交叉引用

本申請(qǐng)要求2014年11月11日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)62/078299；2015年3月9日提交的62/130435；和2015年6月2日提交的62/169996的優(yōu)先權(quán)，每個(gè)以其全部被引入本文作為參考。

發(fā)明背景

急性腎損傷(aki)——也稱為急性腎臟/腎衰竭——在數(shù)小時(shí)或天的時(shí)期中迅速發(fā)展。aki可以導(dǎo)致慢性腎疾病(ckd)，或甚至需要透析的腎衰竭(終末期腎疾病)。其也可導(dǎo)致心臟疾病或死亡。

發(fā)明概述

在第一方面中，本發(fā)明提供限制急性腎損傷(aki)發(fā)展的方法，包括給予經(jīng)受促發(fā)事件(precipitatingevent)的受試者有效量的吡哆胺或其藥學(xué)可接受鹽，以限制aki的發(fā)展，其中給予包括在促發(fā)事件之前、在促發(fā)事件時(shí)、或在促發(fā)事件的24小時(shí)內(nèi)向受試者給予吡哆胺或其藥學(xué)可接受鹽。在另一方面中，本發(fā)明提供限制急性腎損傷(aki)發(fā)展的方法，包括給予有aki危險(xiǎn)的受試者有效量的吡哆胺或其藥學(xué)可接受鹽，以限制aki的發(fā)展。在另一方面中，本發(fā)明提供治療急性腎損傷(aki)發(fā)展的方法，包括給予患有aki的受試者有效量的吡哆胺或其藥學(xué)可接受鹽，以治療aki。在另一方面中，本發(fā)明提供用于監(jiān)測(cè)吡哆胺治療有效性的方法，包括

(a)測(cè)定從接受吡哆胺治療的受試者中獲得的生物樣本中的以下一個(gè)或多個(gè)：(a)col3α1的表達(dá)水平、(b)αsma的表達(dá)水平、(c)kim1的表達(dá)水平、(d)ngal的表達(dá)水平、(e)col1α1的表達(dá)水平和/或(e)異呋喃(isofuran)與異前列烷(isoprostane)比率(isof/isop)；和

(b)將步驟(a)中測(cè)定的標(biāo)記水平與對(duì)照比較；

其中具有與對(duì)照相比減少的一個(gè)或多個(gè)的標(biāo)記水平的那些受試者正在響應(yīng)吡哆胺治療。

附圖描述

圖1.在i/r-aki后28天用500和1000mg/kg/天的吡哆胺(pyr)的預(yù)治療對(duì)腎臟纖維化的劑量依賴性效果。(a)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。小鼠?jīng)歷一側(cè)性腎蒂夾緊(u-ir)，隨后在初始外科手術(shù)后8天對(duì)側(cè)腎切除。用載體對(duì)照或飲用水中的pyr500和1000mg/kg/天預(yù)治療所有小鼠3天，在每個(gè)外科手術(shù)程序后通過(guò)口服管飼法補(bǔ)充200mgpyr一天兩次(或載體)3天。繼續(xù)治療28天，屆時(shí)將小鼠處死并且收獲腎用于分析。(b-d)相對(duì)于gapdhmrna對(duì)照，腎臟纖維化標(biāo)記col1α1、α-sma和col3α1mrna的表達(dá)。(e)天狼星紅染色的量化(％總面積)。(f)天狼星紅染色組織的代表性圖像(外髓質(zhì)；比例尺，50μm)。結(jié)果表達(dá)為平均值+/-sem，n＝9-10只小鼠每組。結(jié)果僅指示如果anovap<0.05：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#p<0.0001。與未損傷對(duì)照(無(wú)括弧)或載體治療的小鼠(括弧)比較。

圖2.在i/r-aki后28天用500和1000mg/kg/天的pyr的預(yù)治療對(duì)腎臟損傷標(biāo)記的劑量依賴性效果。pyr在損傷后第28天對(duì)kim1(a)和ngal(b)mrna的效果。結(jié)果表達(dá)為平均值+/-sem，n＝9-10只小鼠每組。結(jié)果僅指示如果anovap<0.05：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#p<0.0001。與未損傷對(duì)照(無(wú)括弧)或載體治療的小鼠(括弧)比較。

圖3.在i/r-aki后28天用1000mg/kg/天的pyr開(kāi)始于損傷后24小時(shí)的治療對(duì)腎臟纖維化的有益效果。(a)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｐ∈蠼?jīng)歷u-ir，隨后在初始外科手術(shù)后8天對(duì)側(cè)腎切除。用pyr1000mg/kg/天治療小鼠——開(kāi)始于初始損傷后24小時(shí)，在每個(gè)外科手術(shù)程序后通過(guò)口服管飼法補(bǔ)充200mgpyr一天兩次(或載體)3天。繼續(xù)治療28天，屆時(shí)將小鼠處死并且和收獲腎用于分析。(b-d)相對(duì)于gapdhmrna對(duì)照，腎臟纖維化標(biāo)記col1α1、α-sma和col3α1mrna的表達(dá)。(e)天狼星紅染色的量化(％總面積)。(f)天狼星紅染色組織的代表性圖像(外髓質(zhì)；比例尺，50μm)。結(jié)果表達(dá)為平均值+/-sem，n＝8-10/組。結(jié)果指示如果anovap<0.05：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#p<0.0001。與未損傷的(無(wú)括弧)，或載體或延遲pyr治療(括弧)比較。

圖4.在i/r-aki后28天用1000mg/kg/天的pyr開(kāi)始于損傷后24小時(shí)的治療對(duì)腎臟損傷標(biāo)記無(wú)效果。(a，b)在損傷后第28天相對(duì)于gapdhmrna對(duì)照，腎臟損傷標(biāo)記kim1和ngalmrna的表達(dá)。結(jié)果表達(dá)為平均值+/-sem，n＝8-10/組。結(jié)果指示如果anovap<0.05：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#p<0.0001。與未損傷(無(wú)括弧)，或載體或延遲pyr治療(括弧)比較。

圖5.在i/r-aki后3天用500和1000mg/kg/天的pyr的預(yù)治療對(duì)腎臟損傷的劑量依賴性效果。(a)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。小鼠?jīng)歷u-ir并且用載體對(duì)照、飲用水中的pyr500mg/kg/天或pyr1000mg/kg/天預(yù)治療3天，在外科手術(shù)程序后通過(guò)口服管飼法補(bǔ)充200mgpyr一天兩次(或載體)3天。在初始損傷后3天處死小鼠并且收獲腎用于分析。(b，c)在損傷后3天腎臟kim1和ngalmrna表達(dá)被表達(dá)為與gapdhmrna對(duì)照的比率。(d)損傷后3天在om(0–4，任意單位)中的腎小管損害評(píng)分。(e)pas染色組織的代表性圖像(外髓質(zhì)；比例尺，50μm)f)在u-ir后3天在用500和1000mg/kg/天的pyr治療后的表達(dá)腎臟異呋喃/異前列烷比率。結(jié)果表達(dá)為平均值+/-sem，n＝9-10只小鼠每組。結(jié)果僅指示如果anovap<0.05：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#p<0.0001。與未損傷(無(wú)括弧)或載體或pyr500mg/kg/天治療的小鼠(括弧)比較。

圖6.在i/r-aki后的血漿pyr水平。(a)小鼠經(jīng)歷u-ir并且用載體對(duì)照、飲用水中的pyr500mg/kg/天或pyr1000mg/kg/天預(yù)治療3天，在外科手術(shù)程序后通過(guò)口服管飼法補(bǔ)充200mgpyr一天兩次(或載體)3天。在損傷后的第3天的pyr血漿水平的評(píng)價(jià)。(b)小鼠經(jīng)歷u-ir，隨后在初始外科手術(shù)后8天對(duì)側(cè)腎切除。用載體對(duì)照、飲用水中的pyr500mg/kg/天或1000mg/kg/天預(yù)治療所有小鼠，在每個(gè)外科手術(shù)程序后通過(guò)口服管飼法補(bǔ)充200mgpyr一天兩次(或載體)3天。繼續(xù)治療28天，屆時(shí)小鼠經(jīng)歷靜脈切開(kāi)放血術(shù)用于分析血漿pyr水平。損傷后第28天的pyr血漿水平的評(píng)價(jià)。結(jié)果表達(dá)為平均值+/-sem，n＝9-10只小鼠每組。結(jié)果僅指示如果anovap<0.05：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#p<0.0001。與未損傷對(duì)照(無(wú)括弧)或載體或pyr500mg/kg/天治療的小鼠(括弧)比較。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在此引入所有引用的參考文件的全部作為參考。在此申請(qǐng)中，除非另作說(shuō)明，所利用的技術(shù)可在任意若干熟知的參考文件中找到，如：molecularcloning:alaboratorymanual(sambrook,etal.,1989,coldspringharborlaboratorypress)、geneexpressiontechnology(methodsinenzymology,185卷，d.goeddel編輯,1991.academicpress,sandiego,ca)、“guidetoproteinpurification”inmethodsinenzymology(m.p.deutshcer,ed.,(1990)academicpress,inc.)；pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(innis,etal.1990.academicpress,sandiego,ca)、cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique,第二版.(r.i.freshney.1987.liss,inc.newyork,ny)、genetransferandexpressionprotocols,109-128頁(yè),e.j.murray編輯,thehumanapressinc.,clifton,n.j.)和theambion1998catalog(ambion,austin,tx)。

如本文所用，單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另有明確規(guī)定。如本文所用的“和”可與“或者”交替使用，除非另有明確規(guī)定。

本發(fā)明的任意發(fā)明的所有實(shí)施方式可以組合使用，除非上下文明確另有指示。

在第一方面中，本發(fā)明提供限制急性腎損傷(aki)發(fā)展的方法，包括向經(jīng)受促發(fā)事件的受試者給予有效量的吡哆胺或其藥學(xué)可接受鹽，以限制aki的發(fā)展，其中該給予包括在促發(fā)事件之前、在促發(fā)事件之時(shí)或在促發(fā)事件12小時(shí)內(nèi)向受試者給予吡哆胺或其藥學(xué)可接受鹽。

“急性腎損傷”(aki)是指促發(fā)事件后不久發(fā)展的腎功能的突然喪失；例如，發(fā)生在促發(fā)事件7天內(nèi)的腎功能喪失。例如，一旦受試者經(jīng)歷以下一個(gè)或多個(gè)，則aki可被診斷：

·血清肌酸酐增加兩倍，

·腎小球?yàn)V過(guò)率(gfr)減少50％，

·尿排出量<0.5ml/kg/小時(shí)持續(xù)12小時(shí)。

“促發(fā)事件”是導(dǎo)致aki的任何事件或風(fēng)險(xiǎn)因素。在各種非限制性實(shí)施方式中，促發(fā)事件可為疾病或醫(yī)療程序。在一個(gè)實(shí)施方式中，促發(fā)事件可為可以導(dǎo)致流向腎的有效血流量降低的醫(yī)療程序，包括但不限于心血管外科手術(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，促發(fā)事件可為用于醫(yī)學(xué)成像或其它目的對(duì)比染料的注射。在又一實(shí)施方式中，促發(fā)事件可為化療劑的給予。在又一實(shí)施方式中，促發(fā)事件可為受試者進(jìn)入醫(yī)院重病監(jiān)護(hù)病房。在另一個(gè)實(shí)施方式中，促發(fā)事件可為受試者發(fā)展感染引起的炎癥(膿毒癥)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，在促發(fā)事件之前(例如，7天、6天、5天、4天、3天、2天和/或1天之前)、或在促發(fā)事件之時(shí)、或在促發(fā)事件后24小時(shí)內(nèi)(即：在24小時(shí)、23小時(shí)、22小時(shí)、21小時(shí)、20小時(shí)、19小時(shí)、18小時(shí)、17小時(shí)、16小時(shí)、15小時(shí)、14小時(shí)、13小時(shí)、12小時(shí)內(nèi)，11小時(shí)內(nèi)、10小時(shí)內(nèi)、9小時(shí)內(nèi)、8小時(shí)內(nèi)、7小時(shí)內(nèi)、6小時(shí)內(nèi)、5小時(shí)內(nèi)、4小時(shí)內(nèi)、3小時(shí)內(nèi)、2小時(shí)內(nèi)、或1小時(shí)內(nèi))可給予有效量的吡哆胺或其鹽并且可在促發(fā)事件后繼續(xù)給予。

在另一方面中，本發(fā)明提供限制急性腎損傷(aki)發(fā)展的方法，包括向有aki危險(xiǎn)的受試者給予有效量的吡哆胺或其藥學(xué)可接受鹽，以限制aki的發(fā)展。

在各種實(shí)施方式中，aki的風(fēng)險(xiǎn)因素包括，但不限于，低血容量、感染引起的炎癥(膿毒癥)、肝硬化、腎動(dòng)脈狹窄、腎靜脈血栓形成、腎小球腎炎、急性腎小管壞死(atn)、急性間質(zhì)性腎炎(ain)、良性前列腺增生、暴露于阻塞的導(dǎo)尿管、膀胱結(jié)石；和膀胱、輸尿管或腎臟惡性腫瘤?？上蚓哂衋ki風(fēng)險(xiǎn)因素的受試者給予有效量的吡哆胺或其鹽，并且如果受試者進(jìn)展為aki則繼續(xù)給予。

在這些方面、實(shí)施方式和其組合的每個(gè)中，“限制aki的發(fā)展”意為相比于未用本發(fā)明的方法治療的受試者(“對(duì)照”)對(duì)于受試者的任何臨床益處。在各種實(shí)施方式中，相比于對(duì)照限制aki的發(fā)展可導(dǎo)致以下一個(gè)或多個(gè)：

·限制aki特有的血清肌酸酐水平的增加；

·限制aki特有的腎小球?yàn)V過(guò)率的減少；

·降低aki特有的尿量的減少；

·限制aki特有的腎臟纖維化；

·限制aki的一種或多種其它癥狀的發(fā)展，包括但不限于代謝性酸中毒、高鉀水平(和潛在導(dǎo)致的不規(guī)則心跳)、尿毒癥、體液平衡變化和對(duì)其它器官系統(tǒng)的影響；

·限制進(jìn)展至慢性腎臟疾?。?/p>

·限制對(duì)于腎臟透析的需要；和

·限制對(duì)于腎移植的需要。

在這些方面、實(shí)施方式和其組合的每個(gè)中，在aki發(fā)病前向受試者給予吡哆胺或其藥學(xué)可接受鹽。如本領(lǐng)域那些技術(shù)人員所理解的，當(dāng)主治醫(yī)師認(rèn)為適當(dāng)時(shí)，在aki發(fā)病后可繼續(xù)給予吡哆胺或其鹽。

在另一方面中，本發(fā)明提供治療急性腎損傷(aki)發(fā)展的方法，包括向患有aki的受試者給予有效量的吡哆胺或其藥學(xué)可接受鹽，以治療aki。

在此方面中，“治療aki”意為相比于未用本發(fā)明的方法治療的受試者(“對(duì)照”)對(duì)于受試者的任何臨床益處。在各種實(shí)施方式中，相比于對(duì)照，治療aki可導(dǎo)致以下一個(gè)或多個(gè)：

·降低或限制aki特有的血清肌酸酐水平的增加；

·增加或限制aki特有的腎小球?yàn)V過(guò)率的減少；

·降低aki特有的尿量的減少；

·限制aki特有的腎臟纖維化；

·限制aki的一種或多種其它癥狀的發(fā)展，包括但不限于代謝性酸中毒、高鉀水平(和潛在導(dǎo)致的不規(guī)則心跳)、尿毒癥、體液平衡變化和對(duì)其它器官系統(tǒng)的影響；

·限制進(jìn)展至慢性腎臟疾?。?/p>

·限制對(duì)于腎臟透析的需要；和

·限制對(duì)于腎移植的需要。

在本發(fā)明的所有方面、實(shí)施方式和實(shí)施方式的組合中，可以由主治醫(yī)師認(rèn)為適合的任意頻率(1x每天、2x每天、每隔一天等)給予吡哆胺或其鹽。當(dāng)主治醫(yī)師認(rèn)為適當(dāng)時(shí)，本發(fā)明中使用的劑量單位形式可包括任意合適劑量的吡哆胺或其鹽。在非限制性實(shí)施方式中，劑量單位包括1mg和1000mg之間的吡哆胺或其藥學(xué)可接受鹽。這樣的劑量單位形式可以包括，例如，1mg-750mg、1mg-500mg、1mg-250mg、1mg-100mg、50mg-1000mg、50mg-750mg、50mg-500mg、50mg-250mg、50mg-100mg、100mg-1000mg、100mg-750mg、100mg-500mg、100mg-250mg、250mg-1000mg、250mg-750mg、250mg-500mg、500mg-1000mg、500mg-750mg或750mg-1000mg之間的吡哆胺或其藥學(xué)可接受鹽?？梢赃x擇劑量單位形式來(lái)適應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)向需要其的受試者給予指定的每日劑量的吡哆胺或其藥學(xué)可接受鹽的所需給藥頻率。

在本發(fā)明的所有實(shí)施方式和實(shí)施方式組合中，受試者可為任意適合的受試者，包括哺乳動(dòng)物受試者，如人受試者。

根據(jù)本發(fā)明的藥學(xué)可接受鹽是具有制藥技術(shù)領(lǐng)域的那些技術(shù)人員所熟知的生理可接受堿和/或酸的鹽。具有生理可接受堿的適合的鹽包括，例如，堿金屬和堿土金屬，如鈉、鉀、鈣和鎂鹽，以及銨鹽和具有適合有機(jī)堿，如甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶，嗎啉和三乙醇胺的鹽。具有生理可接受酸的適合的鹽包括，例如，具有無(wú)機(jī)酸如鹵化氫(尤其是氯化氫或溴化氫)的鹽、硫酸鹽和磷酸鹽，和具有有機(jī)酸的鹽。

吡哆胺或其鹽可以作為藥物制劑被給予，所述藥物制劑包括適合于口服(包括頰和舌下)、直腸、鼻、局部、肺、陰道或腸胃外(包括肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))給予或處于適合于通過(guò)吸入或吹入給予的形式的藥物制劑。在各種實(shí)施方式中，給予的方式是利用可以根據(jù)痛苦的程度調(diào)節(jié)的方便每日劑量方案的靜脈內(nèi)或口服(或可代替的粘膜遞送，如陰道或鼻途徑)。

對(duì)于固體組合物，傳統(tǒng)的無(wú)毒固體載體包括，例如，醫(yī)藥級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。液體藥學(xué)可給予組合物可以，例如，通過(guò)將如本文所述的活性化合物和任選的藥物佐劑在賦形劑，如例如，水、鹽水、水性葡萄糖、甘油、乙醇等中溶解、分散等進(jìn)行制備，從而形成溶液或懸浮液。如果需要，即將給予的藥物組合物也可以包含少量的無(wú)毒輔助物質(zhì)如潤(rùn)濕劑或乳化劑、ph緩沖劑等，例如，醋酸鈉、失水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺醋酸鈉、三乙醇胺油酸酯等。制備這樣的劑型的實(shí)際方法對(duì)于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員是已知或顯而易見(jiàn)的；例如，參見(jiàn)以上參考的remington’spharmaceuticalsciences。

在另一實(shí)施方式中，是滲透促進(jìn)劑賦形劑的使用，所述滲透促進(jìn)劑賦形劑包括聚合物如：聚陽(yáng)離子(殼聚糖和其季銨衍生物，聚-l-精氨酸、胺化明膠)；聚陰離子(n-羧甲基殼聚糖、聚丙烯酸)；和巰基聚合物(羧甲基纖維素-半胱氨酸、聚卡波非(polycarbophil)-半胱氨酸、殼聚糖-硫代丁基脒、殼聚糖-硫代巰基乙酸(thioglycolicacid)、殼聚糖-谷胱甘肽綴合物)。

對(duì)于口服給予，組合物通常會(huì)采取片劑、膠囊、軟凝膠膠囊的形式或可以為水性或非水性溶液、懸浮液或糖漿。片劑和膠囊是優(yōu)選的口服給予形式。用于口服使用的片劑和膠囊可以包括一種或多種常用的載體如乳糖和玉米淀粉。潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂，也通常被添加。通常，本公開(kāi)的化合物可以與口服、無(wú)毒、藥學(xué)可接受、惰性的載體如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、甘露醇、山梨醇等組合。此外，當(dāng)需要或必要時(shí)，適合的粘合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑和著色劑也可以被摻入至混合物中。適合的粘合劑包括淀粉、明膠、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味劑、天然和合成樹(shù)膠如阿拉伯樹(shù)膠、黃蓍膠(tragacanth)或藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇、蠟等。這些劑型中使用的潤(rùn)滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉等。崩解劑(disintegrator)沒(méi)有限制地包括，淀粉、甲基纖維素、瓊脂、皂土、黃原膠等。

當(dāng)使用液體懸浮液時(shí)，可以將活化劑與任意口服、無(wú)毒、藥學(xué)可接受的惰性載體如乙醇、甘油、水等以及與乳化劑和懸浮劑組合。如果需要，也可以添加調(diào)味劑、著色劑和/或甜味劑。用于摻入至本文口服制劑中的其它任選組分包括，但不限于，防腐劑、懸浮劑、增稠劑等。

腸胃外制劑可以以傳統(tǒng)形式，作為液體溶液或懸浮液、適合于在注射前在液體中溶解或懸浮的固體形式、或作為乳狀液進(jìn)行制備。優(yōu)選地，根據(jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)使用適合的載體、分散劑或潤(rùn)濕劑和懸浮劑配制無(wú)菌可注射懸浮液。無(wú)菌可注射制劑也可以為無(wú)毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌可注射溶液或懸浮液。可以利用的可接受的載體和溶劑是水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌固定油、脂肪酯或多元醇通常被用作溶劑或懸浮介質(zhì)。此外，腸胃外給予可以涉及緩慢釋放或持續(xù)釋放系統(tǒng)的應(yīng)用，以便保持恒定的劑量水平。

腸胃外給予包括關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑，并且包括水性和非水性的等滲無(wú)菌注射溶液——其可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使制劑與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)，和水性和非水性無(wú)菌懸浮液——其可以包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。通過(guò)某些腸胃外途徑的給予可以涉及通過(guò)由無(wú)菌注射器或一些其它機(jī)械裝置如連續(xù)輸注系統(tǒng)推動(dòng)的針或?qū)Ч軐⒈竟_(kāi)的制劑引入至患者的身體中?？梢岳米⑸淦鳌⒆⑸淦?injector)、泵或任意其它本領(lǐng)域認(rèn)為用于腸胃外給予的裝置給予由本公開(kāi)提供的制劑。

可以根據(jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)使用適合的載體、分散劑或潤(rùn)濕劑和懸浮劑制備無(wú)菌可注射懸浮液。無(wú)菌可注射制劑也可以為無(wú)毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌可注射溶液或懸浮液?？梢岳玫目山邮艿妮d體和溶劑是水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌固定油、脂肪酯或多元醇通常被用作溶劑或懸浮介質(zhì)。此外，腸胃外給予可以涉及緩慢釋放或持續(xù)釋放系統(tǒng)的使用，以便保持恒定的劑量水平。根據(jù)本公開(kāi)用于腸胃外給予的制備包括無(wú)菌水性或非水性溶液、懸浮液或乳狀液。非水性溶劑或載體的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和玉米油、明膠和可注射有機(jī)酯如油酸乙酯。這樣的劑型也可以包含佐劑如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^(guò)，例如，經(jīng)細(xì)菌阻留過(guò)濾器過(guò)濾、通過(guò)將滅菌劑摻入至組合物中、通過(guò)照射組合物或通過(guò)加熱組合物來(lái)將它們滅菌。也可以在使用前立即使用無(wú)菌水或一些其它無(wú)菌可注射介質(zhì)來(lái)生產(chǎn)它們。

制劑可以任選地包含等滲劑。制劑優(yōu)選地包含等滲劑，并且甘油是最優(yōu)選的等滲劑。甘油的濃度——當(dāng)其被使用時(shí)——是在本領(lǐng)域已知的范圍中，如例如，約1mg/ml至約20mg/ml。

通過(guò)緩沖劑可以控制腸胃外制劑的ph，所述緩沖劑如磷酸鹽、醋酸鹽、tris或l-精氨酸。緩沖劑的濃度優(yōu)選是充分的以在儲(chǔ)存期間提供ph的緩沖以維持ph在目標(biāo)ph±0.2ph單位。當(dāng)在室溫測(cè)量時(shí)，優(yōu)選的ph是在約7和約8之間。

其它添加劑，如藥學(xué)可接受的增溶劑像tween(聚氧乙烯(20)失水山梨醇單月桂酸酯)、tween(聚氧乙烯(20)失水山梨醇單棕櫚酸酯)、tween(聚氧乙烯(20)失水山梨醇單油酸酯)、pluronic(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和peg(聚乙二醇)可以被任選地添加至制劑，并且可以是有用的——如果制劑將接觸塑料材料。此外，腸胃外制劑可以包含各種抗菌和抗真菌劑，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。

可以通過(guò)將適當(dāng)溶劑中需要量的吡哆胺或其鹽與以上列舉的各種其它原料摻入來(lái)制備無(wú)菌可注射溶液，如果需要，隨后過(guò)濾滅菌。一般而言，通過(guò)將各種滅菌的活性成分摻入至無(wú)菌載體中來(lái)制備分散體，所述無(wú)菌載體包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需來(lái)自以上列舉那些的其它成分。在用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干技術(shù)，其產(chǎn)生活性成分加上來(lái)自先前其無(wú)菌過(guò)濾溶液的任意額外所需成分的粉末。因此，例如，通過(guò)將按重量計(jì)1.5％的活性成分在按體積計(jì)10％的丙二醇和水中攪拌來(lái)制備適合于通過(guò)注射給予的腸胃外組合物。將溶液用氯化鈉成為等滲并且滅菌。

在另一方面中，本發(fā)明提供用于監(jiān)測(cè)吡哆胺治療有效性的方法，其包括

(a)測(cè)定從接受吡哆胺治療的受試者獲得的生物樣本中的以下的一個(gè)或多個(gè)：(a)col3α1的表達(dá)水平、(b)αsma的表達(dá)水平、(c)kim1的表達(dá)水平、(d)ngal的表達(dá)水平和/或(e)異呋喃與異前列烷比率(isof/isop)；和

(b)將步驟(a)中測(cè)定的標(biāo)記水平與對(duì)照比較；

其中相比于對(duì)照具有減少的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記水平的那些受試者正在響應(yīng)吡哆胺治療。

如在本文實(shí)施例中所示，成功的吡哆胺治療導(dǎo)致相比于對(duì)照減少的col3α1、col1α1、αsma、kim1和ngal表達(dá)(mrna和/或蛋白質(zhì))，并且導(dǎo)致減少的異呋喃與異前列烷比率(除了：未用吡哆胺治療的相似受試者；表達(dá)水平或isof/isop比率的預(yù)先存在的標(biāo)準(zhǔn)；等)。因此，該方法可以被用于監(jiān)測(cè)接受吡哆胺治療，如aki、糖尿病性腎病變或其它適應(yīng)癥的吡哆胺治療的受試者中的有效性?？梢允褂萌我膺m合的生物樣本，包括但不限于腎活檢、血液樣本等。

在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟可以進(jìn)行多于一次(2、3、4、5、6或更多次)以隨時(shí)間監(jiān)測(cè)治療進(jìn)展。在又一實(shí)施方式中，如果受試者被測(cè)定為相比于對(duì)照未具有減少的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記水平，則可以增加隨后的吡哆胺劑量。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所測(cè)定的標(biāo)記至少包括異呋喃與異前列烷比率。

實(shí)施例

將兩個(gè)劑量——500mg/kg/天和1000mg/kg/天——的吡哆胺口服給予至aki實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、小鼠aki的外科手術(shù)、缺血-再灌注模型(ir-aki)[cianciolocosentinoetal,2013；skrypnyketal,2013]、已廣泛用于模擬與所獲得的心臟外科手術(shù)有關(guān)的缺血性損傷(csa-aki)的腎臟缺血模型[thieleetal,2015]。對(duì)于大部分研究，吡哆胺在aki誘導(dǎo)前給予3天，并持續(xù)直到研究完成。在一些實(shí)驗(yàn)中，吡哆胺在aki誘導(dǎo)后24小時(shí)被給予。

實(shí)施例1:在i/r-aki后28天用500和1000mg/kg/天的吡哆胺的預(yù)治療對(duì)腎臟纖維化的劑量依賴性效果

如圖1a中所示例的執(zhí)行損傷模型和治療。小鼠經(jīng)歷一側(cè)性腎蒂夾緊(u-ir)，隨后在初始外科手術(shù)后8天對(duì)側(cè)腎切除。用載體對(duì)照或飲用水中的pyr500和1000mg/kg/天預(yù)治療所有小鼠3天，在每個(gè)外科手術(shù)程序后通過(guò)口服管飼法補(bǔ)充200mgpyr一天兩次(或載體)3天。繼續(xù)治療28天，屆時(shí)將小鼠處死并且收獲腎用于分析。用吡哆胺以500和1000mg/kg的預(yù)治療以劑量依賴性方式降低了促纖維化基因(pro-fibroticgene)col3α1、αsma和col1α1mrna的表達(dá)(圖1，b-d)并且減少了纖維化水平(圖1，e和f)。

實(shí)施例2:在i/r-aki后28天用500和1000mg/kg/天的吡哆胺的預(yù)治療對(duì)腎臟損傷標(biāo)記的劑量依賴性效果。

在損傷開(kāi)始隨后圖1a中所示的給藥方案之后28天評(píng)價(jià)腎臟損傷標(biāo)記。用吡哆胺以500和1000mg/kg/天的預(yù)治療在損傷后第28天降低了腎臟損傷標(biāo)記kim1的表達(dá)(圖2a)，但未降低ngal的表達(dá)(圖2b)。

實(shí)施例3:在i/r-aki后28天損傷后24小時(shí)開(kāi)始的用1000mg/kg/天的吡哆胺的治療對(duì)腎臟纖維化的有益效果。

為了確定用高劑量的吡哆胺的延遲治療是否有效降低ir-aki后的損傷后(post-injury)纖維化，在初始損傷后24小時(shí)開(kāi)始用pyr1000mg/kg/天治療小鼠，在每個(gè)外科手術(shù)程序后通過(guò)口服管飼法補(bǔ)充200mgpyr一天兩次(或載體)3天。繼續(xù)治療28天，屆時(shí)將小鼠處死并且和收獲腎用于分析(圖3a)。損傷后24小時(shí)開(kāi)始的延遲吡哆胺治療降低了促纖維化基因col3α1和αsmamrna的表達(dá)(圖3b和c)，但沒(méi)有降低col1α1(圖3d)mrna，并且減少了損傷后纖維化(圖3e和f)。

在損傷后第28天，損傷后24小時(shí)開(kāi)始的延遲吡哆胺治療沒(méi)有降低損傷標(biāo)記kim1和ngal的表達(dá)(圖4a和b)。

這些數(shù)據(jù)表明：a)用吡哆胺以1000mg/kg/天的延遲治療在開(kāi)始aki損傷后的28天對(duì)腎臟纖維化具有有益效果；和b)相比于延遲治療，用吡哆胺的預(yù)治療更有效地降低i/r-aki后的慢性腎臟損傷。

實(shí)施例4:在i/r-aki后3天用500和1000mg/kg/天的吡哆胺的預(yù)治療對(duì)腎臟損傷和氧化應(yīng)激的標(biāo)記的劑量依賴性效果。

為了測(cè)定對(duì)ir-aki后的早期腎臟損傷是否也存在500和1000mg/kg/天的吡哆胺的劑量依賴性效果，在損傷后第3天處死小鼠(圖5a)以評(píng)價(jià)腎臟損傷和腎臟氧化應(yīng)激水平。相比于用載體治療的小鼠，在用1000mg/kg/天而不是500mg/kg/天吡哆胺治療的小鼠中腎臟ngalmrna表達(dá)存在明顯的劑量依賴性減少，但kim1mrna表達(dá)則不存在明顯的劑量依賴性減少(圖5b和c)，組織學(xué)腎小管損害得分降低(圖5d和e)并且腎臟氧化應(yīng)激水平的標(biāo)記異呋喃與異前列烷比率降低(圖5f)。

這些數(shù)據(jù)表明在用吡哆胺治療的小鼠中存在ir-aki后的早期腎臟損傷降低。該數(shù)據(jù)也表明1000mg/kg/天的吡哆胺比500mg/kg/天在降低ir-aki后的早期腎臟上更有效。

實(shí)施例5:i/r-aki后的血漿吡哆胺水平。

已經(jīng)確定1000mg/kg/天pyridorin更有效地預(yù)防小鼠中的ir-aki后的早期和長(zhǎng)期腎損傷，在用500mg/kg/天和1000mg/kg/天吡哆胺治療3和28天的具有ir-aki的小鼠中測(cè)定吡哆胺的血漿水平(圖6)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，存在血漿吡哆胺水平的劑量依賴性增加(圖6)。在用1000mg/kg/天的吡哆胺治療的小鼠中，在第3天和28天的平均吡哆胺血漿水平是～6μg/ml(圖6a和b)，從而表明在這些血漿水平吡哆胺在小鼠ir-aki中具有治療效果。