃取所得混合物。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(na2so4)并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(ch2cl2/meoh)純化以提供相應(yīng)鄰苯二甲酰亞胺。

將這個鄰苯二甲酰亞胺(2.5mmol)溶解于乙醇(20ml)中，并且添加nh2-nh2.h2o(85％，6ml)。攪拌所得反應(yīng)混合物30分鐘。所得反應(yīng)混合物用水(60ml)淬滅，并且用ch2cl2(2×50ml)萃取。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(na2so4)并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠(甲醇/ch2cl2)純化以提供n-((r)-1-氨基-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)煙酰胺。

將2-苯基-1,3-二噁烷-5-醇(0.5g，2.7mmol)溶解于thf(50ml)中，并且冷卻至0℃，同時添加吡啶(0.44g，5.4mmol)和氯甲酸4-硝基苯酯(0.84g，4.1mmol)。使所得反應(yīng)混合物升溫至室溫，并且攪拌2小時。用etoac(2×30ml)萃取所得混合物。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(na2so4)并在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(己烷/etoac)純化以提供(2-苯基-1,3-二噁烷-5-基)碳酸4-硝基苯酯。將這個物質(zhì)(1.0mmol)和n-((r)-1-氨基-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基丁烷-2-基)煙酰胺)(1.0mmol)溶解于dmf(20ml)中。冷卻混合物至0℃，并且添加許尼希氏堿(2.0mmol)。使所得反應(yīng)混合物升溫至室溫，并且攪拌18小時。添加飽和nh4cl水溶液(20ml)，并且用ch2cl2(2×50ml)萃取所得混合物。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(na2so4)并在減壓下濃縮。在室溫下用3nhcl-二噁烷(5ml)和meoh(1ml)處理所得殘余物2小時，接著在減壓下濃縮。所得殘余物通過硅膠色譜法(meoh/ch2cl2)純化以提供((r)-3-((2-((4z,7z,10z,13z,16z,19z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)二硫烷基)-3-甲基-2-(煙酰氨基)丁基)氨基甲酸1,3-二羥基丙烷-2-基酯。

實(shí)施例10

制備(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-巰基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(i-1)：

(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-巰基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺易經(jīng)受氧化以獲得相應(yīng)二硫醚形式，并且出于測定目的加以新鮮制備。根據(jù)wo2012/115695中概述的程序制備4z,4'z,7z,7'z,10z,10'z,13z,13'z,16z,16'z,19z,19'z)-n,n'-(二硫烷二基雙(乙烷-2,1-二基))雙(二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺。將這個物質(zhì)(125mg，0.162mmol)溶解于etoh(1.75ml)中。隨后添加外消旋二硫蘇糖醇(30mg，0.194mmol)至這個乙醇溶液中，繼之以添加250μl1nnaoh以使反應(yīng)混合物的ph達(dá)到約8.5-9.0。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物40分鐘。此時，lc/ms分析顯示完全還原成所需產(chǎn)物，即(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-巰基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺。此后，添加4.5mldmso至溶液中以形成50mm(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-n-(2-巰基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺的dmso儲備溶液。對于在24小時內(nèi)使用，在-20℃下儲存這個50mmdmso儲備溶液。多達(dá)5天的較長限期儲存需要在-80℃下儲存儲備溶液。

實(shí)施例11

脂肪酸半胱胺綴合物對huh-7或ht-29細(xì)胞中自噬和細(xì)胞表面cftr的作用。

化合物制備：首先將測試化合物溶解于100％dmso中成為50mm溶液，接著在fbs中稀釋100倍成為500μm10x儲備溶液。

免疫印跡：將huh-7細(xì)胞接種于10％fbsdmem中過夜。用在dmem中稀釋10倍的藥物(在10％fbsdmem中的終濃度是50μm)替換細(xì)胞培養(yǎng)基。在藥物添加之后4小時，在ripa緩沖液中溶解細(xì)胞。通過用抗lc3a/b抗體(cellsignaling12741)進(jìn)行免疫印跡來分析細(xì)胞溶解產(chǎn)物。將數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為相較于媒介物處理樣品的lc3-ii/lc3-i比率。

共焦顯微術(shù)：將huh-7細(xì)胞接種于蓋玻片上過夜。細(xì)胞用gfp-lc3bacman(lifetechnology)感染24小時，并且用化合物ii-2處理。4小時后，將細(xì)胞固定在2％多聚甲醛中，并且用具有dapi的抗褪色劑(lifetechnology)封固。用zeisslsm510，以40x鏡頭獲取圖像。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，gfp-lc3(綠色熒光)點(diǎn)狀染色增強(qiáng)是自噬活化的特征。

細(xì)胞表面生物素化：在10mm²板中將ht-29細(xì)胞以2.0x10⁶個細(xì)胞接種于10％fbsdmem中過夜。用在dmem中稀釋10倍的藥物(在10％fbsdmem中的終濃度是50μm)替換細(xì)胞培養(yǎng)基。在藥物添加之后24小時，使用pierce細(xì)胞表面蛋白分離試劑盒(thermoscientific89881)處理細(xì)胞以測定細(xì)胞表面生物素化。簡要來說，用冷pbs將細(xì)胞洗滌一次并與磺基-nhs-ss-生物素一起在4℃下孵育30分鐘，并且通過添加淬滅溶液來終止反應(yīng)。刮取細(xì)胞并溶解，并且在10,000xg下離心。使細(xì)胞混懸液與中和親和素瓊脂糖一起在室溫下孵育60分鐘。在ripa緩沖液中溶解細(xì)胞集結(jié)塊(細(xì)胞內(nèi))。通過含有50mmdtt的sds-page樣品緩沖液來洗脫結(jié)合于中和親和素瓊脂糖的蛋白質(zhì)(細(xì)胞表面)。細(xì)胞表面部分與細(xì)胞內(nèi)部分兩者均通過用抗cftr抗體進(jìn)行免疫印跡來分析。

結(jié)果

在huh細(xì)胞中，在脂肪酸半胱胺衍生物ii-2的兩種測試濃度即25和50μm下，用化合物ii-2處理均導(dǎo)致自噬標(biāo)志物lc3-ii(下部條帶)水平增加(參見圖1a)。在25μm的較低濃度下定量分析揭示用化合物ii-2處理使lc3-ii與lc3-i的比率增加(圖1b)，從而指示lc3-i向作為自噬形成的分子標(biāo)志物的lc3-ii的轉(zhuǎn)化增加。如levine和kroemer(2008)cell,132,第27-42頁中所指示，lc3-ii/lc3-i的比率增加指示自噬已被活化。在ht-29細(xì)胞的情況下用化合物ii-3進(jìn)行相同孵育實(shí)驗(yàn)。如圖2c中所示，當(dāng)使ht-29細(xì)胞與化合物ii-3(50μm)一起孵育時，自噬被活化，如由當(dāng)相較于媒介物對照組時，lc3-ii與lc3-i的比率增加所反映。隨著這些ht-29細(xì)胞中的自噬被活化，當(dāng)相較于媒介物對照組時，細(xì)胞表面cftr存在相應(yīng)增加(圖2d)。圖2e概述當(dāng)使ht-29細(xì)胞與50μm的化合物iv-11和iv-12一起孵育時的結(jié)果。因?yàn)樽允杀换罨?，所以對于含有化合物iv-11或iv-12的處理組，細(xì)胞表面cftr存在相應(yīng)增加。

實(shí)施例12

脂肪酸半胱胺綴合物在huh-7或ht-29細(xì)胞的情況下的協(xié)同性質(zhì)

使用實(shí)施例11中詳述的相同實(shí)驗(yàn)程序，例外之處是在藥物添加之后2小時，在ripa緩沖液中溶解細(xì)胞，而非先前所述的4小時。再次通過用抗lc3a/b抗體(cellsignalingtechnology12741)進(jìn)行免疫印跡來分析細(xì)胞溶解產(chǎn)物。將數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為相較于媒介物處理樣品的lc3-ii/lc3-i比率。如圖2a中所示，當(dāng)相較于用胱胺(50μm)、epa(50μm)或胱胺(50μm)和epa(50μm)的組合進(jìn)行的類似處理時，用化合物ii-2在50μm下處理導(dǎo)致自噬標(biāo)志物lc3-ii(下部條帶)協(xié)同增加。定量分析揭示當(dāng)相較于媒介物對照時，lc3-ii與lc3-i的比率增加兩倍(圖2b)。這證明lc3-i向作為自噬活化的已知分子標(biāo)志物的lc3-ii的轉(zhuǎn)化增加?；衔飅i-2顯示協(xié)同自噬活化；所述自噬活化是一種當(dāng)使用個別組分或個別組分的組合(即胱胺和epa)時實(shí)現(xiàn)的作用。

在huh-7細(xì)胞的情況下，在用化合物ii-2以及較高濃度的個別組分(各自250μm的胱胺、epa或胱胺和epa的組合)處理4小時之后重復(fù)這個相同協(xié)同實(shí)驗(yàn)。結(jié)果概述于圖3a和3b中。再次，用50μm的化合物ii-2處理細(xì)胞導(dǎo)致協(xié)同以及較高程度的自噬活化，如由lc3-ii與lc3-i的較大比率所指示。即使用高得多的濃度的胱胺(250μm)、epa(250μm)或胱胺和epa的組合(各自250μm)，也未實(shí)現(xiàn)這個自噬活化程度。

使用ht-29細(xì)胞，用化合物ii-3重復(fù)這個相同協(xié)同實(shí)驗(yàn)。在這個實(shí)驗(yàn)中，使ht-29細(xì)胞與各以下處理組一起孵育24小時：1)媒介物對照組；2)胱胺(25μm)；3)dha(25μm)；4)胱胺(25μm)和dha的組合；5)胱胺(250μm)；6)dha(250μm)；7)胱胺(250μm)和dha(250μm)的組合；8)化合物ii-3(25μm)。結(jié)果概述于圖4中。所示結(jié)果代表三個單獨(dú)測量結(jié)果的平均值。當(dāng)相較于媒介物對照組時，用25μm的化合物ii-3處理的ht-29細(xì)胞顯示協(xié)同以及較高程度的自噬活化，如由lc3-ii與lc3-i的較大比率所指示。這個自噬活化程度未以任何以下處理組實(shí)現(xiàn)：1)媒介物對照組；2)胱胺(25μm)；3)dha(25μm)；4)胱胺(25μm)和dha的組合；5)胱胺(250μm)；6)dha(250μm)；7)胱胺(250μm)和dha(250μm)的組合。如圖4中所示，與化合物ii-3相關(guān)的自噬活化活性不可用個別組分(即25μm或250μm的胱胺和dha)或個別組分的組合處理這些原代cf細(xì)胞來重現(xiàn)。

實(shí)施例13

脂肪酸半胱胺綴合物對δf508cftr缺失突變純合性原代cf人支氣管上皮細(xì)胞的作用：免疫印跡分析和免疫沉淀

預(yù)期本發(fā)明化合物由于它們活化自噬的能力而可適用于治療cf。在以下細(xì)胞測定中評估本發(fā)明化合物以確定它們將缺陷性突變cftr拯救至細(xì)胞膜的能力。

從asterandbioscience(detroit,mi)或作為隸屬于charlesriver的公司的chantest(cleveland,oh)獲得來自純合δf508cf患者的原代細(xì)胞。接著在各種濃度下處理細(xì)胞以確定化合物恢復(fù)缺陷性cftr的能力。如derichs(2013)eur.resp.rev.,22,第58-65頁中所綜述，通過免疫印跡成功檢測到突變cftr條帶c指示缺陷性cftr可被拯救至細(xì)胞膜。

化合物制備

首先將本發(fā)明化合物溶解于100％dmso中成為50mm溶液，接著在fbs中稀釋100倍成為500μm10x儲備溶液。

免疫印跡

制備原代cf細(xì)胞(純合δf508，來源：chantest，kkcfft004i)，并且根據(jù)amaral,m.d.和kunzelmann,k.(編)cysticfibrosis,methodsinmolecularbiology,741,doi10.1007/978-1-61779-117-8_4springerscience+businessmedia,llc2011)中概述的程序使所述原代cf細(xì)胞在snapwell^tm過濾插件上生長。將原代cf細(xì)胞保持在由以下組成的分化培養(yǎng)基中：杜貝卡氏mem(dmem)/f12、ultroser-g(2.0％；pall，目錄號15950-017)、胚胎克隆ii(2％)、胰島素(2.5μg/ml)、牛腦提取物(0.25％；lonza，試劑盒編號cc-4133，組分編號cc-4092c)、氫化可的松(20nm)、三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine)(500nm)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)(2.5μg/ml：invitrogen，目錄號0030124sa)、乙醇胺(250nm)、腎上腺素(1.5μm)、磷酸乙醇胺(250nm)和視黃酸(10nm)。接著在37℃下將根據(jù)以上概述的程序溶解于fbs中并稀釋至所需濃度的測試化合物于分化培養(yǎng)基中添加至個別snapwell^tm過濾插件中。在藥物添加之后24小時，快速冷凍細(xì)胞，并且稍后在ripa緩沖液中溶解。通過bio-rad蛋白質(zhì)測定來測定蛋白質(zhì)的量。通過用抗cftr抗體、抗自噬蛋白-1抗體、抗p62抗體和抗lc3抗體進(jìn)行免疫印跡來分析50μg總細(xì)胞溶解產(chǎn)物。用肌動蛋白(actin)作為上樣對照來使免疫活性標(biāo)準(zhǔn)化。將數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為相較于媒介物處理樣品的cftr-條帶-c/肌動蛋白、自噬蛋白-1/肌動蛋白、p62/肌動蛋白和lc3-ii/lc3-i比率。針對cftr的抗體克隆m3a7(cellsignalingtechnology，2269)、lc3a/b抗體(cellsignaling，12741)、自噬蛋白-1抗體(cellsignalingtechnology，3495)、p62抗體(cellsignalingtechnology，5114)和β-肌動蛋白抗體(cellsignalingtechnology，4970)用作初級抗體。

使化合物ii-3在這些原代cf細(xì)胞的情況下孵育24小時，并且通過免疫印跡來定量在功能上被拯救的cftr條帶c的量。圖5a概述當(dāng)使這些原代cf細(xì)胞(δf508純合性，chantest，kkcfft004i)與以下處理組一起孵育24小時時的結(jié)果：1)媒介物+vx-770(100nm)；2)vx-809(3μm)+vx-770(100nm)的組合；3)化合物ii-3(25μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)的組合；4)化合物ii-3(10μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)的組合。用組合vx-809+vx-770處理原代cf細(xì)胞導(dǎo)致cftr條帶c的量增加。如圖5a中所示，化合物ii-3與vx-809和vx-770的組合產(chǎn)生cftr條帶c的量更顯著增加。所述作用也具有劑量依賴性。所示結(jié)果代表三個單獨(dú)測量結(jié)果的平均值。

也使化合物i-1在這些原代cf細(xì)胞的情況下孵育24小時，并且通過免疫印跡來定量在功能上被拯救的cftr條帶c的量。圖5b概述當(dāng)使這些原代cf細(xì)胞(δf508純合性，chantest，kkcfft0041)與以下處理組一起孵育24小時時的結(jié)果：1)媒介物+vx-770(100nm)；2)vx-809(3μm)+vx-770(100nm)的組合；3)化合物i-1(25μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)的組合；4)化合物i-1(10μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)的組合。如圖5b中所示，化合物i-1與vx-809和vx-770的組合產(chǎn)生cftr條帶c的量更顯著增加。所述作用也具有劑量依賴性。所示結(jié)果代表三個單獨(dú)測量結(jié)果的平均值。

使用這些原代cf細(xì)胞，如實(shí)施例12中進(jìn)行相同類型的協(xié)同實(shí)驗(yàn)。圖5c概述當(dāng)使原代cf細(xì)胞(純合δf508，來源：chantest，kkcfft004i)與以下處理組一起孵育24小時時的結(jié)果：1)媒介物對照組；2)胱胺(25μm)；3)dha(25μm)；4)胱胺(25μm)和dha(25μm)的組合；5)胱胺(250μm)；6)dha(250μm)；7)胱胺(250μm)和dha(250μm)的組合；8)化合物ii-3(25μm)。如圖5c中所示，化合物ii-3(在25μm下)活化原代cf細(xì)胞中的自噬，如由相較于媒介物對照組，lc3-ii與lc3-i的比率增加所指示。這個自噬活化水平不可通過用個別組分(即25μm或250μm的胱胺和dha)或個別組分的組合處理這些原代cf細(xì)胞來重現(xiàn)。所示結(jié)果代表三個單獨(dú)測量結(jié)果的平均值。

在原代cf細(xì)胞的情況下進(jìn)行的協(xié)同實(shí)驗(yàn)也可用于評估可在功能上被拯救的cftr條帶c的水平。圖5d概述當(dāng)使原代cf細(xì)胞(純合δf508，來源：chantest，kkcfft004i)與以下處理組一起孵育24小時時的結(jié)果：1)媒介物對照組；2)胱胺(25μm)；3)dha(25μm)；4)胱胺(25μm)和dha(25μm)的組合；5)胱胺(250μm)；6)dha(250μm)；7)胱胺(250μm)和dha(250μm)的組合；8)化合物i-1(25μm)。如圖5d中所示，當(dāng)用25μm的化合物i-1處理原代cf細(xì)胞時，cftr條帶c的量存在顯著增加。這個作用不可通過用個別組分(即25μm或250μm的胱胺和dha)或個別組分的組合處理這些原代cf細(xì)胞來重現(xiàn)。所示結(jié)果代表三個單獨(dú)測量結(jié)果的平均值。

圖5e、5f、5g和5h概述使用原代cf細(xì)胞(純合δf508)對化合物ii-3的作用機(jī)理研究的結(jié)果。所示結(jié)果代表三個單獨(dú)測量結(jié)果的平均值。在cf中，自噬被阻抑。隨著用作為自噬活化劑的化合物ii-3使自噬恢復(fù)，應(yīng)觀察到相應(yīng)自噬蛋白-1增加、p62的量降低以及最終cftr條帶c的量增加。用以下處理組處理原代cf細(xì)胞(純合δf508)24小時：1)媒介物+vx-770(100nm)；2)化合物ii-3(25μm)+vx-770(100nm)；3)vx-809(3μm)+vx-770(100nm)；4)化合物ii-3(25μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)。圖5e顯示隨著自噬被恢復(fù)，包括化合物ii-3的2個處理組顯示lc3-ii與lc3-i的比率的預(yù)期增加。因?yàn)樽允杀辉黾?，所以在包括化合物ii-3的2個處理組的情況下存在相應(yīng)自噬蛋白-1的水平增加(圖5f)和p62的水平降低(圖5g)。p62的水平降低使一些錯誤折疊的δf508cftr逃脫在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中隔離，并且被運(yùn)送至細(xì)胞表面。這反映在cftr條帶c增加。如圖5h中所示，當(dāng)相較于vx-809(3μm)+vx-770(100nm)組合時，化合物ii-3(25μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)的組合顯示顯著累加作用。

實(shí)施例14

通過尤斯室在fisher大鼠甲狀腺上皮細(xì)胞的情況下評估化合物對cftr離子通道活性的功能性拯救。

cf跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子(cftr)氯離子通道的最普遍致病突變是cftr的一級序列中在位置508處的苯丙氨酸的缺失(δf508-cftr)。這個突變導(dǎo)致運(yùn)輸缺陷，從而導(dǎo)致細(xì)胞表面處δf508-cftr蛋白嚴(yán)重降低。運(yùn)輸缺陷可通過在低溫下孵育(27℃過夜)，或在藥理學(xué)上通過小分子和cftr校正劑來校正。將監(jiān)測在snapwell^tm過濾插件上生長的單細(xì)胞層中過度表達(dá)δf508-cftr的fisher大鼠甲狀腺(frt)上皮細(xì)胞的氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，因?yàn)閏ftr激動劑激起尤斯上皮電壓鉗裝置的短路(isc)電流輸出。這個研究的目標(biāo)在于測量測試化合物使frt上皮細(xì)胞單層中缺陷性δf508-cftr恢復(fù)功能的能力。

將校正劑功效的測量分成兩個階段。初始階段是使上皮與測試化合物一起在37℃孵育器中孵育一段時期(可在2小時至1或2天的范圍內(nèi))，并且第二階段是用上皮電壓鉗(尤斯測定)測量上皮δf508-cftr氯離子通道電流。在短路條件(0mv跨上皮電位)下測量短路電流(isc)。isc大小是校正劑功效的指標(biāo)，并且將其與媒介物和陽性對照進(jìn)行比較。

使低溫保存的用δf508-cftrcdna穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的frt細(xì)胞(pedemonte等(2005)j.clin.invest.,115,第2564-2571頁)擴(kuò)增，并且涂鋪在snapwell^tm過濾器上以在尤斯裝置(physiologicinstruments,inc.,sanddiego,ca)中測量短路電流。使細(xì)胞在漢姆氏f-12培養(yǎng)基(ham’sf-12media)的補(bǔ)充以澤奧辛(zeocin)和g-418的庫恩氏改良形式(coon’smodification)中生長。

為進(jìn)行測定，如下溶解本發(fā)明化合物：

1)在100％dmso中制備25mm儲備溶液。

2)在1.20mlfbs中稀釋12μl25mm儲備溶液以制備250μm中間稀釋10x儲備物(1％dmso，99％fbs)。溫和渦旋所有溶液直至溶液變澄清。

3)通過添加400μl10x儲備物和600μl10x載體(1％dmso，99％fbs)至9000μl庫恩氏培養(yǎng)基中來制備于10ml庫恩氏培養(yǎng)基中10μm的每孔最終稀釋液(4個孔x2ml(每個孔底部)+0.2ml(每個插件頂部)＝8.8ml，并且有1.2ml后備物以防止處理損失)。

對于這個實(shí)施例，使測試化合物溶解，并且添加至尤斯室的適當(dāng)插件中(對于各測試化合物，n＝4，最終測試濃度是10μm)。也使用dmso媒介物對照和陽性對照(在3μm下的vx-809)。對于這個特定實(shí)施例，使包括陽性對照的所有測試物品都與細(xì)胞一起孵育4小時的時期。將在snapwell^tm過濾插件上生長的frt細(xì)胞單層轉(zhuǎn)移至physiologicinstruments尤斯記錄室(physiologicinstruments,inc.,sandiego,ca)中，并且用hb-ps在底側(cè)上以及78cf-ps在頂側(cè)上澆注。接著組合使用一個或多個6通道或8通道physiologicinstrumentsvccmc6或vccmc8上皮電壓鉗以記錄整個操作期間的短路電流(isc)。為開始isc測量，添加兩性霉素(amphotericin)(100μm)至snapwell^tm過濾插件的底側(cè)以對上皮細(xì)胞進(jìn)行可滲透化處理15分鐘。在以下孵育時期(分別是15分鐘、20分鐘、10分鐘、15分鐘和15分鐘)之后依序添加毛喉素(10μm)、ibmx(100μm)、染料木黃酮(20μm)和cftrinh-172(20μm)。使用iworx數(shù)據(jù)采集硬件和labscribe2軟件(iworx,dover,nh)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。依次用單因素anova以及鄧奈特氏多重比較檢驗(yàn)(dunnett’smultiplecomparisontest)和史都登氏t檢驗(yàn)(student’st-test)(當(dāng)適當(dāng)時)獲得在校正劑陽性對照、陰性對照和測試物品處理的上皮之間由激動劑激起的isc的比較。將顯著校正規(guī)定為處于p<0.05的水平下。

在這個測定中，當(dāng)依序用毛喉素、ibmx和cftr增效劑染料木黃酮處理細(xì)胞時，陽性對照vx-809能夠在測試條件下在功能上拯救缺陷性cftr。為測試cftr特異性，在接近操作完成時添加可商購獲得的抑制劑cftrinh-172(其具有化學(xué)名稱(e)-4-((4-氧代-2-硫代-3-(3-(三氟甲基)苯基)噻唑烷-5-亞基)甲基)苯甲酸(cas號307510-92-5))以使短路電流下降至基線。使用這個測定方案，在frt細(xì)胞尤斯室中評估化合物ii-2(10μm)。接著從這個類型的實(shí)驗(yàn)獲得短路電流(isc)隨時間(分鐘)的跡線，并且將此顯示于圖6中?；衔飅i-2能夠在功能上拯救cftr功能，因?yàn)楫?dāng)相較于媒介物對照組時，短路電流存在增加。

這個測定的替代性方案涉及將本發(fā)明化合物連同vx-770或vx-809和vx-770的組合一起長期預(yù)孵育。在這個方案的情況下，使用以上概述的相同方案，使本發(fā)明化合物與vx-770或vx-770和vx-809的組合一起預(yù)孵育24小時。首先添加兩性霉素(100μm)以對細(xì)胞膜進(jìn)行可滲透化處理。在添加兩性霉素之后15分鐘，添加毛喉素(20μm)。在添加毛喉素之后20分鐘，添加可商購獲得的抑制劑cftrinh-172。接著在添加cftrinh-172之后15分鐘終止反應(yīng)。接著從這個類型的實(shí)驗(yàn)獲得短路電流的代表性跡線。當(dāng)在媒介物組與陽性對照組之間進(jìn)行比較時，評估本發(fā)明化合物的功能活性。對于所有尤斯室實(shí)驗(yàn)，陽性對照都是cftr校正劑vx-809(3μm)和cftr增效劑vx-770(100nm)的組合。對短路電流進(jìn)行定量以測定在兩個不同時間點(diǎn)的δisc，第一時間點(diǎn)是在添加毛喉素后，并且稍后時間點(diǎn)是在添加cftrinh-172后(對于測定的更詳盡描述，請參閱vangoor等(2011)pnas,108,第46期,第18843-18848頁)。圖7a、7b、7c、7d和7e概述當(dāng)使frt細(xì)胞與以下處理組一起孵育24小時時的數(shù)據(jù)：1)媒介物+vx-770(100nm)；2)化合物ii-3(10μm)+vx-770(100nm)；3)陽性對照組，vx-809(3μm)+vx-770(100nm)；4)化合物ii-3(10μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)。用4個單獨(dú)插件評估各處理組。如圖7a中所示，在這個測定中，化合物ii-3具有功能活性，如由短路電流增加所指示；所述作用在ii-3(10μm)+vx-809+vx-770的組合的情況下最顯著。圖7b顯示對在添加毛喉素后的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)的定量，如通過δisc(μa/cm²)所測量；而圖7c顯示表示為對照％的相同響應(yīng)(將陽性對照vx-809+vx-770表示為100％)。當(dāng)相較于媒介物+vx-770組時，ii-3(10μm)+vx-770的組合產(chǎn)生適度響應(yīng)。由ii-3(10μm)+vx-809+vx-770組成的組合產(chǎn)生相比于陽性對照的顯著143.6％增加。圖7d顯示對在添加cftrinh-172后的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)的定量，如通過δisc(μa/cm²)所測量；而圖7e顯示表示為對照％的相同響應(yīng)(將陽性對照vx-809+vx-770表示為100％)。再次，在這個時間點(diǎn)，由ii-3(10μm)+vx-809+vx-770組成的組合產(chǎn)生相比于陽性對照組的顯著144.0％增加。

實(shí)施例15

通過尤斯室在原代cf支氣管上皮細(xì)胞(純合δf508)的情況下評估化合物對cftr離子通道活性的功能性拯救。

制備原代cf細(xì)胞(純合δf508，來源：chantest，kkcfft004i)，并且根據(jù)amaral,m.d.和kunzelmann,k.(編)cysticfibrosis,methodsinmolecularbiology741,doi10.1007/978-1-61779-117-8_4springerscience+businessmedia,llc2011)中概述的程序使其在snapwell^tm過濾插件上生長。將原代cf細(xì)胞保持在由以下組成的分化培養(yǎng)基中：杜貝卡氏mem(dmem)/f12、ultroser-g(2.0％；pall，目錄號15950-017)、胚胎克隆ii(2％)、胰島素(2.5μg/ml)、牛腦提取物(0.25％；lonza，試劑盒編號cc-4133，組分編號cc-4092c)、氫化可的松(20nm)、三碘甲腺原氨酸(500nm)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(2.5μg/ml：invitrogen，目錄號0030124sa)、乙醇胺(250nm)、腎上腺素(1.5μm)、磷酸乙醇胺(250nm)和視黃酸(10nm)。

如下在fbs中溶解測試化合物：在離心管中在10.0mlfbs中稀釋100μl25mm測試化合物dmso儲備溶液以制備中間250μm中間稀釋10×儲備物(1％dmso，99％fbs)。使這個溶液在離心管中在室溫下擱置1小時，接著丟棄；然后在所述經(jīng)調(diào)節(jié)離心管中制備新的250μm10×儲備物。這個10×儲備溶液用于制備隨后測試物品濃度。舉例來說，通過添加1000μl10×儲備溶液至9000μl分化培養(yǎng)基中來制備于10ml分化培養(yǎng)基中25μm濃度。使這個25μm溶液在離心管中在室溫下擱置1小時，接著丟棄；并且然后在所述經(jīng)調(diào)節(jié)離心管中制備新的25μm溶液。通過添加400μl10×儲備溶液至9000μl分化培養(yǎng)基和600μl的1％dmso、99％fbs溶液中來制備于10ml分化培養(yǎng)基中10μm濃度。通過添加適當(dāng)體積的10×儲備溶液至分化培養(yǎng)基以及1％dmso、99％fbs溶液中來以相同方式制備于10ml分化培養(yǎng)基中隨后3和1μm濃度。上述相同調(diào)節(jié)步驟用于所有稀釋步驟中。

為進(jìn)行尤斯室測定，接著在37℃下將根據(jù)以上概述的程序溶解于fbs中并稀釋至所需濃度的測試化合物于分化培養(yǎng)基中添加至個別snapwell^tm過濾插件中。在藥物添加之后24小時，將插件轉(zhuǎn)移至physiologicinstruments尤斯記錄室(physiologicinstruments,inc.；sandiego,ca)中，并且用hepes緩沖生理鹽水(hb-ps)維持在頂端室與底側(cè)室兩者中，所述hepes緩沖生理鹽水具有以下組成(以mm計)：nacl，137；kcl，4.0；cacl2，1.8；mgcl2，1；hepes，10；葡萄糖，10；用naoh調(diào)整ph至7.4。接著組合使用一個或多個6通道或8通道physiologicinstrumentsvccmc6或vccmc8上皮電壓鉗以記錄整個操作期間的短路電流(isc)。在27℃下進(jìn)行短路isc測量。為開始操作，添加阿米洛利(30μm)至snapwell^tm過濾插件的頂側(cè)以阻斷上皮na通道(enac)。15分鐘后，添加毛喉素(10μm)以活化cftr。60分鐘后，通過添加cftrinh-172(20μm)來終止實(shí)驗(yàn)。使用iworx數(shù)據(jù)采集硬件和labscribe2軟件(iworx,dover,nh)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。依次用單因素anova以及鄧奈特氏多重比較檢驗(yàn)和史都登氏t檢驗(yàn)(當(dāng)適當(dāng)時)獲得在校正劑陽性對照、陰性對照和測試物品處理的上皮之間由激動劑激起的isc的比較。將顯著校正規(guī)定為處于p<0.05的水平下。

圖8a、8b和8c概述當(dāng)使原代cf細(xì)胞與以下處理組一起孵育24小時時的數(shù)據(jù)：1)媒介物+vx-770(100nm)；2)陽性對照組，vx-809(3μm)+vx-770(100nm)；3)化合物ii-3(1μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)。圖8a顯示在測定期間測量的短路電流(isc)的跡線。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，圖8a中所示的跡線指示相比于陽性對照，即由vx-809+vx-770組成的組合，由化合物ii-3(1μm)+vx-809+vx-770組成的組合在功能上更具活性。圖8b顯示對在毛喉素添加后的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)的定量，如通過δisc(μa/cm²)所測量。相比于陽性對照組(即vx-809+vx-770)，由ii-3(1μm)+vx-809+vx-770組成的組合在功能上更具活性，如由δisc增加更多所指示。圖8c顯示對總響應(yīng)的定量，如通過曲線下面積(auc)所測量，并且表示為對照％(其中將陽性對照表示為100％)。如圖8c中所示，當(dāng)相較于陽性對照(即vx-809+vx-770)時，由ii-3(1μm)+vx-809+vx-770組成的組合顯示137.8％auc增加。

圖9a、9b和9c概述當(dāng)使原代cf細(xì)胞與以下處理組一起孵育24小時時的數(shù)據(jù)：1)媒介物+vx-770(100nm)；2)陽性對照組，vx-809(3μm)+vx-770(100nm)；3)化合物i-1(1μm)+vx-809(3μm)+vx-770(100nm)。圖9a顯示在測定期間測量的短路電流(isc)的跡線。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，圖9a中所示的跡線指示相比于陽性對照，即由vx-809+vx-770組成的組合，由化合物i-1(1μm)+vx-809+vx-770組成的組合在功能上更具活性。圖9b顯示對在毛喉素添加后的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)的定量，如通過δisc(μa/cm²)所測量。相比于陽性對照組(即vx-809+vx-770)，由i-1(1μm)+vx-809+vx-770組成的組合在功能上更具活性，如由δisc增加更多所指示。圖9c顯示對總響應(yīng)的定量，如通過曲線下面積(auc)所測量，并且表示為對照％(其中將陽性對照表示為100％)。如圖9c中所示，當(dāng)相較于陽性對照(即vx-809+vx-770)時，由i-1(1μm)+vx-809+vx-770組成的組合顯示130.8％auc增加。

實(shí)施例16

使用人支氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行的體外細(xì)菌清除測定。

在這個測定中，培養(yǎng)正常16hbe細(xì)胞，并且使用48孔板，以每孔2×10⁵個細(xì)胞加以接種。在37℃下在5％co2下孵育所得板直至約90％匯合。然后用化合物ii-3處理細(xì)胞24小時，接著用銅綠假單胞菌菌株xen05在1:50的感染復(fù)數(shù)(moi)(即細(xì)胞:細(xì)菌的比率)下感染2小時。接著使細(xì)胞與500μl由非可滲透性抗生素(各自50u/ml青霉素和鏈霉素與200μg/ml慶大霉素混合)組成的混合物一起孵育3小時以移除細(xì)胞外細(xì)菌。之后，使細(xì)胞溶解，并且進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)以測定剩余細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌載量。如圖10中所示，在25μm的測試濃度下，化合物ii-3誘導(dǎo)有效細(xì)胞內(nèi)銅綠假單胞菌清除。細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌殺滅作用與通過陽性對照細(xì)胞松弛素-d(即一種細(xì)胞可滲透性抗生素)觀察的殺滅作用類似。

實(shí)施例17

用以評估脂肪酸半胱胺綴合物的血漿穩(wěn)定性的測定

研究測試化合物在人、小鼠、比格犬(beagle)和大鼠血漿(血漿購自bioreclamation)中的體外穩(wěn)定性。用pbs(ph7.4)將血漿稀釋至50％。將測試化合物在dmso中溶解至10mm的終濃度，接著在meoh中稀釋至1mm。在5μm的測試化合物濃度和2.5％的最終dmso濃度下進(jìn)行孵育。添加血漿(198μl)至96孔板中，并且在37℃下孵育30分鐘，隨后添加2μl測試化合物。接著在37℃下孵育所得混合物2小時。在適當(dāng)時間間隔(0、30、60和120分鐘)下，移除等分試樣(50μl)，并且通過添加200μl具有內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物的乙腈來終止反應(yīng)。同時，通過添加200μl乙腈內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物來終止含有苯氟雷司(benflourex)或普魯卡因(procaine)(對照化合物)的血漿樣品。在4℃下在3500rpm下離心樣品板45分鐘，并且將上清液轉(zhuǎn)移至新板中以通過lc/ms-ms(agilent型號：hplc：1200，ms：6410)來分析。用phenomenexc6-苯基(5u)柱實(shí)現(xiàn)色譜分離。由含0.1％甲酸的水和含0.1％甲酸的甲醇組成的二元梯度用于分析物洗脫。

在這個測定中評估化合物ii-2和化合物ii-3。圖11a和11b概述兩種化合物在小鼠和大鼠血漿中的血漿穩(wěn)定性。在小鼠血漿與大鼠血漿兩者中，化合物ii-2均不穩(wěn)定，如由在0.5、1和2小時時間點(diǎn)母體化合物損失所指示(圖11a)。相比之下，并且出乎意料地，在0.5、1和2小時時間點(diǎn)，緊接于二硫鍵具有孿位甲基的化合物ii-3顯示完全血漿穩(wěn)定性(圖11b)。

實(shí)施例18

在口服插管大鼠pk研究中評估脂肪酸半胱胺綴合物

將本發(fā)明化合物溶解于由40％吐溫、50％peceol、10％peg400組成的賦形劑的混合物中，并且用水稀釋以形成自乳化水性混合物以向動物口服施用。對于這個研究，使用已通過手術(shù)用置留性頸靜脈導(dǎo)管(jvc)和門靜脈導(dǎo)管(pvc)植入的spraguedawley大鼠(agilux,worcester,ma)。使用雙插管大鼠的這個方法允許測量在門靜脈中遞送的藥物濃度以及存在于外周中的藥物濃度。對于pk研究，在以下時間點(diǎn)在門靜脈與頸靜脈兩者處進(jìn)行連續(xù)血液收集：給藥后10、20、40分鐘以及1、2、4和6小時。pk研究的生物分析部分使用lc/ms/ms系統(tǒng)(agilent型號：hplc：1200，ms：6410)進(jìn)行，并且用適當(dāng)軟件(winnonlinphoenix646.3.0395)分析。

在這個口服插管大鼠pk實(shí)驗(yàn)中評估化合物ii-2和ii-3。對于化合物ii-2，因?yàn)樗诖笫笱獫{中不穩(wěn)定，所以在口服給藥后大量母體化合物被降解?；衔飅i-2的門靜脈cmax是20.8±9.45ng/ml，伴隨12.5±6.5hr*ng/ml的auclast。在全身性循環(huán)中，化合物ii-2的外周cmax是0.889±0.33ng/ml，伴隨0.443±0.221hr*ng/ml的auclast。對于化合物ii-3，門靜脈cmax是331±120ng/ml，伴隨679±226hr*ng/ml的auclast。存在于化合物ii-3中的孿位甲基也致使它對首過代謝更具有抗性。相較于化合物ii-2，在全身性循環(huán)中，顯著更高比例的母體化合物ii-3是口服生物可用的?；衔飅i-3的相應(yīng)外周cmax是102±16.9ng/ml，伴隨300±103hr*ng/ml的auclast。母體化合物ii-3的外周cmax比母體化合物ii-2的相應(yīng)外周cmax高100倍。

實(shí)施例19

體內(nèi)測定自噬活化

為評估體內(nèi)自噬活化，用化合物ii-3對天然雄性c57bl/6小鼠口服給藥(100mg/kg，每日兩次，3.5天)。在末次劑量之后1小時，收集肺組織和血漿以分析藥物濃度和自噬生物標(biāo)志。如較早實(shí)施例中所討論，lc3-ii與lc3-i的比率用作自噬生物標(biāo)志。當(dāng)用化合物ii-3口服給藥時，在血漿與肺組織兩者中均檢測到母體化合物(即ii-3)和主要代謝物(即化合物i-1)。在末次劑量之后1小時，母體化合物ii-3的血漿濃度是143.0±52.35ng/ml，并且相應(yīng)代謝物i-1是741.37±170.2ng/ml。在這個時間點(diǎn)，小鼠肺組織母體化合物ii-3濃度是536.48±24.01ng/g。也在肺組織中檢測到代謝物i-1，處于411.48±164.0ng/g的濃度下。在100mg/kg的給定劑量下，化合物ii-3能夠誘導(dǎo)自噬，并且經(jīng)分離肺組織中l(wèi)c3-ii與lc3-i的比率增加22％具有統(tǒng)計顯著性(p＝0.04，圖12)。

實(shí)施例20

在鼠肺銅綠假單胞菌感染模型中評估脂肪酸半胱胺綴合物

在這個鼠肺銅綠假單胞菌感染模型的情況下，以每籠10個動物的5組使6-7周齡的雌性balb/c小鼠適應(yīng)1周。從在感染之前3.5天開始，用化合物ii-3(如上所述加以配制)在100mg/kg下每日兩次口服治療動物；接著在整個研究時期內(nèi)使動物繼續(xù)進(jìn)行相同ii-3治療。在這個研究中使用4個其它治療組，包括媒介物對照和陽性對照組：組1)媒介物，口服(從第-3.5天開始每日兩次)和皮下(從感染后8小時開始每日兩次)；組2)化合物ii-3口服(每日兩次，從第-3.5天開始100mg/kg)加媒介物皮下(從感染后8小時開始每日兩次)；組3)環(huán)丙沙星，陽性對照，次有效劑量，1mg/kg皮下(從感染后8小時開始每日兩次)，加媒介物口服(從第-3.5天開始每日兩次)；組4)環(huán)丙沙星，1mg/kg皮下(從感染后8小時開始每日兩次)，加化合物ii-3口服(每日兩次，100mg/kg，從第-3.5天開始)；組5)環(huán)丙沙星，陽性對照，20mg/kg皮下(從感染后8小時開始每日兩次)。

在治療之前以及此后每日將動物稱重直至終止研究。一旦用銅綠假單胞菌感染，即定期觀察動物的健康不佳征象，并且監(jiān)測體溫。終止達(dá)到人道終點(diǎn)的動物，并且記錄死亡時間。在終止時，即感染后24/48小時，移除肺，并且對宏觀病理學(xué)的征象評分并拍照。移除肺、脾和腎，稱重并轉(zhuǎn)移至pbs中，均質(zhì)化，并且涂鋪連續(xù)稀釋液以測定細(xì)菌載量。

實(shí)施例21

在基于細(xì)胞的測定中評估抗纖維化和消炎活性

細(xì)胞制備

在補(bǔ)充以15％胎牛血清(fbs)(gibco10437-028)加青霉素-鏈霉素(1％)(gibco15140-122)的dmemf12(gibco10565)中維持正常人肺纖維母細(xì)胞(sciencellresearchlaboratory3420)、來自特發(fā)性肺纖維化(ipf)患者的肺纖維母細(xì)胞ll29(anha)(atcc)和ll97a(almy)(atcc)。每3至4天拆分細(xì)胞，每次以1:2/1:3稀釋度。在實(shí)驗(yàn)之前一天，使用胰蛋白酶-edta(0.05％)(gibco25300-054)對細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理，并且以每孔1×10⁵個細(xì)胞涂鋪在24孔盤上。

thp-1細(xì)胞從tib202獲得。在補(bǔ)充以10％胎牛血清的rpmi1640(rpmi1640)中維持thp-1細(xì)胞。dmem(#11095)和胎牛血清(低內(nèi)毒素等級)(#10437)從invitrogen獲得。

藥物處理

首先將化合物ii-3和i-1溶解于100％dmso中成為50mm溶液，接著在1％bsa中稀釋200倍成為250μm10x儲備溶液，并且根據(jù)需要進(jìn)行連續(xù)儲備物稀釋(稀釋2倍)。添加10x儲備溶液至細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且在37℃下孵育細(xì)胞24小時。對于在thp-1細(xì)胞的情況下的lps刺激，添加化合物至細(xì)胞培養(yǎng)基中持續(xù)6小時，并且在4小時結(jié)束時，添加50μg/ml終濃度的lps(sigmal3024)，并且孵育細(xì)胞2小時。使正常人肺纖維母細(xì)胞(nlf)或特發(fā)性肺纖維化細(xì)胞(ll29和ll79a細(xì)胞，atcc)與化合物ii-3(25μm)和i-1(25μm)一起在tgfβ(abcamab50036，50ng/ml)存在下或在不存在tgfβ下(被稱為pbs處理組)孵育24小時。在添加tgfβ之前30分鐘添加測試化合物至細(xì)胞中。收集總rna，并且通過rt-pcr，用hprt作為內(nèi)部對照來評估相對mrna表達(dá)水平。將數(shù)據(jù)表示為平均δmrna/hprt，誤差棒表示平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)。通過史都登氏t檢驗(yàn)來確定相較于對照的顯著性。

elisa

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時收集條件培養(yǎng)基。根據(jù)制造商說明書測量基質(zhì)金屬蛋白酶2(mmp-2)(r&dsystemmmp200)和人金屬蛋白酶2組織抑制劑(timp-2)(r&dsystemdtm200)的水平。在這些測定中使用100倍稀釋度的條件培養(yǎng)基。在victorx5多標(biāo)記板讀取器(perkinelmer)上在450nm的吸收下測量elisa，其中在550nm下進(jìn)行本底校正。產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算timp-2和mmp-2的水平。收集條件培養(yǎng)基，并且測定基質(zhì)金屬蛋白酶2(mmp-2)和人金屬蛋白酶2組織抑制劑(timp-2)的水平。將數(shù)據(jù)表示為相比于對照的平均倍數(shù)變化，并且誤差棒表示平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)。通過史都登氏t檢驗(yàn)來確定相較于對照的顯著性。

rt-pcr

使用rneasyplus小型試劑盒(qiagen#74136)收集總rna，并且遵循制造商方案，使用superscriptiii(invitrogen#18080-044)，用隨機(jī)六聚體產(chǎn)生cdna。使用taqman探針(appliedbiosystems，使用推薦的最佳引物對)，用hprt(次黃嘌呤磷?；D(zhuǎn)移酶)作為內(nèi)部對照來測定相對mrna表達(dá)水平。所有pcr探針都購自invitrogen。tnfα(hs01113624)，il1β(hs01555410)，ccl2(hs00234140)，膠原蛋白1a1(hs00164004)，fn1(纖維結(jié)合蛋白1，hs00365052)，timp-2(hs00234278)，mmp-2(hs01548727)。膠原蛋白1a1(col1a1)、fn1、timp-2和mmp-2是熟知纖維化標(biāo)志物(參見selman等(2000)am.j.phys.lungcellmol.physiol.,279,l562-l574)。

結(jié)果：

在正常人肺纖維母細(xì)胞(nlf)與來自特發(fā)性肺纖維化(ipf)患者的肺纖維母細(xì)胞(ll29和ll97a)兩者的情況下評估化合物ii-3和i-1。結(jié)果概述于圖13a-c、14a-d和15a-d中。圖13a顯示當(dāng)在pbs或tgfβ刺激下用化合物ii-3或i-1處理這3種不同類型的細(xì)胞時，膠原蛋白1a1(col1a1)的mrna水平。已用tgfβ處理的細(xì)胞，即正常肺纖維母細(xì)胞(nlf)或ipf細(xì)胞(ll29或ll97a)，顯示膠原蛋白1a1的水平顯著增強(qiáng)，此在用化合物ii-3(25μm)或i-1(25μm)處理后得以抑制。圖13b和13c顯示當(dāng)在pbs或tgfβ刺激下用化合物ii-3(25μm)或i-1(25μm)處理這3種不同類型的細(xì)胞時，纖維結(jié)合蛋白1(fn1)和timp-2的相應(yīng)mrna水平。已用tgfβ處理的nlf、ll29或ll97a細(xì)胞顯示fn1和timp-2的水平顯著增強(qiáng)，此在用化合物ii-3(25μm)或i-1(25μm)處理后得以抑制。col1a1、fn1和timp-2是熟知纖維化標(biāo)志物；并且這些標(biāo)志物受抑制指示化合物ii-3和i-1具有抗纖維化活性。

也評估條件培養(yǎng)基中作為一種已知基質(zhì)降解介體的mmp-2和它的天然抑制劑timp-2的水平。如圖14a-b和圖15a-b中所示，當(dāng)相較于正常肺時，疾病肺纖維母細(xì)胞中mmp2和timp-2的水平均升高。已報道m(xù)mp-2與timp-2之間的這個不平衡導(dǎo)致在纖維發(fā)生時細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)積累(參見selman等(2000)am.j.phys.lungcellmol.physiol.,279,l562-l574)。因此，報道在ipf肺組織中，timp-2的水平增加大于mmp-2的水平增加，并且這種不平衡將有利于增強(qiáng)ecm蛋白沉積。圖14a顯示當(dāng)用媒介物或化合物ii-3(25μm)處理nlf、ll29或ll97a細(xì)胞時，timp-2的基礎(chǔ)水平(pbs處理)。圖14b顯示當(dāng)在tgfβ刺激下用媒介物或化合物ii-3(25μm)處理nlf、ll29或ll97a細(xì)胞時，timp-2的水平。在tgfβ存在下，用化合物ii-3處理導(dǎo)致timp-2水平顯著降低。圖15a和15b顯示nlf、ll29和ll97a細(xì)胞在用媒介物或化合物ii-3處理后，mmp-2的相應(yīng)基礎(chǔ)水平(pbs處理)和tgfβ刺激水平。再次，在tgfβ存在下，用化合物ii-3處理導(dǎo)致mmp-2水平顯著降低。

在thp-1細(xì)胞的情況下評估化合物ii-3的消炎活性。圖16a、16b和16b概述通常使用的炎癥標(biāo)志物的數(shù)據(jù)：tnf-α、il-1β和ccl2。lps刺激導(dǎo)致ccl2、il-1β和tnf-α的mrna表達(dá)慣常增加。如圖16a-c中所示，在lps刺激下用25μm化合物ii-3處理導(dǎo)致所有三種炎癥標(biāo)志物都顯著降低。

實(shí)施例22

在博萊霉素小鼠纖維化模型中評估脂肪酸半胱胺綴合物

特定無病原體7周齡雌性c57bl/6j小鼠用于實(shí)驗(yàn)。在第0天，通過使用(penn-century,usa)在3mg/kg的劑量下單次氣管內(nèi)施用含硫酸博萊霉素(blm)的鹽水來誘導(dǎo)40只小鼠顯現(xiàn)肺纖維化。接著基于在開始治療之前一天的體重來將動物隨機(jī)分入4組(每組10只小鼠)中。在研究的持續(xù)時間期間，將每日測量個體體重。每日監(jiān)測小鼠的存活、臨床征象和行為。使用較早實(shí)施例中所述的制劑口服施用本發(fā)明化合物。研究的4個治療組由以下組成：組1)媒介物；組2)測試化合物，從第0天至第20天每日在30mg/kg下每日兩次口服給藥；組3)測試化合物，從第0天至第20天每日在100mg/kg下每日兩次口服給藥；組4)地塞米松對照組，在0.25mg/kg下口服給藥。在第21天，終止所有組中的小鼠。對于生物化學(xué)分析，可通過水解方法來定量肺羥基脯氨酸。對于肺切片的組織學(xué)分析，可使用已知方案進(jìn)行馬森氏三色染色(masson’strichomestaining)和阿什克羅夫特(ashcroft)評分估計(參見schaefer等(2011)eur.resp.rev.,20:120,第85-97頁)。可使用邦弗倫尼多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計檢驗(yàn)。p值<0.05被視為統(tǒng)計顯著。

實(shí)施例23

在化合物ii-2與ii-3之間比較

當(dāng)與作為不具有雙孿位甲基的類似物的化合物ii-2比較時，存在于化合物ii-3中的雙孿位甲基提供若干優(yōu)勢。舉例來說，化合物ii-3比化合物ii-2顯示更好血漿穩(wěn)定性(參見實(shí)施例17)?；衔飅i-3在大鼠中也具有更好口腔暴露，如實(shí)施例18中所說明。母體化合物ii-2的外周auclast是0.889ng/ml。相比之下，化合物ii-3的外周auclast是102ng/ml；即當(dāng)向大鼠口服給藥時，auc增加100倍。與歸因于雙孿位甲基的更大穩(wěn)定性一致，在細(xì)胞測定中，化合物ii-3也比化合物ii-2更有效。先前在實(shí)施例11中，在ht-29細(xì)胞的情況下，在50μm下4小時短暫孵育時期之后評估化合物ii-2。為更直接比較，在25μm的較低濃度下，歷經(jīng)24小時的較長孵育時期評估兩種化合物。24小時孵育時期也是為在尤斯室測定中獲得出自cftr校正劑諸如vx-809的最大活性所需的時間。使用先前在實(shí)施例13中概述的相同方案，用以下各組處理原代cf細(xì)胞(純合δf508)24小時：1)媒介物；2)化合物ii-2(25μm)；3)化合物ii-3(25μm)。如圖17中所示，在25μm的較低濃度下，在24小時孵育時期下，在運(yùn)輸錯誤折疊的δf508cftr方面，化合物ii-3比化合物ii-2更有效。

以引用的方式并入

本文提及的專利文件和科學(xué)文件各自的整個公開內(nèi)容出于所有目的以引用的方式并入本文。

等效物

本發(fā)明可以其它特定形式體現(xiàn)而不脫離其精神或主要特征。因此，前述實(shí)施方案在所有方面都應(yīng)被視為說明而非限制本文所述的本發(fā)明。因此，本發(fā)明的范圍由隨附權(quán)利要求而非由先前描述所指示，并且落入權(quán)利要求的等效含義和范圍內(nèi)的所有變化都意圖包括在其中。