本發(fā)明涉及膽管癌治療劑，該治療劑包含具有fgfr抑制性活性的單環(huán)吡啶衍生物或其藥理學(xué)上可接受的鹽。
背景技術(shù)：
：該化學(xué)式(i)所代表的化合物被認(rèn)為是5-((2-(4-(1-(2-羥乙基)哌啶-4-基)苯甲酰胺)吡啶-4-基)氧基)-6-(2-甲氧基乙氧基)-n-甲基-1h-吲哚-1-甲酰胺。據(jù)報道,該化學(xué)式(i)所代表的化合物對于成纖維細胞增長因子(fibroblastgrowthfactorreceptors,fgfr)1、2和3具有抑制性活性，并且在胃癌、肺癌、膀胱癌和子宮內(nèi)膜癌中具有抑制細胞生長的活性(專利文獻1)。[化學(xué)式1]膽管癌發(fā)病率低，但被認(rèn)為是具有不良預(yù)后的腫瘤。對于這類膽管癌，主要的治療方法是膽管的手術(shù)切除,但在很多病例中癌細胞不能被完全清除。在這樣的病例中，在該手術(shù)后實施吉西他濱和順鉑的組合給藥(非專利文獻1)。引用清單專利文獻專利文獻1：us2014-235614非專利文獻非專利文獻1：celinaang,"roleofthefibroblastgrowthfactorreceptoraxisincholangiocarcinoma"[成纖維細胞生長因子受體軸在膽管癌中的作用]，journalofgastroenterologyandhepatology[胃腸病學(xué)與肝病學(xué)雜志]，vol.30,p.1116-1122,2015。技術(shù)實現(xiàn)要素：技術(shù)問題然而，足夠的治療活性尚不能從目前報道的膽管癌治療劑中獲得。問題解決方案鑒于這種情況，諸位發(fā)明人進行了深入研究，并且結(jié)果是找到了這種化學(xué)式(i)所代表的化合物對于膽管癌的治療是有效的，且完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供了以下[1]至[12]：[1]一種膽管癌治療劑，其包含5-((2-(4-(1-(2-羥乙基)哌啶-4-基)苯甲酰胺)吡啶-4-基)氧基)-6-(2-甲氧基乙氧基)-n-甲基-1h-吲哚-1-甲酰胺(由化學(xué)式(i)所示)或其藥學(xué)上可接受的鹽。[化學(xué)式2][2]根據(jù)[1]所述的治療劑，其中該膽管癌是肝內(nèi)膽管癌。[3]一種用于膽管癌的治療的藥物組合物，其包含5-((2-(4-(1-(2-羥乙基)哌啶-4-基)苯甲酰胺)吡啶-4-基)氧基)-6-(2-甲氧基乙氧基)-n-甲基-1h-吲哚-1-甲酰胺(由化學(xué)式(i)所示)或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分。[4]根據(jù)[3]所述的藥物組合物，其中該膽管癌是肝內(nèi)膽管癌。[5]一種治療膽管癌的方法，包括向患者給予藥理學(xué)有效量的5-((2-(4-(1-(2-羥乙基)哌啶-4-基)苯甲酰胺)吡啶-4-基)氧基)-6-(2-甲氧基乙氧基)-n-甲基-1h-吲哚-1-甲酰胺(由化學(xué)式(i)所示)或其藥學(xué)上可接受的鹽。[6]根據(jù)[5]所述的方法，其中該患者在給藥前已被證實具有編碼fgfr2-融合蛋白的基因。[7]根據(jù)[6]所述的方法，其中編碼fgfr2-融合蛋白的基因是fgfr2-ahcyl1、fgfr2-bicc11型、fgfr2-bicc12型、fgfr2-txlna或fgfr2-kctd1。[8]根據(jù)[5]到[7]中任一項所述的方法，其中該膽管癌是肝內(nèi)膽管癌。[9]5-((2-(4-(1-(2-羥乙基)哌啶-4-基)苯甲酰胺)吡啶-4-基)氧基)-6-(2-甲氧基乙氧基)-n-甲基-1h-吲哚-1-甲酰胺(由化學(xué)式(i)所示)或其藥學(xué)上可接受的鹽，用于膽管癌的治療。[10]根據(jù)[9]所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中該膽管癌是肝內(nèi)膽管癌。[11]5-((2-(4-(1-(2-羥乙基)哌啶-4-基)苯甲酰胺)吡啶-4-基)氧基)-6-(2-甲氧基乙氧基)-n-甲基-1h-吲哚-1-甲酰胺(由化學(xué)式(i)所示)或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備膽管癌治療劑的用途。[12]根據(jù)[11]所述的用途，其中該膽管癌是肝內(nèi)膽管癌。發(fā)明的有利效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供對于膽管癌的治療有效的治療劑。附圖說明[圖1]圖1是展示fgfr2-bicc11型和2型基因結(jié)構(gòu)的示意圖。[圖2]圖2是顯示蛋白印跡分析結(jié)果的圖，該分析中的蛋白通過培育轉(zhuǎn)染了不同fgfr2融合基因的小鼠成纖維細胞系nih3t3獲得。[圖3]圖3是顯示蛋白印跡分析結(jié)果的圖，該分析中的蛋白通過培育轉(zhuǎn)染了fgfr2融合基因的nih3t3細胞系獲得。[圖4]圖4是顯示蛋白分析結(jié)果的圖，該分析中的蛋白通過培育轉(zhuǎn)染了不同fgfr2融合基因的nih3t3細胞系獲得。[圖5]圖5是顯示fgfr抑制劑活性的圖，該抑制劑作用于轉(zhuǎn)染了fgfr2融合基因的nih3t3細胞系的生長能力。[圖6]圖6是顯示fgfr抑制劑活性的圖，該抑制劑作用于轉(zhuǎn)染了fgfr2融合基因的nih3t3細胞系的生長能力。[圖7]圖7是顯示fgfr抑制劑活性的圖，該抑制劑作用于轉(zhuǎn)染了fgfr2融合基因的nih3t3細胞系的生長能力。具體實施方式本發(fā)明的一個實施方案是包含5-((2-(4-(1-(2-羥乙基)哌啶-4-基)苯甲酰胺)吡啶-4-基)氧基)-6-(2-甲氧基乙氧基)-n-甲基-1h-吲哚-1-甲酰胺(由化學(xué)式(i)所示)或其藥學(xué)上可接受的鹽的膽管癌治療劑。[化學(xué)式3]在本說明書中，藥理學(xué)上可接受的鹽的實例可包括無機酸的鹽、有機酸的鹽或酸性氨基酸的鹽。無機酸的鹽的適當(dāng)實例包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸和磷酸的鹽。有機酸的鹽的適當(dāng)實例包括羧酸(例如乙酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、硬脂酸和苯甲酸)的鹽和磺酸(例如甲磺酸、乙磺酸和對甲苯磺酸)的鹽。酸性氨基酸的鹽的適當(dāng)實例包括天冬氨酸的鹽和谷氨酸的鹽。優(yōu)選的藥理學(xué)上可接受的鹽是琥珀酸鹽或馬來酸鹽，并且更優(yōu)選的鹽是琥珀酸鹽。作為這種藥理學(xué)上可接受的鹽，以質(zhì)量計超出該化學(xué)式(i)所代表的化合物1.5倍的含琥珀酸的鹽(1.5琥珀酸鹽)是特別優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明的由化學(xué)式(i)表示的化合物或其藥理學(xué)上可接受的鹽可以通過專利文獻1中描述的程序來生產(chǎn)。在本說明書中，術(shù)語“膽管”與“膽道”同義地使用。即，膽管癌指肝內(nèi)膽管癌、肝外膽管癌、膽囊管癌、膽囊癌或十二指腸乳頭癌。這種膽管癌也包括這些轉(zhuǎn)移到膽管以外部位的惡性腫瘤。本發(fā)明的膽管癌治療劑對肝內(nèi)膽管癌特別有效。本發(fā)明的膽管癌治療劑可以處于口服給藥的制劑形式，例如固體制劑(如片劑、顆粒、微粒、散劑或膠囊)或溶液、凍膠或糖漿。本發(fā)明的膽管癌治療劑也可以處于非消化道給藥的制劑形式，例如注射液、栓劑、軟膏或糊劑。當(dāng)制備口服給藥的制劑時，可適當(dāng)?shù)叵蛴苫瘜W(xué)式(i)表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽添加藥學(xué)上可接受的載體，例如賦形劑、粘合劑、分解劑、潤滑劑和著色劑。制劑(如片劑、顆粒、散劑或膠囊)也可適當(dāng)?shù)剡M行包衣。當(dāng)制備注射液(例如用于靜脈給藥、肌肉給藥、皮下給藥或腹膜內(nèi)給藥)時，可適當(dāng)?shù)叵蛴苫瘜W(xué)式(i)表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽添加藥學(xué)上可接受的載體(例如ph調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、助懸劑、增溶劑、抗氧化劑、保鮮劑(防腐劑)或等滲劑)，并且然后該注射液可通過傳統(tǒng)方法進行制備。該注射液也可以凍干以提供使用前溶解的凍干制劑。當(dāng)制備外用制劑時，可將基礎(chǔ)材料添加至由化學(xué)式(i)所代表的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，然后可將上述藥學(xué)上可接受的載體(例如保鮮劑、穩(wěn)定劑、ph調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑或著色劑)向其中適當(dāng)?shù)靥砑?，并且隨后，例如透皮制劑(如軟膏或貼片)、滴眼劑、鼻用制劑或栓劑可通過傳統(tǒng)方法進行制備?？捎玫幕A(chǔ)材料的實例包括常用于藥物、類藥品、化妝品等的各種材料。本發(fā)明的膽管癌治療劑可用由化學(xué)式(i)代表的化合物或其藥理學(xué)上可接受的鹽制備，依據(jù)japanesepharmacopoeia16thedition[《日本藥典》第16版]中描述的方法。本發(fā)明的膽管癌治療劑中由化學(xué)式(i)代表的化合物或其藥理學(xué)上可接受的鹽的劑量可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、年齡、性別、體重、以及患者敏感性的差異、給藥方式、給藥時間、給藥間隔、藥物制劑類型等進行適宜地選擇。本發(fā)明的膽管癌治療劑，當(dāng)口服給藥時，可以如下給予：對于成人(體重：60kg)而言，由化學(xué)式(i)代表的化合物或其藥理學(xué)上可接受的鹽的劑量是每天100μg到10g，優(yōu)選每天500μg到10g，更優(yōu)選每天1mg到5g。本發(fā)明的膽管癌治療劑能夠每天分成1到3部分進行給藥。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供治療膽管癌的方法，該方法包括向患者給予由化學(xué)式(i)代表的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。給藥的受試者優(yōu)選地是膽管癌患者，該受試者更優(yōu)選地是肝內(nèi)膽管癌患者，且特別優(yōu)選地是該受試者是具有編碼fgfr2-融合蛋白的基因(fgfr融合基因)的膽管癌患者。fgfr2融合基因是指融合了fgfr2和特定的其他基因的基因，fgfr2融合基因的實例包括fgfr2-bicc11型、fgfr2-bicc12型(seqidno:5)、fgfr2-txlna(seqidno:1)、fgfr2-ahcyl1、fgfr2-ccdc6、fgfr2-kctd1(seqidno:3)、fgfr2-mgea5、fgfr2-tacc3、fgfr2-pphln1、fgfr2-kiaa1598、fgfr2-ccar1、fgfr2-nol4和fgfr2-park2。此處，如圖1中所示，fgfr2-bicc11型是指具有與bicc1基因的khkh序列的5’末端位點融合的fgfr2的基因，而fgfr2-bicc12型是指具有與bicc1基因的sam區(qū)(不育α基序(sterilemotif))的5’末端位點融合的fgfr2的基因。fgfr2-bicc11型編碼由1574個氨基酸組成的多肽，而fgfr2-bicc12型編碼由835個氨基酸組成的多肽(seqidno:6)。bicc11型在bicc12型被發(fā)現(xiàn)之前也指bicc1。作為膽管癌患者，具有fgfr2-ahcyl1、fgfr2-bicc11型、fgfr2-bicc12型、fgfr2-txlna或fgfr2-kctd1的患者是優(yōu)選的，具有fgfr2-bicc12型、fgfr2-txlna或fgfr2-kctd1的患者是更加優(yōu)選的，且具有fgfr2-bicc12型的患者是特別優(yōu)選的。在給予本發(fā)明的膽管癌治療劑之前，可診斷受到給藥的受試者是否具有fgfr2融合基因。診斷fgfr2融合基因的存在與缺失的方法可以是常用的基因診斷法。實例本發(fā)明將通過以下實例更詳細地進行描述。生產(chǎn)實例1：5-((2-(4-(1-(2-羥乙基)哌啶-4-基)苯甲酰胺)吡啶-4-基)氧基)-6-(2-甲氧基乙氧基)-n-甲基-1h-吲哚-1-甲酰胺1.5琥珀酸鹽(下文中也稱作化合物a)的制備[化學(xué)式4]稱取2.93g5-((2-(4-(1-(2-羥乙基)哌啶-4-基)苯甲酰胺)吡啶-4-基)氧基)-6-(2-甲氧基乙氧基)-n-甲基-1h-吲哚-1-甲酰胺置于茄型燒瓶中，向其中添加60ml乙醇，并且將反應(yīng)混合物加熱至70℃同時在油浴中攪拌至溶解。添加琥珀酸(1.23g)，然后停止對該油浴的加熱，并且將該反應(yīng)混合物緩慢冷卻。將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌約2小時，并且在5℃下進一步攪拌一小時。所得固體通過過濾收集以得到化合物a(3.70g)。1h-nmr譜(600mhz,cd3od)δ(ppm):1.96-2.10(4h,m),2.52(6h,s),2.93(1h,m),2.96(3h,s),3.01(2h,m),3.16(2h,t,j＝5.4hz),3.22(3h,s),3.56(2h,t,j＝4.7hz),3.61(2h,m),3.87(2h,t,j＝5.4hz),4.14(2h,t,j＝4.6hz),6.61(1h,d,j＝3.6hz),6.68(1h,dd,j＝5.8,2.3hz),7.37(1h,s),7.42(2h,d,j＝8.3hz),7.58(1h,d,j＝3.6hz),7.73(1h,d,j＝2.2hz),7.88(2h,d,j＝8.3hz),8.08(1h,s),8.15(1h,d,j＝5.8hz)。13c-nmr譜(100mhz,固體狀態(tài))δ(ppm):27.1,28.3,29.7,34.8,38.0,41.3,54.0,57.3,59.7,60.9,72.1,72.5,103.3,104.2,108.5,116.9,126.9,128.6,134.5,136.7,140.7,149.4,151.3,155.1,169.5,170.1,175.6,179.9,183.7。fgfr2融合基因的構(gòu)建fgfr2融合基因的三種cdna類型(fgfr2-bicc12型(seqidno:5)、fgfr2-txlna(seqidno:1)、fgfr2-kctd1(seqidno:3))分別制備自膽道癌患者的癌組織。將編碼flag表位標(biāo)記的核苷酸序列根據(jù)翻譯閱讀框與所得的每個fgfr2融合基因的cdna的n-末端進行連接，并且在pmxs逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中克隆以構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒。此處，以上所連接的fgfr2融合基因也指作“野生型fgfr2融合基因”。該flag表位標(biāo)記的肽序列是h2n-dykddddk-cooh(分子量：1,012da)。此處，fgfr2、txlna和kctd1的每個cdna的多核苷酸序列分別對應(yīng)于seqidno:7、9和11，并且通過fgfr2、txlna和kctd1編碼的肽序列分別對應(yīng)于seqidno:8、10和12。接著構(gòu)建了具有野生型fgfr2融合基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中在編碼fgfr2激酶區(qū)域的兩個氨基酸發(fā)生了進一步突變。該突變意味著在位置568處的酪氨酸殘基被苯丙氨酸取代(y568f)并且在位置569處的酪氨酸殘基被苯丙氨酸取代(y569f)。此處，將該野生型fgfr2融合基因通過經(jīng)受上述突變所獲得的基因也指作“kd突變fgfr2融合基因”這些逆轉(zhuǎn)錄病毒均被感染至小鼠永生成纖維細胞系nih3t3的細胞以將該野生型fgfr2融合基因或者該kd突變fgfr2融合基因轉(zhuǎn)染入該細胞，以獲得穩(wěn)定表達由每個融合基因編碼的蛋白的細胞系。cdna克?。簆mxs載體(細胞生物實驗室公司(cellbiolabs))，plat-e逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞(細胞生物實驗室公司(cellbiolabs))測試實例1：免疫印跡分析首先，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒將野生型fgfr2融合基因或kd突變fgfr2融合基因轉(zhuǎn)染進小鼠成纖維細胞系nih3t3，并且將這些得到的細胞系培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基。使這些培養(yǎng)的細胞系經(jīng)受血清饑餓，并且然后在提取總蛋白之前使用含有fgfr抑制劑的培養(yǎng)基進行處理。此處，由fgfr2-bicc12型編碼的蛋白、由fgfr2-txlna編碼的蛋白和由fgfr2-kctd1編碼的蛋白分別示于seqidno:6、2和4。對于這些得到的總蛋白，使用各種抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析對該融合基因的下游信號進行分析。裝置：westernbreeze化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒(生命技術(shù)公司(lifetechnologies))fgfr抑制劑：bgj398(s2183，selleckchemicals公司)，儲存于10mmdmso溶液pd173074(s1264，selleckchemicals公司)，儲存于10mmdmso溶液化合物a(儲存于20mmdmso溶液)抗體：flag(#635691，克羅泰克實驗室有限公司(clontechlaboratories,inc.))phosphofgfr-y653/654(#3476，日本細胞信號技術(shù)有限公司(cellsignalingtechnologyjapan,k.k.))phosphoakt1-s473(#4060，日本細胞信號技術(shù)有限公司(cellsignalingtechnologyjapan,k.k.))akt-pan(#4691，日本細胞信號技術(shù)有限公司(cellsignalingtechnologyjapan,k.k.))phosphostat3-y705(#9145，日本細胞信號技術(shù)有限公司(cellsignalingtechnologyjapan,k.k.))stat3(#610189，美國bd公司(bectondickinsonandcompany))phosphomapk-t202/y204(#9106，日本細胞信號技術(shù)有限公司(cellsignalingtechnologyjapan,k.k.))mapk(#4695，日本細胞信號技術(shù)有限公司(cellsignalingtechnologyjapan,k.k.))β-肌動蛋白(#a5441，西格瑪奧德里奇有限責(zé)任公司(sigma-aldrichco.llc))?？贵w芯片：pathscanrtk信號抗體芯片(化學(xué)發(fā)光示值讀數(shù))(#7982，日本細胞信號技術(shù)有限公司(cellsignalingtechnologyjapan,k.k.))所得結(jié)果示于圖2中。如圖2所示，發(fā)現(xiàn)mapk基因的磷酸化(mapk基因的活化)依賴于fgfr2激酶活性來發(fā)生。即，轉(zhuǎn)染了fgfr2融合基因的nih3t3細胞具有非貼壁依賴性生長能力。在圖2中，“野生”意指野生型fgfr2突變的fgfr2融合基因，并且“kd”意指kd突變的fgfr2融合基因。接著，向轉(zhuǎn)染了fgfr2融合基因的nih3t3細胞系加入該fgfr抑制劑后(該fgfr抑制劑的終濃度：0.2μm或0.5μm)，使該細胞系經(jīng)受蛋白質(zhì)印跡分析并且類似地提取總蛋白。所得結(jié)果示于圖3中。如圖3所示，通過該fgfr抑制劑的處理，fgfr的磷酸化受到抑制，并且mapk的磷酸化受到顯著抑制。在圖3中，“bg”是指bgj398，“pd”是指pd173074，并且“e9”是指化合物a。具體地，例如，“bg-0.2”意味著添加bgj398使得該終濃度是0.2μm。此外，這些總蛋白類似地提取自未轉(zhuǎn)染該fgfr2融合基因的nih3t3細胞系以及轉(zhuǎn)染了fgfr2-bicc12型、fgfr2-txlna或fgfr2-kctd1的nih3t3細胞系。提取所得的90μg總蛋白通過該pathscan(r)陣列以被用來分析表達的蛋白。如圖4所示，檢測到磷酸化的akt(pakt-s473)、磷酸化的mapk(pmapk-t202/y204)以及磷酸化的s6核糖體蛋白(ps6-s235/236)。測試實例2：集落形成測定使用以下裝置，評估fgfr抑制劑作用于fgfr2融合多肽轉(zhuǎn)化能力的活性。即，將轉(zhuǎn)染了fgfr2融合基因的nih3t3細胞系播種于軟瓊脂培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中瓊脂的濃度：4mg/ml)，并且將fgfr抑制劑添加入該培養(yǎng)基(該fgfr抑制劑的終濃度：0.2μm)，并且對這種非貼壁依賴性集落形成能力進行評估。裝置：cytoselect96-孔細胞轉(zhuǎn)化芯片試劑盒(cba-130，細胞生物實驗室公司(cellbiolabs))fgfr抑制劑：bgj398(s2183，elleckchemicals公司)，儲存于10mmdmso溶液pd173074(s1264，elleckchemicals公司)，儲存于10mmdmso溶液化合物a(儲存于20mmdmso溶液)這些所得的結(jié)果示于圖5和圖6。如圖5和圖6所示，在這些fgfr2融合基因中，受到fgfr2-txlna和fgfr2-kctd1轉(zhuǎn)染的這些nih3t3細胞的非貼壁依賴性生長受到fgfr抑制劑的添加的顯著抑制。另一方面，當(dāng)使用bgj398或pd173074作為fgfr抑制劑時，受到fgfr2-bicc12型轉(zhuǎn)染的nih3t3細胞的非貼壁依賴性生長幾乎不受抑制，而當(dāng)使用化合物a作為fgfr抑制劑時，它受到顯著抑制。在圖5和圖6中，“bg”是指bgj398，“pd”是指pd173074，并且“e9”是指化合物a。如圖7所示，當(dāng)增加bgj398或pd173074使得該終濃度為1.0μm時，非貼壁依賴性生長受到抑制。在圖7中，“bg”是指bgj398，并且“pd”是指pd173074。測試實例3：ic50值的計算(通過集落形成測定)將受到fgfr2融合基因轉(zhuǎn)染的不同nih3t3細胞系在5％co2培養(yǎng)箱(37℃)中用含有10％fbs和青霉素/鏈霉素(日本和光純藥工業(yè)株式會社(wakopurechemicalindustries))的d-mem(日本和光純藥工業(yè)株式會社(wakopurechemicalindustries))培養(yǎng)基進行培養(yǎng)和維持。向96孔板(住友培科公司(sumitomobakelite))的每個孔添加50μl含有0.66％瓊脂培養(yǎng)基(difco瓊脂諾布爾，日本碧迪公司(difcoagarnoble,japanbectondickinson))的d-mem介質(zhì)(西格瑪公司(sigma))(含有10％fbs和青霉素/鏈霉素)。制備該細胞懸浮液使得該細胞數(shù)目是4×104個細胞/ml(通過制備使得表達fgfr2-txlna的細胞的細胞數(shù)目是8×104個細胞/ml)，將該細胞懸浮液與等量的0.66％瓊脂培養(yǎng)基溶液混合，并且使每層50μl的該所得混合物堆積且在4℃下通過冷卻30分鐘進行凝固。將該板恢復(fù)室溫后，使每層50μl的0.66％瓊脂培養(yǎng)基溶液進一步堆積。將50μl稀釋于dmem培養(yǎng)基(含10％fbs)的化合物a添加于各孔，并且置于該5％co2培養(yǎng)箱中(37℃)培養(yǎng)14天。將10μl細胞計數(shù)試劑盒(細胞計數(shù)試劑盒-8，同仁化學(xué)研究所(dojindolaboratories))添加于各孔并置于5％co2培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)1到2小時以得到顯色。使用多標(biāo)簽分析儀(arvo，鉑金埃爾默有限公司(perkinelmer,inc.))測量450nm處的吸光度。假設(shè)化合物a不存在時的吸光度是100％且沒有細胞的孔的吸光度是0％，確定化合物a存在時的吸光度。確定抑制細胞生長50％(ic50值)所需的化合物a的濃度，并在表1中展示。[表1]測試實例4：在皮下移植模型小鼠中的抗腫瘤活性(1)皮下移植模型小鼠的制備將轉(zhuǎn)染了各fgfr2融合基因(fgfr2-bicc12型、fgfr2-kctd1、fgfr2-txlna)的nih3t3細胞系培養(yǎng)于含有10％fbs和青霉素/鏈霉素的dmem培養(yǎng)基中。將d-pbs(-)(和光純藥工業(yè)(wakopurechemicalindustries))添加于所得的培養(yǎng)基使得細胞數(shù)目是1×107個細胞/ml，以制備各個細胞懸浮液。將這些細胞懸浮液中的每個的100μl皮下移植于7周齡裸鼠(株系：balb/cajcl-nu/nu，雌性，日本clea公司(cleajapan,inc.))的右肋區(qū)域以制備fgfr2-bicc12型移植模型小鼠、fgfr2-kctd1移植模型小鼠以及fgfr2-txlna移植模型小鼠。移植六天后，使用數(shù)顯卡尺(商標(biāo)名：digimatic(tm)caliper，日本三豐公司(mitutoyocorporation))測量腫瘤的寬度和長度?；谀[瘤的寬度和長度，通過以下計算公式計算腫瘤的體積。腫瘤體積(mm3)＝長度(mm)×寬度(mm)×寬度(mm)/2(2)化合物a溶液的制備化合物a溶于注射用水中，并且避光儲存于4℃的下直到給藥前。當(dāng)以20ml/kg的劑量對小鼠進行給藥時，制備該溶液使得化合物a的劑量是6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg。(3)藥物溶液的給藥給藥的第一天，基于腫瘤的體積對小鼠進行分組使得這些組的腫瘤體積平均值彼此幾乎相等。每個組小鼠的數(shù)目是5。將化合物a溶液對該化合物a給藥組的小鼠以20ml/kg的劑量每天一次進行持續(xù)地口服給藥。另一方面，向?qū)φ战M中的小鼠進行僅溶劑(注射用水)的類似給藥。對fgfr2-bicc12型或fgfr2-kctd1移植模型小鼠實行為期7天的給藥，并且對fgfr2-txlna移植模型小鼠實行11天。在給藥的第一天和最后一天，對對照組和化合物a給藥組中的每只小鼠進行體重測量。計算了最后一天的體重與第一天的體重之比(相對體重：rbw)。當(dāng)化合物a給藥組rbw/對照組rbw是0.9或更高，判斷該劑量是安全的。對應(yīng)的劑量是6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg以及50mg/kg。在給藥的最后一天，對腫瘤體積也進行了測量。計算了化合物a給藥組的小鼠腫瘤體積相對于對照組的小鼠腫瘤體積的百分比(t/c)(％)。每只移植模型小鼠中的t/c(％)結(jié)果展示于表2到表4。[表2]fgfr2-bicc12型移植模型小鼠化合物at/c(％)6.25mg/kg80*12.5mg/kg71**25mg/kg68**50mg/kg52**統(tǒng)計學(xué)顯著性*：p<0.05**：p<0.01[表3]fgfr2-txlna移植模型小鼠化合物at/c(％)6.25mg/kg54**12.5mg/kg43**25mg/kg15**50mg/kg6**統(tǒng)計學(xué)顯著性**：p<0.01[表4]fgfr2-kctd1移植模型小鼠化合物at/c(％)6.25mg/kg8912.5mg/kg5625mg/kg39*50mg/kg19**統(tǒng)計學(xué)顯著性*：p<0.05**：p<0.01。當(dāng)前第1頁12