相關(guān)申請

本申請要求2014年12月23日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/096,020的優(yōu)先權(quán)，所述專利申請以引用的方式并入。

序列表

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本公開涉及用于治療癌癥的方法。具體地說，本公開提供用于通過施用raf抑制劑與aurora激酶抑制劑的組合治療癌癥的方法。

在2012年，世界各地估計(jì)存在1410萬例癌癥病例。到2035年，這一數(shù)字預(yù)計(jì)增加至2400萬。癌癥仍然是美國第二大常見死因，占死亡人數(shù)的接近四分之一。在2014年，在美國將存在預(yù)計(jì)1,665,540例診斷的新癌癥病理和585,720例癌癥死亡。雖然醫(yī)學(xué)進(jìn)步已經(jīng)提高了癌癥存活率，但對于新的和更有效的治療存在持續(xù)需要。

癌癥的特征在于不受控制的細(xì)胞繁殖。不受控制的細(xì)胞繁殖由控制細(xì)胞分裂、分化和凋亡細(xì)胞死亡的正常過程的失調(diào)引起。有絲分裂是細(xì)胞周期中的一個階段，在所述階段期間，一系列復(fù)雜事件確保染色體分離成兩個子代細(xì)胞的保真度。有絲分裂進(jìn)程主要通過蛋白水解和通過由有絲分裂激酶介導(dǎo)的磷酸化事件來進(jìn)行調(diào)控。aurora激酶家族成員(例如，auroraa、aurorab)通過調(diào)節(jié)中心體分離、紡錘體動力學(xué)、紡錘體組裝檢查點(diǎn)、染色體配對/分離和胞質(zhì)分裂來調(diào)控有絲分裂進(jìn)程。aurora激酶的過度表達(dá)和/或擴(kuò)增一直與幾種腫瘤類型(包括結(jié)腸和乳腺的腫瘤)的瘤形成有關(guān)。此外，腫瘤細(xì)胞中的aurora激酶抑制導(dǎo)致有絲分裂停滯和細(xì)胞凋亡，從而表明這些激酶是癌癥治療的重要靶標(biāo)。

蛋白激酶在細(xì)胞繁殖過程中也起關(guān)鍵作用。此類激酶的部分非限制性列表包括ab1、atk、bcr–ab1、blk、brk、btk、c–kit、c–met、c–src、cdk1、cdk2、cdk4、cdk6、craf1、csf1r、csk、egfr、erbb2、erbb3、erbb4、erk、fak、fes、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、fgfr5、fgr、flk4、flt–1、fps、frk、fyn、hck、igf–1r、ins–r、jak、kdr、lck、lyn、mek、p38、pdgfr、pik、pkc、pyk2、ros、tie1、tie2、trk、yes和zap70。在哺乳動物生物學(xué)中，此類蛋白激酶包含有絲分裂原活化蛋白激酶(mapk)信號傳導(dǎo)途徑。

mapk信號傳導(dǎo)途徑由激酶級聯(lián)組成，所述激酶級聯(lián)將細(xì)胞外信號中繼至細(xì)胞核以調(diào)控基因表達(dá)和關(guān)鍵細(xì)胞功能。由ras/raf/mek/erk信號傳導(dǎo)途徑控制的基因表達(dá)調(diào)控基本細(xì)胞過程，包括增殖、分化、細(xì)胞凋亡和血管生成。ras/raf/mek/erk信號傳導(dǎo)的這些不同作用在各種類型的癌癥中異?；罨４送緩絻?nèi)的基因突變可能產(chǎn)生組成型活性蛋白，從而導(dǎo)致增加的細(xì)胞增殖和對細(xì)胞凋亡的抗性。

raf(絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶)由基因家族編碼，所述基因家族由提供三個raf同種型成員(b-raf、c-raf(raf-1)和a-raf)的三種基因組成。這些蛋白質(zhì)中的每一種在羧基末端共享高度保守的氨基末端調(diào)控區(qū)和催化結(jié)構(gòu)域。雖然每種同種型均在ras/raf/mek/erk途徑中起作用，但b-raf已被證明是mek的主要活化劑。b-raf由ras:gtp募集至b-raf變得活化的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞膜。進(jìn)而，b-raf負(fù)責(zé)活化mek1/2，并且mek1/2活化erk1/erk2。b-raf基因的突變允許b-raf獨(dú)立于上游信號進(jìn)行信號傳導(dǎo)。結(jié)果，突變的b-raf蛋白(如v600e)引起mek和erk的過度下游信號傳導(dǎo)。這導(dǎo)致過度細(xì)胞增殖和存活以及瘤形成。通過突變的b-raf過度活化信號傳導(dǎo)級聯(lián)已經(jīng)牽涉于多種惡性腫瘤中。事實(shí)上，b-raf特異性抑制劑(如威羅菲尼)顯示對于治療表達(dá)突變型b-rafv600e的黑色素瘤的希望，然而抗性疾病的出現(xiàn)受到越來越多的關(guān)注。

因此，如果能夠開發(fā)更有效的治療方案則將是有益的。與raf抑制劑活性劑的組合可能有助于治療癌癥并且甚至可能潛在克服對特定抗癌劑的抗性，所述raf抑制劑活性劑抑制除b-rafv600e突變外的更多raf蛋白同種型。具體地說，raf抑制劑與aurora激酶抑制劑的組合可能是特別有效的。raf抑制劑與aurora激酶抑制劑的組合可具有相加或甚至協(xié)同的治療作用。因此，需要新的癌癥治療方案，包括組合療法。

發(fā)明概要

本公開涉及治療患有癌癥的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用raf激酶抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽；和aurora激酶抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽；所述raf激酶抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽的量是使得其組合在所述癌癥的治療中是治療上有效的。在一些實(shí)施方案中，癌癥是實(shí)體腫瘤癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥是血液惡性腫瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是b-raf突變陽性癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥是nras突變陽性癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥選自皮膚癌、眼癌、胃腸癌、甲狀腺癌、乳腺癌、卵巢癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、喉癌、子宮頸癌、淋巴系統(tǒng)癌癥、泌尿生殖道癌癥、骨癌、膽道癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌以及結(jié)腸癌。在一些實(shí)施方案中，raf激酶抑制劑是化合物a或其藥學(xué)上可接受的鹽。在一些實(shí)施方案中，aurora激酶抑制劑是阿立塞替(alisertib)或其藥學(xué)上可接受的鹽。在一些實(shí)施方案中，aurora激酶抑制劑是阿立塞替鈉。

本公開涉及治療患有癌癥的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用化合物a或其藥學(xué)上可接受的鹽；和阿立塞替或其藥學(xué)上可接受的鹽；所述化合物a和阿立塞替或其藥學(xué)上可接受的鹽的量是使得其組合在所述癌癥的治療中是治療上有效的。在一些實(shí)施方案中，化合物a或其藥學(xué)上可接受的鹽以每劑量達(dá)600mg的量每周一次(qw)施用，在每次施用之間具有6天休息期；并且阿立塞替或其藥學(xué)上可接受的鹽在28天周期的第1天、第3天、第5天、第8天、第10天、第12天、第15天、第17天、第19天、第22天、第24天和第26天以每天兩次給予的每劑量約30mg至約50mg的量施用。

附圖簡述

圖1是示出在sk-mel-2黑色素瘤異種移植模型(nras突變體)中，對于單獨(dú)和與阿立塞替組合施用的12.5mg/kgqd的化合物a，隨時間推移的平均腫瘤體積的圖。

圖2是示出在sk-mel-2黑色素瘤異種移植模型(nras突變體)中，對于單獨(dú)和與阿立塞替組合施用的50.0mg/kgbiw的化合物a，隨時間推移的平均腫瘤體積的圖。

圖3是示出在a375黑色素瘤異種移植模型(b-raf突變體)中，對于單獨(dú)和與阿立塞替組合施用的12.5mg/kgqd的化合物a，隨時間推移的平均腫瘤體積的圖。

圖4是示出在a375黑色素瘤異種移植模型(b-raf突變體)中，對于單獨(dú)和與阿立塞替組合施用的50mg/kgbiw的化合物a，隨時間推移的平均腫瘤體積的圖。

發(fā)明描述

本公開提供用于治療癌癥的新的組合療法。具體地說，本公開提供一種治療患有癌癥的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用：(i)第一組合物，其包含raf抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性劑；和(ii)第二組合物，其包含aurora激酶抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性劑；所述活性劑的量是使得其組合在癌癥的治療中是治療上有效的。

除非另外指明，否則本文使用的術(shù)語應(yīng)以下定義的含義。

如本文所用，術(shù)語“raf激酶”是指絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶家族中的任一種。所述家族由三個同種型成員(b-raf、c-raf(raf-1)和a-raf)組成。raf蛋白激酶參與由激酶級聯(lián)組成的mapk信號傳導(dǎo)途徑，所述激酶級聯(lián)將細(xì)胞外信號中繼至細(xì)胞核以調(diào)控基因表達(dá)和關(guān)鍵細(xì)胞功能。除非上下文另外指明，否則術(shù)語“raf激酶”是指來自任何物種的任何raf激酶蛋白質(zhì)，包括但不限于此。一方面，raf激酶是人raf激酶。

術(shù)語“raf抑制劑”或“raf的抑制劑”用于表示能夠與絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶raf的一個或多個同種型成員(b-raf、c-raf(raf-1)和/或a-raf)(包括突變體形式)相互作用的化合物。raf突變體形式包括b-rafv600e、b-rafv600d、b-rafv600k、b-rafv600e+t5291和/或b-rafv600e+g468a。

在一些實(shí)施方案中，raf激酶被抑制至少約50％、至少約75％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％。在一些實(shí)施方案中，使raf激酶活性降低50％所需的raf激酶抑制劑的濃度是小于約1□m、小于約500nm、小于約100nm、小于約50nm、小于約25nm、小于約10nm、小于約5nm或小于約1nm。

在一些實(shí)施方案中，這種抑制對一種或多種raf同種型有選擇性，即raf抑制劑對b-raf(野生型)、突變型b-raf、a-raf和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf(野生型)、b-rafv600e、a-raf和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf(野生型)、b-rafv600e、a-raf和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf(野生型)、b-rafv600d、a-raf和c-raf有選擇性。

在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf(野生型)、b-rafv600k和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf(野生型)、b-rafv600e和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf(野生型)、b-rafv600d和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf(野生型)、b-rafv600k和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對突變型b-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對突變型b-rafv600e有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對突變型b-rafv600d有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對突變型b-rafv600k有選擇性。

術(shù)語“泛-raf抑制劑”是不止抑制raf蛋白的b-raf同種型的raf抑制劑。

如本文所用，術(shù)語“aurora激酶”是指參與有絲分裂進(jìn)程的相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶家族中的任一種。在細(xì)胞分裂中起作用的各種細(xì)胞蛋白質(zhì)是aurora激酶磷酸化的底物，包括但不限于組蛋白h3、p53、cenp-a、肌球蛋白ii調(diào)控輕鏈、蛋白磷酸酶-1、tpx-2、incenp、存活素、拓?fù)洚悩?gòu)酶iiα、波形蛋白、mbd-3、mgcracgap、結(jié)蛋白、ajuba、xieg5(在非洲爪蟾中)、ndc10p(在芽殖酵母中)以及d-tacc(在果蠅中)。aurora激酶本身也是自磷酸化的底物，例如在thr288。除非上下文另外指明，否則術(shù)語“aurora激酶”是指來自任何物種的任何aurora激酶蛋白，包括但不限于auroraa、aurorab和aurorac。一方面，aurora激酶是auroraa或b。一方面，aurora激酶是人aurora激酶。

術(shù)語“aurora激酶抑制劑”或“aurora激酶的抑制劑”用于表示能夠與aurora激酶相互作用并抑制其酶活性的化合物。抑制aurora激酶酶活性意味著降低aurora激酶磷酸化底物肽或蛋白質(zhì)的能力。在一些實(shí)施方案中，aurora激酶活性的這種降低是至少約50％、至少約75％、至少約90％、至少約95％或至少約99％。在一些實(shí)施方案中，降低aurora激酶酶活性所需的aurora激酶抑制劑的濃度是小于約1μm、小于約500nm、小于約100nm或小于約50nm。

在一些實(shí)施方案中，這種抑制是選擇性的，即aurora激酶抑制劑在低于產(chǎn)生另一種不相關(guān)的生物效應(yīng)(例如降低不同激酶的酶活性)所需的抑制劑的濃度的濃度下降低aurora激酶磷酸化底物肽或蛋白質(zhì)的能力。在一些實(shí)施方案中，aurora激酶抑制劑還降低另一種激酶的酶活性。在一些實(shí)施方案中，aurora激酶抑制劑降低牽涉于癌癥中的另一種激酶的酶活性。

本文使用術(shù)語“約”意指大致地、在...范圍內(nèi)、粗略地或在...左右。當(dāng)結(jié)合數(shù)值范圍來使用術(shù)語“約”時，它通過擴(kuò)展到在所列舉數(shù)值以上和以下的界限來改變所述范圍。通常，本文使用術(shù)語“約”來使一個數(shù)值改變到所指出的值以上和以下的10％偏差值。

如本文所用，術(shù)語“包含”是指“包括，但不限于”。

如本文所用，術(shù)語“治療(treatment)”、“治療(treat)”和“治療(treating)”意在包括受試者所患的癌癥的全部干預(yù)措施，如施用所述組合以緩解、減緩、終止或逆轉(zhuǎn)所述癌癥的一種或多種癥狀并且延遲所述癌癥的進(jìn)展，即使所述癌癥實(shí)際上未被消除。治療可包括例如癥狀的嚴(yán)重程度、癥狀的數(shù)量或復(fù)發(fā)頻率的降低，例如抑制腫瘤生長、阻滯腫瘤生長或已經(jīng)存在的腫瘤的消退。

如本文中用于指組合療法的術(shù)語“治療有效量”是指一起服用以使得組合作用引發(fā)所需的生物或藥物反應(yīng)(即，破壞靶癌細(xì)胞或減緩或阻滯受試者的癌癥進(jìn)展)的藥劑的組合的量。例如，如本文中用于指組合療法的“治療有效量”將是當(dāng)在治療周期期間的相同或不同日期一起施用(順序或同時)時具有有益的組合作用的raf抑制劑的量和aurora激酶抑制劑的量。在一些實(shí)施方案中，組合作用是相加的。在一些實(shí)施方案中，組合作用是協(xié)同的。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，在具有治療有效量的組合療法的情況下，如在上述實(shí)例中，raf抑制劑的量和/或aurora激酶抑制劑的量單獨(dú)地可以是或可以不是治療有效的。

關(guān)于藥劑對細(xì)胞的作用的“細(xì)胞毒性作用”是指殺死細(xì)胞?！凹?xì)胞生長抑制作用”是指抑制細(xì)胞增殖?！凹?xì)胞毒性劑”是指對細(xì)胞具有細(xì)胞毒性或細(xì)胞生長抑制作用、從而分別消減細(xì)胞群體內(nèi)的細(xì)胞或抑制細(xì)胞群體內(nèi)的細(xì)胞的生長的藥劑。

如本文所用的術(shù)語“受試者”是指哺乳動物，并且“哺乳動物”包括但不限于人。在一些實(shí)施方案中，在根據(jù)本公開的方法開始治療之前，已經(jīng)用藥劑(例如，raf抑制劑或aurora激酶抑制劑)治療了受試者。在一些實(shí)施方案中，受試者處于發(fā)展或經(jīng)歷癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險中。

除非另外說明，否則本文所描繪的結(jié)構(gòu)意在包括不同之處僅在于存在一個或多個同位素富集的原子的化合物。例如，具有本發(fā)明的結(jié)構(gòu)(除了氫原子被氘或氚置換或碳原子被富含13c或14c的碳置換外)的化合物在本公開的范圍內(nèi)。

將對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，本文描述的某些化合物可以互變異構(gòu)體形式存在，所述化合物的所有此類互變異構(gòu)體形式在本公開的范圍內(nèi)。除非另外說明，否則本文所描繪的結(jié)構(gòu)還意在包括所述結(jié)構(gòu)的所有立體化學(xué)形式；即，每個不對稱中心的r和s構(gòu)型。因此，本發(fā)明化合物的單一立體化學(xué)異構(gòu)體以及對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體混合物在本公開的范圍內(nèi)。

可在本公開的方法中使用能夠抑制raf激酶的活性的化合物。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑抑制b-raf、突變型b-raf、a-raf和c-raf。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf、b-rafv600e、a-raf和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf、b-rafv600e、a-raf和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf、b-rafv600d、a-raf和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf、b-rafv600k和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf、b-rafv600e和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf、b-rafv600d和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對b-raf、b-rafv600k和c-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對突變型b-raf有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對突變型b-rafv600e有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對突變型b-rafv600d有選擇性。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑對突變型b-rafv600k有選擇性。

具體地說，raf抑制劑包括本文所述的化合物，以及在例如wo2006/065703、wo2010/064722、wo2011/117381、wo2011/090738、wo2011/161216、wo2011/097526、wo2011/025927、wo2011/023773、wo2011/147764、wo2011/079133和wo2011/063159中公開的化合物。raf抑制劑包括威羅菲尼、達(dá)拉菲尼和encoratinib。這些化合物中任一種的溶劑化形式和水合形式也適用于本公開的方法中。所述化合物中任一種的藥學(xué)上可接受的鹽以及此類鹽的溶劑化形式和水合形式也適用于本公開的方法中。這些raf抑制劑可以有機(jī)合成領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知的多種方式制備，包括但不限于上述參考文獻(xiàn)中詳細(xì)描述的合成方法。

在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑是小分子量化合物。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑是泛-raf抑制劑。具體地說，泛-raf抑制劑包括化合物a，以及例如在wo2009/006389、wo2006/06570和us2013/0252977(dp-4978)中公開的化合物。

可在體外或體內(nèi)測定raf抑制劑結(jié)合和/或抑制raf激酶的能力。體外測定包括測量raf激酶對mek的磷酸化作為定量化合物抑制raf激酶的酶活性的能力的方法的生物化學(xué)fret測定。還可以測定所述化合物影響由raf激酶活性介導(dǎo)的細(xì)胞或生理功能的能力。例如，體外測定定量癌細(xì)胞中磷-erk的量。這些活性中的每一種的測定是本領(lǐng)域中已知的。

在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑是(r)-2-(1-(6-氨基-5-氯嘧啶-4-甲酰胺)乙基)-n-(5-氯-4-(三氟甲基)吡啶-2-基)噻唑-5-甲酰胺(化合物a)或其藥學(xué)上可接受的鹽：

(化合物a)?；衔颽描述于wo2009/006389中。

可在本公開的方法中使用能夠抑制aurora激酶的酶活性的化合物。具體地說，aurora激酶抑制劑包括本文所述的化合物，以及在例如，wo05/111039、us2005/0256102、us2007/0185087、wo08/021038、us2008/0045501、wo08/063525、us2008/0167292、wo07/113212、ep1644376、us2005/0032839、wo05/005427、wo06/070192、wo06/070198、wo06/070202、wo06/070195、wo06/003440、wo05/002576、wo05/002552、wo04/071507、wo04/058781、wo06/055528、wo06/055561、wo05/118544、wo05/013996、wo06/036266、us2006/0160874、us2007/0142368、wo04/043953、wo07/132220、wo07/132221、wo07/132228、wo04/00833和wo07/056164中公開的化合物。這些化合物中任一種的溶劑化形式和水合形式也適用于本公開的方法中。所述化合物中任一種的藥學(xué)上可接受的鹽以及此類鹽的溶劑化形式和水合形式也適用于本公開的方法中。這些aurora激酶抑制劑可以有機(jī)合成領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知的多種方式制備，包括但不限于上述參考文獻(xiàn)中詳細(xì)描述的合成方法。

在一些實(shí)施方案中，選擇性auroraa激酶抑制劑是小分子量化合物。具體地說，auroraa激酶的選擇性抑制劑包括本文所述的化合物，以及在例如us2008/0045501、us7,572,784、wo05/111039、wo08/021038、us7,718,648、wo08/063525、us2008/0167292、us8,026,246、wo10/134965、us2010/0310651、wo11/014248、us2011/0039826和us2011/0245234中公開的化合物，其各自特此以引用的方式整體并入，4-{[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮雜卓-2-基]氨基}-2-甲氧基苯甲酸鈉，kw-2449(kyowa)、enmd-2076(entremed)以及mk-5108(vertex/merck)。

可在體外或體內(nèi)測定auroraa激酶抑制劑選擇性地結(jié)合和/或抑制auroraa激酶的能力。體外測定包括用于確定auroraa激酶磷酸化底物蛋白或肽的能力的選擇性抑制的測定。替代體外測定定量所述化合物選擇性地結(jié)合auroraa激酶的能力。選擇性抑制劑結(jié)合可通過在結(jié)合之前放射性標(biāo)記抑制劑、分離抑制劑/auroraa激酶復(fù)合物并測定所結(jié)合的放射性標(biāo)記的量來測量?；蛘?，選擇性抑制劑結(jié)合可通過進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn)來測定，其中將新的抑制劑與和已知放射性配體結(jié)合的auroraa激酶一起孵育。還可以測定所述化合物影響由auroraa激酶活性介導(dǎo)的細(xì)胞或生理功能的能力。為了評定對auroraa激酶的超過對aurorab激酶的選擇性，還可使用與以上針對auroraa激酶所描述的那些測定類似的測定，在體外和體內(nèi)測定抑制劑選擇性地結(jié)合和/或抑制aurorab激酶的能力?？赏ㄟ^phish3的免疫熒光檢測，在不存在aurorab激酶抑制的情況下在體外和體內(nèi)測定抑制劑抑制auroraa激酶的能力。(proc.natl.acad.sci.(2007)104，4106)。這些活性中的每一種的測定是本領(lǐng)域中已知的。

在一些實(shí)施方案中，auroraa激酶抑制劑是式(i)的4-{[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮雜卓-2-基]氨基}-2-甲氧基苯甲酸((阿立塞替(mln8237))，或其藥學(xué)上可接受的鹽：

在一些實(shí)施方案中，式(i)的藥學(xué)上可接受的鹽是式(ii)的4-{[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮雜卓-2-基]氨基}-2-甲氧基苯甲酸鈉，或其結(jié)晶形式：

在一些實(shí)施方案中，式(ii)的化合物是4-{[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮雜卓-2-基]氨基}-2-甲氧基苯甲酸鈉。在一些實(shí)施方案中，式(ii)的化合物是4-{[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮雜卓-2-基]氨基}-2-甲氧基苯甲酸鈉一水合物。在一些實(shí)施方案中，式(ii)的化合物是4-{[9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮雜卓-2-基]氨基}-2-甲氧基苯甲酸鈉多晶型物形式2，如us2008/0167292、us8,026,246和us2011/0245234中所描述，其各自特此以引用的方式整體并入。

在一些實(shí)施方案中，與非接觸細(xì)胞的生長相比，與raf抑制劑和aurora激酶抑制劑接觸的細(xì)胞的生長被延遲至少約50％。在一些實(shí)施方案中，與非接觸細(xì)胞相比，接觸細(xì)胞的細(xì)胞增殖被抑制至少約75％、至少約90％或至少約95％。在一些實(shí)施方案中，短語“抑制細(xì)胞增殖”包括與非接觸細(xì)胞相比，接觸細(xì)胞的數(shù)目減少。因此，抑制接觸細(xì)胞中的細(xì)胞增殖的raf抑制劑和aurora激酶抑制劑可誘導(dǎo)所述接觸細(xì)胞經(jīng)歷生長遲緩、經(jīng)歷生長停滯、經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡(即，細(xì)胞凋亡)或經(jīng)歷壞死性細(xì)胞死亡。

另一方面，本公開提供一種藥物組合物，其包含i)raf抑制劑和ii)aurora激酶抑制劑。本公開提供用于治療癌癥的新的組合療法。具體地說，本公開提供一種治療患有癌癥的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用：(i)第一組合物，其包含raf抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性劑；和(ii)第二組合物，其包含aurora激酶抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性劑；所述活性劑的量是使得其組合在癌癥的治療中是治療上有效的。

在一些實(shí)施方案中，癌癥是實(shí)體腫瘤癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥是血液惡性腫瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥復(fù)發(fā)性的。一方面，復(fù)發(fā)性癌癥是在不可檢測到癌癥的一段時間之后復(fù)發(fā)的癌癥。

在一些實(shí)施方案中，癌癥是難治性的。一方面，難治性癌癥對癌癥治療無反應(yīng)；它也被稱為抗性癌癥。在一些實(shí)施方案中，腫瘤是不可切除的。一方面，不可切除的腫瘤不能通過外科手術(shù)移除。在一些實(shí)施方案中，癌癥先前尚未進(jìn)行治療。在一些實(shí)施方案中，癌癥是局部晚期的。一方面，“局部晚期”是指比較廣泛但仍局限在一個區(qū)域的癌癥。在一些情況下，“局部晚期”可以指尚未擴(kuò)散但已侵入附近器官或組織而使其難以用單獨(dú)外科手術(shù)移除的小腫瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是轉(zhuǎn)移性的。一方面，轉(zhuǎn)移性癌癥是從其開始的身體部位(主要部位)擴(kuò)散到身體其他部位的癌癥。

在一些實(shí)施方案中，癌癥是braf突變陽性癌癥。如本文所用，“braf”或“b-raf”是指b-raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸激酶，與指定為nm_004333，seqidno:1(開放閱讀框是seqidno:2，seqidno:1的核苷酸62至2362)的mrna序列相關(guān)的基因，所述mrna序列編碼genpept登錄號np_004324，seqidno:3)。b-raf的其他名稱包括rafb1和努南綜合征7(ns7)。b-raf充當(dāng)絲氨酸/蘇氨酸激酶，在調(diào)控map激酶/erk信號傳導(dǎo)路徑中起作用且可在染色體7q上發(fā)現(xiàn)。

在一些實(shí)施方案中，癌癥是b-raf突變陽性癌癥。在一些實(shí)施方案中，b-raf突變包括但不限于v600e、v600d或v600k突變。在一些實(shí)施方案中，b-raf突變是v600e。在一些實(shí)施方案中，b-raf突變是v600d。在一些實(shí)施方案中，b-raf突變是v600k。在一些實(shí)施方案中，b-raf突變是v600e+t5291。在一些實(shí)施方案中，b-raf突變是v600e+g468a。“v600e突變”是指在氨基酸位置600處用谷氨酸取代纈氨酸。t529i是蘇氨酸至異亮氨酸b-raf守門員突變，并且g468a是外顯子11中g(shù)1403c處的b-raf二級突變。“v600k突變”是指在氨基酸位置600處用賴氨酸取代纈氨酸?！皏600d突變”是指在氨基酸位置600處用天冬氨酸取代纈氨酸。v600k突變導(dǎo)致b-raf中位置600處從纈氨酸(v)至賴氨酸(k)的氨基酸取代。v600k突變導(dǎo)致b-raf中位置600處從纈氨酸(v)至賴氨酸(k)的氨基酸取代。

在一些實(shí)施方案中，癌癥是nras突變陽性癌癥。如本文所用，“nras”或“n-ras”是指成神經(jīng)細(xì)胞瘤ras病毒(v-ras)致癌基因同源物，與指定為genbank登錄號nm_002524，seqidno:4(開放閱讀框是seqidno:5，seqidno:7的核苷酸255至824)的mrna序列相關(guān)的基因，所述mrna序列編碼genpept登錄號np_002515，seqidno:6)。n-ras的其他名稱包括iv型自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征(alps4)、nras1和努南綜合征6(ns6)。n-ras充當(dāng)具有g(shù)tp酶活性的致癌基因且可在染色體1p上發(fā)現(xiàn)。n-ras與細(xì)胞膜和各種效應(yīng)蛋白(如raf和rhoa)相互作用，所述效應(yīng)蛋白通過細(xì)胞骨架和對細(xì)胞粘附的作用執(zhí)行其信號傳導(dǎo)功能(fotiadou等人(2007)mol.cel.biol.27:6742-6755)。

在一些實(shí)施方案中，癌癥是nras突變陽性癌癥。一方面，nras突變是q61r突變。

本公開提供一種治療患有癌癥的受試者的方法。在一些實(shí)施方案中，癌癥選自皮膚癌、眼癌、胃腸癌、甲狀腺癌、乳腺癌、卵巢癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、喉癌、子宮頸癌、淋巴系統(tǒng)癌癥、泌尿生殖道癌癥、骨癌、膽道癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、肺癌、前列腺癌以及結(jié)腸癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥不是非小細(xì)胞肺癌(nsclc)。在一些實(shí)施方案中，癌癥選自皮膚癌、眼癌、胃腸癌、甲狀腺癌、乳腺癌、卵巢癌、腦癌、喉癌、子宮頸癌、淋巴系統(tǒng)癌癥、泌尿生殖道癌癥、骨癌、膽道癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、肺癌、前列腺癌以及結(jié)腸癌。

在一些實(shí)施方案中，癌癥是血液惡性腫瘤。在一些實(shí)施方案中，血液惡性腫瘤選自急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病(cml)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)和骨髓增生異常綜合征。

在一些實(shí)施方案中，癌癥選自甲狀腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、急性骨髓性白血病(aml)和結(jié)腸癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是黑色素瘤或結(jié)腸癌。

在一些實(shí)施方案中，癌癥是皮膚癌。在一些實(shí)施方案中，皮膚癌是黑色素瘤。在一些實(shí)施方案中，黑色素瘤是b-raf突變型黑色素瘤。在一些實(shí)施方案中，黑色素瘤是nras突變型黑色素瘤。

在一些實(shí)施方案中，癌癥是胃腸癌。如本文所用，“胃腸癌”包括食道癌、胃癌(也稱胃癌)、膽道系統(tǒng)癌、胰腺癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌和肛門癌)。在一些實(shí)施方案中，胃腸癌是食道腺癌、胃食管結(jié)合部腺癌或胃腺癌。在一些實(shí)施方案中，胃腸癌是胃癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是結(jié)腸癌。結(jié)腸癌也被稱為結(jié)腸直腸(crc)癌、腸癌或直腸癌。

在一些實(shí)施方案中，癌癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥。在一些實(shí)施方案中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥是腦癌。

在一些實(shí)施方案中，甲狀腺癌是甲狀腺癌。

在一些實(shí)施方案中，泌尿生殖道癌癥是膀胱癌。

raf抑制劑和aurora激酶抑制劑以使得它們在癌癥治療中提供協(xié)同作用的這樣一種方式施用。施用可通過任何合適的方式，條件是所述施用提供所需的治療作用，即協(xié)同作用。在一些實(shí)施方案中，raf抑制劑和aurora激酶抑制劑在同一治療周期期間施用，例如，在一個治療周期期間，例如三或四周時間段，將raf激酶抑制劑和aurora激酶抑制劑兩者均施用至受試者。

在一些實(shí)施方案中，將raf抑制劑和aurora激酶抑制劑循環(huán)施用至受試者。循環(huán)治療涉及施用第一藥劑(例如，第一預(yù)防或治療劑)一段時間，隨后施用第二藥劑和/或第三藥劑(例如，第二和/或第三預(yù)防或治療劑)一段時間，并且重復(fù)這種順序施用。循環(huán)治療可減少對一種或多種療法的抗性的發(fā)展、避免或減少所述療法之一的副作用和/或提高治療的功效。

在一些實(shí)施方案中，施用藥劑的治療期間之后是特定時間持續(xù)時間的非治療期，在此期間不向受試者施用治療劑。所述非治療期之后可以是相同或不同頻率的一系列后續(xù)治療期和非治療期持續(xù)相同或不同的時間長度。在一些實(shí)施方案中，治療期和非治療期是交替的。應(yīng)理解，循環(huán)治療中的治療期可持續(xù)直到受試者實(shí)現(xiàn)完全應(yīng)答或部分應(yīng)答，此時可停止治療。或者，循環(huán)治療中的治療期可持續(xù)直到受試者實(shí)現(xiàn)完全應(yīng)答或部分應(yīng)答，此時治療期可持續(xù)特定數(shù)量的循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，治療期的長度可以是特定數(shù)量的循環(huán)，而不管受試者應(yīng)答。在一些其他實(shí)施方案中，治療期的長度可持續(xù)直到受試者復(fù)發(fā)。

raf抑制劑的量或合適劑量取決于許多因素，包括待治療病狀的嚴(yán)重程度的性質(zhì)、特定抑制劑、施用途徑以及個體受試者的年齡、體重、一般健康狀況和應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量水平是實(shí)現(xiàn)b-raf、c-raf、a-raf和/或b-rafv600e的抑制的劑量水平。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量水平是實(shí)現(xiàn)b-raf、c-raf和/或b-rafv600e的抑制的劑量水平。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量水平是如通過腫瘤消退、或疾病進(jìn)展、無進(jìn)展存活或總體存活的其他標(biāo)準(zhǔn)測量而測量的實(shí)現(xiàn)治療應(yīng)答的劑量水平。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量水平是實(shí)現(xiàn)這種治療應(yīng)答并且還使與施用治療劑相關(guān)的任何副作用最小化的劑量水平。

raf激酶抑制劑的合適每日劑量通常可以單次或分次或多次劑量在作為單一藥劑的最大耐受劑量的約10％至約100％的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量是作為單一藥劑的最大耐受劑量的約15％至約100％。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量是作為單一藥劑的最大耐受劑量的約25％至約90％。在一些其他實(shí)施方案中，合適的劑量是作為單一藥劑的最大耐受劑量的約30％至約80％。在一些其他實(shí)施方案中，合適的劑量是作為單一藥劑的最大耐受劑量的約40％至約75％。在一些其他實(shí)施方案中，合適的劑量是作為單一藥劑的最大耐受劑量的約45％至約60％。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量是作為單一藥劑的最大耐受劑量的約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約100％、約105％或約110％。

應(yīng)理解，可在白天或晚上的任何時間服用合適劑量的raf抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在早晨服用合適劑量的raf抑制劑的選擇性抑制劑。在一些其他實(shí)施方案中，在晚上服用合適劑量的raf抑制劑。在一些其他實(shí)施方案中，在早晨和晚上均服用合適劑量的raf抑制劑。應(yīng)理解，可與或不與食物一起服用合適劑量的raf抑制劑。在一些實(shí)施方案中，與膳食一起服用合適劑量的raf抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在禁食時服用合適劑量的raf抑制劑。

本公開提供一種治療患有癌癥的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用：(i)第一組合物，其包含化合物a或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性劑；和(ii)第二組合物，其包含阿立塞替或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性劑；所述活性劑的量是使得其組合在癌癥的治療中是治療上有效的。在一些實(shí)施方案中，每周一次(qw)施用化合物a，在每次施用之間具有6天休息期。raf抑制劑(例如化合物a)的合適每周劑量通?？梢詥未位蚍执位蚨啻蝿┝吭诿恐芤淮?qw)達(dá)約1500mg的范圍內(nèi)。qw意味著每次施用之間具有6天休息期的給藥。在一些實(shí)施方案中，化合物a作為單劑量施用。在一些實(shí)施方案中，化合物a以分次劑量施用。在一些實(shí)施方案中，化合物a作為在同一天的分次劑量施用。在一些實(shí)施方案中，化合物a以多個劑量施用?；衔颽的合適每周劑量是每周一次每劑量達(dá)約1000mg，在每次施用之間具有6天休息期?；衔颽的其他合適的每周劑量通?？梢詥未位蚍执位蚨啻蝿┝吭诿恐芤淮蚊縿┝考s200mg至約1000mg的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，化合物a的合適每周劑量是每劑量達(dá)600mg?；衔颽的其他合適的每周劑量通?？梢詥未位蚍执位蚨啻蝿┝吭诩s400mg至約1000mg的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，合適的每周劑量是每周一次每劑量約400mg至約900mg。在一些實(shí)施方案中，合適的每周劑量是每周一次每劑量約500mg至約900mg。在一些其他實(shí)施方案中，合適的每周劑量是每周一次每劑量約400mg至約600mg。在一些其他實(shí)施方案中，合適的每周劑量是每周一次每劑量約200mg至約500mg。在一些其他實(shí)施方案中，合適的每周劑量是每周一次每劑量約200mg至約300mg。在一些實(shí)施方案中，合適的每周劑量是每周一次每劑量約200mg、300mg、約400mg、約500mg、約600mg、約700mg、約800mg或約900mg。

在一些實(shí)施方案中，化合物a以每劑量達(dá)約200mg施用。raf抑制劑(例如化合物a)的合適每周劑量通?？梢詥未位蚍执位蚨啻蝿┝吭诿縿┝窟_(dá)約200mg的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，化合物a作為單劑量施用。在一些實(shí)施方案中，化合物a以分次劑量施用。在一些實(shí)施方案中，化合物a以多個劑量施用?；衔颽的其他合適劑量通?？梢詥未位蚍执位蚨啻蝿┝吭诿縿┝考s50mg至約200mg的范圍內(nèi)?；衔颽的其他合適劑量通?？梢詥未位蚍执位蚨啻蝿┝吭诿縿┝考s75mg至約200mg的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量是每劑量約100mg至約200mg。在一些其他實(shí)施方案中，合適的劑量是每天兩次約150mg至約200mg。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量是每劑量約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約55mg、約60mg、約65mg、約70mg、約75mg、約80mg、約85mg、約90mg、約95mg、約100mg、約105mg、約110mg、約115mg、約120mg、約125mg、約130mg、約135mg、約140mg、約145mg、約150mg、約155mg、約160mg、約165mg、約170mg、約175mg、約180mg、約185mg、約190mg、約195mg或約200mg。在一些實(shí)施方案中，化合物a的合適劑量是每劑量約100mg至約200mg。

施用至受試者的raf抑制劑的劑量還將取決于施用頻率。在一些實(shí)施方案中，每周一次(qw)施用化合物a，在每次施用之間具有6天休息期。在一些實(shí)施方案中，每天施用化合物a。在一些實(shí)施方案中，每隔一天施用化合物a。在一些實(shí)施方案中，化合物a按28天周期施用，其中化合物a在28天周期的第1天、第3天、第5天、第8天、第10天、第12天、第15天、第17天、第19天、第22天、第24天和第26天施用。

對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見的是，提供所需治療作用的其他raf抑制劑劑量或施用頻率適用于本公開。

auroraa激酶的選擇性抑制劑的量或合適劑量取決于許多因素，包括待治療病狀的嚴(yán)重程度的性質(zhì)、特定抑制劑、施用途徑以及個體受試者的年齡、體重、一般健康狀況和應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量水平是如通過增加的皮膚有絲分裂指數(shù)、或腫瘤有絲分裂細(xì)胞中減少的染色體配對和紡錘體雙極性、或癌癥患者中有效暴露的其他標(biāo)準(zhǔn)測量而測量的實(shí)現(xiàn)有效暴露的劑量水平。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量水平是如通過腫瘤消退、或疾病進(jìn)展、無進(jìn)展存活或總體存活的其他標(biāo)準(zhǔn)測量而測量的實(shí)現(xiàn)治療應(yīng)答的劑量水平。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量水平是實(shí)現(xiàn)這種治療應(yīng)答并且還使與施用治療劑相關(guān)的任何副作用最小化的劑量水平。

auroraa激酶的選擇性抑制劑的合適每日劑量通常可以單次或分次或多次劑量在作為單一藥劑的最大耐受劑量的約10％至約100％的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量是作為單一藥劑的最大耐受劑量的約15％至約100％。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量是作為單一藥劑的最大耐受劑量的約25％至約90％。在一些其他實(shí)施方案中，合適的劑量是作為單一藥劑的最大耐受劑量的約30％至約80％。在一些其他實(shí)施方案中，合適的劑量是作為單一藥劑的最大耐受劑量的約40％至約75％。在一些其他實(shí)施方案中，合適的劑量是作為單一藥劑的最大耐受劑量的約45％至約60％。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量是作為單一藥劑的最大耐受劑量的約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約100％、約105％或約110％。

應(yīng)理解，可在白天或晚上的任何時間服用合適劑量的auroraa激酶的選擇性抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在早晨服用合適劑量的auroraa激酶的選擇性抑制劑。在一些其他實(shí)施方案中，在晚上服用合適劑量的auroraa激酶的選擇性抑制劑。在一些其他實(shí)施方案中，在早晨和晚上均服用合適劑量的auroraa激酶的選擇性抑制劑。應(yīng)理解，可與或不與食物一起服用合適劑量的auroraa激酶的選擇性抑制劑。在一些實(shí)施方案中，與膳食一起服用合適劑量的auroraa激酶的選擇性抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在禁食時服用合適劑量的auroraa激酶的選擇性抑制劑。

阿立塞替的合適每日劑量通?？梢詥未位蚍执位蚨啻蝿┝吭诩s20mg至約120mg/天的范圍內(nèi)。阿立塞替的其他合適的每日劑量通?？梢詥未位蚍执位蚨啻蝿┝吭诩s30mg至約90mg/天的范圍內(nèi)。阿立塞替的其他合適的每日劑量通常可以單次或分次或多次劑量在約40mg至約80mg/天的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量是每天兩次給予的每劑量約10mg至約50mg。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量是每天兩次給予的每劑量約30mg至約50mg。在一些其他實(shí)施方案中，合適的劑量是每天兩次給予的每劑量約40mg至約50mg。在一些其他實(shí)施方案中，合適的劑量是每天兩次給予的每劑量約30mg至約40mg。在一些其他實(shí)施方案中，合適的劑量是每天兩次給予的每劑量約25mg至約40mg。在一些實(shí)施方案中，合適的劑量是約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約55mg、約60mg、約65mg、約70mg、約75mg、約80mg、約85mg、約90mg、約95mg、約100mg、約105mg、約110mg、約115mg或約120mg/天。在某些其他實(shí)施方案中，合適的劑量是每天兩次給予的每劑量約10mg、約15mg、約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約55mg或約60mg。在一些實(shí)施方案中，阿立塞替的合適劑量是每天兩次給予的每劑量約40mg。在一些實(shí)施方案中，阿立塞替的合適劑量是每天兩次給予的每劑量約30mg。在一些實(shí)施方案中，阿立塞替的合適劑量是每天兩次給予的每劑量約35mg。在一些實(shí)施方案中，阿立塞替的合適劑量是每天兩次給予的每劑量約50mg。

在一些實(shí)施方案中，其中施用第一量的auroraa激酶的選擇性抑制劑的第一治療期之后可以是另一個治療期，其中施用相同或不同量的auroraa激酶的相同或不同的選擇性抑制劑。第二個治療期之后可以是其他治療期。在治療期和非治療期期間，可向受試者施用一種或多種另外的治療劑。

在一些實(shí)施方案中，對于4周周期(例如28天)中的3周，aurora激酶抑制劑3天施用且4天休息。在一些實(shí)施方案中，aurora激酶抑制劑按28天周期施用，其中auroraa激酶抑制劑在28天周期的第1天、第2天、第3天、第8天、第9天、第10天、第15天、第16天和第17天施用。在一些實(shí)施方案中，aurora激酶抑制劑按28天周期每日兩次施用，其中auroraa激酶抑制劑在28天周期的第1天、第2天、第3天、第8天、第9天、第10天、第15天、第16天和第17天施用。在一些實(shí)施方案中，阿立塞替按28天周期每日兩次施用，其中auroraa激酶抑制劑在28天周期的第1天、第2天、第3天、第8天、第9天、第10天、第15天、第16天和第17天施用。

raf抑制劑和aurora激酶抑制劑的施用可在相同或不同的日期，條件是施用提供所需的治療作用。在本公開的一些實(shí)施方案中，raf抑制劑和auroraa激酶抑制劑的施用將在相同日期。在本公開的一些實(shí)施方案中，raf抑制劑和auroraa激酶抑制劑的施用將在相同和/或不同的日期，例如，化合物a在28天周期的第1天、第3天、第5天、第8天、第10天、第12天、第15天、第17天、第19天、第22天、第24天和第26天施用，并且阿立塞替在28天周期的第1天、第2天、第3天、第8天、第9天、第10天、第15天、第16天和第17天施用。本公開涵蓋替代治療周期，只要它們產(chǎn)生所需的結(jié)果即可。

auroraa激酶抑制劑可以單一劑型或作為單獨(dú)的劑型與raf抑制劑一起施用。當(dāng)作為單獨(dú)劑型施用時，raf抑制劑可在施用本公開的auroraa激酶抑制劑之前、同時或之后施用。

在一些實(shí)施方案中，施用有益量的治療劑涵蓋在28天治療周期期間在第1天、第3天、第5天、第8天、第10天、第12天、第15天、第17天、第19天、第22天、第24天和第26天以每劑量約100mg至約200mg(化合物a的測量的量)施用化合物a與在28天治療周期期間在第1天、第2天、第3天、第8天、第9天、第10天、第15天、第16天和第17天以每天兩次給予的每劑量約30至約50mg(作為阿立塞替的量測量的)的量施用阿立塞替或其藥學(xué)上可接受的鹽的組合。在一些實(shí)施方案中，有益量的治療劑是協(xié)同量。在一些實(shí)施方案中，有益量的治療劑是相加量。

在一些實(shí)施方案中，用于治療患有癌癥的受試者的方法包括向所述受試者施用治療有效量的一定量的化合物a和一定量的阿立塞替或其藥學(xué)上可接受的鹽的組合。這些癌癥受試者包括但不限于具有b-raf突變的黑色素瘤受試者、威羅菲尼或其他b-raf抑制劑失敗的黑色素瘤受試者、具有n-ras突變b-raf野生型的黑色素瘤患者、具有b-rafv600e突變b-raf野生型的結(jié)腸直腸癌受試者、具有b-rafv600e突變b-raf野生型的卵巢癌受試者、具有b-rafv600e突變b-raf野生型的肺癌患者、具有n-ras突變b-raf野生型的aml受試者、具有n-ras突變b-raf野生型的肝癌受試者、具有b-rafv600e或n-ras突變b-raf野生型的甲狀腺癌受試者、具有b-raf野生型的胰腺癌受試者、具有b-raf野生型的膽道癌受試者。

本公開提供一種用于延長患有癌癥的受試者中對治療的應(yīng)答的持續(xù)時間的方法，所述方法包括向所述受試者施用：(i)第一組合物，其包含raf抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性劑；和(ii)第二組合物，其包含aurora激酶抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性劑；所述活性劑的量是使得其組合對于延長應(yīng)答的持續(xù)時間而言是有效的。

raf抑制劑可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法施用。例如，raf抑制劑可以第一組合物的形式施用，在一些實(shí)施方案中以raf抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物(如本文所述的那些)的形式施用。在一些實(shí)施方案中，第一組合物是如在2014年3月26日提交的美國臨時申請61/970,595和wo2015/148828中所描述的固體分散體擠出物。在一些實(shí)施方案中，第一組合物是包含乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的固體分散體擠出物。在一些實(shí)施方案中，共聚物是共聚維酮，例如va64。在一些實(shí)施方案中，第一組合物是非晶形的。

auroraa激酶的選擇性抑制劑可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法施用。例如，auroraa激酶的選擇性抑制劑可以第二組合物的形式施用，在一些實(shí)施方案中作為auroraa激酶的選擇性抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物(如本文所述的那些)施用。一方面，藥物組合物適合于口服施用。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物是用于口服施用的片劑，例如腸溶包衣片劑。此類片劑描述于us2010/0310651中，其特此以引用的方式整體并入。在一些其他實(shí)施方案中，藥物組合物是用于口服施用的液體劑型。此類液體劑型描述于us2011/0039826中，其特此以引用的方式并入。在一些實(shí)施方案中，這些組合物任選地還包含一種或多種另外的治療劑。

如果在這些組合物中使用raf抑制劑或aurora激酶抑制劑的藥學(xué)上可接受的鹽，則所述鹽優(yōu)選地衍生自無機(jī)或有機(jī)酸或堿。對于合適的鹽的綜述，參見例如，berge等人，j.pharm.sci.66:1-19(1977)和remington:thescienceandpracticeofpharmacy，第20版，a.gennaro編著，lippincottwilliams&wilkins，2000。

合適的酸加成鹽的非限制性實(shí)例包括以下：乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(lucoheptanoate)、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基-丙酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽以及十一酸鹽。

合適的堿加成鹽包括但不限于，銨鹽；堿金屬鹽，如鈉鹽和鉀鹽；堿土金屬鹽，如鈣鹽和鎂鹽；與有機(jī)堿如二環(huán)己基胺、n-甲基-d-葡糖胺、叔丁胺、乙二胺、乙醇胺和膽堿的鹽；以及與氨基酸如精氨酸、賴氨酸等的鹽。

此外，含有氮的堿性基團(tuán)可用此類試劑季銨化：如低級烷基鹵化物，如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物以及碘化物；二烷基硫酸酯，如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯；長鏈鹵化物，如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂?；然?、溴化物和碘化物；芳烷基鹵化物，如芐基和苯乙基溴化物；以及其他。因此獲得水或油可溶性或可分散性產(chǎn)物。

術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”在本文中用于指與受體受試者相容的材料。一方面，受試者是哺乳動物。一方面，受試者是人。一方面，所述材料適合于將活性劑遞送至靶位點(diǎn)而不終止所述活性劑的活性。與載體相關(guān)的毒性或不利作用(如果有的話)優(yōu)選地與活性劑的預(yù)期用途的合理風(fēng)險/益處比相稱。

術(shù)語“載體”、“佐劑”或“媒介物”可互換使用并且包括任何和所有溶劑、稀釋劑或其他液體媒介物、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑等，如適合于所需的具體劑型。remington:thescienceandpracticeofpharmacy，第20版，a.gennaro編著，lippincottwilliams&wilkins，2000公開了用于配制藥學(xué)上可接受的組合物的各種載體和用于其制備的已知技術(shù)。除了如通過產(chǎn)生任何所不希望的生物效應(yīng)或另外以有害的方式與藥物組合物的任何其他組分相互作用而與本公開的化合物不相容的任何常規(guī)的載體介質(zhì)以外，所述載體的用途將涵蓋在本公開的范圍內(nèi)?？捎米魉帉W(xué)上可接受的載體的材料的一些實(shí)例包括但不限于離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)(如磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、氫氧化鎂和氫氧化鋁)、甘氨酸、山梨酸或山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、無熱原水、鹽或電解質(zhì)(如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉和鋅鹽)、膠體二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、羊毛脂、糖(如乳糖、葡萄糖、蔗糖)、淀粉(如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉)、纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素)、粉狀黃蓍膠、麥芽、明膠、滑石、賦形劑(如可可脂和栓劑蠟)、油(如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油)、二醇類(如丙二醇和聚乙二醇)、酯(如油酸乙酯和月桂酸乙酯)、瓊脂、藻酸、等滲鹽水、林格氏溶液、醇(如乙醇、異丙醇、十六烷醇和甘油)、環(huán)糊精、潤滑劑(如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂)、石油烴(如礦物油和凡士林)。根據(jù)配方師的判斷，著色劑、釋放劑、包覆劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑、防腐劑以及抗氧化劑也可存在于組合物中。

本公開的藥物組合物可通過本領(lǐng)域中熟知的方法如常規(guī)?；⒒旌?、溶解、膠囊化、凍干或乳化工藝等來生產(chǎn)。組合物可以多種形式產(chǎn)生，包括顆粒、沉淀、或微粒、粉末，包括冷凍干燥、旋轉(zhuǎn)干燥或噴霧干燥粉末、非晶粉末、片劑、膠囊、糖漿、栓劑、注射液、乳液、酏劑、混懸液或溶液。制劑可任選地包含溶劑、稀釋劑和其他液體媒介物、分散或懸浮助劑、表面活性劑、ph調(diào)節(jié)劑、等滲劑、增稠或乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑等，如適合于所需的具體劑型。

在一些實(shí)施方案中，本公開的組合物被配制用于向哺乳動物藥物施用。一方面，用于向人藥物施用。本公開的此類藥物組合物可通過口服、胃腸外、吸入噴霧、局部、直腸、鼻、口腔、陰道或經(jīng)由植入式儲藥器的方式施用。如本文所用的術(shù)語“胃腸外”包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、病灶內(nèi)以及顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。優(yōu)選地，口服、靜脈內(nèi)或皮下施用所述組合物。本公開的制劑可被設(shè)計(jì)為短效、快速釋放或長效。此外，化合物可以局部而非全身的方式施用，如在腫瘤部位施用(例如通過注射)。

用于口服施用的液體劑型包括但不限于，藥學(xué)上可接受的乳劑、微乳劑、溶液、混懸液、糖漿以及酏劑。除活性化合物外，液體劑型可含有通常在本領(lǐng)域中使用的惰性稀釋劑，例如像水或其他溶劑、溶解劑和乳化劑如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、環(huán)糊精、二甲基甲酰胺、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇以及山梨醇酐的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀釋劑外，口服組合物還可包含佐劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑以及芳香劑。

可注射制劑，例如無菌可注射水性或油性混懸液可根據(jù)已知的技術(shù)使用合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑來配制。無菌可注射制劑也可以是在胃腸外可接受的無毒稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液、混懸液或乳劑，例如，作為1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶劑是水、林格氏溶液(u.s.p.)和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)性油通常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。出于這一目的，可采用任何溫和的不揮發(fā)性油，包括合成的甘油單酯或二甘油酯。此外，脂肪酸如油酸用于制備可注射制劑。可注射制劑可例如通過經(jīng)由細(xì)菌滯留過濾器過濾，或通過并入呈無菌固體組合物形式的滅菌劑來滅菌，所述無菌固體組合物可在使用前溶解或分散于無菌水或其他無菌可注射介質(zhì)中。配制用于胃腸外施用的組合物可通過快速濃注或通過定時推入注射，或者可通過連續(xù)輸注來施用。

為了延長本公開的化合物的作用，通?？善谕麥p緩對來自皮下注射或肌內(nèi)注射的化合物的吸收。這可通過使用水溶性差的結(jié)晶或非晶材料的液體混懸液來實(shí)現(xiàn)。化合物的吸收速率則取決于其溶解速率，而溶解速率進(jìn)而可取決于晶體大小和晶形?；蛘撸改c外施用的化合物形式的延遲吸收通過將化合物溶解或懸浮于油性媒介物中來實(shí)現(xiàn)?？勺⑸鋬焓叫问酵ㄟ^在可生物降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成化合物的微膠囊基質(zhì)來形成。取決于化合物與聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性質(zhì)，可控制化合物的釋放速率。其他可生物降解的聚合物的實(shí)例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。儲庫式可注射制劑也可通過在可與身體組織相容的脂質(zhì)體或微乳液中包封化合物來制備。

用于直腸或陰道施用的組合物優(yōu)選地是可通過使公開的化合物與合適的非刺激性賦形劑或載體混合而制備的栓劑，所述賦形劑或載體如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟，它們在環(huán)境溫度下為固體但在體溫下為液體，并且因此在直腸或陰道腔中融化并釋放活性化合物。

用于口服施用的固體劑型包括膠囊、片劑、丸劑、粉末和顆粒劑。在此類固體劑型中，活性化合物與至少一種藥學(xué)上可接受的惰性賦形劑或載體(如檸檬酸鈉或磷酸二鈣)和/或以下物質(zhì)混合：a)填充劑或增量劑，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合劑，例如像羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；c)濕潤劑，如甘油；d)崩解劑，如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；e)溶解阻滯劑，如石蠟；f)吸收促進(jìn)劑，如季銨化合物；g)潤濕劑，例如像十六醇和單硬脂酸甘油酯；h)吸附劑，如高嶺土和膨潤土；以及i)潤滑劑，如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，劑型還可包含緩沖劑，如磷酸鹽或碳酸鹽。

相似類型的固體組合物也可使用此類賦形劑如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等來用作軟質(zhì)和硬質(zhì)填充的明膠膠囊中的填充劑。片劑、糖錠劑、膠囊、丸劑和顆粒劑的固體劑型可使用包衣和包殼如腸溶衣和制藥領(lǐng)域中熟知的其他包衣來制備。它們可任選地含有乳濁劑并且也可具有僅在或優(yōu)選在腸道的某一部分，任選地以延遲的方式釋放活性成分的組合物。可使用的包埋組合物的實(shí)例包括聚合物質(zhì)和蠟。相似類型的固體組合物也可使用此類賦形劑如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等來用作軟質(zhì)和硬質(zhì)填充的明膠膠囊中的填充劑。

所述活性化合物還可以是具有如上所述的一種或多種賦形劑的微囊化形式。片劑、糖錠劑、膠囊、丸劑和顆粒劑的固體劑型可使用包衣和包殼如腸溶衣、釋放控制包衣和制藥領(lǐng)域中熟知的其他包衣來制備。在此類固體劑型中，活性化合物可與至少一種惰性稀釋劑如蔗糖、乳糖或淀粉混合。按照一般的慣例，此類劑型還可包含除惰性稀釋劑以外的其他物質(zhì)，例如，壓片潤滑劑和其他壓片助劑，如硬脂酸鎂和微晶纖維素。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，劑型還可包含緩沖劑。它們可任選地含有乳濁劑并且也可具有僅在或優(yōu)選在腸道的某一部分，任選地以延遲的方式釋放活性成分的組合物?？墒褂玫陌窠M合物的實(shí)例包括聚合物質(zhì)和蠟。

本公開的化合物的局部或經(jīng)皮施用的劑型包括：軟膏、糊劑、霜劑、洗劑、凝膠、粉末、溶液、噴霧劑、吸入劑或貼劑。在無菌條件下，將活性組分與藥學(xué)上可接受的載體以及任何所需的防腐劑或可能需要的緩沖劑混合。眼用制劑、滴耳劑和滴眼劑也涵蓋在本公開的范圍內(nèi)。另外，本公開涵蓋經(jīng)皮貼劑的用途，所述經(jīng)皮貼劑具有提供將化合物受控制地遞送至身體的額外優(yōu)點(diǎn)。此類劑型可通過將化合物溶解或分散于適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中來制備。吸收促進(jìn)劑也可用于增加化合物穿過皮膚的通量。速率可通過提供速率控制膜或通過將化合物分散于聚合物基質(zhì)或凝膠中來控制。

用于本公開的方法中的組合物可以單位劑型配制，以便于施用和劑量的均勻性。如本文所用的表達(dá)“單位劑型”是指適合于所治療受試者的物理上離散的藥劑單元。然而，應(yīng)理解，本公開的化合物和組合物的總每日用量將由主治醫(yī)師在合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)決定。用于胃腸外施用的單位劑型可在安瓿或多劑量容器中。

本公開包括一種試劑盒，其包括：(i)第一組合物，其包含raf抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性劑；和(ii)第二組合物，其包含aurora激酶抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性劑；以及用于施用所述第一組合物與所述第二組合物的組合的說明書。

本公開包括一種試劑盒，其包括：當(dāng)用于治療受試者的癌癥時(i)第一組合物，其包含raf抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性劑；和(ii)第二組合物，其包含aurora激酶抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性劑；以及用于施用所述第一組合物與所述第二組合物的組合的說明書。

威羅菲尼(roche)被美國食品與藥品管理局(fda)批準(zhǔn)用于治療具有b-rafv600e突變的黑色素瘤患者。最近，達(dá)拉菲尼(b-raf抑制劑)和曲美替尼(mek抑制劑)被批準(zhǔn)用于具有b-rafv600e陽性黑色素瘤的患者。與3期研究中的化學(xué)療法相比，兩種藥物均顯著提高中位無進(jìn)展存活期。然而，與威羅菲尼的情況一樣，這些應(yīng)答被認(rèn)為是短暫的(lancet(2012；380:358-365)，nengljmed2012；367:107-114)。與許多其他靶向療法類似，對b-raf抑制的獲得性抗性對這一患者群體的長期存活益處提出了治療性挑戰(zhàn)。

為了提高b-raf抑制劑的益處，研究繼續(xù)以鑒定使表達(dá)突變型b-raf的黑素瘤細(xì)胞對威羅菲尼有抗性的機(jī)制。最近的研究表明，mapk途徑的再活化是對b-raf抑制的抗性機(jī)制?？剐詸C(jī)制主要涉及通過旁路機(jī)制再活化erk信號傳導(dǎo)，所述旁路機(jī)制是ras/raf依賴性的，如n-ras活化(nazarian等人，nature.2010，468：973-7)、h-ras活化(su等人，newenglandjournalofmedicine.2012，366：207-215)或c-raf上調(diào)(johannessen等人，nature.2010，468：968-72；montagut等人，cancerres.2008，68：4853-61)、b-rafv600e的異常剪接變體(poulikakos等人，nature.2011，480：387-390)，或ras/raf無關(guān)的(tpl2/cot過度表達(dá))johannessen等人，nature.2010，468：968-72。因此，多種機(jī)制可減弱b-raf突變型癌癥中b-raf抑制對mapk信號傳導(dǎo)的影響。雖然可能引起對b-raf抑制的抗性的b-raf(t529i)的守門員突變尚未在臨床上鑒定，但是這種突變已在實(shí)驗(yàn)上證明引起抗性，whittaker等人，scitranslmed.2010，2(35)：ra41。最近的研究還表明，通過rtk如igf-1r或pdgfrβ活化mapk-冗余信號傳導(dǎo)途徑可在對b-raf抑制的獲得性抗性中起作用；nazarian等人，nature.2010，468：973-7；villanueva等人，cancercell.2010，18：683-95；shi等人，cancerres.2011，71：5067-74。顯然，mapk再活化參與許多這些抗性機(jī)制。泛-raf抑制劑預(yù)期阻斷mapk再活化。

另外，包括威羅菲尼及其緊密類似物n-[3-(5-氯-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺(plx4720；一種可商購的選擇性b-raf抑制劑)的b-raf特異性抑制劑被證明通過與b-raf野生型背景中的其他raf同種型二聚化而誘導(dǎo)反常途徑活化，hatzivassilioug,等人nature，2010，464：431-435；poulikakos等人，nature，2010，464：427-430；heidorn,等人，cell，2010，140：209-221。據(jù)信，威羅菲尼通過結(jié)合b-raf野生型并刺激b-raf-c-raf二聚化來活化raf/mek/erk途徑。據(jù)信，通過b-raf特異性抑制的這種反常途徑活化是在用威羅菲尼治療的一些黑色素瘤患者中皮膚副作用(如鱗狀細(xì)胞癌)的主要原因。由于其在這種遺傳背景中的反常途徑活化活性，威羅菲尼未被批準(zhǔn)用于治療具有b-raf野生型遺傳背景的癌癥患者。

化合物a是抑制包括b-raf、c-raf和b-rafv600e突變的raf蛋白質(zhì)同種型的raf激酶抑制劑(參見實(shí)施例1)。由于其泛raf活性，化合物a通過上游信號傳導(dǎo)如n-ras突變和k-ras突變(兩者均具有b-raf野生型遺傳背景)而是針對具有mapk途徑活化的腫瘤細(xì)胞有活性的。因此，化合物a具有用于治療具有b-raf突變(如黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌和甲狀腺癌)或n-ras突變、b-raf野生型(如黑色素瘤、aml、cml、all、cll、肝癌)的癌癥患者的潛力，(schubbert等人，naturereviewscancer，2007，7：295；pylayeva-gupta等人，naturereviewscancer，2011，11：761)?；衔颽還是針對發(fā)展對威羅菲尼的抗性的黑色素瘤腫瘤細(xì)胞有活性的。因此，據(jù)信化合物a與aurora激酶抑制劑的組合對于威羅菲尼或其他b-raf抑制劑失敗的皮膚癌患者將是有效的。

本公開涉及用于確定是否用本文所述的藥物組合物治療患有癌癥的受試者的方法，所述方法包括：

a)測量包含腫瘤細(xì)胞的受試者樣品中與基因突變相關(guān)的至少一種或多種b-raf或n-ras標(biāo)志物的至少一種特征；

b)鑒定在用所述藥物組合物治療后，在步驟a)中測量的至少一種特征對于結(jié)果是否是信息性的；以及

c)如果所述信息特征表明所述腫瘤細(xì)胞包含至少一種指示用所述藥物組合物治療的有利結(jié)果的具有b-raf和/或n-ras突變狀態(tài)的標(biāo)志物基因，則確定用所述藥物組合物治療所述受試者。

本公開涉及通過向患有癌癥的受試者施用本文所述的藥物組合物來治療所述受試者的方法，所述方法包括：

a)測量包含腫瘤細(xì)胞的受試者樣品中與基因突變相關(guān)的至少一種或多種b-raf或n-ras標(biāo)志物的至少一種特征；

b)鑒定在用所述藥物組合物治療后，在步驟a)中測量的至少一種特征對于結(jié)果是否是信息性的；以及

c)如果所述信息特征表明所述腫瘤細(xì)胞包含至少一種指示用所述藥物組合物治療的有利結(jié)果的具有b-raf和/或n-ras突變狀態(tài)的標(biāo)志物基因，則確定用所述藥物組合物治療所述受試者。

本公開涉及用于確定被診斷患有癌癥的受試者中通過藥物組合物治療的藥理學(xué)有效性的增加的可能性的方法，所述方法包括：使來自所述受試者的癌癥(腫瘤)樣品的核酸樣品經(jīng)受b-raf和/或n-ras突變測試或pcr，其中在b-raf和/或n-ras基因中存在至少一種突變表明所述治療的藥理學(xué)有效性的可能性增加。

本公開涉及通過向患有癌癥的受試者施用本文所述的藥物組合物來治療所述受試者的方法，所述方法包括：使來自所述受試者的癌癥(腫瘤)樣品的核酸樣品經(jīng)受b-raf和/或n-ras突變測試或pcr，其中在b-raf和/或n-ras基因中存在至少一種突變表明所述治療的藥理學(xué)有效性的可能性增加。

本公開涉及一種治療患有癌癥的受試者的方法，所述方法包括：

i)從來自所述受試者的癌癥樣品獲得核酸樣品；

ii)使所述樣品經(jīng)受b-raf和/或n-ras突變測試或pcr，以及

鑒定b-raf和/或n-ras中至少一種突變的存在；以及

將有效量的本文所述的藥物組合物施用至其樣品中鑒定出b-raf和/或n-ras基因中存在至少一種突變的受試者。

在一些實(shí)施方案中，可通過測序核酸，例如dna、rna、cdna或與標(biāo)志物基因(例如，基因型標(biāo)志物基因，例如b-raf或n-ras)相關(guān)的蛋白質(zhì)來鑒定標(biāo)志物中的突變。本領(lǐng)域中存在若干測序方法來對核酸進(jìn)行測序。核酸引物可被設(shè)計(jì)成結(jié)合至包含潛在突變位點(diǎn)的區(qū)域，或者可被設(shè)計(jì)成補(bǔ)充突變序列而不是野生型序列。引物對可被設(shè)計(jì)成包括包含標(biāo)志物基因的潛在突變的區(qū)域。引物或引物對可用于測序?qū)?yīng)于標(biāo)志物基因的dna的一條或兩條鏈。引物可與探針(例如核酸探針，例如雜交探針)結(jié)合使用以在測序之前擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域來加強(qiáng)用于檢測標(biāo)志物基因中的突變的序列量?？蛇M(jìn)行測序的區(qū)域的實(shí)例包括整個基因、基因的轉(zhuǎn)錄物以及基因或轉(zhuǎn)錄物的片段，例如外顯子或非翻譯區(qū)或包含突變位點(diǎn)的標(biāo)志物的一部分中的一個或多個。用于引物選擇和序列或組成分析的靶標(biāo)的突變的實(shí)例可在收集突變信息的公共數(shù)據(jù)庫中找到，如由美國國家生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)(bethesda，md)維護(hù)的基因型和表型數(shù)據(jù)庫(dbgap)，以及由威康信托基金會桑格研究所(wellcometrustsangerinstitute)(cambridge，uk)維護(hù)的癌癥體細(xì)胞突變目錄(cosmic)數(shù)據(jù)庫。

測序方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。方法的實(shí)例包括桑格法、sequenom^tm方法和下一代測序(ngs)方法。包括使用電泳(例如毛細(xì)管電泳以分離引物延伸的標(biāo)記的dna片段)的桑格法可自動化用于高通量應(yīng)用。引物延伸測序可在目標(biāo)區(qū)域的pcr擴(kuò)增后進(jìn)行。軟件可幫助序列堿基識別和突變鑒別。sequenom^tm測序分析(sandiego，ca)是將實(shí)際質(zhì)量與特定目標(biāo)片段的預(yù)期質(zhì)量進(jìn)行比較以鑒別突變的一種質(zhì)譜方法。ngs技術(shù)(也稱為“大規(guī)模并行測序”和“第二代測序”)通常提供比先前方法高得多的通量并且使用各種方法(綜述于zhang等人(2011)j.genet.genomics38:95-109以及shendure和hanlee(2008)naturebiotech.26:1135-1145)。ngs方法可鑒別樣品中標(biāo)記物中的低頻率突變。一些ngs方法(參見例如，gs-flx基因組測序儀(rocheappliedscience，branford，ct)、基因組分析儀(illumina，inc.sandiego，ca)、solid^tm分析儀(appliedbiosystems，carlsbad，ca)、polonatorg.007(doversystems，salem，nh)、heliscope^tm(helicosbiosciencescorp.，cambridge，ma))在流動池中空間上分離的pcr產(chǎn)物進(jìn)行或不進(jìn)行克隆擴(kuò)增的情況下使用循環(huán)陣列測序以及各種方案來檢測通過測序酶(例如聚合酶或連接酶)并入的標(biāo)記的修飾的核苷酸。在一種ngs方法中，引物對可用于pcr反應(yīng)中以擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域。擴(kuò)增區(qū)域可連接成級聯(lián)產(chǎn)物?？寺∥膸煸诹鲃映刂袕膒cr或連接的產(chǎn)物產(chǎn)生并且進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增(“橋”或“聚簇”pcr)以用于單末端測序，因?yàn)榫酆厦柑砑訕?biāo)記的可逆封端堿基，所述堿基取決于標(biāo)記的堿基的身份在四個通道中的一個中成像且然后對于下一個循環(huán)移除。軟件可幫助與基因組序列的比較來鑒別突變。另一種ngs方法是外顯子測序，其重點(diǎn)在于測序基因組中所有基因的外顯子。與其他ngs方法一樣，可通過捕獲方法或擴(kuò)增方法富集外顯子。

在一些實(shí)施方案中，可使用本領(lǐng)域中已知的方法在生物樣品中通過原位和體外形式分析dna，例如對應(yīng)于野生型或突變標(biāo)志物的基因組dna。dna可直接從樣品中分離或在分離另一種細(xì)胞組分(例如，rna或蛋白質(zhì))后分離。試劑盒可供用于dna分離，例如dnamicro試劑盒(qiagen，valencia，ca)。也可使用此類試劑盒擴(kuò)增dna。

在另一個實(shí)施方案中，可使用本領(lǐng)域中已知的方法在生物樣品中通過原位和體外形式分析對應(yīng)于標(biāo)志物的mrna。許多表達(dá)檢測方法使用分離的rna。對于體外方法，不針對分離mrna選擇的任何rna分離技術(shù)可用于純化來自腫瘤細(xì)胞的rna(參見例如，ausubel等人，編著，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork1987-1999)。此外，可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)，例如像chomczynski(1989，美國專利號4,843,155)的單步rna分離方法容易地加工大量組織樣品?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)程序(參見例如，chomczynski和sacchi(1987)anal.biochem.162:156-159)、溶液(例如，trizol，tri(molecularresearchcenter，inc.，cincinnati，oh；參見美國專利號5,346,994)或試劑盒(例如，group分離試劑盒(valencia，ca)或leukolock^tm總rna分離系統(tǒng)，ambiondivisionofappliedbiosystems，austin，tx)來分離rna。

可采用另外步驟來從rna樣品中除去dna。細(xì)胞溶解可用非離子洗滌劑完成，然后進(jìn)行微量離心以除去細(xì)胞核且因此除去大部分細(xì)胞dna。隨后可從細(xì)胞核分離dna以用于dna分析。在一個實(shí)施方案中，使用硫氰酸胍溶解、隨后cscl離心以分離rna與dna來從各種目標(biāo)類型的細(xì)胞提取rna(chirgwin等人(1979)biochemistry18:5294-99)。通過用oligo-dt纖維素選擇來選擇poly(a)+rna(參見sambrook等人(1989)molecularcloning--alaboratorymanual(第2版)，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，n.y.)?；蛘?，可通過例如用熱苯酚或苯酚/氯仿/異戊醇有機(jī)萃取來完成rna與dna的分離。如果需要，可將rna酶抑制劑添加至溶解緩沖液。同樣，對于某些細(xì)胞類型，可能需要向所述方案添加蛋白質(zhì)變性/消化步驟。對于許多應(yīng)用，希望相對于其他細(xì)胞rna(如轉(zhuǎn)移rna(trna)和核糖體rna(rrna))富集mrna。大多數(shù)mrna在其3'端含有poly(a)尾。這允許它們通過親和色譜法富集，例如使用偶聯(lián)至固體支持體如纖維素或sephadex.r^tm.介質(zhì)的oligo(dt)或poly(u)(參見ausubel等人(1994)currentprotocolsinmolecularbiology，第2卷，currentprotocolspublishing，newyork)。一旦結(jié)合，使用2mmedta/0.1％sds從親和柱洗脫poly(a)+mrna。

可通過用于檢測或測量(例如)核酸(例如，rna、mrna、基因組dna或cdna)和/或翻譯的蛋白質(zhì)的(例如)一種標(biāo)志物或多種標(biāo)志物的特征的各種熟知的方法中的任一種來評定例如在從測試受試者獲得樣品(例如，腫瘤活檢)之后樣品中的標(biāo)志物的特征。此類方法的非限制性實(shí)例包括用于檢測分泌的蛋白、細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白或核蛋白的免疫學(xué)方法，蛋白質(zhì)純化方法，蛋白質(zhì)功能或活性測定，核酸雜交方法(任選地包括“錯配裂解”步驟(myers，等人(1985)science230:1242)來消化錯配的(即突變體或變體)區(qū)域以及分離和鑒別來自所得消化片段的突變體或變體)，核酸逆轉(zhuǎn)錄方法以及核酸擴(kuò)增方法和擴(kuò)增產(chǎn)物的分析。這些方法包括基因陣列/芯片技術(shù)、rt-pcr、基因表達(dá)測定(appliedbiosystems，fostercity，ca)(例如，在glp批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室條件下)、原位雜交、免疫組織化學(xué)、免疫印跡、fish(熒光原位雜交)、facs分析、rna印跡、dna印跡、dna分析珠粒芯片(illumina，inc.，sandiego，ca)、定量pcr、細(xì)菌人工染色體陣列、單核苷酸多態(tài)性(snp)陣列(affymetrix，santaclara，ca)或細(xì)胞遺傳學(xué)分析。

用于檢測兩種核酸之間的至少一個核苷酸的差異的技術(shù)的實(shí)例包括但不限于選擇性寡核苷酸雜交、選擇性擴(kuò)增或選擇性引物延伸。例如，可制備寡核苷酸探針，其中將已知的多態(tài)性核苷酸置于中心位置(等位基因或突變體特異性探針)，且然后在僅發(fā)現(xiàn)完美匹配的情況下允許雜交的條件下與靶dna雜交(saiki等人(1986)nature324:163)；saiki等人(1989)proc.natlacad.sciusa86:6230；以及wallace等人(1979)nucl.acidsres.6:3543)。這種等位基因特異性寡核苷酸雜交技術(shù)可用于同時檢測n-ras的不同多態(tài)性或突變區(qū)域中的若干核苷酸變化。例如，將具有特定等位基因變體或突變體的核苷酸序列的寡核苷酸連接至固體支持體(例如雜交膜)上，且然后將所述支持體(例如膜)與標(biāo)記的樣品核酸雜交。因此，雜交信號的分析可揭示樣品核酸的核苷酸的身份。

除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本公開所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同意義。盡管可在本公開的實(shí)踐或測試中使用與本文所述的那些方法和材料類似或等效的任何方法和材料，但本文描述優(yōu)選的方法、裝置和材料。本文提及的所有出版物出于描述和公開在出版物中報道的可與本公開結(jié)合使用的材料和方法的目的以引用的方式整體并入本文。

實(shí)施例

定義

實(shí)施例1：使用純化的raf激酶同種型進(jìn)行的激酶抑制測定

使用如在wo2009/006389中描述的生物化學(xué)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)測定來測定化合物a的激酶活性。化合物a對突變體b-rafv600e、野生型b-raf和野生型c-raf激酶的半數(shù)最大抑制濃度(ic50)值在以下表1中示出?；衔颽與b-raf激酶的無活性的dfg-向外構(gòu)象結(jié)合。

表1.

實(shí)施例2：在nras突變的sk-mel-2人黑色素瘤異種移植模型中的體內(nèi)腫瘤功效

將8周齡的雌性無胸腺ncr-nu/nu小鼠在右側(cè)腹區(qū)域中用30-40mg腫瘤片段皮下接種，在體內(nèi)傳代中增殖。用游標(biāo)卡尺監(jiān)測腫瘤生長，并使用公式(0.5×[長度×寬度²])計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)平均腫瘤體積(mtv)達(dá)到大約167mm³(100-245mm³的)時，將動物隨機(jī)分為12個處理組(n＝8只/組)。在腫瘤接種12天后開始向動物給予媒介物或測試化合物。處理的第一天被指定為第0天。

測試化合物

將化合物a配制在peg400中，并將所得懸浮液在溫水浴中超聲處理直到獲得澄清溶液。對于較低劑量，將10mg/ml溶液用100％peg400稀釋。

將阿立塞替鈉配制在wfi中20％hpbcd的一半體積中，且然后用wfi中的2％碳酸氫鈉稀釋至最終體積(wfi中10％hpbcd/1％nahco3)。

將2種媒介物100％peg400(媒介物1)和wfi中的10％hpbcd/1％nahco3(媒介物2)同時施用(0.05ml/10gbw)至媒介物組中的小鼠。

腫瘤測量：

在處理的第一天開始每周兩次測量腫瘤大小和體重。當(dāng)動物的腫瘤達(dá)到大約2000mm3時將動物終止，并且研究在處理開始后的第62天終止。

通過計(jì)算在處理開始后第20天的tgi％(媒介物組的mtv-處理組的mtv)/媒介物組的mtv來確定腫瘤生長的抑制。使用關(guān)于δauc的線性混合效應(yīng)回歸分析來進(jìn)行處理組與媒介物之間腫瘤生長的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

用于評估功效的另外終點(diǎn)是：非特異性死亡、完全腫瘤應(yīng)答和無腫瘤存活者(tfs)的數(shù)量，所述無腫瘤存活者被定義為在研究終止(在處理開始后第62天)前數(shù)據(jù)收集的最后一天觀察不到可測量的腫瘤。完全應(yīng)答(cr)被定義為腫瘤質(zhì)量下降至不可檢測的大小(＜32mm3)。

統(tǒng)計(jì)分析

使用線性混合效應(yīng)回歸模型評定媒介物對照組與處理組之間隨時間推移的腫瘤生長趨勢的差異。這些模型考慮到在多個時間點(diǎn)測量每只動物。將一種模型擬合以用于所述比較，并且使用從所述模型預(yù)測的值來計(jì)算對照組和處理組的腫瘤體積對時間曲線下面積(auc)。統(tǒng)計(jì)上顯著的p值表明兩組(媒介物和處理)隨時間推移的趨勢是不同的。

在log10轉(zhuǎn)化之前，將所有腫瘤體積具有的值加1。將這些值在處理組之間進(jìn)行比較以評定隨時間推移的趨勢差異是否是統(tǒng)計(jì)上顯著的。為了比較多對處理組，使用最大似然法將以下混合效應(yīng)線性回歸模型擬合為數(shù)據(jù)：

yijk-yi0k＝y(tǒng)i0k+處理i+天j+天j²+(處理*天)ij(處理*天2)ij+eijk(1)

其中yijk是第i次處理中第k個動物的第j個時間點(diǎn)的log10腫瘤值，yi0k是第i次處理中第k個動物的第0天(基線)log10腫瘤值，天j是以中位數(shù)為中心的時間點(diǎn)且(連同天2j)被視為連續(xù)變量，并且eijk是殘余誤差?？臻g冪律協(xié)方差矩陣用于說明隨時間推移關(guān)于同一動物的重復(fù)測量值。如果不是統(tǒng)計(jì)上顯著的，則將相互作用項(xiàng)以及天2j項(xiàng)去除。

使用似然比檢驗(yàn)來評定一對給定處理組是否展示統(tǒng)計(jì)上顯著的差異。將完整模型的-2對數(shù)似然值與無任何處理項(xiàng)的模型(簡化模型)進(jìn)行比較，并且使用卡方檢驗(yàn)來檢驗(yàn)值的差異。所述檢驗(yàn)的自由度被計(jì)算為完整模型的自由度與簡化模型的自由度之間的差異。

從上述模型中獲取log腫瘤值(yijk-yi0k，其可被解釋為log10(從第0天的倍數(shù)變化))的預(yù)測差異以計(jì)算每個處理組的平均auc值。然后將dauc值計(jì)算為：

這假定aucctl為正數(shù)。在aucctl為負(fù)數(shù)的情況下，將上述公式乘以-1。

對于協(xié)同作用分析，使用log腫瘤值的觀察到的差異來計(jì)算每只動物的auc值。在處理組中的動物從研究中除去時的情況下，最后觀察到的腫瘤值結(jié)轉(zhuǎn)通過所有隨后時間點(diǎn)。使用來自上述成對模型的預(yù)測值計(jì)算對照或媒介物組的auc。協(xié)同作用的量度定義如下：

協(xié)同作用得分＝(平均值(fraca)+平均值(fracb)-平均值(fracab))*100(6)

其中ak和bk是單獨(dú)處理組中的第k個動物，且abk是組合處理組中的第k個動物。aucctl是對照組的模型預(yù)測auc，并且被視為無變異性的常數(shù)。協(xié)同作用得分的標(biāo)準(zhǔn)誤差被計(jì)算為a組、b組和ab組之間的標(biāo)準(zhǔn)誤差平方和的平方根。使用welch-satterthwaite方程估計(jì)自由度。進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)以確定協(xié)同作用得分是否與0不同。通過將協(xié)同作用得分除以其標(biāo)準(zhǔn)誤差來計(jì)算p值，并用上述計(jì)算的自由度針對t-分布(雙尾)進(jìn)行檢驗(yàn)。

作用被分為四個不同的類別。如果協(xié)同作用得分小于0則其被認(rèn)為是協(xié)同的，并且如果協(xié)同作用得分與0沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異則其被認(rèn)為是相加的。如果協(xié)同作用得分大于零，但組合的平均auc低于兩種單一藥劑處理中的最低平均auc，則所述組合是次相加的。如果協(xié)同作用得分大于零，并且組合的平均auc大于單一試劑處理中的至少一種的平均auc，則所述組合是拮抗性的。

如果需要，區(qū)間分析涉及與另一處理組和時間間隔相比較的指定處理組和時間間隔。對于給定組、時間間隔和動物，通過以下估計(jì)每天的腫瘤生長速率

速度＝100*(10^δγ/δt-1)(7)

其中δy是目標(biāo)區(qū)間內(nèi)log10腫瘤體積的差異，并且□t是時間間隔的長度。如果一個或兩個時間點(diǎn)缺失，則所述動物被忽略。然后將動物間的平均速率與使用具有不等方差的雙側(cè)未配對t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。對于多次比較和所檢查的終點(diǎn)，不存在預(yù)先規(guī)定的調(diào)整。所有p值<0.05被稱為統(tǒng)計(jì)上顯著的。協(xié)同分析：p>0.05＝相加；p<0.05且得分<0＝協(xié)同；p<0.05，得分>0且組合生長速率低于兩個單一藥劑生長速率＝次相加；p<0.05，得分>0且組合生長速率高于單一藥劑生長速率中的至少一個＝拮抗。

結(jié)果

使用如在上述方法中所描述進(jìn)行的小鼠異種移植模型來評定化合物a和阿立塞替的體內(nèi)組合效應(yīng)。此研究的細(xì)節(jié)在以下表2中示出。表2中針對阿立塞替列出的劑量是游離化合物的量。

表2.結(jié)果總結(jié)

組合分析的總結(jié)在表3中提供。當(dāng)與媒介物組相比時，組合處理組中的每個在攜帶sk-mel-2人黑色素瘤異種移植物的小鼠中具有顯著抗腫瘤活性(δauc，p<0.001)。

與化合物a(12.5mg/kgqd或50mg/kgbiw)和阿立塞替(20mg/kgqd；tgi分別＝80.1％或73.1％)組合處理抑制腫瘤生長超過單一藥劑治療，并且協(xié)同作用分析表明，當(dāng)化合物a每日一次處理時化合物a和阿立塞替的相互作用是相加的，但當(dāng)化合物a每周兩次處理時化合物a和阿立塞替的相互作用是次相加的。每組的mtv在圖1和2中以圖形方式表示。

表3.組合分析

實(shí)施例3：在b-raf突變的人黑色素瘤異種移植模型中的體內(nèi)腫瘤功效

將每只動物用3x106個a375腫瘤細(xì)胞(0.1ml中，與基質(zhì)膠1:1)接種到右側(cè)腹中用于腫瘤模型開發(fā)。每周兩次監(jiān)測體重和腫瘤生長。使用游標(biāo)卡尺并應(yīng)用公式v＝w2xl/2將腫瘤大小測量到最接近0.1mm，其中v＝體積，w＝寬度且l＝腫瘤異種移植物的長度。允許異種移植物生長直到它們在接種后11天達(dá)到大約195mm3的平均大小。將攜帶適當(dāng)大小的異種移植物的小鼠隨機(jī)分配到十二組中的一組，并開始用其指定的測試材料，媒介物(100％peg400和/或wfi中10％hpβcd+1％nahco3)和/或測試物品處理：化合物a(12.5或50mg/kg)、阿立塞替(10或20mg/kg)或化合物a/阿立塞替的組合處理。

測試化合物

將化合物a配制在100％peg400(媒介物1)中。制備化合物a并在室溫(18℃至25℃)下儲存。

將阿立塞替鈉配制在注射用水(wfi)中的10％hpβcd加1％nahco3(媒介物2)中。制備阿立塞替并在室溫(18℃至25℃)下儲存。

媒介物處理組中的動物被給予媒介物1和媒介物2。

媒介物或化合物的劑量體積是5ml/kg體重。

腫瘤測量

從動物分組當(dāng)天(例如，第0天)開始每周兩次測量腫瘤大小和體重。當(dāng)動物的腫瘤達(dá)到大約2000mm3時將動物終止，并且研究在處理開始后的第38天終止。

通過計(jì)算在處理開始后第21天的tgi％(媒介物組的mtv-處理組的mtv)/媒介物組的mtv]來確定腫瘤生長的抑制。使用關(guān)于δauc的線性混合效應(yīng)回歸分析來進(jìn)行處理組與媒介物之間腫瘤生長的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

統(tǒng)計(jì)分析

如實(shí)施例2中所描述來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果

使用如在上述方法中所描述進(jìn)行的小鼠異種移植模型來評定化合物a和阿立塞替的體內(nèi)組合效應(yīng)。此研究的細(xì)節(jié)在以下表4中示出。針對阿立塞替列出的劑量是游離化合物的量。

化合物a(12.5mg/kg，qd)和阿立塞替的組合物作用是相加的，而化合物a(50mg/kg，biw)和阿立塞替的組合作用是協(xié)同的。

表4.結(jié)果總結(jié)

實(shí)施例4：用于測量標(biāo)志物的方法

基于b-rafpcr的測定(供應(yīng)商：qiagen；目錄#：870801)

b-rafrgqpcr試劑盒v2結(jié)合兩種技術(shù)和以檢測實(shí)時pcr測定中的突變。這種測定檢測b-rafv600突變v600e(gag)和v600e復(fù)合物(gaa)、v600d(gat)、v600k(aag)、v600r(agg)。所述試劑盒檢測到v600e(gag)和v600e復(fù)合物(gaa)的存在，但不能區(qū)分它們。

arms

通過被設(shè)計(jì)用于匹配突變dna的等位基因特異性引物來選擇性地擴(kuò)增特異性突變序列。

scorpions

使用scorpions進(jìn)行擴(kuò)增檢測。scorpions是與熒光標(biāo)記的探針(即fam^tm或hex^tm)和淬滅劑共價連接的pcr引物。在pcr期間，當(dāng)所述探針與擴(kuò)增子結(jié)合時，熒光團(tuán)和淬滅劑變得分離，從而導(dǎo)致熒光信號的增加。

步驟

b-rafrgqpcr試劑盒v2包括兩步程序。在第一步驟中，進(jìn)行對照測定以評定樣品中的總可擴(kuò)增的b-rafdna。在第二步驟中，進(jìn)行突變測定和對照測定兩者來確定突變dna的存在或不存在。

·對照測定

用fam標(biāo)記的對照測定用于評定樣品中的總可擴(kuò)增的b-rafdna。對照測定擴(kuò)增b-raf基因的外顯子3的區(qū)域。引物和scorpion探針被設(shè)計(jì)為獨(dú)立于任何已知的b-raf多態(tài)性而擴(kuò)增。

·突變測定

每個突變測定包含fam標(biāo)記的scorpion探針和用于區(qū)分野生型dna和特異性突變dna的arms引物。

數(shù)據(jù)分析：δct方法

scorpion實(shí)時測定使用檢測在背景信號以上的熒光信號所需的pcr循環(huán)次數(shù)作為在反應(yīng)開始時存在的靶分子的量度。檢測到在背景熒光以上的信號的點(diǎn)被稱為“循環(huán)閾值”(ct)。

樣品δct值被計(jì)算為來自同一樣品的突變測定ct與對照測定ct之間的差異。如果樣品的δct小于所述測定的截斷δct值，則將所述樣品分類為突變陽性。在所述值以上，樣品含有少于通過所述試劑盒能夠檢測到的突變百分比(超出測定限制)，或者樣品是突變陰性。

當(dāng)使用arms引物時，可能發(fā)生一些無效的引發(fā)，從而從不含突變的dna得到非常晚的背景ct。從背景擴(kuò)增計(jì)算的所有δct值都大于截斷δct值，并且樣品被分類為突變陰性。

對于每個樣品，如下計(jì)算值，從而確保突變ct值和對照ct值來自同一樣品：

δct＝{樣品突變ct}–{樣品對照ct}

樣品對照ct可在27-33之間的范圍內(nèi)

樣品突變ct可在15-40之間的范圍內(nèi)

突變體識別的可接受的δct是<6或7

用于測量n-ras突變的方法與以上針對b-raf描述的那些相似。用于檢測n-rasq61突變的qiagenn-ras測定包括：

q61k(181c>a)

q61r(182a>g)

序列表

<110>bozon,viviana

米倫紐姆醫(yī)藥公司

<120>藥物制劑、其制備方法以及其使用方法

<130>mpi14-027p1nwo

<150>us62/096,020

<151>2014-12-23

<160>6

<170>用于windows4.0版的fastseq

<210>1

<211>2949

<212>dna

<213>智人

<400>1

cgcctcccttccccctccccgcccgacagcggccgctcgggccccggctctcggttataa60

gatggcggcgctgagcggtggcggtggtggcggcgcggagccgggccaggctctgttcaa120

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tatagaggccctattggacaaatttggtggggagcataatccaccatcaatatatctgga300

ggcctatgaagaatacaccagcaagctagatgcactccaacaaagagaacaacagttatt360

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tacatcttcttcctcttctagcctttcagtgctaccttcatctctttcagtttttcaaaa480

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<210>2

<211>2301

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<400>2

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151015

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340345350

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