急性腎損傷診斷ngal膠體金免疫測試盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及急性腎損傷早期診斷是檢測試劑板，屬于早期診斷急性腎損傷的【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明利用NGAL蛋白作為急性腎損傷早期診斷的生化指標，在一步法檢測條或檢測板上固定膠體金標記的針對抗原的抗體以及固定化的未標記的抗體，以達到一次性檢測急性腎損傷指標的目的。本發(fā)明提供的試劑板簡便、快捷，不需要儀器設(shè)備，僅用肉眼即可判讀結(jié)果，適合在任何場所檢測，且每份試劑均為單獨包裝，可存放于室溫下，便于保存。本發(fā)明檢測靈敏性高，特異性強，能夠在急性腎損傷發(fā)病早期即開始檢測，適合急性腎損傷早期篩選和診斷。
【專利說明】急性腎損傷診斷NGAL膠體金免疫測試盒及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及NGAL蛋白的抗體對的制備，膠體金標記顯色的免疫層析反應技術(shù)和利用NGAL的抗體來早期診斷急性腎損傷的【技術(shù)領(lǐng)域】。尤其涉及一種急性腎損傷早期診斷檢測試劑板。
技術(shù)背景
[0002]本發(fā)明的主要技術(shù)背景包括NGAL的特異性、膠體金的快速簡便、雙抗體技術(shù)的敏感準確。
[0003]急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是由各種原因引起的腎功能在短時間(幾小時至幾天)內(nèi)突然下降而出現(xiàn)的臨床綜合征，是威脅重癥患者生命的常見疾病。重癥監(jiān)護病房中約50%的患者可合并此癥，AKI的終末階段急性腎功能衰竭(acuterenalfailure, ARF)，其病死率高達26.5% -45%。目前探尋一種穩(wěn)定、特異、敏感的早期診斷標志物，以期達到早期診斷、早期防治AKI，成為降低重癥患者病死率的關(guān)鍵。傳統(tǒng)指標如血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及腎小球濾過率(eGFR)由于所受影響因素較多，不夠敏感，作為腎損傷的標志物并不能令人滿意。目前臨床仍然主要以Scr作為AKI的診斷依據(jù)，但是Scr受年齡、性別、體質(zhì)量、藥物、容量負荷、肌肉代謝、蛋白攝入等諸多非腎臟因素的影響，結(jié)果并不可靠。尿量作為傳統(tǒng)指標也面臨與Scr類似的問題。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，腎近曲小管細胞在損傷后可高表達中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)，腎臟皮質(zhì)小管、血液和尿液中均有NGAL的大量堆積，提示血NGAL和尿NGAL對AKI具有早期診斷價值。
[0004]NGAL(中性粒細胞明膠酶相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白)是一種小分子質(zhì)量的分泌蛋白，與明膠酶B(MMP-9)的功能密切相關(guān)，可在腫瘤細胞及多種上皮細胞中表達，包括近端腎小管上皮細胞。對腎急性I / R損傷及順鉬誘導的AKI模型進行研究后發(fā)現(xiàn):在缺血引起的腎損傷中，受損的腎小管上皮細胞能產(chǎn)生大量的NGAL，這些NGAL—方面能誘導腎小管間質(zhì)中浸潤的中性粒細胞發(fā)生凋亡以保護腎組織免受炎癥細胞的侵害，另一方面還可誘導腎間充質(zhì)細胞向腎小管上皮細胞的轉(zhuǎn)化，從而誘導腎小管上皮細胞的再生。在正常腎組織中，NGAL呈低水平表達，當接觸腎毒性物質(zhì)或發(fā)生缺血性損傷后，皮質(zhì)腎小管、血液、尿液中會出現(xiàn)NGAL大量蓄積，并可在損傷后3h的尿液和血清中檢測到NGAL，明顯早于尿N-乙酰-β -葡萄糖苷酶(中性粒細胞明膠酶)、β 2微球蛋白及血肌酐的改變。NGAL還參與腎損傷的修復等。
[0005]用膠體金顆粒標記抗體或抗原，以檢測未知抗原或抗體的方法稱免疫膠體金技術(shù)。氯金酸(HAuCl4)在還原劑的作用下,可聚合成特定大小的金顆粒,形成帶負電的疏水膠溶液。該溶液因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。在堿性條件下，膠體金顆粒表面的負電荷與蛋白質(zhì)的正電荷基團靠靜電引力結(jié)合。
[0006]由于膠體金的電子密度高，顆粒聚集后呈紅色，因此可用于標記多種大分子，如白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素、脂蛋白、植物血凝素、卵白素等。除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，它還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA, ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結(jié)合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領(lǐng)域。
[0007]膠體金免疫層析技術(shù)與以往常規(guī)診斷方法相比具有以下突出優(yōu)點:
[0008]①快速:全部檢測過程僅需1-3分鐘。
[0009]②簡便:不需其它任何儀器設(shè)備，操作也極其簡單，可隨時隨地進行。
[0010]③可單份檢測:對標本既能成批檢測，又可單份檢測，患者可立刻拿到結(jié)果，不必等待。
[0011]④穩(wěn)定性好:金標試劑穩(wěn)定，可長期保存。
[0012]⑤檢測標本種類多:既可用于查血，又可用于檢尿或唾液，因而適合各種人群的檢查。
[0013]⑥可向基層醫(yī)療單位推廣:由于具有以上幾個特點，使得本方法既可在大型醫(yī)院使用，又可向基層醫(yī)療單位如:鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院、連隊衛(wèi)生所、醫(yī)師診所、甚至家庭推廣使用。
[0014]⑦患者可自檢，方法家庭化:如果給試劑盒里配置適當?shù)挠闷?，患者可以在家里自檢。
[0015]⑧系統(tǒng)化:該方法易于形成系列化產(chǎn)品，如肝炎系列、性病系列、胃病系列、腫瘤系列等。
[0016]膠體金免疫滲透試驗法是一種借助膠體金標記顯色的免疫層析反應。膠體金標記抗原(或抗體)檢測相應抗體(或抗原)的免疫學新方法，為研制特異、敏感、快速和便捷的免疫學檢測技術(shù)和臨床診斷方法奠定了基礎(chǔ)。金標檢測法在特制的金標板上加入5 μ L全血、血清或血漿放在檢測儀上2?3min即可得到全定量的結(jié)果。
[0017]三明治雙抗體技術(shù)是建立在單克隆抗體技術(shù)之上的生物【技術(shù)領(lǐng)域】較新的后抗體技術(shù)。雙抗體夾心法應用抗體對識別抗原的兩個位點來捕捉抗原，避免了抗體與抗原的同一位點的競爭結(jié)合，減少了抗原決定簇的空間位阻現(xiàn)象，所以較一般的抗原捕捉法更敏感，特異性更強，重復性更好，尤其適用于抗原含量很少的標本的檢測。本發(fā)明結(jié)合此技術(shù)開發(fā)針對NGAL的抗體對，對早期檢測急性腎損傷病人血液中指標更突顯其重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]本發(fā)明的目的是提供一種利用NGAL的單克隆抗體對作為急性腎損傷早期診斷的生化指標，建立一種能在現(xiàn)場快速檢測的試劑板，本方法不需要任何的輔助儀器，檢測時間僅5-15分鐘，通過測定人血液中的NGAL的濃度，來診斷急性腎損傷，提高了急性腎損傷診斷的敏感性和特異性。
[0019]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:一種急性腎損傷檢測試劑板，包括膠體金標記的NGAL抗體及相應的未標記抗體，羊抗鼠IgG抗體,聚乙烯板、聚氯乙烯襯膜、濾膜、玻璃纖維紙、聚酯膜、免疫層析膜和吸水紙組成。所述NGAL的抗體是單克隆抗體對。
[0020]所述NGAL的單克隆抗體用純化的抗原免疫BALB / c小鼠，得到抗原刺激的脾臟細胞，融合該脾臟細胞核小鼠的骨髓瘤細胞系，利用HAT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞，用ELSA方法鑒定抗NGAL的細胞株，進行三次克隆化得到分泌高特異性單克隆抗體的細胞株，通過小鼠腹水生產(chǎn)抗NGAL的單克隆抗體。
[0021]抗NGAL單克隆抗體對的篩選，主要采用抑制法篩選高親和力的亞克隆，進而在克隆化和ELSA相加實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上進行競爭抑制表位分析和親和力的測定，得到不同表位的單抗細胞株，進一步腹水生產(chǎn)并純化得到多量抗體，進行單株標記，采用ELSA直接法進行標記抗體的工作濃度滴定，然后采用ELSA競爭抑制法進行單標抗體表位測定，從而篩選出高效親和力的三明治抗體對。
[0022]將膠體金標記的抗NGAL的單克隆抗體均勻噴灑于單位面積的聚酯膜上；將抗NGAL的單克隆抗體的另一和羊抗鼠IgG抗體固定在單位面積的免疫層析膜上。
[0023]金標抗NGAL的單克隆抗體是制備方法為分別取半徑為40nm的膠體金及相應的抗NGAL的單克隆抗體，在pH8.2的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結(jié)合，加3% BSA作為穩(wěn)定齊U，采用高速離心法除去未結(jié)合的單克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體顆粒及其凝聚物，在離心管底部的深紅色沉淀即為膠體金-單克隆抗體復合物。
[0024]該檢測板水平面自下而上依次包括:樣品吸收區(qū)，可溶解的金標抗NGAL的單克隆抗體，固定化抗NGAL的單克隆抗體，一條固相化羊抗鼠IgG抗體和吸水區(qū)。
[0025]本發(fā)明所提供的急性腎損傷檢測試劑板，是以NGAL作為生化指標來診斷急性腎損傷。這包括制備上述NGAL的單克隆抗體對的方法，以及利用膠體金標記抗體和免疫層析方法測定血液或血清中的NGAL的濃度，以診斷急性腎損傷。
[0026]本方法利用金標記抗NGAL單抗作為第一抗體，用來捕捉抗原；精確呈橫條狀分布于免疫層析膜上的抗NGAL單克隆抗體對的另一抗體用來識別抗原，通過顯示免疫層析膜上的條紋，來判定檢測樣品中的NGAL的含量，從而篩選和診斷急性腎損傷。
[0027]本檢測試劑板由聚乙烯板、聚氯乙烯襯膜、濾膜、玻璃纖維紙、聚酯膜、免疫層析膜、膠體金標記的抗NGAL單抗、未標記抗NGAL單抗、羊抗鼠IgG抗體和吸水紙組成。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有突出的優(yōu)點和實用性:
[0029]1、檢測敏感性高、特異性強
[0030]2、可向基層醫(yī)療單位推廣:由于具有以上幾個特點，使得本方法既可在大型醫(yī)院使用，又可向基層醫(yī)療單位如:鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院、連隊衛(wèi)生所、醫(yī)師診所、甚至家庭推廣使用。
[0031]3、檢測快速
[0032]4、攜帶方便、操作簡便:本發(fā)明改變了對急性腎損傷篩選和診斷必須由專業(yè)人員或?qū)Ｓ脙x器才能進行檢測的局限性。樣品可為全血、血清或血漿，即可直接用指血檢測，操作簡單快速。
[0033]5、本發(fā)明制備工藝簡單，成本低；檢測試劑板在常溫下即可保存，無需特殊設(shè)備和儀器。保存期可達兩年。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1:急性腎損傷診斷檢測試劑板平面結(jié)構(gòu)區(qū)域圖。

【具體實施方式】
:
[0035]實施例一
[0036]急性腎損傷診斷檢測試劑板的生產(chǎn)方法:
[0037]1、NGAL的單克隆抗體對的制備
[0038]用純化的NGAL作為抗原分別免疫BALB / c小鼠，間隔21天免疫第二次，以后每間隔10天免疫一次，共免疫3-4次，然后取出免疫小鼠的脾臟細胞，用PEG將該脾臟細胞與小鼠的骨髓瘤細胞系F / O進行融合，利用HAT選擇性培養(yǎng)基在96孔細胞培養(yǎng)板上篩選雜交瘤細胞，用ELISA方法鑒定抗NGAL的細胞株，進行三次克隆化后得到穩(wěn)定分泌高特異性單克隆抗體的細胞株，在相同抗原包被板上采用ELSA抑制法，即參照組中加入細胞培養(yǎng)上清，在抑制組加入細胞培養(yǎng)上清和抗原混合物，比較兩組OD值差異從而篩選出高親和力的亞克隆。然后在間接ELISA實驗上進行相加法表位分析，即參照組中分別加入兩個單株細胞培養(yǎng)上清，測定組中同時加入兩株細胞培養(yǎng)上清，比較兩組OD值(Ap A2和A1+2)，通過下面公式計算:AI=[2A1+2 / (A^A2)-1] X 100%
[0039]在比較計算結(jié)果的基礎(chǔ)上進行表位分析和親和力的測定，Al值小于50%為相加陰性，即兩細胞株分泌的抗體識別抗原的表位相同，Al值大于50%為相加陽性，表示兩細胞株之間無競爭，即兩細胞株分泌的抗體識別抗原的兩個不同的表位，從而初步得到針對抗原不同表位的單抗細胞株。進一步將得到的單抗細胞株分別注射入小鼠腹腔進行腹水生產(chǎn)，利用ProteinA-Sepharose親和層析柱純化腹水得到多量單克隆抗體,用HRP酶對純化的抗體進行單株標記，用ELISA直接法進行標記抗體的工作濃度滴定，然后用ELISA競爭抑制法在參照組中加入酶標抗體，在測定組中加入酶標抗體和未標記待測抗體混合物，比較兩組OD值，參照組OD值大于測定值OD值的表示存在競爭抑制，視為兩抗體識別抗原的表位相同。反之，兩抗體不存在競爭抑制時視為兩抗體識別抗原的表位不同，從而最終篩選得到高效親和力的三明治抗體對。
[0040]2、膠體金標記抗NGAL單克隆抗體的方法
[0041]分別取半徑為40nm的膠體金及相應的抗NGAL的單克隆抗體，在pH8.2的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結(jié)合,加3% BSA作為穩(wěn)定劑，BSA為牛血清白蛋白。采用高速離心法除去未結(jié)合的單克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀即為膠體金-單克隆抗體復合物。
[0042]3.將金標復合物噴涂于聚酯膜上
[0043]用聚乙二醇洗滌膠體金-單克隆抗體復合物，離心出去上清液，得到深紅色沉淀，純化后的沉淀用緩沖液溶解，用噴涂設(shè)備涂于聚酯膜上，烘干。
[0044]4、免疫層析膜的包被
[0045]用純化的抗NGAL單克隆抗體對中的另一單抗溶液和羊抗鼠IgG抗體溶液用噴涂設(shè)備于硝酸素纖維膜上劃線，線的長度為3mm，每條線在3mm寬的硝酸素纖維膜上的滴加量為5-7ng。兩種抗體由下至上分別為NGAL和羊抗鼠IgG抗體,每條線間隔3mm。包被好的免疫層析膜用3% BSA溶液進行封閉。
[0046]5、試劑板裝備
[0047]塑料聚乙烯板作為支撐載體，上面粘有一層聚氧乙烯片材作為襯膜，由下至上由一層濾膜和一層玻璃纖維組成的樣品吸收區(qū)，其次是三層吸附了膠體金-單抗復合物的聚酯膜。然后是硝酸纖維膜，最上一層是吸水層，由一層濾紙組成，外面用特制膠帶包封。
[0048]實驗例I
[0049]急性腎損傷診斷檢測試劑板的使用方法:
[0050]1、對全血的檢測
[0051]用滴管取指血100μ I滴入檢測板的孔中，5-15分鐘觀察結(jié)果。出現(xiàn)兩條帶時為陽性。只有一條帶時為陰性。一條帶都無時表示檢測板失效。
[0052]2、對血清、血漿的檢測
[0053]用滴管取離心好的血清、血漿100 μ I垂直滴入檢測板的孔中，5-15分鐘觀察結(jié)果。出現(xiàn)兩條帶時為陽性。只有一條帶時為陰性。一條帶都無時表示檢測板失效。
【權(quán)利要求】
1.一種急性腎損傷早期診斷檢測試劑板，包括膠體金標記的NGAL抗體及相應的三種未標記抗體，羊抗鼠IgG抗體，聚乙烯板、聚氯乙烯襯膜、濾膜、玻璃纖維紙、聚酯膜、免疫層析膜和吸水紙組成。
2.如權(quán)利要求1所述的急性腎損傷早期診斷檢測試劑板，其特征在于:所述抗NGAL的抗體為單克隆抗體對。
3.如權(quán)利要求1所述的急性腎損傷早期診斷檢測試劑板，其特征在于:所述抗NGAL單克隆抗體分別用純化的抗原免疫BALB / c小鼠，得到抗原刺激的脾臟細胞，用ELISA方法鑒定分別抗NGAL的細胞株，進行三次克隆化后得到分泌高特異性的單克隆抗體的細胞株，通過小鼠腹水生產(chǎn)抗NGAL的單克隆抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的急性腎損傷早期診斷檢測試劑板，其特征在于:抗NGAL單克隆抗體對的篩選，主要采用抑制法篩選高親和力的亞克隆，進而在多次克隆化和ELISA相加實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上進行競爭抑制表位分析和親和力的測定，得到不同表位的單抗細胞株，進一步腹水生產(chǎn)并純化得到多量抗體，進行單株標記，采用ELISA直接法進行標記抗體的工作濃度滴定，然后采用ELISA競爭抑制法進行單標抗體表位測定，從而篩選出高效親和力的抗體對。
5.如權(quán)利要求1所述的急性腎損傷早期診斷檢測試劑板，其特征在于:將膠體金標記的抗NGAL的單克隆抗體均勻噴灑于單位面積的聚酯膜上；將抗NGAL的單克隆抗體對的另一抗體和羊抗鼠IgG抗體固定在單位面積的免疫層析膜上。
6.如權(quán)利要求5所述的急性腎損傷早期診斷檢測試劑板，其特征在于:金標抗NGAL的單克隆抗體的制備方法為分別取半徑為40nm的膠體金及相應的抗NGAL的單克隆抗體，在PH8.2的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結(jié)合，加3% BSA作為穩(wěn)定劑，采用高速離心法除去未結(jié)合的單克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀即為膠體金-單克隆抗體復合物。
7.如權(quán)利要求1所述的急性腎損傷早期診斷檢測試劑板，其特征在于:該檢測板水平面自下而上依次包括:樣品吸收區(qū)?？扇芙獾慕饦丝筃GAL的單克隆抗體，固相化抗NGAL的單克隆抗體，一條固相化羊抗鼠IgG抗體和吸水區(qū)。
【文檔編號】G01N33/577GK104459133SQ201310426318
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】劉宏飛 申請人:劉宏飛