本發(fā)明涉及維生素e和多不飽和脂肪酸(pufa)的混合物作為用于預(yù)防、控制和/或治療與不是由酒精濫用引起的肝臟中過量脂肪積累相關(guān)的病癥的藥劑的用途。這包括在有需要的受試者中預(yù)防、控制和/或治療肝臟中的非酒精性脂肪變性——稱為非酒精性脂肪性肝病(nafld)——和/或非酒精性脂肪性肝炎(nash)。具體地，本發(fā)明涉及這種包含維生素e和pufa作為活性成分的化合物在用于預(yù)防、控制和/或治療與nafld有關(guān)的病癥的藥物的制造中的用途。

背景技術(shù)：

雖然脂肪肝的病理生理學(xué)尚不完全明了，但公認的機制是“兩次打擊(two-hit)”理論(day和james，1998gastroenterology114：842-845)。第一次打擊對應(yīng)于肝臟中游離脂肪酸(ffa)的積累，其可能與肥胖有關(guān)，或更一般地與代謝綜合征(包括糖尿病、高血壓和血脂異常)有關(guān)。第二次打擊是指由于因不同因素產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致的這些脂肪酸的過氧化(angulo和lindor，2001gastroenterology120：1281-1285)。

第一次打擊的最終結(jié)果是過度的ffa平衡，起因是脂質(zhì)β氧化的過量供應(yīng)和/或失效，導(dǎo)致了肝臟中的脂肪酸積累，這引起了第一次病變(charlton等人，2002hepatology35：898-904)。這些初步影響使得肝臟更容易受到第二次打擊的攻擊因子的攻擊，第二次打擊由氧化應(yīng)激和促炎細胞因子(tnf-α、tgf-β、il-6、il-8)介導(dǎo)。ffa增加細胞色素p4502e1(cyp2e1)的表達，cyp2e1是微粒體酶，其參與若干ffa的β-氧化，從而導(dǎo)致活性氧代謝物的釋放(weltman等人，1998hepatology27：128-133)。還有一些ffa被過氧化物酶體β-氧化代謝，產(chǎn)生附加的活性氧代謝物(過氧化氫、羥自由基)(rao和reddy，2001seminliverdis21：43-55)。過量的這些分子在肝臟中消耗天然抗氧化劑如谷胱甘肽和維生素e，從而引起氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化(neuschwander-tetri和caldwell，2003hepatology37：1202-1219)。因此，肝細胞細胞器和膜中發(fā)生損傷，導(dǎo)致肝細胞變性并最終壞死(garcia-monzon等人，2000jhepatol33：716-7243737)。線粒體中的脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致活性氧代謝物的額外產(chǎn)生，從而導(dǎo)致更多的氧化應(yīng)激(solisherruzo等人，2006revespenfermdig98：844-874)。在這些情況下，核因子κb(nf-κb)將被激活，其刺激炎性介質(zhì)如促炎細胞因子(tnf-α、tgf-β、il-8)的合成(angulo，2002nengljmed346:1221-1231)。此外，脂質(zhì)過氧化的最終醛副產(chǎn)物如丙二醛(mda)和4-羥基壬烯醛顯示出趨化性質(zhì)并激活促炎細胞因子(tnf-α、tgf-β、il-6、il-8)和刺激產(chǎn)肝臟膠原的星狀細胞(pessayre，2007jgastroenterolhepatol22(增補版1)：s20-s27))。nafld患者肝臟中tnf-α的表達增加(crespo等人，2001hepatology34(6):1158-1163)。最終結(jié)果是稱為脂肪性肝炎的混合性病變，其特征在于肝組織的脂肪變性、炎性浸潤和纖維變性，以及最終的肝細胞壞死。持續(xù)的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化誘發(fā)連續(xù)的膠原蛋白產(chǎn)生，這導(dǎo)致纖維變性達到肝硬化階段(chitturi和farrell，2001hepatology36：403-409)。

肝臟特異性庫普弗細胞(kupffercell)在脂肪肝疾病如nash的發(fā)病機理中起著重要作用。庫普弗細胞是肝臟駐留巨噬細胞，其提供抵抗內(nèi)毒素和來自門靜脈的有害外源顆粒的顯著保護。nash的發(fā)病機制可能包括由于庫普弗細胞的吞噬功能受損(loffreda等人，1998fasebj.12:57-65)而導(dǎo)致的高內(nèi)毒素血癥(hyperendotoxemia)(creely等人，2007amjphysiolendocrinolmetab.292:e740–e747)。細菌代謝物、內(nèi)毒素、脂多糖等的清除受損可能會加速肝臟疾病的發(fā)病。庫普弗細胞的激活導(dǎo)致附加的應(yīng)激刺激，并且可以決定肝細胞從存活到細胞凋亡的命運。在庫普弗細胞中存在細胞因子如tnf-α和il-1β的過度產(chǎn)生。同時，庫普弗細胞對這些分子變得更加敏感(diehl，2002amjphysiolgastrointestliverphysiol.282:g1–g5)。由激活的庫普弗細胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì)觸發(fā)肝臟星狀細胞合成可以導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化的膠原。與單純脂肪肝患者中觀察到的彌漫分布相比，在nash患者肝臟的周圍區(qū)域中可以觀察到肥大的庫普弗細胞的聚集體(park等人，2007jgastroenterolhepatol.22:491-497)。

關(guān)于肝臟中的發(fā)炎事件，如與nafld或nash相關(guān)的發(fā)炎事件，已經(jīng)在各種人類臨床研究中檢查了維生素e的效應(yīng)(pacana等人，curropinclinnutrmetabcare2012；15:641-648)。通過攝取維生素e，肝酶可以隨著血漿細胞因子水平的降低而增加。對于患有經(jīng)組織活檢證實的nash的非糖尿病成人，使用800iu/天的日劑量可以獲得肝組織學(xué)改善。然而，不推薦將維生素e用于糖尿病患者中作為nash、未進行組織活檢的nafld、nash肝硬化或隱源性肝硬化的治療手段(chalasani等人，hepatology，第55卷，第6號，2012)。

因此，需要具有肝保護效應(yīng)但具有弱副作用或無副作用的新藥劑。這些藥劑可用于預(yù)防、控制和/或治療不是由酒精濫用引起的脂肪肝疾病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些化合物可以調(diào)節(jié)參與nafld或相關(guān)肝功能障礙的炎性介質(zhì)的生物合成/過度產(chǎn)生，所述介質(zhì)包括例如類花生酸(前列腺素、白細胞三烯)、細胞因子、趨化因子、核因子和/或一氧化氮。

令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)維生素e和pufa的組合顯示出肝保護效應(yīng)，并且能夠協(xié)同地調(diào)節(jié)一些促炎介質(zhì)如細胞因子的生物合成/過度產(chǎn)生。因此，此類化合物可用于預(yù)防、控制和/或治療與肝臟中脂肪過度積累相關(guān)的病癥，優(yōu)選用于預(yù)防、控制和/或治療nafld。

因此，本發(fā)明涉及包含維生素e和pufa的混合物在治療、控制和/或預(yù)防肝臟炎癥和肝臟中細胞損傷方面的用途，更優(yōu)選預(yù)防、控制和/或治療nafld及相關(guān)疾病方面的用途。因此，在一個方面，本發(fā)明涉及維生素e和pufa制造下述藥物的用途，所述藥物用于預(yù)防、控制和/或治療需要調(diào)節(jié)肝細胞中的炎癥反應(yīng)的病癥，特別是治療和預(yù)防nafld。

根據(jù)本發(fā)明的包含維生素e和pufa的混合物可以用作營養(yǎng)組合物，即作為膳食組合物的補充劑，即(強化的)食物/飼料或飲料，或作為劑量單位形式的組合物，諸如藥物組合物，例如片劑、顆粒劑、糊劑或泡騰制劑，該泡騰制劑可以進一步包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，包括但不限于潤滑劑、著色劑、潤濕劑、填充劑、崩解劑和調(diào)味劑。糊劑可以填充到硬或軟明膠膠囊中。

如本文所用，術(shù)語“維生素e”包括各種生育酚的天然和合成混合物，包括α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。生育酚在室溫下為液體，是具有通式(i)的一組甲基化酚類化合物，

其中r¹、r³和r⁴彼此獨立地為氫或甲基；并且其中每個*表示單獨的手性中心。對于生育酚異構(gòu)體，r¹、r³和r⁴如下：α-生育酚(r¹＝r³＝r⁴＝ch3)；β-生育酚(r¹＝r⁴＝ch3，r³＝h)；γ-生育酚(r¹＝h，r³＝r⁴＝ch3)；δ-生育酚(r¹＝r³＝h，r⁴＝ch3)。

式(i)中的取代基r¹和r³中的至少一個優(yōu)選為ch3，更優(yōu)選使用α-生育酚和/或γ-生育酚。

式(i)的生育酚具有在式中用星號(*)表示的手性碳中心。這些手性中心處的構(gòu)型被定義為r或s，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的概念。

對于殘基r¹、r³和r⁴的給定定義，由于這些手性中心，根據(jù)式(i)的相應(yīng)生育酚分別以8種不同的異構(gòu)體存在(即(2r,4’r,8’r)-、(2r,4’s,8’r)-、(2r,4’r,8’s)-、(2r,4’s,8’s)-、(2s,4’r,8’r)-、(2s,4’s,8’r)-、(2r,4’r,8’s)-和(2s,4’s,8’s)-生育酚)。如本文所用，生育酚以所述手性異構(gòu)體的混合物或異構(gòu)純物質(zhì)的形式存在。(2rs,4’rs,8’rs)生育酚也稱為(全消旋)-生育酚。

維生素e的特別有用形式是與pufa一起在混合物中使用的α-生育酚。

pufa根據(jù)分子碳鏈中雙鍵的位置分為n-9、n-6或n-3pufa。n-6pufa的示例是亞油酸(c18:2)、花生四烯酸(c20:4)、γ-亞麻酸(gla，c18:13)和二高-γ-亞麻酸(dgla，c20:3)。n-3pufa的示例為α-亞麻酸(c18:13)、二十碳五烯酸(epa，c20:5)，以及二十二碳六烯酸(dha，c22:6)。特別是epa和dha近年來已經(jīng)引起了食品行業(yè)的興趣。這兩種脂肪酸最可用來源是魚類和從魚類或微藻中提取的深海魚油(marineoil)。

如本文所用，術(shù)語“pufa”是指具有包含16個或更多個碳原子(例如，16個、18個、20個或22個碳原子(分別為c16、c18、c20或c22))的主鏈和主鏈中的兩個或更多個碳-碳雙鍵的脂肪酸。如本文所用，“長鏈pufa”(lc-pufa)是指具有包含18個或更多個碳原子的主鏈和在主鏈中的兩個或更多個碳-碳雙鍵的脂肪酸，例如c18:3n-3(α-亞麻酸或ala)。當符號ca:bn-x用于亞甲基間隔的pufa時，“ca”是碳數(shù)目(例如c18、c20或c22)，b是雙鍵的數(shù)目，以及x是從脂肪酸鏈的甲基端計數(shù)的第一雙鍵的位置。

如本文所用，pufa涵蓋其游離酸形式，以及其鹽和酯。如本文所用，術(shù)語酯是指用另一取代基取代pufa分子的羧酸基團中的氫。常見酯的示例包括甲基、乙基、三氯乙基、丙基、丁基、戊基、叔丁基、芐基、硝基芐基、甲氧基芐基和二苯甲基。pufa的其他酯描述于us2010-0130608a1中，該專利以引用方式并入本文。

用于本發(fā)明的pufa包括ω-3、ω-6和ω9多不飽和脂肪酸，以及由其衍生的脂氧化物。用于本發(fā)明的示例性ω-3pufa包括但不限于α-亞麻酸(c18:3n-3)、c18:4n-4、ω-3二十碳五烯酸(20:5n-3)(二十碳五烯酸)、ω-3二十二碳五烯酸(二十二碳五烯酸)、ω-3二十二碳六烯酸(22:6n-3)、二十二碳四烯酸(22:4n-6)，以及它們的組合。用于本發(fā)明的示例性ω-6pufa包括但不限于γ-亞麻酸、亞油酸、共軛亞油酸、花生四烯酸(20:4n-6)、ω-6二十二碳五烯酸，以及它們的組合。在一些實施方案中，用于本發(fā)明的pufa油是全順式的。

在一些實施方案中，pufa包括dha及其任何鹽或衍生物，dha也以其化學(xué)名稱(全-z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸已知。因此，術(shù)語dha涵蓋dha乙酯(dha-ee)以及dha游離脂肪酸，含有dha的磷脂、其他酯、甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯。dha是ω-3pufa。

在另外的實施方案中，pufa包括epa及其任何鹽或衍生物，epa也以其化學(xué)名稱(全-z)-5,8,1l,14,17-二十碳五烯酸已知。因此，術(shù)語epa涵蓋游離酸性epa以及epa烷基酯和包含epa的甘油三酯。epa是ω-3pufa。

在一些實施方案中，用于制造熱穩(wěn)定乳液的pufa油基本上不含一種或多種特定的脂肪酸。例如，含有dha-ee的pufa油可以基本上不含epa。在另一方面，含有epa-ee的pufa油可以基本上不含dha。

適用于本發(fā)明的市售pufa包括但不限于martekdha^tms油(martekbiosciencescorp.,columbia,md.)、rosemary-freemartekdha^tms油(martekbiosciencescorp.,columbia,md.)、microalgaedha^tm油(martekbiosciencescorp.,columbia,md.)、油(omegaproteincorp.,houston,tex.)、油(lipidnutrition,wormerveer,nl)、meg-3油和粉末(oceannutritioncorp.,dartmouth,ca)、evogel(symriseag,holzminden,de)、深海魚油(aristaindustries,wilton,conn.)和油(sourcefoodtechnology,inc.,raleigh,n.c.)。

pufa的特別有用形式是ω-3pufa，其與維生素e(特別是根據(jù)本發(fā)明的α-生育酚)一起用于混合物中，即用于治療、控制和/或預(yù)防與不是由酒精濫用引起的肝臟中過量脂肪積累相關(guān)的病癥。

pufa優(yōu)選以某一濃度使用，使得成年人(體重約70kg)的日常攝取在10mg/天至4000mg/天的范圍內(nèi)，優(yōu)選200mg/天至600mg/天的范圍內(nèi)，更優(yōu)選約400mg/天。食品或飲料適當?shù)孛糠莺屑s5mg至約1000mg的pufa。如果該營養(yǎng)組合物是藥物制劑，則此類制劑可以含有每劑量單位(例如每個膠囊或片劑)約10mg至約1000mg的pufa，或液體制劑每日劑量約10mg至每日劑量約4000mg的量的pufa。

維生素e或其衍生物優(yōu)選以某一濃度使用，使得成年人(體重約70kg)的日常消耗在5mg/天至2000mg/天的范圍內(nèi)，優(yōu)選15至50iu/天的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為30iu/天。食物或飲料適當?shù)孛糠莺屑s2mg至約500mg的維生素e。如果該營養(yǎng)組合物是藥物制劑，則此類制劑可以含有每劑量單位(例如每個膠囊或片劑)約5mg至約1000mg的維生素e，或液體制劑每日劑量約5mg至每日劑量約2000mg的量的維生素e。

如本文所用的術(shù)語“受試者”包括其中炎癥事件已知的所有高等動物。具體地，受試者是哺乳動物，包括動物或人類。

如本文所用，與nafdl或nash相關(guān)的“脂肪肝”或“過量脂肪積累”是指肝臟含有超過約5至約10重量％的脂肪。

如上所述，根據(jù)本發(fā)明的化合物具有肝保護性質(zhì)，并且可用于預(yù)防、控制和/或治療nafld中所涉及的病癥或相關(guān)的肝臟功能障礙。它們也可以用作助劑，通過調(diào)節(jié)肝細胞中炎性介質(zhì)的生物合成/過度產(chǎn)生來治療因肝臟中的過量非酒精性脂肪積累導(dǎo)致的各種疾病或病癥。

在一個具體實施方案中，本發(fā)明的化合物用于預(yù)防、控制和/或治療與不是由酒精濫用引起的肝臟中的過量脂肪積累相關(guān)的病癥，優(yōu)選地預(yù)防、控制和/或治療nafld和nash。

因此，本發(fā)明具體地涉及如上定義的維生素e和pufa的組合用于預(yù)防、控制和/或治療需要調(diào)節(jié)與不是由酒精攝取/濫用引起的肝臟中脂肪積累相關(guān)的炎癥反應(yīng)的病癥、特別是上述那些病癥(的藥物/組合物的制造中)的用途。

在另一個實施方案中，可以通過在施用如本文所公開的化合物之前、同時或之后施用，將本發(fā)明的化合物/混合物與本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的用于治療、控制和/或預(yù)防肝臟中的炎癥性疾病的其他營養(yǎng)組合物或治療劑聯(lián)合使用。

根據(jù)施用模式，根據(jù)本發(fā)明的化合物/混合物基本上由維生素e和pufa組成——即作為主要的活性成分——并進一步添加粘合劑、填充劑、載體、賦形劑(包括技術(shù)人員已知的水、甘油等)。

根據(jù)本發(fā)明，以重量比計算，所施用的維生素e和多不飽和脂肪酸的比率可以在約1:1至約1:5的范圍內(nèi)，例如1:2，或在約4:1或約5:1至約20:1的范圍內(nèi)。具體地，維生素e被計算為α-生育酚。在一個實施方案中，可用的比率可以是多不飽和脂肪酸與維生素e的重量比計算為0.2:1、0.4:1、0.6:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、8:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、25:1或30:1，其中維生素e計算為α-生育酚。

為了確定各化合物或其組合的抗炎性質(zhì)，在所述化合物的存在下，用體外炎癥刺激激活合適的細胞或細胞系(即全血、巨噬細胞、白細胞)。這導(dǎo)致促炎前列腺素e2(即環(huán)氧合酶-2的產(chǎn)物)、一氧化氮(由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶合成)和各種細胞因子和白介素的分泌。由于它們的抗炎效應(yīng)，化合物會降低這兩種代謝物的水平。類似地，炎癥通路基因的表達將通過定量pcr或微陣列分析來監(jiān)測?？寡谆衔锝档土怂鼈兊谋磉_水平。將在特異性炎癥參數(shù)水平上以及更一般地在與細胞炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因表達譜中鑒定化合物的累加和/或協(xié)同效應(yīng)。

使用維生素e和pufa的聯(lián)合治療的抗炎效應(yīng)可以在受刺激的巨噬細胞(包括庫普弗細胞)中通過確定對反映炎癥反應(yīng)的細胞因子合成的抑制來證實。

為了誘導(dǎo)與nafld有關(guān)的體外“炎癥反應(yīng)”，庫普弗細胞，即肝臟駐留巨噬細胞，是用來研究測檢物(如根據(jù)本發(fā)明的維生素e和pufa的混合物)的肝保護效應(yīng)的理想細胞類型?；蛘撸梢允褂么嬖谟谕庵苎毎械氖罂凭奘杉毎鹯aw264.7或甚至單核細胞/巨噬細胞作為適當?shù)奶娲Ｐ?raptis等人，jhepatology60,625-632,2014)。對于體外實驗，可以將細胞接種到微量滴定板或12孔板中，并用不含有或含有梯度量的測檢物的脂多糖(lps)刺激。使媒介物濃度(即dmso)保持恒定?？梢栽谶m當?shù)臅r間段(例如24小時)后收獲培養(yǎng)上清液?？梢酝ㄟ^適當?shù)幕趀lisa的多重測定來測量細胞因子和白介素。計算在給定濃度的測檢物下對存在于肝臟特異性細胞中的所提及炎性介質(zhì)的抑制百分比(與lps刺激的細胞的最大產(chǎn)量相比)，并計算對測檢物的推定協(xié)同效應(yīng)(參見下文)。

以下實施例僅是說明性的，并不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在本申請中引用的所有參考文獻、專利申請、專利和公開專利申請的內(nèi)容以引用方式并入本文。

實施例

實施例1：維生素e和pufa在白細胞中的協(xié)同效應(yīng)

實驗過程：

從健康供體獲得白細胞。通過ficoll-isopaque梯度離心純化單核細胞(mnc)。將細胞(3-8×10⁶個細胞/毫升)在補充有0.25％fbs、0.1mmneaa、50u/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素和5×10^-5的m2-巰基乙醇的無酚紅rpmi1640中培養(yǎng)。將細胞用lps(100ng/ml)和ifn-γ(20u/ml)刺激2至24小時。用于測定細胞因子和趨化因子的多參數(shù)試劑盒購自bio-radlaboratories(hercules,ca)，并用于liquichipworkstationis200(qiagen，hilden，germany)中。用liquichipanalyzer軟件(qiagen)評估數(shù)據(jù)。

由chou和talalay開發(fā)的算法用于計算協(xié)同效應(yīng)(chou,t-c.和talalay,p.，asimplebiol.chem.252,6438-6442,1977；chou,t-c.&talalay,p.analysisofcombineddrugeffects-anewlookataveryoldproblem.trendsinbiologicalsciences.1983年11月，第450-454頁，1983)。用聯(lián)合作用指數(shù)(ci)量化相互作用。簡而言之，測定對每種單獨物質(zhì)或兩種物質(zhì)的混合物的濃度的抑制％。分別計算受影響的部分(fa)(值在0和1之間)和不受影響的部分(fu)(1-fa)。對于中效曲線(median-effectplot)，將log(fa/fu)相對于log(d)作圖，其中d表示每一單獨化合物或兩種化合物的混合物的濃度。使用基于chou和talalay方法的calcusyn軟件(biosoft，ferguson，mo)，針對每個受影響的部分計算ci：ci＜1反映了對各相應(yīng)炎癥參數(shù)的協(xié)同抑制；如果ci＝1，則物質(zhì)具有累加相互作用；當ci＞1時，物質(zhì)的相互作用反映了拮抗。還觀察到，在給定濃度或比率下物質(zhì)可以分別具有協(xié)同或拮抗相互作用(參見例如pappa等人，quantitativecombinationeffectsbetweensulforaphaneand3,3’-generalizedequationfortheanalysisofmultipleinhibitionsinmichaelis-mentenkineticsystems.j.diindolylmethaneonproliferationofhumancoloncancercellsinvitro.carcinogenesis28,1471-77,2007)。

結(jié)果：

用lps刺激細胞，lps是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的病原體來源組分，炎癥反應(yīng)反映為炎性基因的表達以及細胞因子、白介素和趨化因子的分泌(表1)。lps誘導(dǎo)炎性介質(zhì)如tnf-α分泌的大量增加。伴隨地，分泌了炎性介質(zhì)。在用lps刺激之前，通過用α-生育酚或ω-3pufa預(yù)孵育細胞來調(diào)節(jié)這些參數(shù)。例如，促炎細胞因子tnf-γ分別被降低了29％和64％(表1a)。il-1β和ccl4/mip-1b也被這兩種物質(zhì)顯著降低(表1b、表1c)。因此，這些物質(zhì)減少了響應(yīng)于炎癥刺激的細胞中的炎癥應(yīng)激程度。

當α-生育酚和ω-3pufa以不同的濃度和比率組合時，在抑制促炎細胞因子tnf-α的產(chǎn)生方面，以及在抑制促炎白介素il-1β、以及趨化因子ccl4的產(chǎn)生方面，均觀察到了顯著的協(xié)同效應(yīng)(參見表1a至表1c，右欄)。對tnf-α的協(xié)同效應(yīng)最為突出。

表1：α-生育酚和ω-3pufa在白細胞炎癥反應(yīng)中的協(xié)同效應(yīng)。at＝α-生育酚；更詳細內(nèi)容請參見正文。

1a：at和ω-3pufa之間在抑制tnf-α方面的協(xié)同效應(yīng)

1b：at和ω-3pufa在抑制ccl4/mip-1β中的協(xié)同效應(yīng)

1c：at和ω-3pufa之間在抑制il-1β方面的協(xié)同效應(yīng)

實施例2：軟明膠膠囊

通過常規(guī)方法制備軟明膠膠囊，從而提供5至1000mg(例如50mg)劑量的維生素e(例如α-生育酚)，以及10至1000mg(例如200mg)的選自由如上述定義的pufa組成的組的至少一種化合物(例如dha)，其中所述量是推薦的日劑量。待添加的其他成分：甘油、水、明膠、植物油。

實施例3：硬明膠膠囊

通過常規(guī)方法制備硬明膠膠囊，從而提供5至1000mg劑量的維生素e(例如α-生育酚)，以及10至1000mg的選自由如上述定義的pufa組成的組的至少一種化合物(例如dha)，其中所述量是推薦的日劑量。待添加的其他成分：填充劑，例如適量乳糖或纖維素或纖維素衍生物；潤滑劑，例如硬脂酸鎂(0.5％)(如果必要的話)。

實施例4：片劑

通過常規(guī)方法制備片劑，從而提供每片劑5至1000mg(例如20mg)的維生素e(例如α-生育酚)和10至1000mg的選自由如上述定義的pufa組成的組的至少一種化合物(例如dha)作為活性成分，并提供微晶纖維素、二氧化硅(sio2)、硬脂酸鎂、交聯(lián)聚維酮nf(其是崩解劑)約500mg作為賦形劑。

實施例5：軟飲料

可以根據(jù)表2和表3制備用β-胡蘿卜素10％cws著色并且含有維生素e(例如α-生育酚)和選自由如上述定義的pufa組成的組的至少一種化合物(例如dha)的橙汁飲料。

表2：軟飲料成分

首先，在攪拌下將苯甲酸鈉溶于水中。繼續(xù)攪拌，并依次加入糖漿、抗壞血酸、檸檬酸、果膠溶液和復(fù)合果汁。不要使用高速攪拌機。將裝瓶糖漿用(加碳酸的)水稀釋成1升飲料。

表3：復(fù)合果汁的成分

為了制備復(fù)合果汁，首先將去離子水加入濃縮果汁中，輕輕攪拌，以使?jié)饪s果汁水合。然后，將油性香料和β-胡蘿卜素10％cws原液加入，并在轉(zhuǎn)子-定子勻化器中預(yù)乳化。在200巴的高壓勻化器中進行均化。

典型地每份軟飲料可以是240ml，含有約5至100mg/份的量的維生素e(例如α-生育酚)和約5至500mg/份的量的pufa(例如dha)。

實施例6：維生素e和pufa在庫普弗細胞中的協(xié)同效應(yīng)

本研究擴展到從鼠或人肝臟分離的巨噬細胞：從肝組織獲得貼壁細胞(即庫普弗細胞)。根據(jù)li等人，immonologicalletters158,52-56,2014描述的方法或根據(jù)本領(lǐng)域中已知的任何方法進行分離和培養(yǎng)。將這些細胞用如上所述的化合物處理(參見實施例1)。這些細胞將被炎癥刺激激活，并測定各種物質(zhì)及其組合降低炎癥反應(yīng)的效應(yīng)。通過使用這種設(shè)置，可獲得與針對血細胞來源的巨噬細胞描述的那些(參見實施例1)相同的效應(yīng)。