本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及聚肌胞苷酸，咪喹莫特和嘎德莫特在構(gòu)建病毒免疫小鼠模型中的用途。

背景技術(shù)：

呼吸道病毒感染是常見的，且常表現(xiàn)出良性的臨床病程。然而，相當(dāng)多一部分的病人發(fā)展成伴隨性或繼發(fā)性細(xì)菌感染，這種并發(fā)癥可導(dǎo)致呼吸衰竭或死亡。盡管在兒童，老人和免疫力抑制人群中，此類并發(fā)癥的暴發(fā)率最高，但是病毒細(xì)菌性肺炎也可能出現(xiàn)于健康成年人群中，并導(dǎo)致沉重的疾病負(fù)擔(dān)。隨著流感感染流行，病毒-細(xì)菌性肺炎屢次被報道。它是導(dǎo)致20世紀(jì)的流感流行期和2009年甲型H1N1流感大流行期的患者死亡主要原因。

對于病毒感染是如何促進(jìn)細(xì)菌感染的機(jī)制仍然知之甚少，但有可能極其復(fù)雜。流感研究案例已提出的機(jī)制包括流感引起一般具有保護(hù)性的呼吸道上皮細(xì)胞層的損傷機(jī)制，細(xì)菌介導(dǎo)受體的結(jié)合增強(qiáng)機(jī)制，抗炎因子如IL-10誘導(dǎo)機(jī)制，以及識別模式分子的表達(dá)如Toll樣受體的減弱機(jī)制。此外，近期，我們和其他人發(fā)現(xiàn)，宿主針對流感的免疫反應(yīng)，如I型和II型干擾素誘導(dǎo)，可能與抑制先天性抗菌免疫應(yīng)答關(guān)鍵環(huán)節(jié)。原因包括巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞應(yīng)答受損先前文獻(xiàn)顯示：這兩種類型的先天性免疫細(xì)胞在肺部病原菌清除方面具有至關(guān)重要的作用。然而，鑒于流感感染導(dǎo)致肺部的多樣性變化，由流感誘導(dǎo)的非損傷性的抗病毒免疫通路的活化是否有助于細(xì)菌繼發(fā)性感染的機(jī)制尚不明確。

此外，流感導(dǎo)致宿主防御障礙的現(xiàn)象是否與其他病毒病原體相關(guān)尚不清楚。在臨床上，許多病毒與細(xì)菌會形成聯(lián)合感染，包括呼吸道合胞病毒（RSV）和鼻腔病毒（這兩者都是RNA病毒）。因此，我們進(jìn)行了此項(xiàng)研究，假設(shè)僅僅活化宿主呼吸道疾病的病毒RNA識別受體將會導(dǎo)致細(xì)菌清除力的下降。我們在采用合成化合物（特別是聚肌胞苷酸，咪喹莫特和嘎德莫特）給藥，接下來，進(jìn)行細(xì)菌感染。此類藥物是眾所周知的可模擬病毒核酸對免疫系統(tǒng)的影響的藥物。聚肌苷酸是可激活TLR3的合成化合物，TLR3受體可識別核內(nèi)dsRNA；還有RIG類似受體（RLRs）維甲酸誘導(dǎo)性基因（RIG-I）和可識別RNA病毒核酸的黑色素瘤分化-相關(guān)蛋白5（MDA5）細(xì)胞質(zhì)受體。咪喹莫特和嘎德莫特（R848）激活可識別單鏈RNA的TLR7。聚肌苷酸和TLR7激動劑作為治療或預(yù)防劑，抵御流感或潛在生物病原體的多種呼吸道病原菌，包括流感，H5N1禽流感病毒，和土拉弗朗西斯菌。它們被認(rèn)為是一種有效且安全的抗病毒免疫反應(yīng)的“助推器”。以肺部感染小鼠作為動物模型，我們以滴鼻給藥的方式，注入聚肌苷酸和TLR7激動劑，繼而，以常見的呼吸道病原菌（可導(dǎo)致繼發(fā)性肺炎的病原菌）感染實(shí)驗(yàn)小鼠，最終確定的抗病毒免疫通絡(luò)的激活是否增加宿主繼發(fā)性細(xì)菌感染的敏感性。我們發(fā)現(xiàn)，聚肌苷酸給藥，類似流感感染，損害宿主對肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌的清除力。此外，聚肌苷酸的有害作用可能是由I型干擾素介導(dǎo)的。我們的研究結(jié)果表明，聚肌苷酸可能不是一個良性免疫刺激分子，其作為病毒流行時的預(yù)防或治療劑的存在疑慮。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

呼吸道的病毒感染是常見呼吸道疾病，緊接著大部分的病人會發(fā)展成為伴隨性或者繼發(fā)性細(xì)菌感染，然而對于病毒感染是如何促進(jìn)細(xì)菌感染的機(jī)制仍然知之甚少。雖然流感研究案例已經(jīng)提出若干的機(jī)制，但是鑒于流感感染導(dǎo)致的肺部變化是多樣的，由流感誘導(dǎo)的非損傷性的抗病毒免疫通路的活化是否有助于細(xì)菌繼發(fā)性感染的機(jī)制尚不明確。此外，流感導(dǎo)致宿主防御障礙的現(xiàn)象是否與其他病毒病原體相關(guān)尚不清楚。近期，我們與他人的研究發(fā)現(xiàn)由流感引起的免疫應(yīng)答反而能夠抑制抗菌性先天免疫的關(guān)鍵部分，比如由IFNI和IFNII引起的免疫。

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明模擬了小鼠體內(nèi)病毒免疫模型，第一方面提供聚肌胞苷酸在宿主肺部對細(xì)菌清除中的作用。

聚肌胞苷酸和咪喹莫特分別是TLR3激動劑和TLR7激動劑，都是我們所熟知的能夠模擬核酸病毒對免疫系統(tǒng)影響的藥物。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)聚肌胞苷酸鼻腔給藥后的小鼠對于肺部肺炎鏈球菌的清除能力于對照組大大降低，而TLR7激動劑組無明顯變化，同時我們也檢測到聚肌胞苷酸也能使肺部對金黃色葡萄球菌的清除能力降低。

本發(fā)明第二方面提供細(xì)菌清除能力和聚肌胞苷酸的持續(xù)給藥時間呈反向關(guān)系。

由于流感通常需要持續(xù)幾天，所以我們進(jìn)行了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。經(jīng)聚肌胞苷酸給藥一次或三次的實(shí)驗(yàn)小鼠對細(xì)菌的清除能力均都有所明顯下降，但是經(jīng)聚肌胞苷酸給藥一次的小鼠肺部細(xì)菌的平均CFU值是對照組的8倍，而經(jīng)聚肌胞苷酸給藥三次的小鼠是13倍。因此細(xì)菌清除能力隨著聚肌胞苷酸持續(xù)給藥時間的增加而降低。

本發(fā)明第三方面提供TLR3和Cardif通路在聚肌胞苷酸誘導(dǎo)細(xì)菌清除率下降中的作用。

聚肌胞苷酸能同時激活TLR3和Cardif通路。我們發(fā)現(xiàn)，TLR3-/-小鼠和Cardif-/-小鼠在聚肌胞苷酸給藥后，宿主對肺部的細(xì)菌清除率有所提高，而TLR3和Cardif雙敲小鼠則表現(xiàn)為顯著提高。TLR3和Cardif基因均無敲除的小鼠在無聚肌胞苷酸給藥的條件下，其肺部的肺部的清除率與野生小鼠組無明顯差異。因此，TLR3和Cardif通路均有助于聚肌胞苷酸誘導(dǎo)宿主對細(xì)菌的易感性。

本發(fā)明第四方面提供IFNI在肺部細(xì)菌清除中發(fā)生的作用

我們已證實(shí)，流感期間，IFNI可導(dǎo)致肺炎鏈球菌的清除率降低。在本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)聚肌胞苷酸給藥后的小鼠肺部IFN的表達(dá)量是明顯升高，經(jīng)聚肌胞苷酸給藥后的IFNAR缺陷型小鼠肺部細(xì)菌的清除率有所增加。然而，我們使用IFNAR阻斷抗體進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在無病毒抗體的條件下，IFNI通路不會介導(dǎo)肺部對肺炎鏈球菌的清除。

本發(fā)明的第五方面提供IFNI可增加機(jī)體在抗病毒免疫機(jī)制活化條件下對肺炎鏈球菌的易感性。

聚肌胞苷酸處理后的野生型小鼠在細(xì)菌感染7天后死亡率即達(dá)到100%，而聚肌胞苷酸處理后的Ifnar?/?小鼠在細(xì)菌感染14天后，仍有60%的存活率。通過小鼠肺部切片發(fā)現(xiàn)，當(dāng)繼發(fā)性細(xì)菌感染引起早期和晚期細(xì)菌清除障礙后，IFNI在聚肌胞苷酸引起的死亡危害中起著一定的作用。

附圖說明：

圖1：聚肌胞苷酸提高肺組織對細(xì)菌的易感性。A. 實(shí)驗(yàn)小鼠每天分別用多聚肌胞苷酸(50 ug)，TLR7激動劑，生理鹽水處理，持續(xù)2天。最后一次處理24h后，用肺炎鏈球菌(900 CFU，30 ul)感染小鼠。在第三天的時候檢測小鼠肺部細(xì)菌的CFU。*, p＜0.05，p值的獲得是通過單因素方差分析法分別比較聚肌胞苷酸組與生理鹽水以及TLR7組。B. 實(shí)驗(yàn)小鼠每天分別用多聚肌胞苷酸(50 mg)和生理鹽水處理，持續(xù)三天。最后一次處理24h后，用金黃色葡萄球菌(MRSA, LAC USA300; 6*10⁶ CFU)，24h后，檢測小鼠肺部細(xì)菌的CFU。p＜0.05，p值通過實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水組比較獲得。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由2組具有代表性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中分析獲得

圖2：聚肌胞苷酸的肺部細(xì)菌清除能力呈劑量依賴效果。小鼠每天以聚肌胞苷酸(pIC, 50ug)或生理鹽水進(jìn)行鼻腔內(nèi)給藥 ，持續(xù)1天或3天。最后一次給藥24h后，用肺炎鏈球菌(1*10⁵ CFU，30ul)感染小鼠。48h后，檢測小鼠肺部細(xì)菌的CFU。*p＜0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由2組具有代表性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中分析獲得。

圖3：在聚肌胞苷酸間接介導(dǎo)的免疫抑制中病毒模式識別途徑的作用。用聚肌胞苷酸處理年齡和性別匹配的Cardif^-/-, Tlr3^-/-, Cardif^-/-，/Tlr3^-/-，野生型小鼠三天，接著已肺炎鏈球菌感染實(shí)驗(yàn)小鼠(1*10⁴ CFU)，48h后檢測肺部細(xì)菌的CFU值。**, p＜0.01，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由2組具有代表性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中分析獲得。

圖4：經(jīng)聚肌胞苷酸處理后的實(shí)驗(yàn)小鼠在稍后會出現(xiàn)細(xì)菌清除障礙現(xiàn)象。以聚肌胞苷酸（50ug）或生理鹽水處理實(shí)驗(yàn)小鼠三天。最后一次給藥24h后，用肺炎鏈球菌(1*10⁴ CFU，30ul)感染小鼠。分別在第1,3，5天的時候檢測小鼠肺部的細(xì)菌CFU值，每組都一個平均值。誤差棒代表了標(biāo)準(zhǔn)差。*, p＜0.05，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由2組具有代表性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中分析獲得。

圖5：聚肌胞苷酸處理過的小鼠體內(nèi)INFI的檢測。A.用聚肌胞苷酸（50ug），gardiquimod（100ug），或生理鹽水處理實(shí)驗(yàn)小鼠三天。小鼠整肺勻漿處理后用ELISA檢測IFN-α4。每組標(biāo)記平均值以及標(biāo)準(zhǔn)差（n=4）。*, p＜0.05。B.用聚肌胞苷酸處理野生型(Ifnar^+/+)小鼠和(Ifnar^-/-)小鼠三天，緊接著用肺炎鏈球菌（7*10⁴CFU）感染實(shí)驗(yàn)小鼠。48h后，檢測小鼠肺部細(xì)菌的CFU。每組5只小鼠。*, p＜0.05。C.用聚肌胞苷酸處理野生型(Ifnar^+/+)小鼠三天，第四天用肺炎鏈球菌（2*10⁴CFU）感染實(shí)驗(yàn)小鼠。同時給實(shí)驗(yàn)小鼠注射抗IFNAR抗體或者對照的IgG（第一天1.5mg，第三天0.75mg，第五天0.75mg）。肺炎鏈球菌感染48h后檢測小鼠肺部的CFU值。*, p＜0.05。

圖6：在持續(xù)聚肌胞苷酸給藥及肺炎鏈球菌感染下，Ifnar和野生組在后期的存活率及細(xì)菌的清除率。A.用聚肌胞苷酸處理年齡和性別匹配的野生型小鼠和Ifnar^-/- 小鼠三天，緊接著用肺炎鏈球菌（1*10⁴CFU）感染實(shí)驗(yàn)小鼠。觀察肺炎鏈球菌感染后14天之內(nèi)小鼠的生命跡象，若小鼠生命跡象垂危，則對其進(jìn)行安樂死處理。**, p = 0.001。每組小鼠7-8只。所有其他的比較無統(tǒng)計學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由2組具有代表性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中分析獲得。B,C.在不同的實(shí)驗(yàn)中，用聚肌胞苷酸處理年齡和性別匹配的野生型小鼠和Ifnar^-/- 小鼠三天，分別在第三天和第四天用肺炎鏈球菌（1.5*10⁴CFU）感染實(shí)驗(yàn)小鼠. B組小鼠檢測小鼠肺部細(xì)菌CFU值，C組小鼠檢測血液中細(xì)菌CFU值。*, p＜0.05。每組小鼠4只。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由2組具有代表性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中分析獲得。

圖7：肺炎鏈球菌感染后Cardif?/?和Ifnar?/?實(shí)驗(yàn)動物血液及肺組織負(fù)荷。年齡與性別相匹配的Cardif?/?和Ifnar?/?，以及野生型實(shí)驗(yàn)動物注射肺炎鏈球菌（1×10⁴CFU）。48小時后，對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行安樂死，取肺組織及血液用于細(xì)菌CFU值計算。ns 表示無意義比較；直線表示檢測最小值。數(shù)據(jù)由兩個分開的實(shí)驗(yàn)得到。n=8/group。

圖8：肺炎鏈球菌感染后Tlr3-/-和野生型實(shí)驗(yàn)動物血液及肺組織負(fù)荷。年齡與性別相匹配的Tlr3-/-和野生型實(shí)驗(yàn)動物注射肺炎鏈球菌（1×10⁴ CFU）。48小時后，對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行安樂死，取肺組織及血液用于細(xì)菌CFU值計算。ns 表示無意義比較；直線表示檢測最小值。數(shù)據(jù)由兩個分開的實(shí)驗(yàn)得到。n=8-9/group。

圖9：肺炎鏈球菌感染后聚肌胞苷酸給藥動物的早期細(xì)菌負(fù)荷和炎癥細(xì)胞的應(yīng)答。年齡與性別相匹配的Ifnar-/-和野生型實(shí)驗(yàn)動物每天進(jìn)行聚肌胞苷酸給藥(50μg)，持續(xù)3天，緊接著注射肺炎鏈球菌(7×10³CFU)。6小時后，對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(BAL)。A.第一次1ml的支氣管肺泡灌洗液稀釋5倍，用于細(xì)菌CFU值計算。B.此時間點(diǎn)對于總支氣管肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞(多形核白細(xì)胞)總量計算的描述。C.野生組和Ifnar-/-動物機(jī)體內(nèi)中性粒細(xì)胞量。

圖10：肺炎鏈球菌感染后聚肌胞苷酸給藥動物肺部組織學(xué)切片。年齡與性別相匹配的Ifnar?/?和野生型實(shí)驗(yàn)動物每天進(jìn)行聚肌胞苷酸給藥（50μg），持續(xù)3天，緊接著在第3天注射肺炎鏈球菌（1×10⁴ CFU）。取肺組織制成切片。組織切片顯示，野生組肺組織呈現(xiàn)大面積的固結(jié)和炎性細(xì)胞浸潤（左）。而Ifnar?/?組肺組織表現(xiàn)較小面積的炎癥，肺組織大部分正常（右）。肺組織切片的描述代表每一組；n=3-4/group。

具體實(shí)施方式：

以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點(diǎn)以及兩個端點(diǎn)之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的小鼠鼻腔給藥，細(xì)菌感染，CFU值測定，支氣管肺泡灌洗，ELISA，小鼠肺組織的采集，制作石蠟切片及染色，統(tǒng)計分析及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。

呼吸道的病毒感染是常見呼吸道疾病，且常表現(xiàn)良性的臨床病程。然而，相當(dāng)多一部分的病人發(fā)展成伴隨性或繼發(fā)性細(xì)菌感染，這種并發(fā)癥可導(dǎo)致呼吸衰竭或死亡。盡管兒童，老人和免疫力低下的人群常面臨暴發(fā)此類并發(fā)癥的高風(fēng)險，但是病毒細(xì)菌性肺炎也可能出現(xiàn)于健康成年人，并導(dǎo)致沉重的疾病負(fù)擔(dān)。隨著流感感染流行，病毒-細(xì)菌性肺炎屢次被報道。對于病毒感染是如何促進(jìn)細(xì)菌感染的機(jī)制仍然知之甚少。鑒于流感感染導(dǎo)致肺部的多樣的變化，由流感誘導(dǎo)的非損傷性的抗病毒免疫通路的活化是否有助于細(xì)菌繼發(fā)性感染的機(jī)制也尚不明確。在臨床上，許多病毒與細(xì)菌會形成聯(lián)合感染，包括呼吸道合胞病毒（RSV）和鼻腔病毒（這兩者都是RNA病毒），流感導(dǎo)致宿主防御障礙的現(xiàn)象是否與其他病毒病原體相關(guān)尚不清楚。

小鼠

在所有實(shí)驗(yàn)中，使用C57BL/6J遺傳背景且年齡和性別相匹配的小鼠。干擾素α/β受體基因雙敲除小鼠由本實(shí)驗(yàn)室保存。Toll樣受體3和CARDIF（也被稱為干擾素β啟動模擬器1，線粒體抗病毒信號蛋白和病毒誘導(dǎo)信號適配器）雙基因敲除小鼠是由Toll樣受體3基因敲除小鼠（來自日本大阪大學(xué)，Shizuo Akira的實(shí)驗(yàn)室）和CARDIF基因敲除小鼠（來自洛桑大學(xué)，Jurg Tschopp博士的實(shí)驗(yàn)室）雜交產(chǎn)生所得，這兩種基因敲除小鼠都有完整的C57BL/6J遺傳背景，并保存在我們實(shí)驗(yàn)室。干擾素α/β受體基因雙敲除小鼠、Toll樣受體3基因敲除小鼠、Toll樣受體3和CARDIF雙基因敲除小鼠、CARDIF基因敲除小鼠和野生型小鼠均保存在美國加州大學(xué)洛杉磯分校的同一特定無菌設(shè)施內(nèi)。所有的動物實(shí)驗(yàn)都是按照國家衛(wèi)生研究所政策中關(guān)于人文關(guān)懷和使用實(shí)驗(yàn)動物的條例來進(jìn)行的，由美國加州大學(xué)洛杉磯分校的動物研究所進(jìn)行監(jiān)督（OARO協(xié)議2005-143），并注重減小實(shí)驗(yàn)動物的痛苦和折磨。

病毒樣受體的配體和IFNAR抗體的接種

聚肌胞苷酸、咪喹莫特和嘎德莫特是由Invivogen公司提供的。小鼠腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物，使其麻醉，然后使用聚肌胞苷酸（50 μg）、咪喹莫特（50 μg）和嘎德莫特（100 μg）混合于50 μl無菌生理鹽水或生理鹽水，鼻腔內(nèi)給藥。在聚肌胞苷酸給藥第一天注射1.5 mg MAR1-5A3抗體（Leinco Technologies, I-401），小鼠體內(nèi)將產(chǎn)生IFNAR1中和體。緊接著，在第3天及第5天（伴隨肺炎鏈球菌感染）再次注射1.5 mg MAR1-5A3抗體，劑量0.75 mg。以正常小鼠的IgG表達(dá)水平為對照。

細(xì)菌制備和小鼠氣管內(nèi)接種

除非另有注明，否則一株血清型3肺炎鏈球菌（ATCC 6303）將用于所有的實(shí)驗(yàn)研究中。甘油凍存的細(xì)菌在Todd-Hewitt液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%的CO2, 37℃。在培養(yǎng)6小時，細(xì)菌達(dá)到對數(shù)生長期。將細(xì)菌進(jìn)行離心，用無菌PBS將沉淀重懸。通過測定600 nm吸光度預(yù)估細(xì)菌的濃度，其次將細(xì)菌進(jìn)行5倍稀釋后，在瓊脂平板上過夜培養(yǎng)，根據(jù)菌落數(shù)確定細(xì)菌的準(zhǔn)確濃度。

在金黃色葡萄球菌感染實(shí)驗(yàn)中，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌菌株（USA300 /LAC）由Frank DeLeo 博士友情提供。金黃色葡萄球菌置于胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）中，并存儲于37℃的振蕩培養(yǎng)箱（200rpm）中，進(jìn)行過夜培養(yǎng)。隔夜培養(yǎng)的細(xì)菌在經(jīng)1:200稀釋，4個小時傳代培養(yǎng)后，處于中期對數(shù)生長期?？赏ㄟ^測量600 nm的吸光度值預(yù)估細(xì)菌濃度。通過將稀釋的細(xì)菌接種于TSB瓊脂培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)，以此確定原細(xì)菌的CFU值。

采用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物，經(jīng)腹腔注射實(shí)驗(yàn)小鼠，使其處于麻醉狀態(tài)；其次將小鼠的氣管暴露，采用無菌27號針頭注射30 μl的細(xì)菌培養(yǎng)液；最后將其皮膚切口縫合。

CFU值的測定

在預(yù)定的時間點(diǎn)，在小鼠體內(nèi)注射二氧化碳使其安樂死。結(jié)合肝素抗凝劑，收集小鼠右心室的血液，并用PBS進(jìn)行1:2稀釋，并將10 μl血液接種于血瓊脂(用于肺炎鏈球菌培養(yǎng))和胰蛋白酶大豆肉湯瓊脂平板上（用于金黃色葡萄球菌培養(yǎng)），以此來確定血液中細(xì)菌的CFU值。在小鼠肺切除前，將含有5mM EDTA的1mL PBS注入右心室，灌注至肺血管。在預(yù)定的時間點(diǎn)，將整個肺切除且在含有蛋白酶抑制劑混合物（羅氏公司）的1mL PBS中進(jìn)行勻漿。用PBS將勻漿液進(jìn)行1:5稀釋。每種稀釋液中10 μl溶液接種于血瓊脂或TSB瓊脂平板，以確定肺部細(xì)菌的CFU值。

支氣管肺泡灌洗

在預(yù)定的時間點(diǎn)，使動物安樂死。小心剝離實(shí)驗(yàn)動物內(nèi)的肺組織及氣管。將1ml PBS-EDTA通過注入右心室，灌注肺血管。將聚乙烯管插入氣管，每灌入1mL灌洗液，直至灌輸滿10ml（大概80%會回灌）。第一次的支氣管肺泡灌洗液中一部分用于細(xì)菌計算，剩余的支氣管肺泡灌洗液用以細(xì)胞計數(shù)。在支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞離心沉淀，以RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮，在血細(xì)胞計數(shù)器下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。大概有50000-100000的細(xì)胞用于細(xì)胞離心涂片，以比較細(xì)胞間差異。細(xì)胞離心涂片經(jīng)Diff-Quik染色（由Wright-Giemsa改良）；大量的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞采用雙盲法（在每個載玻片的2個獨(dú)立位置數(shù)10個細(xì)胞）計算。

細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

Verikine TM鼠干擾素α酶聯(lián)免疫試劑盒從PBL InterferonSource公司（皮斯卡塔韋，新澤西州）購買。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，利用該試劑盒測定細(xì)胞因子水平。

肺組織取樣

在指定的時間點(diǎn)，收集實(shí)驗(yàn)動物肺組織。1ml 4%的多聚甲醛灌注右心室，灌流至肺血管，加以固定。聚乙烯管插入氣管，將約1ml 4%的多聚甲醛灌入，使肺部膨脹，使其固定；其次將氣管的結(jié)扎。切除整個胸腔，并將其固定，浸泡于多聚甲醛6小時-過夜，然后將其送至美國加州大學(xué)洛杉磯分校轉(zhuǎn)化病理核心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行石蠟包埋、切片和通過蘇木精-伊紅染色法方法染色。切片是由Dr. W.Dean Wallace，一位病理學(xué)教員協(xié)助進(jìn)行的，而他對動物的基因型并不清楚。

統(tǒng)計學(xué)分析

通過對數(shù)秩檢驗(yàn)，我們比較了動物在輻射劑量大小或時間長短下的存活曲線。而對于其他數(shù)據(jù)，通過多重適當(dāng)?shù)谋容^法（雙尾曼-惠特尼U檢驗(yàn)（對于CFU）或單因素方差分析校正法）顯示統(tǒng)計學(xué)分析的重要性。P=0.05或更低的AP值被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有計算均使用了Windows操作系統(tǒng)中的Prism軟件程序進(jìn)行（格拉夫派得軟件公司）。在所有圖表中誤差線表示SEM和重復(fù)數(shù)。

實(shí)施例1

聚肌胞苷酸降低細(xì)菌的清除率

我們首先檢測在細(xì)菌感染后，聚肌胞苷酸給藥對細(xì)菌清除率的影響。實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行持續(xù)兩天（即2次）的聚肌胞苷酸或咪喹莫特鼻腔給藥。在第三天（即最后一次聚肌胞苷酸劑量后的24小時），動物鞘內(nèi)注射肺炎鏈球菌。我們發(fā)現(xiàn)進(jìn)行鼻腔聚肌胞苷酸給藥的動物肺部細(xì)菌量明顯增加。有趣的是，與生理鹽水對照組相比，咪喹莫特或者嘎德莫特（TLR7激動劑，如圖1A）給藥組在細(xì)菌清除方面并沒有明顯的差異。但兩組在初始攻毒階段表現(xiàn)強(qiáng)大的清除率。因此TLR7配體的單獨(dú)給藥不足以降低細(xì)菌的清除率。

其次，我們檢測聚肌胞苷酸是否也降低另一個重要的引起病毒繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎的臨床病原菌（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA））的清除率。與上文類相似，在金黃色葡萄球菌感染24h后，聚肌胞苷酸給藥將減低其清除率（圖1B）。因此，聚肌胞苷酸似乎損害了宿主肺組織對兩種臨床上引起病毒繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎病原菌（肺炎鏈球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）的防御機(jī)制。

實(shí)施例2

聚肌胞苷酸提高了肺組織對細(xì)菌的易感性

其次，我們檢測聚肌胞苷酸是否也降低另一個重要的引起病毒繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎的臨床病原菌（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA））的清除率。與上文類相似，在金黃色葡萄球菌感染24h后，聚肌胞苷酸給藥將減低其清除率（圖1B）。因此，聚肌胞苷酸似乎損害了宿主肺組織對兩種臨床上引起病毒繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎病原菌（肺炎鏈球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）的防御機(jī)制。

實(shí)施例3

聚肌胞苷酸給藥后持續(xù)時間和細(xì)菌感染的風(fēng)險

其次，我們觀察，在聚肌胞苷酸給藥后，動物機(jī)體體內(nèi)的細(xì)菌清除率下降的時間點(diǎn)。由于病毒感染，例如流感，通常需要持續(xù)幾天甚至更久的時間，隨即我們進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，以1劑量或3次劑量服用聚肌胞苷酸來模擬病毒感染的作用。經(jīng)一次或3次聚肌胞苷酸或生理鹽水鼻腔給藥24h后，實(shí)驗(yàn)動物鞘內(nèi)注射肺炎鏈球菌。在48h時，記錄機(jī)體內(nèi)的細(xì)菌量。我們發(fā)現(xiàn)，聚肌胞苷酸的劑量與細(xì)菌的清除率相關(guān)。一次性聚肌胞苷酸給藥的實(shí)驗(yàn)動物機(jī)體內(nèi)的細(xì)菌清除率將呈降低的趨勢（比生理鹽水對照組平均的CFU值高8倍，p=0.05），同時經(jīng)3次聚肌胞苷酸給藥的實(shí)驗(yàn)動物肺部細(xì)菌的CFU較高（如圖2，比生理鹽水組平均的CFU值高13倍，p=0.01）。因此，細(xì)菌清除力的損害程度與聚肌胞苷酸持續(xù)時間成正比。

實(shí)施例4

TLR3和Cardif通路有助于聚肌胞苷酸誘導(dǎo)宿主對細(xì)菌的易感性

由于聚肌胞苷酸同時激活了TLR3和Cardif依賴性解旋酶RIG-I和MDA5，我們試圖確定是否其中一個或者兩個通路都與聚肌胞苷酸損害宿主細(xì)菌清除力相關(guān)。對于此類研究，我們將聚肌胞苷酸用于TLR3（Tlr3-/-）缺失、Cardif(Cardif?/?)缺失以及兩者同時缺失（雙敲除）的實(shí)驗(yàn)動物。在抗病毒反應(yīng)的初期，Cardif 充當(dāng)RIG-I及MDA5信號的銜接分子。我們發(fā)現(xiàn)TLR3（Tlr3-/-）缺失或Cardif(Cardif－/?)的實(shí)驗(yàn)動物在聚肌胞苷酸給藥后，機(jī)體內(nèi)細(xì)菌清除率經(jīng)有所提高。相比于生理鹽水組， 雙敲除(Cardif?/?/Tlr3?/?)組在繼發(fā)性細(xì)菌感染環(huán)境下，進(jìn)行聚肌胞苷酸給藥，機(jī)體內(nèi)細(xì)菌清除率顯著提高（圖3）。然而，既無Tlr3?/?或Cardif?/?缺陷的動物在無聚肌胞苷酸給藥條件下，其肺部肺炎鏈球菌清除率與野生株組相比存在明顯的差異（圖7&8）。因此，動物模型研究性試驗(yàn)顯示，聚肌胞苷酸對細(xì)菌清除率的不利影響與TLR3和Cardif依賴性抗病毒通路活化有關(guān)。

實(shí)施例5

聚肌胞苷酸對于后期細(xì)菌清除力的影響

鑒于在肺炎球菌感染48小時后，聚肌胞苷酸給藥的實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)含有較高的細(xì)菌量，我們希望確定，聚肌胞苷酸是否在后期對細(xì)菌的清除率帶來不利的影響，或聚肌胞苷酸是否只是簡單的延緩了細(xì)菌清除過程。因此我們進(jìn)行每3日聚肌胞苷酸給藥，其次進(jìn)行肺炎鏈球菌的感染，并評估在感染后的第1,3和5天肺部細(xì)菌菌落數(shù)（CFU）。我們發(fā)現(xiàn)直至第5天，生理鹽水對照組的肺部細(xì)菌量低于檢測最小值，趨于健康；而聚肌胞苷酸給藥的動物體內(nèi)細(xì)菌量增加（圖4），趨向于發(fā)病。因此，聚肌胞苷酸對肺部抗菌防御機(jī)制呈長期不利影響。

實(shí)施例6

I型干擾素在介導(dǎo)聚肌胞苷酸作用中的角色

我們之前已證實(shí)：在流感感染期間，已闡述的I型干擾素在宿主病毒感染過程中，可導(dǎo)致肺炎鏈球菌的清除率降低。因此，我們試圖確定，聚肌胞苷酸的負(fù)面作用是否也可以用I型干擾素進(jìn)行解釋。首先，我們將聚肌胞苷酸（50微克）、嘎德莫特（100微克）以及生理鹽水鼻腔給藥三天，并檢測肺部的I型干擾素的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，聚肌胞苷酸（非生理鹽水或嘎德莫特）鼻腔給藥組的肺部IFN-α水平呈現(xiàn)明顯變化（圖5A）。因此，該劑量下的嘎德莫特并不足以引起肺部I型IFN顯著的變化。其次，我們將野生型動物和I型干擾素受體(Ifnar1-/?)缺陷的實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行鼻腔給藥3次；隨后，進(jìn)行肺炎鏈球菌感染；最后，檢測細(xì)菌清除率。我們發(fā)現(xiàn)，(Ifnar?/?)動物能抵抗聚肌胞苷酸的負(fù)面作用，其細(xì)菌清除率有所增加（圖5B）。無一組實(shí)驗(yàn)動物在此時間點(diǎn)出現(xiàn)明顯的菌血癥。因?yàn)橄忍煨匀毕軮FNAR的動物可能會存在微妙的補(bǔ)償機(jī)制，我們使用IFNAR的阻斷抗體進(jìn)行相同的試驗(yàn)。在聚肌胞苷酸給藥后，我們發(fā)現(xiàn)，IFNAR阻斷抗體免疫組與IgG處理組相比可更好的控制肺炎球菌感染(圖5C)。因此，基因缺失還是抗體引起IFNAR阻斷導(dǎo)致I型IFN干擾素信號的消除，此過程可維護(hù)在聚肌胞苷酸給藥下機(jī)體對于細(xì)菌清除作用。野生型和Ifnar動物在無聚肌胞苷酸給藥條件下，機(jī)體細(xì)菌量沒有明顯變化。此暗示：在無病毒配體條件下，I型干擾素通路并不會介導(dǎo)肺部組織對肺炎鏈球菌的清除。

實(shí)施例7

聚肌胞苷酸給藥實(shí)驗(yàn)動物的I型干擾素的檢測

鑒于檢測炎性細(xì)胞反應(yīng)，我們將聚肌胞苷酸給藥3天；其次，將野生型和Ifnar?/?的動物進(jìn)行鞘內(nèi)肺炎鏈球菌感染。在細(xì)菌感染后6h，我們實(shí)行支氣管肺泡灌洗，以檢查炎癥細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)，野生和Ifnar?/?組在6h時的細(xì)菌量存在顯著差異（圖9A）。野生組顯示對數(shù)倍的細(xì)菌量CFU（野生型組平均CFU為51000，Ifnar?/?為740）。引人注意的是，盡管野生組細(xì)菌量較高，但其炎癥反應(yīng)相比Ifnar?/?缺失組處于緩和狀態(tài)。平均來看，兩組細(xì)胞數(shù)相似，即總細(xì)胞數(shù)（野生組1.7*10⁶細(xì)胞，Ifnar?/?組2.0*10⁶細(xì)胞），巨噬細(xì)胞（野生組1.2*10⁶細(xì)胞，Ifnar?/?組21.3*10⁶細(xì)胞）(圖9B及數(shù)據(jù)未顯示) 。盡管相比于野生組，Ifnar?/?動物機(jī)體內(nèi)中性粒細(xì)胞量呈兩倍以上的趨勢（野生組為4.1*10⁵，Ifnar?/?組中性粒細(xì)胞為8.0*10⁵細(xì)胞），但無顯著性差異（圖9C）。因此，在此動物模型中，經(jīng)聚肌胞苷酸給藥的Ifnar動物組在感染6h后的清除能力有所提高。與聚肌胞苷酸給藥野生組相比，聚肌胞苷酸給藥的Ifnar動物組的中性粒細(xì)胞聚集量增加，引起機(jī)體對細(xì)菌清除力增強(qiáng)。

實(shí)施例8

聚肌胞苷酸引起依賴于I型干擾素的繼發(fā)性細(xì)菌感染宿主的死亡率增加

鑒于聚肌胞苷酸可導(dǎo)致細(xì)菌清除率降低，我們希望檢測，I型干擾素的消除是否可提高細(xì)菌感染后宿主生存率。我們將聚肌胞苷酸和生理鹽水鼻腔給藥，持續(xù)給藥3天；其次，將野生型和Ifnar?－/?動物組進(jìn)行肺炎鏈球菌感染（大約為LD50 量）。對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行監(jiān)測，直至它們滿足標(biāo)準(zhǔn)安樂死或其經(jīng)肺炎鏈球菌感染后14天。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)聚肌胞苷酸給藥的野生組實(shí)驗(yàn)動物在肺炎球菌感染后7天內(nèi)死亡率為100%（圖6A）。與之相反，經(jīng)聚肌胞苷酸給藥的Ifnar動物在細(xì)菌感染（p=0.01，聚肌胞苷酸給藥野生組相比Ifnar動物組）14天后，存活率超過60%。肺炎鏈球菌感染下的生理鹽水對照組和Ifnar?/?動物組無明顯差異?？傮w而言，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聚肌胞苷酸誘導(dǎo)了I型干擾素。I型干擾素在抗病毒免疫機(jī)制活化條件下可增加動物機(jī)體對肺炎鏈球菌的易感性。

為了確定宿主死亡機(jī)制，我們在動物進(jìn)行安樂死前檢測肺部及血液的細(xì)菌量。相比于聚肌胞苷酸給藥Ifnar－/?組，聚肌胞苷酸給藥野生組的血液及肺部組織內(nèi)的細(xì)菌量較高。以上結(jié)論暗示，在聚肌胞苷酸的給藥和肺炎鏈球菌感染的條件下，I型干擾素的缺失導(dǎo)致細(xì)菌清除力大不相同（圖6B和6C）。其次，我們檢測聚肌胞苷酸給藥Ifnar組和野生組的肺組織切片。野生組肺組織呈現(xiàn)大面積的固結(jié)和炎性細(xì)胞浸潤，與組織內(nèi)細(xì)菌的增加量一致。而Ifnar?/?組肺組織表現(xiàn)較小面積的炎癥，肺組織大部分正常（圖10）。因此，I型干擾素至少介導(dǎo)聚肌胞苷酸導(dǎo)致機(jī)體在繼發(fā)性細(xì)菌感染后存活率下降的部分機(jī)制，而其主要是通過降低前期和后期機(jī)體細(xì)菌的清除率達(dá)到這一效果。

綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。

上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。