專(zhuān)利名稱(chēng)：包含基于聚肌苷酸-聚胞苷酸的佐劑的免疫原物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大致涉及免疫原組合物和其使用方法。更特定地，本發(fā)明涉及一種免疫原組合物，包含聚核苷酸佐劑以及-或多種抗原物質(zhì)，用以促進(jìn)宿主體內(nèi)的疾病特異性免疫反應(yīng)。

背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)具有產(chǎn)生特異性和非特異性免疫力。非特異性免疫包含多種細(xì)胞及作用機(jī)制，例如巨噬細(xì)胞(macrophages)或顆粒細(xì)胞(granulocytes)的吞噬作用(phagocytosis)以吞噬外來(lái)顆?；蚩乖?，以及天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)活性等。非特異性免疫力依賴(lài)是原來(lái)的免疫機(jī)制，且不會(huì)展現(xiàn)出特異性和記憶性的獲得性特性，該獲得性特性是特異性免疫反應(yīng)的典型特點(diǎn)。特異性和非特異性免疫之間的關(guān)鍵性差異是以B和T細(xì)胞的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)。這些細(xì)胞主要是在被特定抗原所活化后獲得他們的反應(yīng)性，而且在未來(lái)暴露于該特定抗原時(shí)展現(xiàn)出免疫記憶性。因此接種疫苗(涉及免疫特異性和記憶性)是一種保護(hù)機(jī)體以對(duì)抗有害病原體的有效機(jī)制。
一般而言，B和T淋巴細(xì)胞在他們的細(xì)胞表面上有針對(duì)特定抗原的特定受體，產(chǎn)生特異性免疫力。該特異性免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)各抗原以二種方式特異免疫反應(yīng)1)體液免疫反應(yīng)，涉及刺激B細(xì)胞并產(chǎn)生抗體或免疫球蛋白、抗原及輔助T細(xì)胞(主要為T(mén)h2)功能，以及2)細(xì)胞免疫反應(yīng)，一般涉及T細(xì)胞、包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)和其它涉及CTL反應(yīng)的產(chǎn)生的細(xì)胞例如，抗原遞呈細(xì)胞以及Th1細(xì)胞。
為持續(xù)尋求更安全且更有效的疫苗，重組、純化及合成等新技術(shù)已被用以改善抗原的品質(zhì)和特異性。純化、亞單位或合成抗原顯現(xiàn)出安全性增加但免疫原性降低，而此已成為檢定出有效佐劑的一個(gè)驅(qū)動(dòng)力。因此有效佐劑日漸成為現(xiàn)代疫苗的一種必要成份。佐劑通常是化合物，當(dāng)它和抗原共同給予時(shí)(與該抗原相結(jié)合，或在給予該抗原以前給予)會(huì)促進(jìn)和/或改變對(duì)于該特定抗原的免疫反應(yīng)。
常見(jiàn)促進(jìn)免疫反應(yīng)的典型佐劑包括鋁化合物(該佐劑常被通稱(chēng)為鋁佐劑″Alum″)、水包油乳劑(完全弗氏佐劑CFA是一種水包油乳劑，含有經(jīng)干燥和熱殺滅的結(jié)核桿菌)、皂甙(從皂質(zhì)樹(shù)Quillaja Saponoria皮分離而來(lái)，該佐劑活性成份被稱(chēng)為Quile A)、CpG ODN(合成寡聚脫氧核苷酸，含有去甲基化的CpG二核苷酸)、從明尼蘇達(dá)Re595沙氏桿菌(Salmonella minnesota Re595)的脂多糖衍生而來(lái)的單磷酰脂A(MPL)、脂質(zhì)體(通常由如磷脂等可生物降解性材料制成)以及可生物降解性聚合微球體(由如聚膦腈(polyphosphazene)和聚酐等多種聚合物制成)。這些化合物的佐劑性質(zhì)已經(jīng)過(guò)評(píng)估各有優(yōu)缺點(diǎn)。
聚核苷酸復(fù)合物已在試驗(yàn)用作佐劑等多種用途上。雙鏈RNAs(dsRNAs)是非常有效的生物修飾因子，可在納摩爾濃度下對(duì)細(xì)胞引起明顯作用。dsRNA的調(diào)控效應(yīng)包括在分子和細(xì)胞水平上廣泛的作用。
在分子水平上，dsRNAs可誘導(dǎo)如干擾素(interferon)的合成、蛋白質(zhì)激酶的產(chǎn)生、增進(jìn)組織兼容性抗原以及抑制代謝作用等生物效應(yīng)。在細(xì)胞水平上，dsRNA可激發(fā)如熱原性(pyrogenicity)、細(xì)胞分裂(mitogenicity)、巨噬細(xì)胞活化、活化體液免疫、活化細(xì)胞免疫以及引發(fā)抗病毒等生物效應(yīng)。dsRNAs的免疫調(diào)控效應(yīng)已被揭露于美國(guó)專(zhuān)利第4,124,702號(hào)，其提出dsRNAs在活的動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生。美國(guó)專(zhuān)利第3,906,092號(hào)提出含有聚核苷酸或聚核苷酸復(fù)合物的疫苗增強(qiáng)佐劑型疫苗抗體反應(yīng)。Houston等人建立PICLC(聚肌苷酸聚胞苷酸poly-L-離胺酸羧基-甲基纖維素復(fù)合物)作一種有效的佐劑，藉此增加初級(jí)抗體反應(yīng)而無(wú)需其它佐劑的輔助。
作為被研究最多的聚核苷酸復(fù)合物中的一種，聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)在用于猴和人體時(shí)并不有效，這是因?yàn)镻IC在進(jìn)入體內(nèi)后不穩(wěn)定。因此許多方式用來(lái)改進(jìn)PIC的不足，例如，由PIC與poly-L-賴(lài)氨酸氫溴酸鹽復(fù)合物對(duì)于胰核糖核酸酶水解的抵抗性較原PIC高約5至15倍。
Lin等人敘述，一種包含聚肌苷酸-聚胞苷酸、卡那霉素和鈣離子的抗病毒藥物可用作一種佐劑(參見(jiàn)Lin，et al.，A new immunostimulatory complex(PICKCa)inexperimental rabiesantiviral and adjuvant effects，Arch Virol，131307-19，1993；以及中國(guó)專(zhuān)利93105862.7號(hào))。中國(guó)專(zhuān)利第93105862.7號(hào)提供由PIC、卡那霉素和鈣離子所構(gòu)成的復(fù)合物(簡(jiǎn)稱(chēng)PICKCa)在人和哺乳動(dòng)物作為疫苗佐劑用途。但是，Lin發(fā)現(xiàn)該種原先發(fā)現(xiàn)的PICKCa型作為佐劑時(shí)不能提供最佳的有效性/安全性狀態(tài)，且在某些情況下會(huì)引起令人無(wú)法接受的不良副作用。
本發(fā)明提供具有改善有效性和安全性狀態(tài)的新穎免疫原組合物，以及使用該等組合物的方法。本發(fā)明免疫原組合物包含聚核苷酸佐劑和抗原。
文獻(xiàn)
相關(guān)參考資料列示于下
JP 1093540A2；
美國(guó)專(zhuān)利第4,124,702號(hào)
美國(guó)專(zhuān)利第3,692,899號(hào)
美國(guó)專(zhuān)利第3,906,092號(hào)
美國(guó)專(zhuān)利第4,389,395號(hào)
美國(guó)專(zhuān)利第4,349,538號(hào)
美國(guó)專(zhuān)利第4,024,241號(hào)
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美國(guó)專(zhuān)利第4,323,559號(hào)
美國(guó)專(zhuān)利第4,327,085號(hào)
美國(guó)專(zhuān)利第4,185,089號(hào)
美國(guó)專(zhuān)利第4,082,736號(hào)
美國(guó)專(zhuān)利第4,369,178號(hào)
美國(guó)專(zhuān)利第4,314,998號(hào)
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發(fā)明內(nèi)容
總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及新穎的免疫原組合物，其包含聚核苷酸佐劑和免疫原性或抗原性物質(zhì)，以及用以促進(jìn)免疫反應(yīng)的方法。
因此，本發(fā)明提供一種免疫原組合物。該組合物包含(a)聚核苷酸佐劑，該佐劑包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、至少一種抗生素以及至少一個(gè)正價(jià)離子；以及(b)至少一種抗原；其中該組合物被配制成供持續(xù)釋放給予形式。
依據(jù)本發(fā)明的免疫原組合物可包含聚核苷酸佐劑組合物，該聚核苷酸佐劑組合物中的分子在分子量上是異質(zhì)的，其中該分子量為至少66,000道爾頓。



圖1-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生干擾素-γ的小鼠脾細(xì)胞； 圖2-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生IL-2的小鼠脾細(xì)胞； 圖3-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)被小鼠脾細(xì)胞所產(chǎn)生的IL-4； 圖4-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清(稀釋400倍)的特異性IgG效價(jià)； 圖5-以含有PIKA和/或滅活裂解型流感抗原(inactivated split influenzaantigen)的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生干擾素-γ的小鼠脾細(xì)胞； 圖6-以含有PIKA和/或滅活裂解型流感抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生IL-2的小鼠脾細(xì)胞； 圖7-以含有PIKA和/或滅活裂解型流感抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生IL-4的小鼠脾細(xì)胞； 圖8-以含有PIKA和/或滅活裂解型流感抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清(稀釋900倍)的特異性IgG效價(jià)； 圖9-以含有PIKA和/或HIV gp120抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生干擾素-γ的小鼠脾細(xì)胞； 圖10-以含有PIKA和/或HIV gp120抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生IL-2的小鼠脾細(xì)胞； 圖11-以含有PIKA和/或HIV gp120抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生IL-4的小鼠脾細(xì)胞； 圖12-以含有PIKA和/或HIV gp120抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用FACS法來(lái)分析小鼠脾細(xì)胞，圖中顯示表達(dá)干擾素-γ的CD4+細(xì)胞百分率； 圖13-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生干擾素-γ的小鼠脾細(xì)胞； 圖14-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生IL-2的小鼠脾細(xì)胞； 圖15-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生IL-4的小鼠脾細(xì)胞； 圖16-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用FACS法來(lái)分析小鼠脾細(xì)胞，圖中顯示表達(dá)干擾素-γ的CD4+細(xì)胞百分率； 圖17-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清(稀釋400倍)的特異性IgG效價(jià)； 圖18-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗進(jìn)行免疫16周之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特異性IgG效價(jià)； 圖19-以含有PIKA和/或HSV 2gD抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生干擾素-γ的小鼠脾細(xì)胞； 圖20-以含有PIKA和/或HSV 2gD抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生IL-2的小鼠脾細(xì)胞； 圖21-以含有PIKA和/或HSV 2gD抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生IL-4的小鼠脾細(xì)胞； 圖22-以含有PIKA和/或HSV 2gD抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用FACS法來(lái)分析小鼠脾細(xì)胞，圖中顯示表達(dá)干擾素-γ的CD4+細(xì)胞百分率； 圖23-以含有PIKA和/或HSV 2gD抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清(稀釋2,700倍)的特異性IgG效價(jià)； 圖24-以含有PIKA和/或滅活H5N1抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生干擾素-γ的小鼠脾細(xì)胞； 圖25-以含有PIKA和/或滅活H5N1抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生IL-2的小鼠脾細(xì)胞； 圖26-以含有PIKA和/或滅活H5N1抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生IL-4的小鼠脾細(xì)胞； 圖27-以含有PIKA和/或滅活H5N1抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用FACS法來(lái)分析小鼠脾細(xì)胞，圖中顯示表達(dá)干擾素-γ的CD4+細(xì)胞百分率； 圖28-以含有PIKA和/或滅活H5N1抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清(稀釋900倍)的特異性IgG效價(jià)； 圖29-以含有PIKA和/或全部滅活SARS抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清(稀釋16,000倍)的特異性IgG效價(jià)； 圖30-以含有PIKA和/或滅活H5N1抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于雞血清的特異性抗體H5的效價(jià)； 圖31-以含有PIKA和/或滅活H5N1抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于雞血清的特異性抗體H9的效價(jià)； 圖32-暴露于野生型狂犬病毒后再接受狂犬病疫苗治療的小鼠的存活率； 圖33-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特異性抗體效價(jià)； 圖34-以含有PIKA和/或滅活裂解型流感抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特異性抗體效價(jià)； 圖35-以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特異性IgG1效價(jià)； 圖36-以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特異性IgG2a效價(jià)； 圖37-以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生干擾素-γ的小鼠脾細(xì)胞； 圖38-以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗進(jìn)行免疫之后，以2ug/ml的IPQ肽再刺激6天，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生干擾素-γ的小鼠脾細(xì)胞； 表1提供一個(gè)可作為抗原來(lái)源的典型病毒病原體以及與這些機(jī)體相關(guān)的疾病的列表。
表2提供一個(gè)可作為抗原來(lái)源的典型細(xì)菌病原體以及與這些機(jī)體相關(guān)的疾病的列表。
表3提供一個(gè)可作為抗原來(lái)源的典型真菌病原體以及與這些機(jī)體相關(guān)的疾病的列表。
表4提供一個(gè)可作為抗原來(lái)源的典型寄生蟲(chóng)以及與這些機(jī)體相關(guān)的疾病的列表。
表5提供一個(gè)可作為抗原來(lái)源的典型癌腫(例如以組織種類(lèi)來(lái)分類(lèi))的列表。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明可通過(guò)后續(xù)對(duì)于本發(fā)明一些實(shí)施方案描述以及其中所包括的實(shí)施例的詳細(xì)內(nèi)容而更容易被了解。
本申請(qǐng)?jiān)谡獌?nèi)容中參照公開(kāi)文獻(xiàn)，這些公開(kāi)文獻(xiàn)的內(nèi)容被并入本申請(qǐng)中作為參考，以充分地?cái)⑹霰景l(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的水準(zhǔn)。
在進(jìn)一步敘述本發(fā)明之前，應(yīng)明了本發(fā)明不會(huì)被局限于所述特定實(shí)施方案中，因?yàn)檫@些實(shí)施方案必然是多樣的。亦應(yīng)明了本說(shuō)明書(shū)中所使用的用語(yǔ)僅是為了闡述特定實(shí)施方案，而非作為限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將會(huì)被僅僅界定在所附的權(quán)利要求中。
除非另行界定，本說(shuō)明書(shū)中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)用語(yǔ)均和本案所屬技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)人員所普遍明了的意義相同?，F(xiàn)在就實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方法和材料加以敘述，但是和本說(shuō)明書(shū)中所述方法和材料類(lèi)似或等效的任何方法和材料均可用以實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明。本說(shuō)明書(shū)中所提到的所有公開(kāi)文獻(xiàn)均被并入于此作為參考，以揭示并說(shuō)明所述公開(kāi)文獻(xiàn)中的方法和/或材料。
應(yīng)注意，如本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中所使用的用語(yǔ)，除非前后文意指明另有其它意義，否則單數(shù)形用語(yǔ)“a”、“and”和“the”包括復(fù)數(shù)形用語(yǔ)。因此，例如提及“免疫原組合物”即包括該組合物的的復(fù)數(shù)形式，提及“該抗原”即包括提及一或多個(gè)抗原以及熟習(xí)于本領(lǐng)域技術(shù)人士所知悉的等效體等等。此外應(yīng)注意，權(quán)利要求可被撰寫(xiě)成排除任何可選擇性成分。因此，此一說(shuō)明是要作為使用例如“僅有(solely)”、“只有(only)”等排除性用語(yǔ)于權(quán)利要求構(gòu)成要件的相關(guān)載述內(nèi)容時(shí)或是使用“負(fù)向”限制(“negative”limitation)時(shí)的前述基礎(chǔ)(antecedent basis)。
名詞定義 在陳述本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容之前，應(yīng)當(dāng)了解被使用于本說(shuō)明書(shū)中的數(shù)個(gè)用語(yǔ)。
使用于此處的“佐劑”此用語(yǔ)是指增加或改變宿主對(duì)于抗原化合物的免疫反應(yīng)的任何物質(zhì)或物質(zhì)混合物。特定地說(shuō) 1.“PICKCa”此用語(yǔ)是一般性地指稱(chēng)由PIC卡那霉素和鈣所構(gòu)成的組合物，而和組合物的特定物理和免疫原性無(wú)關(guān)。
2.“Av-PICKCa”是指PICKCa在商業(yè)上被使用作為抗病毒藥劑的形式。
3.“PIKA”是指本發(fā)明組合物，包含PIC、抗生素(例如卡那霉素)以及陽(yáng)離子(例如鈣)，其中所述PIKA的特征在于物理特性(例如本說(shuō)明書(shū)中所敘述的分子量、尺寸等)，以使得PIKA在給予后可展現(xiàn)出一個(gè)佐劑的特性，且具有相較于以PICKCa為例更低的副作用(例如毒性降低)以及相較于以Av-PICKCa為例更高的效力強(qiáng)度(例如促進(jìn)增強(qiáng)的免疫反應(yīng))。
“聚I:C”或“PIC”等用語(yǔ)是指含有聚核糖肌苷和聚核糖胞苷核酸的組合物，亦分別稱(chēng)作為聚肌苷酸-聚胞苷酸。
“含PIC分子”或“含PIC化合物”是非限制性地指稱(chēng)PIC，它可選擇性地通過(guò)復(fù)合或組合所述含PIC分子的組合物中的抗生素(例如卡那霉素)以及陽(yáng)離子(例如鈣)中的至少一者或二者。在一實(shí)施方案中，在復(fù)合物中該含PIC分子不包含聚-L-賴(lài)氨酸或其衍生物。
在本發(fā)明佐劑組合物的前后文中所使用的“異質(zhì)”此用語(yǔ)是指該組合物的成份(例如含PIC分子)在分子量、尺寸或此二者的物理特性上不是均一的。當(dāng)組合物被描述成對(duì)于給定物理特性呈異質(zhì)，且進(jìn)一步通過(guò)該物理特性的數(shù)值范圍來(lái)描述時(shí)，即是將該組合物敘述成實(shí)質(zhì)上包含以具有分布在所述范圍內(nèi)的物理特性為特征的分子。雖然該組合物可能不會(huì)含有代表所述范圍的下及上限內(nèi)的每一物理特性數(shù)值的分子，但該組合物通常會(huì)包含至少一個(gè)具有該上限數(shù)值或下限數(shù)值物理特性的分子。在某些實(shí)施方案中，該組合物可包含位于用以描述該組合物的所述物理特性范圍以外的分子。這些在組合物中位于所定范圍以外的分子不會(huì)實(shí)質(zhì)影響該組合物的基本的和新穎的特性。
“個(gè)體”此用語(yǔ)在此和“宿主”、“主體”和“動(dòng)物”互換使用，包括人類(lèi)及所有畜養(yǎng)(如家畜和寵物)和野生的動(dòng)物及禽鳥(niǎo)，其非限制性地包括牛、馬、乳牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、兔、鹿、貂、雞、鴨、鵝、火雞、斗雞等。
“抗體”此用語(yǔ)包括多克隆抗體及單克隆抗體以及這些抗體的抗原化合物結(jié)合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv片段，以及這些抗體和片段的單鏈衍生物。此外，“抗體”此用語(yǔ)包括天然發(fā)生的抗體以及非天然發(fā)生的抗體，包括例如嵌合型(chimeric)、雙功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗體，以及相關(guān)的合成異構(gòu)形式(isoforms)?！翱贵w”此用語(yǔ)可和“免疫球蛋白”互換使用。
如本說(shuō)明書(shū)中所使用，“抗原化合物”此用語(yǔ)是指可在適當(dāng)情形下被免疫系統(tǒng)所辨識(shí)(例如結(jié)合至抗體或被加工，以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng))的任何物質(zhì)。
如本說(shuō)明書(shū)中所使用，“抗原”包括但不限于細(xì)胞、細(xì)胞提取物、蛋白質(zhì)、脂蛋白、糖蛋白、核蛋白、多肽、肽、多糖、多糖綴合物、多糖的肽仿真體、脂肪、糖脂質(zhì)、糖類(lèi)、病毒、病毒提取物、細(xì)菌、細(xì)菌提取物、真菌、真菌提取物、多細(xì)胞生物例如寄生蟲(chóng)、以及過(guò)敏原?？乖蔀橥庠葱?例如來(lái)自于被給予該抗原的個(gè)體以外的其它來(lái)源，例如來(lái)自于一個(gè)不同的物種)或是內(nèi)源性(例如源自于宿主體內(nèi)，例如身體的疾病因子、癌抗原、病毒感染細(xì)胞所產(chǎn)生的抗原等等)?？乖梢允翘烊恍?例如天然產(chǎn)生的)、合成型或重組型?？乖?xì)胞提取物、完整細(xì)胞和純化抗原，其中“純化”此用語(yǔ)是指該抗原呈現(xiàn)相較于抗原通常存在的環(huán)境和/或相較于粗提物(例如抗原的培養(yǎng)形式)更為豐富的形式。
本說(shuō)明書(shū)中所使用的“免疫原組合物”此用語(yǔ)是指由二或更多種物質(zhì)(例如抗原和佐劑)所構(gòu)成的組合，當(dāng)將這些物質(zhì)給予宿主時(shí)會(huì)共同激發(fā)免疫反應(yīng)。
“多肽”、“肽”“寡肽”和“蛋白”等用語(yǔ)在本說(shuō)明書(shū)中可互換使用，它們的意思是任何長(zhǎng)度氨基酸聚合物形式，該聚合物形式可包括編碼和非編碼性氨基酸、經(jīng)化學(xué)或生化修飾或衍生的氨基酸以及具有修飾肽主鏈的多肽。
“抗原化合物有效量”是指抗原化合物的用量將會(huì)致使個(gè)體產(chǎn)生針對(duì)該抗原化合物的特異性免疫反應(yīng)，該抗原化合物可選擇性地和佐劑組合。
“免疫反應(yīng)”此用語(yǔ)是指脊椎動(dòng)物個(gè)體的免疫系統(tǒng)對(duì)于抗原性或免疫原性化合物的任何反應(yīng)。典型的免疫反應(yīng)包括但不限于局部及系統(tǒng)性細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)，例如包括CD8+CTLs的抗原特異性誘導(dǎo)作用在內(nèi)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)、包括T-細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子釋出作用在內(nèi)的輔助T-細(xì)胞反應(yīng)，以及包括抗體反應(yīng)在內(nèi)的B-細(xì)胞免疫反應(yīng)。
本說(shuō)明書(shū)所使用的“誘導(dǎo)免疫反應(yīng)”此用語(yǔ)是一般性地包含免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)(induction and/or potentiation)。
“誘導(dǎo)免疫反應(yīng)”此用語(yǔ)是指刺激、起始或誘導(dǎo)一個(gè)免疫反應(yīng)。
“增強(qiáng)(potentiating)免疫反應(yīng)”是指一個(gè)既存的免疫反應(yīng)被改善、助長(zhǎng)、補(bǔ)充、擴(kuò)增、促進(jìn)、增加或延長(zhǎng)。
“增強(qiáng)免疫反應(yīng)”此表達(dá)方式或類(lèi)似表達(dá)方式的意思是，相較于先前的免疫反應(yīng)狀態(tài)，免疫反應(yīng)被提高、改善或上升，而對(duì)宿主有利，所述先前的免疫反應(yīng)狀態(tài)例如給予本發(fā)明的免疫原組合物之前的免疫反應(yīng)狀態(tài)。
“體液免疫力(humoral immunity)”和“體液免疫反應(yīng)(humoral immuneresponse)”等用語(yǔ)是指因應(yīng)抗原刺激而產(chǎn)生抗體分子的免疫形式。
“細(xì)胞免疫(cell-mediated immunity)”和“細(xì)胞免疫反應(yīng)(cell-mediated immuneresponse)”等用語(yǔ)是指淋巴細(xì)胞所提供的免疫防御力，例如T淋巴細(xì)胞在靠近受害細(xì)胞時(shí)所提供的防御力。細(xì)胞免疫反應(yīng)通常包括淋巴細(xì)胞的增殖。當(dāng)測(cè)量“淋巴細(xì)胞的增殖”時(shí)，會(huì)測(cè)量淋巴細(xì)胞因應(yīng)特定抗原的增殖能力。淋巴細(xì)胞增殖是指B細(xì)胞、T-輔助細(xì)胞或細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)的細(xì)胞增殖。
“免疫原量”此用語(yǔ)是指，相較于沒(méi)有聚核苷酸佐劑時(shí)抗原所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，當(dāng)與本發(fā)明的免疫原組合物共同給予時(shí)足以刺激免疫反應(yīng)的抗原用量。
“免疫增效量(immunopotentiating amount)”此用語(yǔ)是指，相較于沒(méi)有聚核苷酸佐劑時(shí)所觀察到的抗體效價(jià)和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)水平，當(dāng)佐劑和在本發(fā)明組合物中的抗原化合物共同給予時(shí)，致使抗體效價(jià)和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)增加所需的佐劑量。
本說(shuō)明書(shū)中所使用的“治療”此用語(yǔ)是一般性地指稱(chēng)獲得所需藥理和/或生理效應(yīng)。該效應(yīng)從完全地和/或部分地防止疾病或其癥狀的角度來(lái)看可以是屬于預(yù)防性質(zhì)的，和/或該效應(yīng)從完全地和/或部分地穩(wěn)定或治愈疾病和/或疾病所導(dǎo)致的負(fù)面效果來(lái)看可以是屬于醫(yī)療性質(zhì)的。本說(shuō)明書(shū)中所使用的“治療”此用語(yǔ)涵蓋對(duì)于個(gè)體(特別是哺乳動(dòng)物個(gè)體，更特別是人類(lèi))體內(nèi)的疾病的任何處理，且包括(a)預(yù)防可能有罹病傾向但尚未診斷出罹病的個(gè)體發(fā)生疾病或癥狀；(b)遏制疾病癥狀，例如阻止該疾病癥狀的發(fā)展；或是舒緩疾病癥狀，例如致使該疾病或癥狀消退；(c)降低疾病傳染物質(zhì)所產(chǎn)生的產(chǎn)物水平(例如毒素、抗原等)；(d)降低對(duì)于疾病傳染物質(zhì)的不利生理反應(yīng)(例如發(fā)燒、組織水腫等)。
如本說(shuō)明書(shū)中所使用，“混合”此用語(yǔ)包括用以組合組合物的成份的任何方法；這些方法包括但不限于摻合、分配、溶解、乳化、凝集、懸浮或?qū)⒔M合物的組成份合理地加以組合的其它方法。
“藥學(xué)上可接受的鹽”的化學(xué)物意指該鹽是藥用上可接受的，且擁有母化合物的所需藥理活性。這些鹽包括(1)合成鹽的酸，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等無(wú)機(jī)酸共同形成鹽；或是和例如乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊丙酸、羥乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、馬來(lái)酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯?；?苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、葡庚糖酸、4，4′-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、三級(jí)丁基乳酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、粘康酸等有機(jī)酸等共同形成鹽；或是(2)當(dāng)母化合物中所存在的酸性質(zhì)子被如堿金族金屬離子、堿土族金屬離子或鋁離子等金屬離子所置換，或是配位有如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇(tromethamine)、甲基葡萄糖胺(N-methylglucamine)等有機(jī)堿時(shí)，所形成的鹽。
本說(shuō)明書(shū)中所使用的”單位劑型”此用語(yǔ)是指數(shù)個(gè)在實(shí)體上呈分離的單位，適合作為使用于人類(lèi)和動(dòng)物個(gè)體的單位劑量，各個(gè)單位含有一預(yù)定量的本發(fā)明化合物，該預(yù)定量經(jīng)計(jì)算后呈現(xiàn)一個(gè)足以和藥學(xué)/藥理上可接受的稀釋劑、載劑或載體共同產(chǎn)生所需效應(yīng)的用量。
本發(fā)明的例示性實(shí)施方案 本發(fā)明涉及用在人類(lèi)、非人類(lèi)動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物中引起和/或促進(jìn)免疫反應(yīng)的免疫原組合物和方法，該免疫反應(yīng)可為體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)。一般而言，本發(fā)明免疫原組合物包含抗原(“抗原組合物”)和佐劑。該佐劑的存在會(huì)促進(jìn)或改變對(duì)于該抗原的免疫反應(yīng)。該佐劑可通過(guò)影響免疫球蛋白、趨化因子和/或細(xì)胞因素的亞型(異構(gòu)型)的產(chǎn)生而改變免疫反應(yīng)的品質(zhì)。結(jié)果先天性免疫力、體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)因該佐劑的存在而更加有效。
一個(gè)特別的優(yōu)點(diǎn)在于PIKA佐劑和抗原物質(zhì)相組合可有效地引起特異體液免疫反應(yīng)，從而增進(jìn)保護(hù)性免疫力。
另一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)在于PIKA佐劑和抗原物質(zhì)相組合可引起特異細(xì)胞免疫反應(yīng)，而該特異細(xì)胞免疫反應(yīng)是治療用疫苗在限制和治療細(xì)胞內(nèi)病毒、細(xì)菌和病原感染時(shí)以及臨床疾病治療(例如治療癌癥或自體免疫疾病)時(shí)所需要的。
因此，本發(fā)明包括組合物，這些組合物具有特殊的產(chǎn)物特性，使這些組合物特別適合使用作為疫苗，以給予動(dòng)物和/或人類(lèi)，以因應(yīng)對(duì)于誘導(dǎo)有益免疫反應(yīng)之安全佐劑的需求。
因此，本發(fā)明提供可安全地使用于人類(lèi)和動(dòng)物的佐劑和免疫原組合物。
因此，本發(fā)明提供一種免疫原組合物，包含(a)聚核苷酸佐劑，該佐劑包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、至少一種抗生素以及至少一個(gè)正價(jià)離子；以及(b)至少一個(gè)抗原；其中該組合物被配制成供持續(xù)釋放給予之用。
依據(jù)本發(fā)明的免疫原組合物可包含聚核苷酸佐劑組合物，該組合物中的分子在分子量上是異質(zhì)的，其中該分子量為至少66,000道爾頓。66,000道爾頓的數(shù)值相當(dāng)于約6.4S沉降系數(shù)單位(Svedbergs)的分子尺寸。因此，66,000至1,200,000道爾頓的分子量范圍相當(dāng)于約6.4至24.0沉降系數(shù)單位的分子尺寸。
在一些實(shí)施方案中，PIKA佐劑組合物包含聚核苷酸、一種抗生素以及一個(gè)正價(jià)離子，其中該聚核苷酸可為聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)；該抗生素可為卡那霉素，以及該離子可以是鈣。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種用以增進(jìn)抗原化合物的抗原性的免疫原組合物，包含可誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的聚核苷酸佐劑組合物。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種用以增進(jìn)抗原化合物的抗原性的免疫原組合物，包含可誘導(dǎo)抗原特異性體液免疫反應(yīng)的聚核苷酸佐劑組合物。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供用以增進(jìn)抗原化合物之抗原性的免疫原組合物，包含可誘導(dǎo)特定細(xì)胞和體液合并免疫反應(yīng)的聚核苷酸佐劑組合物。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供佐劑組合物或含有佐劑組合物的免疫原組合物，其中該佐劑組合物或該免疫原組合物被冷凍干燥。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供聚核苷酸佐劑組合物在制備一用以誘導(dǎo)宿主免疫原反應(yīng)的藥劑上的用途。
聚核苷酸佐劑 本發(fā)明免疫原組合物具有含PIC聚核苷酸佐劑(例如PIKA組合物)通常包含聚肌苷酸、聚胞苷酸、一種抗生素(例如卡那霉素)，以及二價(jià)離子(例如鈣)。請(qǐng)明了，本說(shuō)明書(shū)以PIKA作為這種含PIC佐劑的范例。
相關(guān)含PIC佐劑可利用在本領(lǐng)域中可得的方法來(lái)制造。含PIC佐劑組合物可通過(guò)任何適當(dāng)方法所制造。例如，聚核苷酸佐劑組合物可通過(guò)在具有pH6至pH8的pH值的氯化鈉/磷酸鹽緩沖液內(nèi)，將聚肌苷酸、聚胞苷酸、種抗生素和正價(jià)離子來(lái)源加以混合而制成。聚肌苷酸和聚胞苷酸的濃度通常為0.1至10mg/ml，通常為0.5至5mg/ml且更常為0.5to 2.5mg/ml。增色值(hyperchromicity value)應(yīng)高于10％、高于15％、高于20％或高于50％。PIC的制備以及和抗生素(如卡那霉素)和正價(jià)離子(如鈣)的組合通常是在符合于國(guó)際優(yōu)良制程規(guī)范(GoodManufacturing Process)的品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該佐劑的抗生素組份是卡那霉素。當(dāng)該抗生素是卡那霉素時(shí)，在一些實(shí)施方案中，聚核苷酸佐劑組合物內(nèi)的卡那霉素可和一或多種抗生素共同使用或被一或多種抗生素所取代，這些抗生素選自于包括泰百霉素、蒽環(huán)霉素、丁苷菌素硫酸鹽、慶大霉素、潮霉素、艾米康絲菌素、雙去氧卡那霉素、暗霉素、美它酰胺、新霉素、嘌呤霉素、鏈霉素和鏈脲霉素所構(gòu)成的群組中。本發(fā)明聚核苷酸佐劑組合物內(nèi)的抗生素(例如卡那霉素等)的濃度通常為約10單位/ml至100,000單位/ml，約100單位/ml至10,000單位/ml，或約500單位/ml至5,000單位/ml。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該聚核苷酸佐劑組合物更包含正價(jià)離子(陽(yáng)離子)，通常是二價(jià)正價(jià)離子，且通常是堿金族金屬的陽(yáng)離子。在本發(fā)明的組合物內(nèi)，該正價(jià)離子一般被用作為正價(jià)離子的來(lái)源，例如鹽或復(fù)合物，例如一種有機(jī)或無(wú)機(jī)鹽或復(fù)合物，且通常是無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)復(fù)合物。典型的正價(jià)離子包括但不必然限于鈣、鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅。
該正價(jià)離子可以呈任何適當(dāng)?shù)柠}或有機(jī)復(fù)合物的形式，包括但不必然限于氯化物、氟化物、氫氧化物、磷酸鹽或硫酸鹽。例如，當(dāng)該正價(jià)離子是鈣時(shí)，則該離子可呈碳酸鈣、氯化鈣、氟化鈣、氫氧化鈣、磷酸鈣或硫酸鈣的形式。
本發(fā)明的組合物內(nèi)可配有正價(jià)離子(例如鈣)，該正價(jià)離子的濃度位在約10umol至10mmol/ml的范圍內(nèi)，通常為約50umol至5mmol/ml，且更常為約100umol至1mmol/ml。本說(shuō)明書(shū)中所使用的”umol”此用語(yǔ)意指微摩爾。
當(dāng)本發(fā)明佐劑組合物中的正價(jià)離子是鈣時(shí)，則它可和其它正價(jià)離子相組合或被其它正價(jià)離子所取代，這些正價(jià)離子包括鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅，其中這些離子可呈無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)復(fù)合物的形式。
所得的組合物是含PIC佐劑組合物，其另含有抗生素和正價(jià)離子。在一特定實(shí)施方案中，當(dāng)該抗生素是卡那霉素及該正價(jià)離子是鈣時(shí)，該產(chǎn)品可稱(chēng)為PICKCa。在相關(guān)實(shí)施方案中，PICKCa組合物可無(wú)限制地含有不同物理特性的分子。
PIKA佐劑組合物 在特定的例示性實(shí)施方案中，該含PIC佐劑是PIKA。PIKA可通過(guò)多種方式來(lái)制得，以從PICKCa來(lái)制得特別有利。PIKA可通過(guò)涉及分離和/或濃縮具有所界定分子尺寸和/或分子量之分子的額外制程，而從PICKCa制得。利用過(guò)濾、層析、熱處理、離心分離、電泳和類(lèi)似方法來(lái)分離和濃縮具有特定特性的聚核苷酸分子均為標(biāo)準(zhǔn)制備方法，且為熟習(xí)于本領(lǐng)域技術(shù)人士所知悉。
在特別相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的特點(diǎn)是被通稱(chēng)為PIKA的佐劑，其包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、抗生素(例如卡那霉素)以及正價(jià)離子(例如鈣離子)，其中該組合物含有在分子量上為異質(zhì)的佐劑分子，該分子的分子量為約66,000至1,200,000道爾頓。也就是說(shuō)，該佐劑組合物包含重量分布于約66,000至1,200,000道爾頓的范圍內(nèi)的分子。
在相關(guān)實(shí)施方案中，該組合物中的PIKA聚核苷酸佐劑組合物分子是異質(zhì)的，也就是說(shuō)這些佐劑分子的重量分布在分子量范圍內(nèi)，其中該分子量為約300,000至1,200,000道爾頓，或是約66,000至660,000道爾頓，或是約300,000至660,000道爾頓，或是約300,000至2,000,000道爾頓，或是約66,000至約100,000道爾頓，100,000至200,000道爾頓，或是約300,000至約4,000,000道爾頓，或是約500,000至1,000,000道爾頓，或是約1,000,000至1,500,000道爾頓，或是約1,500,000至2,000,000道爾頓，或是約2,000,000至2,500,000道爾頓，或是約2,500,000至3,000,000道爾頓，或是約3,000,000至3,500,000道爾頓，或是約3,500,000至4,000,000道爾頓，或是約4,000,000至4,500,000道爾頓，或是約4,500,000至5,000,000道爾頓。
在相關(guān)實(shí)施方案中，該組合物中的PIKA聚核苷酸佐劑組合物分子具有平均分子量，該平均分子量等于或高于66,000道爾頓，或是等于或高于150,000道爾頓，或是等于或高于250,000道爾頓，或是等于或高于350,000道爾頓，或是等于或高于500,000道爾頓，或是等于或高于650,000道爾頓，或是等于或高于750,000道爾頓，或是等于或高于1,000,000道爾頓，或是等于或高于1,200,000道爾頓，或是等于或高于1,500,000道爾頓，或是等于或高于2,000,000道爾頓。
在特別相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種被通稱(chēng)為PIKA的聚核苷酸佐劑，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、抗生素以及正價(jià)離子，其中該組合物含有在分子尺寸上呈異質(zhì)的佐劑分子，也就是說(shuō)這些佐劑分子的尺寸分布在一個(gè)分子尺寸范圍內(nèi)，這些佐劑分子的沉降系數(shù)單位(Svedbergs)為約6.43S至24.03S。
在相關(guān)實(shí)施方案中，該組合物中的PIKA聚核苷酸佐劑組合物分子是異質(zhì)的，也就是說(shuō)這些佐劑分子的尺寸分布在一個(gè)分子尺寸范圍內(nèi)，其中該分子尺寸為約12.8S至24.03S，或是約3至12S，或是約6.43至18.31S，或是約12.8至18.31S，或是約12.8S至30.31S，或是約12.8S至41.54S，或是約13.5S至18.31S，或是約13.5S至24.03S，或是約16.14至22.12S，或是約22.12S至26.6S，或是約26.6S至30.31S，或是約30.31S至33.55S，或是約33.55S至36.45S，或是約36.45S至39.1S，或是約39.1S至41.54S，或是約41.54S至43.83S，或是約43.83S至45.95S。
在其它相關(guān)實(shí)施方案中，該P(yáng)IKA聚核苷酸佐劑組合物具有一平均沉降系數(shù)單位(Svedbergs)，該平均沉降系數(shù)高于9，或是高于12，或是高于13.5，或是高于15，或是高于16，或是高于17，或是高于18，或是高于19，或是高于20，或是高于21，或是高于22，或是高于25，或是高于30。
免疫原性質(zhì) 一種包括有PIKA和抗原的免疫原組合物能夠以至少二種方式來(lái)引起抗原特異性免疫反應(yīng)i)體液免疫反應(yīng)，涉及刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體或免疫球蛋白(其它細(xì)胞亦涉及產(chǎn)生抗體反應(yīng)過(guò)程，例如抗原遞呈細(xì)胞(APCs，包括巨噬細(xì)胞)及輔助T細(xì)胞(Th1和Th2)，以及ii)細(xì)胞免疫反應(yīng)，一般涉及T細(xì)胞、包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)和其它涉及CTL反應(yīng)產(chǎn)生的細(xì)胞，例如Th1和/或Th2細(xì)胞以及抗原遞呈細(xì)胞。
此外，該聚核苷酸佐劑組合物可通過(guò)影響所產(chǎn)生的免疫球蛋白亞型(異構(gòu)型)以及它們的親和力，來(lái)改變免疫反應(yīng)的性質(zhì)。
因此，本發(fā)明免疫原組合物所誘導(dǎo)的免疫原反應(yīng)的程度和性質(zhì)可通過(guò)測(cè)量由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子、趨化因子和抗體等分子的存在而進(jìn)行評(píng)估。
白介素-4主要是由活化的Th2細(xì)胞所產(chǎn)生。白介素-4(IL-4)的產(chǎn)生會(huì)活化B細(xì)胞，從而產(chǎn)生IgG1和IgE免免疫球蛋白(抗體)，其可在血清樣品中測(cè)量。IL-4被視為T(mén)h2免疫反應(yīng)的一個(gè)指針和典型細(xì)胞因子。Th2細(xì)胞可促進(jìn)抗體反應(yīng)。
白介素-2(IL-2)主要是由活化的Th1細(xì)胞、NK細(xì)胞和淋巴因子活化型殺傷細(xì)胞(LAK)所產(chǎn)生。IL-2可幫助T細(xì)胞的增殖和成熟，此為有效的適應(yīng)性細(xì)胞免疫反應(yīng)中的一個(gè)必要階段。
干擾素-γ(INF-γ)可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括天然殺傷細(xì)胞和CD4+和CD8+T細(xì)胞，在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中扮演一必要角色，包括將巨噬細(xì)胞活化成為具有高度微生物殺傷力的細(xì)胞。另外，干擾素-γ是影響誘使特定Th1T細(xì)胞發(fā)展的因子，從而向上調(diào)控適應(yīng)性細(xì)胞免疫反應(yīng)。
本發(fā)明思及將本發(fā)明聚核苷酸佐劑和抗原共同使用的方法，以例如誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)的抗原特異性體液反應(yīng)和/或特異性細(xì)胞，例如T細(xì)胞免疫反應(yīng)。所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)可為在之前沒(méi)有免疫的個(gè)體中對(duì)于抗原的反應(yīng)，或是可用以促進(jìn)之前已有的免疫反應(yīng)(例如加強(qiáng)劑)。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的含PIKA免疫原組合物已被發(fā)現(xiàn)具有本說(shuō)明書(shū)所敘述的優(yōu)異性質(zhì)。
許多不同種類(lèi)的抗原已在活體內(nèi)測(cè)試其于存在或不存在PIKA佐劑下誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力。受測(cè)抗原包括乙型肝炎adw型表面抗原重組蛋白、滅活裂解型流感疫苗(得自于Sanofi Pasteur藥廠的VAXIGRIP)、合成型HIV肽抗原、第2型單純皰疹病毒gD抗原重組蛋白、重組型炭疽菌保護(hù)蛋白抗原、滅活型全病毒禽流感抗原品系H5N1和滅活型全病毒嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)滅活抗原。
在各例中，PIKA佐劑和抗原的共同存在相較于抗原或PIKA單獨(dú)存在更能夠增進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)。特別是，細(xì)胞因子干擾素-γ、IL-2和IL-4的增進(jìn)表達(dá)(參見(jiàn)實(shí)施例1.1、1.2、1.3、1.4、1.5和1.6)顯示PIKA佐劑的存在更能激發(fā)專(zhuān)一性適應(yīng)免疫力，更特別是，細(xì)胞因子干擾素-γ、IL-2的增強(qiáng)表達(dá)顯示主要的Th1細(xì)胞免疫力在PIKA佐劑的存在下被顯著地增強(qiáng)。細(xì)胞免疫反應(yīng)活性是治療細(xì)胞內(nèi)病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)感染所必須的關(guān)鍵特性，且對(duì)于發(fā)展治療用疫苗特別重要。
此外，含PIKA組合物通過(guò)CD4+T細(xì)胞而刺激干擾素-γ的產(chǎn)生(實(shí)施例1.3、1.4、1.5和1.6)。此種特性確認(rèn)PIKA可增強(qiáng)宿主的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。
血清內(nèi)被觀測(cè)到的抗體增加顯示PIKA佐劑誘導(dǎo)有利的體液免疫反應(yīng)。隨著將PIKA加入免疫原組合物，觀察到特異性抗體IgG的效價(jià)增加(參見(jiàn)實(shí)施例1.1、1.2、1.4、1.5、1.6、2，3、5和6)。
當(dāng)PIKA佐劑與滅活抗原(實(shí)施例1.2、1.6、2、3、4和6)、肽抗原(實(shí)施例1.3)和重組型抗原(實(shí)施例1.1、1.4、1.5、5和7)相組合時(shí)，可促進(jìn)宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)。
PIKA佐劑的一個(gè)特性在于提供適當(dāng)保護(hù)以限制和/或根除宿主體內(nèi)的感染，和/或降低因病原感染所導(dǎo)致的疾病癥狀的危險(xiǎn)性。實(shí)施例1.2和6中所使用的抗原VAXIGRIP(Sanofi Pasteur)本身就是一種人用流感疫苗，其可引起被認(rèn)為足以提供保護(hù)的免疫力程度以防止實(shí)際流感病毒感染。免疫系統(tǒng)所表達(dá)的有益細(xì)胞因子(IL-2、干擾素-γ和IL-4)和特異性IgG的水平顯示，添加PIKA至VAXIGRIP可進(jìn)一步增進(jìn)免疫反應(yīng)。
為進(jìn)一步展現(xiàn)PIKA的保護(hù)性質(zhì)，24只10天齡雞被接種以一種含有PIKA和滅活禽流感抗原的組合物，該禽流感抗原包括病毒株H5N1和H9N2(實(shí)施例3)。這些雞只隨后以活的H5N1病毒加以攻毒，并觀察二周。觀察期間結(jié)束時(shí)，被接種以PIKA/抗原組合物的雞只存活率為83％，相較之下，對(duì)照組中24只未預(yù)先接種PIKA/抗原組合物的雞只被暴露于活病毒，存活率只有17％。
在顯示PIKA佐劑的治療促進(jìn)性質(zhì)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，數(shù)只Balb/c鼠被攻毒以野生型狂犬病病毒的一個(gè)病毒株(實(shí)施例4)。感染之后，三群動(dòng)物在治療時(shí)被接種以不同的狂犬病疫苗。被接種以倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原加上PIKA的組合的鼠群存活率達(dá)到80％。給予倉(cāng)鼠腎細(xì)胞純化型狂犬病抗原和鋁佐劑的第二群鼠的存活率為15％。另外，給予Sanofi-Aventis的”Verorab”-Vero細(xì)胞滅活狂犬病疫苗的第三群鼠具有20％的存活率。
為進(jìn)一步展現(xiàn)PIKA佐劑的性質(zhì)，實(shí)施例7顯示PIKA和adw型HBsAg的共同存在能促進(jìn)在小鼠血清內(nèi)特異性IgG1(表26圖35)的產(chǎn)生，并更顯著地促進(jìn)IgG2a(表27圖36)的效價(jià)。此觀察結(jié)果的結(jié)論是PIKA可促進(jìn)治療性免疫反應(yīng)，特別是Th1偏好型免疫反應(yīng)。
在一個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中(實(shí)施例7)，PIKA在含adw型HBsAg的疫苗配方中的存在顯示可促進(jìn)被CD8T細(xì)胞肽抗原表位所刺激的脾細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ。這個(gè)結(jié)果顯示PIKA誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)(表28圖37)。
另外，(實(shí)施例7)PIKA存在于含HbsAg的疫苗配方中顯示可促使活體外和2ug/ml CD8T細(xì)胞肽抗原表位共同培養(yǎng)6天的脾細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ。這個(gè)結(jié)果顯示PIKA誘導(dǎo)中心記憶T細(xì)胞反應(yīng)。
其它特征 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物進(jìn)一步通過(guò)PIKA佐劑和抗原的相對(duì)存在量來(lái)界定，其中該存在量是通過(guò)數(shù)量、濃度、體積、分子數(shù)目或其它被認(rèn)可的度量來(lái)測(cè)量。
在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物包含聚核苷酸佐劑組合物和-或多種抗原，其中佐劑和抗原的存在量是通過(guò)分子的重量或數(shù)目來(lái)界定，而呈現(xiàn)下列比例低于1比1,000、低于1比900、低于1比800、低于1比700、低于1比500、低于1比400、低于1比300、低于1比200、低于1比100、低于1比50、低于1比10、低于1比5、低于1比2、約1比1、高于2比1、高于5比1、高于10比1、高于50比1、高于100比1、高于200比1、高于300比1、高于400比1、高于500比1、高于600比1、高于700比1、高于800比1、高于900比1、高于1,000比1。
在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物是通過(guò)劑量來(lái)界定，該劑量是指欲給予以便誘導(dǎo)最佳免疫反應(yīng)的疫苗用量，或是另指給予劑量范圍，其涵蓋用以引起免疫反應(yīng)所需要的最低劑量，至過(guò)量即會(huì)潛在性地誘導(dǎo)不良副作用因而在醫(yī)學(xué)上無(wú)法證明可增加有利反應(yīng)的最高劑量。
在某些特別相關(guān)的實(shí)施方案中，該免疫原組合物包含聚核苷酸佐劑組合物和抗原，其中抗原的單位劑量是以數(shù)量來(lái)計(jì)算，該數(shù)量為高于0.1ug、高于0.5ug、高于0.001mg、高于0.005mg、高于0.01mg、高于0.025mg、高于0.05mg、高于0.075mg、高于0.1mg、高于0.25mg、高于0.5mg、高于1.2mg、高于1.4mg、高于1.6mg、高于1.8mg、高于2.0mg、高于2.5mg、高于3mg、高于3.5mg、高于4mg、高于5mg、高于6mg、高于7mg、高于8mg、高于9mg、高于10mg、高于15mg、高于20mg、高于25mg或是高于50mg。
抗原的最佳量和抗原相對(duì)于PIKA佐劑的最佳比例可通過(guò)觀測(cè)宿主體內(nèi)的抗體效價(jià)和其它免疫反應(yīng)等標(biāo)準(zhǔn)研究方法來(lái)確認(rèn)。
抗原 在特別相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供聚核苷酸佐劑組合物以及抗原或疫苗，其中該抗原的來(lái)源為人類(lèi)抗原、動(dòng)物抗原、植物抗原、源自于病毒、細(xì)菌(包括分枝桿菌(Mycobacterium))、真菌或寄生蟲(chóng)中的任一種的感染物的一種或多種制劑、癌腫抗原、過(guò)敏性成分以及例如會(huì)導(dǎo)致自體免疫疾病的其它抗原。
在某些實(shí)施方案中，該抗原可從粗制或純化的天然來(lái)源衍生而來(lái)，并以它的原始存活形式來(lái)使用，或是于被殺死、滅活、截短、減毒或轉(zhuǎn)形成為不可回復(fù)形式或是去毒或突變成為無(wú)毒性形式或被過(guò)濾或純化后使用。
在某些實(shí)施方案中，該抗原是被分離的微生物抗原，例如病毒抗原、細(xì)菌抗原、真菌抗原、過(guò)敏性成分抗原、癌腫抗原或自體免疫抗原。在其它實(shí)施方案中，抗原是完整的滅活抗原。使完整抗原滅活的方法為業(yè)界所熟知；任何常用方法均可使用以使抗原滅活，且可針對(duì)相關(guān)抗原種類(lèi)而適當(dāng)?shù)剡x用。這些使抗原滅活的方法包括例如利用光反應(yīng)性化合物；氧化劑；輻射線(例如UV射線；γ-射線)；核黃素和UV射線的組合；溶劑-去污劑處理(例如以有機(jī)溶劑三N-丁基-磷酸酯和Tween 80等去污劑來(lái)處理)；聚乙二醇處理；巴斯德滅菌法(熱處理)；以及低pH處理；以胃蛋白酶或胰蛋白酶進(jìn)行溫和酶處理；亞甲藍(lán)(MB)光處理；以二甲基亞甲藍(lán)(DMMB)和可見(jiàn)光進(jìn)行處理；以S-59(一種補(bǔ)骨脂內(nèi)酯衍生物)和UVA照射進(jìn)行處理；以及類(lèi)似方法。
在特別相關(guān)的實(shí)施方案中，抗原可通過(guò)固相合成法來(lái)合成，或是可通過(guò)重組遺傳技術(shù)而獲得，或是可被人為制造以仿真病原體的免疫原性質(zhì)。
多肽抗原可利用本技藝所熟知標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化方法從天然來(lái)源分離，這些標(biāo)準(zhǔn)方法包括但不限于液相層析法(例如高效液相層析法、快速蛋白液相層析法等)、尺寸排它性層析法、凝膠電泳(包括一維凝膠電泳、二維凝膠電泳)、親和層析法或其它純化技術(shù)?？墒褂霉滔嚯暮铣杉夹g(shù)，這些技術(shù)是熟習(xí)于本領(lǐng)域技術(shù)人士所知悉的。請(qǐng)參見(jiàn)Jones，The Chemical Synthesis of Peptides(Clarendon Press，Oxford)(1994)。一般而言，在這些方法中，肽是通過(guò)將活化單體單元順序加入結(jié)合有增長(zhǎng)肽鏈的固相來(lái)制造。建構(gòu)完成的重組DNA技術(shù)可用以制造多肽，這些方法包括但不限于例如將表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中(例如在活體外細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)成為單細(xì)胞實(shí)體的真核宿主細(xì)胞，例如酵母菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，或原核細(xì)胞(例如在活體外細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的)，該表達(dá)構(gòu)建體含有編碼一多肽的核苷酸序列，而產(chǎn)生遺傳基因改變的宿主細(xì)胞；在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，蛋白質(zhì)可被該遺傳基因改變的宿主細(xì)胞所制得。
在一些實(shí)施方案中，該抗原為純化抗原，例如具有約25％至50％的純度、約50％至約75％的純度、約75％至約85％的純度、約85％至約90％的純度、約90％至約95％的純度、約95％至約98％的純度、約98％至約99％的純度，或高于99％的純度。
抗原可為非細(xì)胞型、囊封型、感染性克隆(infectious clone)、擴(kuò)增片段(replicon)、具載體型(vectored)、微囊封型(microencapsulated)、單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)的。
本發(fā)明的聚核苷酸佐劑組合物亦可用于促進(jìn)免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)是針對(duì)運(yùn)用DNA疫苗和/或DNA表達(dá)蛋白所產(chǎn)生的抗原。這些疫苗中用以編碼抗原的DNA序列可以是”裸露的”，或是被容納在一個(gè)如脂質(zhì)體的載體系統(tǒng)內(nèi)。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明的免疫原組合物可通過(guò)選用一或多種抗原和PIKA佐劑相組合來(lái)界定。
具體上說(shuō)，本發(fā)明提供免疫原組合物和其使用方法，其中該免疫原組合物包含PIKA佐劑以及病毒抗原，其中典型的抗原包括但不限于表1所述一或多種病毒的抗原。
表1病毒病原體和疾病








具體上說(shuō)，本發(fā)明提供免疫原組合物和其使用方法，其中該免疫原組合物包含PIKA佐劑以及細(xì)菌抗原，其中典型的抗原包括但不限于表2所述一或多種細(xì)菌的抗原。
表2細(xì)菌病原體和疾病 具體上說(shuō)，本發(fā)明提供一種免疫原組合物和其使用方法，其中該免疫原組合物包含PIKA佐劑以及真菌抗原，其中典型的抗原包括但不限于表3所述一或多種真菌的抗原。
表3真菌病體和疾病 具體上說(shuō)，本發(fā)明提供一種免疫原組合物和其使用方法，其中該免疫原組合物包含PIKA佐劑以及寄生蟲(chóng)抗原，其中典型的抗原包括但不限于表4所述一或多種寄生蟲(chóng)的抗原。
表4寄生蟲(chóng)病原體和疾病 本發(fā)明提供一種免疫原組合物和其使用方法，其中該免疫原組合物包含PIKA佐劑以及過(guò)敏成份抗原(“過(guò)敏原”)或疫苗，其中該抗原或疫苗的來(lái)源是從源自于人類(lèi)或動(dòng)物過(guò)敏成分來(lái)源的病原衍生而來(lái)或是仿真該病原來(lái)產(chǎn)生，該病原包括植物、動(dòng)物、真菌、昆蟲(chóng)、食品、藥物、灰塵和塵螨等。
過(guò)敏原包括但不限于環(huán)境空氣過(guò)敏原；豕草/花粉熱(ragweed/hayfever)等植物花粉；雜草花粉過(guò)敏原；牧草花粉過(guò)敏原；石茅高梁(Johnson grass)；樹(shù)木花粉過(guò)敏原；黑麥草(ryegrass)；屋塵螨(例如Der p I，Der fI等)等蜘蛛類(lèi)過(guò)敏原儲(chǔ)藏室粉螨過(guò)敏原；日本柳杉花粉熱；霉菌孢子過(guò)敏原；動(dòng)物過(guò)敏原(例如狗、天竺鼠、倉(cāng)鼠、沙鼠、大鼠、小鼠等過(guò)敏原)；食物過(guò)敏原(例如甲殼類(lèi)水產(chǎn)品過(guò)敏原；例如花生等堅(jiān)果類(lèi)；柑橘類(lèi)水果)；昆蟲(chóng)過(guò)敏原；毒液(膜翅目昆蟲(chóng)(Hymenoptera)、胡蜂、蜜蜂、木胡蜂、黃蜂、火蟻)；來(lái)自于蟑螂、跳蚤、蚊子等其它環(huán)境昆蟲(chóng)的過(guò)敏原；鏈球菌抗原等細(xì)菌過(guò)敏原；蛔蟲(chóng)抗原等寄生蟲(chóng)過(guò)敏原；病毒抗原；真菌孢子；藥物過(guò)敏原；抗生素；青霉素(penicillins)和相關(guān)化合物；其它抗生素；激素(胰島素)、酶(鏈激酶(streptokinase))等完整蛋白；可作為不完全抗原或半抗原(haptens)的所有藥物和它們的代謝物；可作為半抗原并作為過(guò)敏原的工業(yè)用化學(xué)品和它們的代謝物(例如酸酐(例如苯偏三甲酸酐)和異氰酸酯(例如甲苯二異氰酸酯))；面粉(例如導(dǎo)致面包師哮喘癥(Baker′s asthma)的過(guò)敏原、蓖麻籽、咖啡豆和前述工業(yè)用化學(xué)品等職業(yè)過(guò)敏原；蚤過(guò)敏原；以及非人類(lèi)動(dòng)物中的人類(lèi)蛋白。
過(guò)敏原包括但不限于細(xì)胞、細(xì)胞提取物、蛋白質(zhì)、多肽、肽、多糖、多糖綴合物、多糖的肽或非肽仿真體以及其它分子、小分子、脂肪、糖脂質(zhì)和糖類(lèi)。
特定天然、動(dòng)物和植物過(guò)敏原的范例包括但不限于下列屬所特有的蛋白犬屬(家犬(Canis familiaris))；Dermatophagoides(例如粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae))；貓屬(家貓(Felis domesticus))；豚草屬(豚草(Ambrosia artemiisfolia))；黑麥草屬(例如多年生黑麥草(Lolium perenne)或多花黑麥草(Loliummultiflorum))；柳杉屬(日本柳杉(Cryptomeria japonica))；鏈格孢屬(煉格孢菌(Altemaria alternate))；紅樺(Alder)；赤楊屬(Alnus gultinoasa)；樺屬(瘤皮樺(Betula verrucosa))；櫟屬(白橡(Quercus alba))；木犀屬(油橄欖(Olea europa))；蒿屬(野艾(Artemisiavulgaris))；車(chē)前草(例如長(zhǎng)葉車(chē)前草(Plantago lanceolata))；墻草屬(例如直墻草(Parietaria officinalis)或猶大墻草(Parietaria judaica))；小蠊屬(例如德國(guó)小蠊(Blattella germanica))；蜜蜂(例如Apis multiflorum)；柏木屬(例如絲柏(Cupressus sempervirens)、亞利桑那柏(Cupressus arizonica)和大果柏(Cupressus macrocarpa)；圓柏屬(例如Juniperus sabinoides、鉛筆柏(Juniperusvirginiana)、杜松(Juniperus communis)和Juniperus ashei)；側(cè)柏屬(例如東方側(cè)柏(Thuya orientalis)；扁柏屬(例如日本扁柏(Chamaecyparis obtuse))；大蠊屬(例如美洲大蠊(Periplaneta Americana))；鵝觀草屬(例如偃麥草(Agropyronrepens))；黑麥屬(例如黑麥(Secale cereale))；小麥屬(例如小麥(Triticumaestivum))；鴨茅屬(例如鴨茅(Dactylis glomerata))；狐茅屬(例如草地狐茅(Festucaelatior))；早熟禾屬(例如草地早熟禾(Poa pratensis)或加拿大早熟禾(Poacompressa))；燕麥屬(例如燕麥(Avena sativa))；絨毛草屬(例如絨毛草(Holcuslanatus))；黃花茅屬(例如黃花茅(Anthoxanthum odoratum))；燕麥草屬(例如燕麥草(Arrhenatherum elatius))；剪股穎屬(例如小糠草(Agrostis alba))；梯牧草屬(例如梯牧草(Phleum pretense))；鷸草屬(例如鷸草(Phalaris arundinacea))；雀稗屬(例如百喜草(Paspalum notatum))；高梁屬(例如石茅高粱(Sorghumhalepensis))；和雀麥屬(例如無(wú)芒雀麥(Bromus inermis))。
在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供聚核苷酸佐劑組合物和其使用方法，其中該免疫原組合物包含PIKA佐劑以及自體免疫抗原或疫苗。
具體上說(shuō)，本發(fā)明提供免疫原組合物和其使用方法，其中該免疫原組合物僅包含PIKA佐劑或PIKA與癌腫抗原的組合，其中典型的抗原包括但不限于表5所述一或多種癌腫的抗原。
表5癌腫




在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，癌腫抗原的來(lái)源可為1).病毒蛋白，例如乙型肝炎病毒(HBV)、Epstein-Barr病毒(EBV)和人類(lèi)乳頭瘤病毒(HPV)，其分別在肝細(xì)胞癌、淋巴癌和子宮頸癌的發(fā)展上具有重要性；2).完整癌細(xì)胞，其可經(jīng)過(guò)滅活和/或這些細(xì)胞的未純化和/或半純化提取物；3).腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)例如腫瘤特異性致癌蛋白、糖基化蛋白、神經(jīng)節(jié)糖苷、糖脂、粘質(zhì)素(mucins)、肽、糖類(lèi)和抗獨(dú)特型(anti-idiotype)單株抗體。
在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，含聚核苷酸佐劑的免疫原組合物可通過(guò)防止既有癌腫繼續(xù)生長(zhǎng)、防止治愈的癌腫復(fù)發(fā)、或是去除未被先前療程所滅殺的癌細(xì)胞，而用以治療癌腫。此療程可在其它療程之前、同時(shí)或之后給予個(gè)體，因此可形成治療癌癥的完整組合式療程的一部分。
在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，治療用癌腫疫苗可以誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫反應(yīng)以對(duì)抗原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤。另外，誘導(dǎo)強(qiáng)免疫力可促使建立免疫記憶力，從而降低或遏制腫瘤的復(fù)發(fā)。癌腫疫苗可誘導(dǎo)特異性抗體來(lái)對(duì)抗腫瘤相關(guān)性表面抗原，優(yōu)選為誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，且更優(yōu)選為具有誘導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)的偏好。
本發(fā)明的免疫原組合物可包含各種習(xí)知腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原(TAA)中的任何一種?？梢允褂玫⒎潜仨毷褂猛暾腡AA分子。取而代之地，可使用TAA的一部分，例如它的一個(gè)抗原表位?？杀皇褂糜赮FV中的腫瘤相關(guān)抗原(或是它的含抗原表位片段)包括但不限于MAGE-2、MAGE-3、MUC-1、MUC-2、HER-2、高分子量黑色素瘤相關(guān)抗原MAA、GD2、癌胚抗原(CEA)、TAG-72、卵巢相關(guān)抗原OV-TL3和MOV18、TUAN、甲型幼兒蛋白(AFP)、OFP、CA-125、CA-50、CA-19-9、腎腫瘤相關(guān)抗原G250、EGP-40(也被稱(chēng)作為EpCAM)、S100(惡性黑色素瘤相關(guān)抗原)、p53以及p21ras。任何TAA(包括前述任何TAA和或它的抗原表位)的合成型類(lèi)似物均可使用。另外，組合物內(nèi)可以包含一或多種TAAs(或它的抗原表位)的組合。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物包含聚核苷酸佐劑以及至少二種不同的抗原，例如在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物包含二種抗原、三種抗原、四種抗原、五種抗原或是超過(guò)五種抗原。
其它成份 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物除了PIKA佐劑和抗原以外，另包含一或多種成份例如免疫調(diào)節(jié)劑、載劑等。
在一特別相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種免疫原組合物和其使用方法，其中該免疫原組合物包含PIKA佐劑、抗原或疫苗，以及另一種免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)(包含佐劑在內(nèi))，其中適合的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)包括但不限于鋁組合物例如氫氧化鋁；含有免疫原物質(zhì)的水包油乳劑組合物或是乳劑，包括完全弗氏佐劑(CompleteFreund’sAdjuvant)；含有經(jīng)干燥和熱殺滅的結(jié)核桿菌的水包油乳劑；不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund’sAdjuvant)；含有分枝桿菌細(xì)胞壁成份的乳劑；含有角鯊烯(squalene)的乳劑(MF-59)；去毒化的內(nèi)毒素；脂質(zhì)A衍生物，包括微生物單磷脂酰脂質(zhì)A(MPL)；半抗原；硝化纖維素吸收性蛋白；皂甙，包含從皂質(zhì)樹(shù)QuillajaSaponoria皮分離而來(lái)的免疫調(diào)節(jié)劑顆粒，例如QS21；人類(lèi)內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)劑；從細(xì)菌衍生而來(lái)的佐劑，包括去甲基化的CpG二聚核苷酸；寡聚脫氧核苷酸(例如合成寡核苷酸)，含有去甲基化的CpG二聚核苷酸；脂質(zhì)體(例如由如磷脂等可生物降解性材料制成的脂質(zhì)體)；可生物降解性聚合微球體(由如聚乳酸-共-甘醇酸(PLGA)、聚膦腈(polyphosphazene)和聚酐等多種聚合物制成的聚合微球體)；白介素-2；卡介苗；顆粒性白血球及單核球群落刺激因子；Montanide ISA-51；鑰孔蟲(chóng)戚血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)；DNA；蛋白；囊封型抗原(encapsulatedantigens)；免疫刺激復(fù)合物(ISCOM’s)；霍亂毒素和霍亂毒素衍生物；小帶閉合毒素(zonula occludens toxin)；大腸桿菌忌熱性腸毒素(Escherichia coli heat-labileenterotoxin)；忌熱性毒素和忌熱性毒素衍生物；百日咳毒素和百日咳毒素衍生物；胞壁酰二肽(muramyl dipeptide)衍生物；賽比克藥廠(Seppic)的montanide系列佐劑；聚-二(羧負(fù)離子基苯氧基)膦腈以及利甚曼原蟲(chóng)延長(zhǎng)因子(leishmania elongationfactor)。
當(dāng)本發(fā)明的免疫原組合物和另佐劑共同給予時(shí)，聚核苷酸佐劑可在給予該另佐劑之前和/或之后和/或同時(shí)給予。例如，聚核苷酸佐劑可在初次給予抗原時(shí)并合給予，隨后追加給予一劑含有其中一種佐劑或所有二種佐劑的疫苗。選擇性地，初次給予的疫苗可排除聚核苷酸佐劑，但后續(xù)給予病人含有該聚核苷酸佐劑的免疫原物質(zhì)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物可以和細(xì)胞因子或是例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15等其它輔助刺激分子共同給予。
在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種免疫原物質(zhì)，包含PIKA佐劑、一或多種抗原物質(zhì)，加上一適當(dāng)載劑。該載劑可為例如油水乳劑、懸浮液、脂質(zhì)載劑、鋁鹽、脂質(zhì)體卷(cochleates)、ISCOMs、脂質(zhì)體、活細(xì)菌載體、活病毒載體、微球體、核酸疫苗、聚合物、聚合物環(huán)、氟化鈉、轉(zhuǎn)基因植物、病毒原質(zhì)體(virosomes)、類(lèi)病毒顆粒，以及其它常用傳輸載體。
聚核苷酸佐劑可直接給予個(gè)體或是和傳輸復(fù)合物共同給予。該傳輸復(fù)合物是一種并合有致標(biāo)手段的物質(zhì)，例如對(duì)于諸如樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cell)等標(biāo)的細(xì)胞表面具有更高親和力和/或易被標(biāo)的細(xì)胞所吸收的分子。傳輸復(fù)合物的范例包括但不限于并有下列物質(zhì)的核酸傳輸復(fù)合物固醇(例如膽固醇)、脂肪(例如正價(jià)離子脂肪、病毒原質(zhì)體或脂質(zhì)體)或是標(biāo)的細(xì)胞特異性結(jié)合成份(例如能被一標(biāo)的細(xì)胞特異性受體所辨識(shí)的配位體)。優(yōu)選的復(fù)合物在活體內(nèi)是足夠穩(wěn)定以防止在被標(biāo)的細(xì)胞內(nèi)化之前顯著崩解。但是，該復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的適當(dāng)條件下是可以裂解的。
在相關(guān)實(shí)施方案中，含有PIKA佐劑的組合物不包含聚-L-賴(lài)氨酸或其衍生物。
組合套裝(Kits) 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明免疫原組合物的組合套裝。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種組合套裝，包含分別位在不同配方內(nèi)的PIKA佐劑和抗原。
在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種組合套裝，包含聚核苷酸佐劑和免疫原化合物，其中該免疫原物質(zhì)是抗原。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合套裝包含配制于無(wú)菌液體(例如水性)配方內(nèi)的本發(fā)明免疫原組合物，其中該配方是無(wú)菌的且盛裝在無(wú)菌容器、無(wú)菌小管或無(wú)菌注射筒內(nèi)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合套裝包含被配制成注射用的本發(fā)明免疫原組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合套裝包含配制于無(wú)菌液體配方內(nèi)的本發(fā)明免疫原組合物，盛裝在無(wú)菌注射筒內(nèi)；以及針頭。本發(fā)明的組合套裝包含配制于無(wú)菌液體配方內(nèi)且呈一單位劑量(例如單次劑量)的本發(fā)明免疫原組合物，盛裝在無(wú)菌注射筒內(nèi)；以及針頭。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合套裝包含被冷凍干燥且被盛裝在無(wú)菌容器內(nèi)的本發(fā)明免疫原組合物，以及含有用以復(fù)原冷凍干燥組合物的無(wú)菌液體的容器。在一些實(shí)施方案中，該組合套裝另包含復(fù)原冷凍干燥組合物的無(wú)菌液體的指南。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合套裝包含一免疫原組合物，該免疫原組合物被配制成通過(guò)直腸、陰道、鼻、口(包括經(jīng)呼吸道吸入)、眼、局部、肺臟、眼球或透皮來(lái)給予，以及適當(dāng)傳輸裝置，例如吸入器、栓劑施用器等。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合套裝另包含例如有關(guān)給予劑量和給予頻率的使用指南。在一些實(shí)施方案中，指南是被直接印刷在組合套裝上。在其它的實(shí)施方案中，指南是被設(shè)置成為包裝內(nèi)容物的印刷品。指南亦可被設(shè)置在其它媒介物上，例如呈數(shù)字或模擬形式的電子媒體上，例如錄音匣、錄音帶、光盤(pán)、多功能數(shù)字光盤(pán)等。
配方 本發(fā)明的免疫原組合物可被配置在任一種配方中。例如，本發(fā)明的免疫原組合物可被制備成為一種可注射型溶液、干燥粉末、液態(tài)溶液例如水性或生理食鹽水溶液，或成為懸浮液、油膏、乳劑、片劑、包衣片劑、微膠囊、栓劑、液滴、藥片、顆粒、糖衣錠、膠囊、凝膠、糖漿或漿液。所需免疫原組合物配方的制備被一般性地?cái)⑹鲈赩accine 4th Edition by Stanley A Plotkin et al.，W.B.SaundersCompany；4th edition 2003。適當(dāng)?shù)呐浞揭啾粩⑹鲈诶鏏.Gennaro(2000)“RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，”20th edition，Lippincott，Williams，&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel et al.，eds.，7th ed.，Lippincott，Williams，& Wilkins；以及Handbook ofPharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe et al.，eds.，3rd ed.Amer.PharmaceuticalAssoc.；Methods in Molecular Medicine，Vol.87Vaccine Protocols，2nd edition(2003)，Humana Press；Mucosal Vaccines(1996)，Kiyono et al.，eds.，Academic Press；以及Vaccine AdjuvantsPreparation Methods and Research Protocols(2000)D.T.O′Hagan，Humana Press。
本發(fā)明的免疫原組合物可被微囊封、并入脂質(zhì)體卷(encochleated)、涂布在微型金質(zhì)顆粒上、或是容納于脂質(zhì)體、氣霧劑或丸片內(nèi)以植入皮膚，或是被干燥于一尖銳對(duì)象(例如一針頭)上以刮擦進(jìn)入皮膚內(nèi)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原物質(zhì)可單獨(dú)傳輸或與懸浮液系統(tǒng)并合傳輸。在一些實(shí)施方案中，該懸浮液系統(tǒng)是選自于由例如巨分子復(fù)合物、奈米膠囊、微球體、微珠粒和脂體基質(zhì)系統(tǒng)所構(gòu)成的群組中。脂體基質(zhì)系統(tǒng)可選擇性地含有水包油乳劑、微胞(micelles)、混合微胞(mixed micelles)或脂質(zhì)體(liposomes)。
在某些實(shí)施方案中，含有PIKA佐劑的本發(fā)明免疫原組合物是呈藥學(xué)上可接受性溶液的形式，該溶液可例行性地含有藥學(xué)上可接受濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、兼容性載劑、佐劑和其它任擇性治療用組份。該組合物可含有例如崩解劑、粘合劑、包覆劑、膨脹劑、潤(rùn)滑劑、香料、甘味劑或助溶劑等添加劑。
在某些實(shí)施方案中，含有PIKA佐劑的本發(fā)明免疫原組合物是以其原物形式或藥學(xué)上可接受的鹽形式來(lái)給予。
本發(fā)明的免疫原組合物可以無(wú)菌和非無(wú)菌形式來(lái)使用，例如膠囊、液態(tài)溶液、液滴、乳劑、懸浮液、酏劑(elixirs)、油膏、栓劑、凝膠、軟膠囊、噴劑、吸入劑、氣霧劑、粉末、片劑、包衣片、菱錠(lozenges)、微膠囊、栓劑、糖衣錠(dragees)、糖漿、漿液、顆粒、灌腸劑(enemas)或藥片。可以運(yùn)用任何惰性載劑，例如生理食鹽水或磷酸鹽緩沖化生理食鹽水、穩(wěn)定劑、驅(qū)動(dòng)劑等任何惰性載劑，該惰性載劑被包封在用以幫助給藥的明膠膠囊內(nèi)或是在微膠囊或載體內(nèi)，或是可以運(yùn)用使得本發(fā)明方法所使用的化合物具有適用于本發(fā)明方法的溶解性質(zhì)的任何載劑。
在某些實(shí)施方案中，PIKA佐劑組合物以及包含PIKA佐劑和抗原化合物的免疫原組合物可被冷涷干燥，以呈固體形式長(zhǎng)時(shí)穩(wěn)定保存。冷涷干燥法是熟習(xí)本領(lǐng)域技術(shù)人士所知悉的。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供佐劑組合物或免疫原組合物，其中該免疫原組合物，或是被包含在該免疫原組合物的佐劑組合物，呈現(xiàn)固體或液體形式或是位于溶液或懸浮液或乳劑內(nèi)。
本發(fā)明的免疫原組合物可借著通過(guò)呼吸道吸入途徑(經(jīng)口腔、氣管內(nèi)、鼻內(nèi))的藥用傳輸系統(tǒng)來(lái)給予個(gè)體。因此，本發(fā)明的免疫原組合物可被配制成適合吸入給予的形式。該藥用傳輸系統(tǒng)適合于將本發(fā)明的細(xì)菌組合物局部給予至支氣管的粘膜被覆層而進(jìn)行吸入性治療。本發(fā)明可運(yùn)用依賴(lài)壓縮氣體驅(qū)動(dòng)力的系統(tǒng)而將細(xì)菌噴出容器。為達(dá)成此一目的，可使用氣霧劑或加壓容器。
本說(shuō)明書(shū)所使用的“氣霧劑”此用語(yǔ)是依據(jù)它的慣用意義來(lái)使用，意指被加壓推進(jìn)氣體攜載至施行治療地址的極細(xì)微液態(tài)或固態(tài)顆粒。當(dāng)藥用氣霧劑被運(yùn)用于本發(fā)明時(shí)，該氣霧劑含有免疫原組合物，而該免疫原組合物可被溶解、懸浮或乳化在由流體載劑和拋射劑所構(gòu)成的混合物中。氣霧劑可呈溶液、懸浮液、乳劑、粉末或半固體制劑的形式。本發(fā)明所使用的氣霧劑是意圖以細(xì)微固態(tài)顆粒或液態(tài)氣霧的形式通過(guò)個(gè)體的呼吸道來(lái)給予。被熟習(xí)本項(xiàng)技術(shù)人士所知悉的各種拋射劑均可被使用。適當(dāng)拋射劑的范例包括但不限于烴類(lèi)或其它適當(dāng)氣體。以加壓氣霧劑為例，其劑量可通過(guò)設(shè)置一閥件來(lái)設(shè)定，以傳輸經(jīng)計(jì)算的用量。
數(shù)個(gè)不同種類(lèi)的呼吸道吸入方法可被使用于本發(fā)明。本發(fā)明的免疫原組合物基本上可被配制成三種不同種類(lèi)的吸入用配方。第一，本發(fā)明的免疫原組合物可與低沸點(diǎn)拋射劑共同配制。這種配方通常通過(guò)常用定量吸入器(MDI′s)來(lái)給予。但是，可運(yùn)用美國(guó)專(zhuān)利第5,404,871號(hào)和第5,542,410號(hào)中所論及的技術(shù)來(lái)測(cè)量個(gè)體的呼吸體積和流速，而將常用MDI′s加以改裝以增進(jìn)重復(fù)給藥的能力。
選擇性地，本發(fā)明的免疫原組合物可被配制在水性或酒精溶液中，并通過(guò)常用霧化器來(lái)傳輸。在一些實(shí)施方案中，這種溶液配方是利用例如美國(guó)專(zhuān)利第5,497,763號(hào)、第5,544,646號(hào)、第5,718,222號(hào)和第5,660,166號(hào)中所揭露的裝置和系統(tǒng)來(lái)霧化。
另外，本發(fā)明的免疫原組合物可被配制成干粉配方。這種配方的給予方式可透過(guò)產(chǎn)生該粉末的氣霧之后再簡(jiǎn)單地吸入該干粉配方。這種給予方式的實(shí)施技術(shù)被敘述在美國(guó)專(zhuān)利第5,775,320號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利第5,740,794號(hào)中。
適合鼻內(nèi)給予的配方包括鼻用噴劑、鼻用滴劑、氣霧劑配方等。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物被配制成持續(xù)釋放劑(例如控制釋放型配方)。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物被配制成丸片或柱體，并以貯釋注射劑(depot injections)或植入物的形式植入肌肉內(nèi)或皮下。這種植入物通常會(huì)應(yīng)用如可生物降解性聚合物等習(xí)知惰性材料。可注射的貯釋形式可通過(guò)在如聚乳酸聚甘醇酸(polylactide-polyglycolide)等可生物降解性聚合物中形成本發(fā)明免疫原組合物的微膠囊基質(zhì)來(lái)制成。其它適用的可生物降解性聚合物的范例包括聚(原酸酯)(poly(orthoesters))和聚酐?？勺⑸涞馁A釋配方亦可通過(guò)將組合物埋覆在可與身體組織兼容的脂質(zhì)體或微乳劑內(nèi)來(lái)制成。傳輸釋放系統(tǒng)亦包括下列范例以聚合物為基礎(chǔ)的系統(tǒng)、微膠囊、脂肪、水凝膠釋放系統(tǒng)、硅橡膠系統(tǒng)(sylastic systems)、肽系統(tǒng)、以肽為基礎(chǔ)的系統(tǒng)、蠟質(zhì)覆膜、壓片、部分融合型植入物。其它形式的持續(xù)釋放劑是熟習(xí)于本領(lǐng)域技術(shù)人士所知悉的。
方法 在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種用以刺激和/或促進(jìn)對(duì)于抗原化合物的免疫反應(yīng)的方法，包含將本發(fā)明的免疫原組合物給予宿主。在一些實(shí)施方案中，該宿主是人類(lèi)。在其它實(shí)施方案中，該宿主是非人類(lèi)動(dòng)物，例如非人類(lèi)哺乳動(dòng)物、禽鳥(niǎo)物種等。
在某些實(shí)施方案中，該聚核苷佐劑組合物可被使用在疫苗內(nèi)。該疫苗組合物可選擇性地含有其它佐劑。所涵蓋的疫苗種類(lèi)為抗傳染病、抗癌癥、抗過(guò)敏和抗自體免疫疾病。
另外，本發(fā)明提供一種用以促進(jìn)對(duì)于抗原化合物的免疫反應(yīng)的方法，包含將本發(fā)明的免疫原組合物給予宿主。該宿主是人類(lèi)或非人類(lèi)動(dòng)物。
在某些實(shí)施方案中，該佐劑和該抗原共同被給予。在其它實(shí)施方案中，該佐劑是在給予該抗原之前或之后被給予。
本發(fā)明的免疫原組合物在一些實(shí)施方案中是通過(guò)肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈、皮下或皮內(nèi)注射等胃腸道外注射來(lái)傳輸。在其它實(shí)施方案中，該免疫原組合物是以注射以外的方式(例如不以機(jī)械裝置來(lái)破壞上皮細(xì)胞障壁的方式)經(jīng)皮內(nèi)傳輸。在其它實(shí)施方案中，該免疫原組合物是通過(guò)直腸、陰道、鼻、口(包括經(jīng)呼吸道吸入)、眼、眼球、局部、肺臟或透皮來(lái)傳輸。
個(gè)體會(huì)透過(guò)環(huán)境接觸而暴露于抗原中，因而會(huì)有發(fā)展出例如過(guò)敏反應(yīng)、傳染病、自體免疫疾病或癌癥的危險(xiǎn)。在其它實(shí)施方案中，個(gè)體因先前透過(guò)環(huán)境接觸而暴露于抗原中，結(jié)果罹患傳染病、自體免疫疾病、癌癥或過(guò)敏癥。
在某些實(shí)施方案中，當(dāng)含有聚核苷酸佐劑的免疫原組合物的給予形式是用以治療癌癥時(shí)，傳輸方式是將該免疫原組合物直接注射進(jìn)入腫瘤或腫瘤附近。在一些實(shí)施方案中，該免疫原組合物是平均地傳輸于腫瘤表面或內(nèi)部以增進(jìn)生物分布性，從而增進(jìn)治療效果。
例如，對(duì)于以水溶液進(jìn)行胃腸道外給予而言，該溶液在必要時(shí)應(yīng)該被適當(dāng)?shù)鼐彌_化，且先以足量的生理食鹽水或葡萄糖來(lái)稀釋以使其呈現(xiàn)等張。這些特定的水性溶液特別適用于靜脈和腹腔內(nèi)給予。關(guān)于這點(diǎn)，熟習(xí)本領(lǐng)域技術(shù)人士將可參照本申請(qǐng)揭示內(nèi)容而知悉可供使用的無(wú)菌水性媒介物?？晒┍景l(fā)明使用的典型注射媒介物包括含有或不含有分散劑和/或防腐劑的緩沖液，以及食用油、礦物油、鱈魚(yú)肝油、角鯊烯(squalene)、一-、二-或三酸甘油酯，以及這些成份的混合物。
本發(fā)明的免疫原組合物是以有效量被給予，也就是說(shuō)，本發(fā)明的免疫原組合物的用量在選定給予途徑中可有效地刺激、誘導(dǎo)或增進(jìn)免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)是被特定病原性微生物所產(chǎn)生的抗原所激發(fā)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物的用量可有效地遏制和/或根除病原性微生物的感染和/或降低感染所并發(fā)的癥狀。
例如，在一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的免疫原組合物給予個(gè)體可有效地治療一傳染病，其中傳染病的治療包含下列一或多者降低病原體在個(gè)體內(nèi)的數(shù)目(例如降低病毒負(fù)荷量、降低細(xì)菌負(fù)荷量(bacterial load)、降低原蟲(chóng)數(shù)目、降低蠕蟲(chóng)數(shù)目)和/或降低傳染病相關(guān)參數(shù)，該參數(shù)包括但不限于傳染物質(zhì)所產(chǎn)生的產(chǎn)物水平的降低(例如毒素、抗原等)；以及降低對(duì)于該傳染物質(zhì)的非所需生理反應(yīng)(例如發(fā)燒、組織水腫等)。
這些組成所需的精確用量是隨著個(gè)體不同，依據(jù)個(gè)體的物種、年齡、體重及一般狀態(tài)，被治療或預(yù)防的疾病、感染或病況的嚴(yán)重性，所使用的特定化合物及它的給予形式等而有所變化。熟習(xí)本領(lǐng)域技術(shù)人士得知本說(shuō)明書(shū)的公開(kāi)的內(nèi)容后，可僅僅利用例行實(shí)驗(yàn)而決定適當(dāng)?shù)挠昧?。初次給予后，個(gè)體可再接受一或多次適當(dāng)間隔的追加免疫。
在一些實(shí)施方案中，一系列劑量的本發(fā)明免疫原組合物被給予。在這些實(shí)施方案中，第一劑本發(fā)明免疫原組合物是為了給予疫苗。第二劑本發(fā)明免疫原組合物是在個(gè)體因暴露于該第一劑而已經(jīng)被免疫致敏化之后再給予該個(gè)體。加強(qiáng)劑(booster)可在初次免疫數(shù)日、數(shù)周或數(shù)月之后給予，依據(jù)病人的反應(yīng)和狀況而定。例如，加強(qiáng)劑在給予第一劑約2日至約12個(gè)月后給予，例如在給予第一劑約2日至約7日、約1周至約2周、約2周至約4周、約4周至約8周、約8周至約6個(gè)月、或6個(gè)月至約12個(gè)月后給予。本發(fā)明亦思及利用第三、四、五、六劑或后續(xù)劑量來(lái)進(jìn)行第三、四、五、六次或后續(xù)加強(qiáng)免疫的應(yīng)用。
在某些實(shí)施方案中，給予手段可包含數(shù)個(gè)替代性途徑的組合，例如在系統(tǒng)性給予劑型(例如腹腔、肌肉內(nèi)、皮下或皮內(nèi)給予)之后接續(xù)以粘膜傳輸劑型(例如經(jīng)鼻內(nèi)吸入)，反之亦然。
在某些實(shí)施方案中，聚核苷佐劑可以和給予病人的第一劑抗原或是和給予病人的任何后續(xù)配劑或是和給予病人的所有配劑合并給予。所給予的至少一劑中將會(huì)包含PIKA佐劑以作為完整流程的一部分。
在某些實(shí)施方案中，所給予的免疫原組合物的組成可以在初始給予和加強(qiáng)劑之間和/或數(shù)個(gè)加強(qiáng)之間具有變化。舉例來(lái)說(shuō)，所給予的初次配劑可包含DNA疫苗，而加強(qiáng)劑是呈重組蛋白疫苗的形式。所給予的至少一劑中將會(huì)包含PIKA佐劑以作為完整流程的一部分。
運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)分析方法可容易地測(cè)定對(duì)于抗原的抗體反應(yīng)是否已經(jīng)在個(gè)體內(nèi)被誘導(dǎo)或促進(jìn)。例如，酶連結(jié)免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、免疫沉降分析和蛋白墨點(diǎn)(“western blot”)分析等免疫分析以及中和分析(例如活體外或活體內(nèi)的病毒感染性中和分析可用以測(cè)定體液或其它生物樣品(例如個(gè)體的血清、分泌物或其它流體)內(nèi)對(duì)于微生物抗原具有特異性的抗體的存在。
運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)分析方法可容易地測(cè)定對(duì)于抗原的CD4免疫反應(yīng)是否已經(jīng)在個(gè)體內(nèi)被誘導(dǎo)，例如螢光-活化細(xì)胞分類(lèi)法(fluorescence-activated cell sorting(FACS))(請(qǐng)參見(jiàn)例如Waldrop et al.(1997)J.Clin.Invest.991739-1750)；細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分析用以測(cè)定抗原刺激后細(xì)胞因子的產(chǎn)生(參見(jiàn)例如Suni et al.(1998)J.Immunol.Methods 21289-98；Nomura et al.(2000)Cytometry 4060-68；Ghanekar et al.(2001)Clin.Diagnostic Lab.Immunol.8628-631)；MHC-肽多聚體染色分析，例如利用可被檢測(cè)地標(biāo)志(例如被螢光標(biāo)志)的可溶性第II類(lèi)MHC/肽多聚體(參見(jiàn)例如Billand Kotzin(2002)Arthritis Res.4261-265；Altman et al.(1996)Science 27494-96；以及Murali-Krishna et al.(1998)Immunity 8177-187)；酶連結(jié)免疫點(diǎn)(ELISPOT)分析(參見(jiàn)例如Hutchings et al.(1989)J.Immunol.Methods 1201-8；以及Czerkinskyet al.(1983)J.Immunol.Methods 65109-121)等。作為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分析的一個(gè)非限制性實(shí)施例，全血被抗原和共刺激抗體(例如抗-CD28、抗-CD49d)刺激2小時(shí)以上；加入布雷菲德菌素A(BrefeldinA)以抑制細(xì)胞因子分泌；以及處理細(xì)胞以利用針對(duì)CD4以及針對(duì)TNF-α、IFN-γ和IL-2等細(xì)胞因子的螢光標(biāo)志抗體進(jìn)行FACS分析。
運(yùn)用常用分析方法可以測(cè)定對(duì)于抗原(例如病原體)的抗原特異性CD8(例如細(xì)胞毒性T細(xì)胞；“CTL”)反應(yīng)是否被誘導(dǎo)，這些分析方法包括但不限于通過(guò)測(cè)量CTL對(duì)于細(xì)胞表面上表達(dá)出抗原的標(biāo)的細(xì)胞所造成的特異性分解作用，其中標(biāo)的細(xì)胞已并有可檢測(cè)標(biāo)志，該標(biāo)志在標(biāo)的細(xì)胞分解后會(huì)釋出且可利用例如51Cr-釋放分析、以鑭螢光為基礎(chǔ)的細(xì)胞分解分析等方法來(lái)測(cè)量。
適合進(jìn)行治療的個(gè)體 適合利用本發(fā)明誘導(dǎo)對(duì)于微生物病原體的免疫反應(yīng)的方法以及治療或預(yù)防微生物病原體感染的方法來(lái)進(jìn)行治療的個(gè)體，包括已被病原性微生物感染的個(gè)體；易被病原性微生物感染但尚未被感染的個(gè)體；以及具有被病原性微生物感染的危險(xiǎn)性但尚未被感染的個(gè)體。適合的個(gè)體包括嬰兒、幼童、青少年和成人。
適合利用本發(fā)明誘導(dǎo)對(duì)于微生物病原體的免疫反應(yīng)的方法以及治療或限制微生物病原體感染的方法來(lái)進(jìn)行治療的個(gè)體包括小兒科目標(biāo)族群，例如約1歲至約17歲之間的個(gè)體，包括嬰兒(例如約1個(gè)月至約1歲)、幼童(例如約1歲至約12歲)和青少年(例如約13歲至約17歲)。
適合利用本發(fā)明誘導(dǎo)對(duì)于微生物病原體的免疫反應(yīng)的方法以及治療或限制微生物病原體感染的方法來(lái)進(jìn)行治療的個(gè)體包括新生兒，例如1天至約14天齡的個(gè)體(例如人類(lèi)新生兒)，例如約1天至約2天齡、約2天至約10天齡、或是約10天至約14天齡。
在特定實(shí)施方案中，該個(gè)體是一位約10歲或更年少(例如約5歲或更年少)的人類(lèi)兒童，且免疫原組合物在下列一或多個(gè)時(shí)間被給予出生后2周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月、7個(gè)月、8個(gè)月、9個(gè)月、10個(gè)月、11個(gè)月、12個(gè)月、15個(gè)月、18個(gè)月或21個(gè)月，或是在2歲、3歲、4歲、5歲、6歲、7歲、8歲、9歲或10歲時(shí)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物被給予一位在約6個(gè)月至約6歲的年齡范圍的個(gè)體，其中該個(gè)體在約6個(gè)月齡時(shí)接受第一劑，并在例如2歲、4歲和6歲時(shí)接受2-3劑的后續(xù)加強(qiáng)劑。
在特定實(shí)施方案中，該個(gè)體是一位約17歲至49歲的人類(lèi)成人。在一些實(shí)施方案中，該個(gè)體是一位50至65歲、65歲至75歲、75至85歲或超過(guò)85歲的老年人類(lèi)成人。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物是在一個(gè)體與微生物病原體的實(shí)際或潛在來(lái)源(例如已知被微生物病原體所感染或懷疑被感染的個(gè)體)接觸之后(例如在確認(rèn)或懷疑接觸之后)立即給予該個(gè)體。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物是在個(gè)體已知被微生物病原體所感染或懷疑被感染的個(gè)體接觸之后約1小時(shí)內(nèi)、約2小時(shí)內(nèi)、約5小時(shí)內(nèi)、約8小時(shí)內(nèi)、約12小時(shí)內(nèi)、約18小時(shí)內(nèi)、約24小時(shí)內(nèi)、約2日內(nèi)、約4日內(nèi)、約7日內(nèi)、約2周內(nèi)或1個(gè)月內(nèi)給予該個(gè)體。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原組合物被給予已知或懷疑是微生物病原體的攜帶者的個(gè)體，無(wú)論他們是否顯現(xiàn)感染癥狀。
適合利用本發(fā)明誘導(dǎo)對(duì)于微生物病原體的免疫反應(yīng)的方法以及治療或限制微生物病原體感染的方法來(lái)進(jìn)行治療的個(gè)體包括缺乏CD4+T細(xì)胞的個(gè)體(「CD4+-缺乏性」個(gè)體)，例如具有低于正常數(shù)目的功能性CD4+T淋巴細(xì)胞的個(gè)體。本說(shuō)明書(shū)所使用的「正常個(gè)體」此用語(yǔ)的意思是，所具有的CD4+T淋巴細(xì)胞水平和功能是位在族群正常范圍內(nèi)的個(gè)體，就人類(lèi)而言，通常每毫升血液中具有600至1500個(gè)CD4+T淋巴細(xì)胞。CD4+-缺乏性個(gè)體包括罹患后天免疫不全癥或原發(fā)性免疫不全癥的個(gè)體。后天免疫不全癥可能是因放射線治療或化學(xué)治療等所造成的暫時(shí)性CD4+缺乏。
具有健康完整的免疫系統(tǒng)但具有轉(zhuǎn)變成CD4+缺乏的危險(xiǎn)性的個(gè)體(「高危險(xiǎn)」個(gè)體)亦適合以本發(fā)明的方法來(lái)治療。高危險(xiǎn)個(gè)體包括但不限于較一般族群具有更高可能性轉(zhuǎn)變成CD4+缺乏的個(gè)體。具有轉(zhuǎn)變成CD4+缺乏的危險(xiǎn)性的個(gè)體包括但不限于因?yàn)楹捅籋IV感染的個(gè)體進(jìn)行性活動(dòng)而具有受HIV感染的危險(xiǎn)性的個(gè)體；靜脈藥物使用者；可能被暴露于受HIV感染的血液、血液制品或其它受HIV所污染的體液的個(gè)體；通過(guò)受HIV感染個(gè)體的產(chǎn)道的嬰兒；被HIV感染母親所哺育的嬰兒等。
適合利用本發(fā)明治療癌癥的方法來(lái)進(jìn)行治療的個(gè)體包括已被致癌物質(zhì)所感染的個(gè)體；易于罹患癌癥但尚未被診斷出罹患癌癥的個(gè)體；以及具有罹患癌癥的危險(xiǎn)但尚未被診斷出罹患癌癥的個(gè)體。適合的個(gè)體包括嬰兒、幼童、青少年和成人。
適合利用本發(fā)明治療癌癥的方法來(lái)進(jìn)行治療的個(gè)體包括已被診斷出罹患癌癥的個(gè)體。先前已接受例如化學(xué)治療或放射線治療來(lái)治療癌癥而現(xiàn)在正監(jiān)控該先前所治療的癌癥是否復(fù)發(fā)的個(gè)體；以及接受骨髓移植手術(shù)或其它器官移植手術(shù)的個(gè)體。
適合利用本發(fā)明用以治療過(guò)敏的配方和方法來(lái)進(jìn)行治療的個(gè)體包括已被診斷出患有過(guò)敏的個(gè)體。可以接受本說(shuō)明書(shū)所述方法和藥劑來(lái)進(jìn)行治療的個(gè)體包括已知對(duì)于一或多種過(guò)敏原具有過(guò)敏反應(yīng)(allergic hypersensitivity)的個(gè)體?？梢越邮苤委煹膫€(gè)體包括罹患前述任何一種過(guò)敏性疾病的個(gè)體。具有對(duì)于一或多種過(guò)敏原產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的危險(xiǎn)性的個(gè)體也可以接受治療。接受一或多個(gè)治療過(guò)敏性疾病的標(biāo)準(zhǔn)療程但治療失敗的個(gè)體也適合利用本發(fā)明。
適合接受治療的個(gè)體包括居住在工業(yè)國(guó)家的個(gè)體；居住在發(fā)展中國(guó)家的個(gè)體；居住在鄉(xiāng)村地區(qū)的個(gè)體；居住在較偏遠(yuǎn)隔離地區(qū)的個(gè)體等。
本發(fā)明的免疫原組合物的目標(biāo)族群是依據(jù)微生物病原體的不同而有所變化的。
以上所述內(nèi)容是一般性地?cái)⑹霰景l(fā)明。以下描述實(shí)施例將可協(xié)助了解本發(fā)明。這些實(shí)施例僅以例示說(shuō)明為目的，而非意圖對(duì)于本發(fā)明的范圍加以限制。當(dāng)情勢(shì)所趨或?yàn)橐驎r(shí)制宜時(shí)，當(dāng)可思及本發(fā)明在形式上的變化和等效性取代。雖然本說(shuō)明書(shū)使用特定的用語(yǔ)，但是這些用語(yǔ)是意圖供說(shuō)明之用，而不是以限制為目的。
實(shí)施例 實(shí)施例1PIKA和各種抗原相組合以誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng) 這個(gè)實(shí)施例涉及利用PIKA和各種抗原相組合以在活體內(nèi)刺激特異性免疫反應(yīng)。這個(gè)研究利用共通流程進(jìn)行一系列獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，但每次利用一種不同的抗原。受測(cè)抗原包括乙型肝炎adw型表面抗原重組蛋白、滅活裂解型流感疫苗(得自于Sanofi Pasteur的VAXIGRIP)、合成型HIV肽抗原、第2型單純皰疹病毒gD抗原重組蛋白、重組型炭疽菌保護(hù)蛋白抗原、滅活型全病毒禽流感抗原品系H5N1和滅活型全病毒嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)滅活抗原。
個(gè)別實(shí)驗(yàn)的流程涉及將數(shù)組Balb/c小鼠(每組3只)接種以抗原組合物、抗原和PIKA佐劑(一種由主要位在約66kDa至1,200kDa的重量分布范圍內(nèi)的PIKA分子所構(gòu)成的異質(zhì)組合物)、PIKA、含有磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的對(duì)照組。
依據(jù)所使用的各種抗原給予實(shí)際劑量。在初次注射后第10至14天，給予小鼠相同的加強(qiáng)劑疫苗。在加強(qiáng)劑注射后第10至14天采取血液樣品，隨后處死小鼠并從脾臟取得組織樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是以各組內(nèi)個(gè)別小鼠的測(cè)驗(yàn)結(jié)果的平均值來(lái)呈現(xiàn)。
制備脾臟細(xì)胞的懸浮液，并將來(lái)自于各只小鼠的細(xì)胞懸浮液的樣品置入ELISPOT培養(yǎng)板的6-12孔中并加以培養(yǎng)。該ELISPOT培養(yǎng)板的各孔容納有200ul的脾細(xì)胞懸浮液，每孔約有2x105至1x106個(gè)細(xì)胞(詳見(jiàn)下表)。對(duì)于各只小鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)樣品來(lái)說(shuō)，半數(shù)含有脾細(xì)胞的孔是以培養(yǎng)基來(lái)培育，另外半數(shù)的孔是利用特定抗原的兩種不同濃度其中一種來(lái)刺激并進(jìn)行評(píng)估。培養(yǎng)板是在環(huán)境受控制的條件下于37℃培育20小時(shí)之后，再進(jìn)行最后準(zhǔn)備并利用具標(biāo)準(zhǔn)型ELISPOT培養(yǎng)板讀數(shù)機(jī)來(lái)讀取數(shù)據(jù)。
運(yùn)用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知悉的標(biāo)準(zhǔn)ELISPOT測(cè)驗(yàn)法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-4、IL-2和干擾素-γ的細(xì)胞數(shù)目。
運(yùn)用流式細(xì)胞篩選分析法(Flow Cytometry analysis)來(lái)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞所產(chǎn)生的干擾素-γ。螢光-活化細(xì)胞分類(lèi)儀(FACS)的應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知悉的。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，濃度為2.5x106個(gè)細(xì)胞/ml的脾細(xì)胞溶液被制備并分置于個(gè)別小管，每個(gè)樣品置入2ml。隨后制備接受抗原刺激的樣品，并在環(huán)境受控制的條件下于37℃培育5小時(shí)。接著將樣品加以洗滌并染色，再置入具標(biāo)準(zhǔn)型FACS讀數(shù)機(jī)中讀取數(shù)據(jù)。
運(yùn)用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知悉的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)驗(yàn)法來(lái)檢測(cè)從處死動(dòng)物所取得的血清中的特異性抗體效價(jià)。
實(shí)施例1.1重組型乙型肝炎表面抗原(HBSAg)adw 下表6所顯示的結(jié)果是利用乙型肝炎adw型表面抗原重組蛋白來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生干擾素-γ、IL-2和IL-4的細(xì)胞存在數(shù)目的ELISPOT測(cè)驗(yàn)結(jié)果。表6中的數(shù)據(jù)(也請(qǐng)一并參見(jiàn)圖1、2和3)代表ELISPOT讀數(shù)和斑點(diǎn)形成細(xì)胞(spot forming cells)的數(shù)目，也就是產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)目的直接測(cè)量值。
斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)目隨著PIKA佐劑的加入而顯著增加(相較于僅加入抗原)顯示將PIKA佐劑加入乙型肝炎表面抗原重組蛋白可以促進(jìn)被培養(yǎng)的脾細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子干擾素-γ、IL-2和IL-4。所觀察到的細(xì)胞因子表達(dá)顯示PIKA佐劑的存在促進(jìn)了體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。
表6-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生細(xì)胞因子的小鼠脾細(xì)胞
以HBsAg 2.0ug/ml進(jìn)行刺激 單位斑點(diǎn)形成脾細(xì)胞 對(duì)于處死前所采血液樣品所進(jìn)行的ELISA測(cè)驗(yàn)結(jié)果(下表7和圖4)顯示PIKA的存在明顯地促進(jìn)了免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)是通過(guò)血清中所測(cè)得的特異性抗體效價(jià)來(lái)計(jì)算。
表7-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特定IgG效價(jià)

得到的結(jié)論是PIKA佐劑的加入促進(jìn)了對(duì)于HBsAg的整體免疫反應(yīng)，特別是特異性免疫反應(yīng)，更特別是適應(yīng)性免疫反應(yīng)，且主要是Th1偏好型免疫反應(yīng)以及促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)。
實(shí)施例1.2VAXIGRIP(Sanofi Pasteur)，含有類(lèi)H1N1、H3N2病毒株和b/Shanghai5/361/2002病毒株的滅活純化流感抗原 下表8所顯示的結(jié)果是利用VAXIGRIP疫苗(由Sanofi Pasteur藥廠所生產(chǎn)的一種滅活裂解人類(lèi)流感疫苗)來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生干擾素-γ、IL-2和IL-4的細(xì)胞存在數(shù)目的ELISPOT測(cè)驗(yàn)結(jié)果。表8中的數(shù)據(jù)(也請(qǐng)一并參見(jiàn)圖5、6和7)代表ELISPOT讀數(shù)和斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目，也就是細(xì)胞因子產(chǎn)生量的直接測(cè)量值。
斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)目隨著PIKA佐劑的加入而顯著增加(相較于僅加入抗原)顯示將PIKA佐劑加入流感抗原可以促進(jìn)被培養(yǎng)的脾細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子干擾素-γ、IL-2和IL-4。所觀察到的細(xì)胞因子表達(dá)顯示PIKA佐劑的存在促進(jìn)了體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。
表8-以含有PIKA和/或滅活裂解型流感抗原(inactivated split influenzaantigen)的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生細(xì)胞因子的小鼠脾細(xì)胞

單位斑點(diǎn)形成脾細(xì)胞 對(duì)于處死前所采血液樣品所進(jìn)行的ELISA測(cè)驗(yàn)結(jié)果(下表9和圖8)顯示PIKA的存在明顯地促進(jìn)了免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)是通過(guò)血清中所測(cè)得的特異性抗體效價(jià)來(lái)測(cè)量。
表9-以含有PIKA和/或滅活裂解型流感抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特定IgG效價(jià)
得到的結(jié)論是PIKA佐劑的加入促進(jìn)了對(duì)于流感抗原的整體免疫反應(yīng)，特別是特異性免疫反應(yīng)，更特別是適應(yīng)性免疫反應(yīng)，又更特別是細(xì)胞免疫反應(yīng)。
VAXIGRIP是一種經(jīng)過(guò)認(rèn)可的流感疫苗，它被認(rèn)為可以顯著地降低罹患流感的危險(xiǎn)性。PIKA的加入促進(jìn)了細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平，因而顯示含有VAXIGRIP和PIKA的疫苗亦可激發(fā)免疫反應(yīng)而顯著地降低罹患流感的危險(xiǎn)性。
實(shí)施例1.3合成型HIV肽抗原 下表10所顯示的結(jié)果是利用HIV肽抗原來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生干擾素-γ、IL-2和IL-4的細(xì)胞存在數(shù)目的ELISPOT測(cè)驗(yàn)結(jié)果。表10中的數(shù)據(jù)(也請(qǐng)一并參見(jiàn)第9、10和11圖)代表ELISPOT讀數(shù)和斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目，也就是細(xì)胞因子產(chǎn)生量的直接測(cè)量值。
斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)目隨著PIKA佐劑的加入而顯著增加(相較于僅加入抗原)顯示將PIKA佐劑加入HIV抗原可以促進(jìn)被培養(yǎng)的脾細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子干擾素-γ、IL-2和IL-4。所觀察到的細(xì)胞因子表達(dá)顯示PIKA佐劑的存在促進(jìn)了體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。
表10-以含有PIKA和/或HIV gp120抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生細(xì)胞因子的小鼠脾細(xì)胞
單位斑點(diǎn)形成脾細(xì)胞 FACS分析的結(jié)果顯示在下表11(也請(qǐng)一并參見(jiàn)第12圖)。產(chǎn)生干擾素呷的CD4+T細(xì)胞只存在于含有PIKA和HIV抗原的配方的事實(shí)確認(rèn)了適應(yīng)性免疫反應(yīng)已到達(dá)成熟階段且PIKA能幫助這個(gè)過(guò)程的完成。
表11-以含有PIKA和/或HIV gp120抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用FACS法來(lái)分析小鼠脾細(xì)胞
得到的結(jié)論是PIKA佐劑的加入促進(jìn)了對(duì)于HIV抗原的整體免疫反應(yīng)，特別是特異性免疫反應(yīng)，更特別是適應(yīng)性免疫反應(yīng)，又更特別是細(xì)胞免疫反應(yīng)。
實(shí)施例1.4來(lái)自于炭疽桿菌(Bacillus Anthracis)的重組型炭疽菌保護(hù)蛋白抗原(rPA) 下表12所顯示的結(jié)果是利用重組炭疽菌抗原來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生干擾素-γ、IL-2和IL-4的細(xì)胞存在數(shù)目的ELISPOT測(cè)驗(yàn)結(jié)果。表12中的數(shù)據(jù)(也請(qǐng)一并參見(jiàn)圖13、14和15)代表ELISPOT讀數(shù)和斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目，也就是細(xì)胞因子產(chǎn)生量的直接測(cè)量值。
斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)目隨著PIKA佐劑的加入而顯著增加(相較于僅加入抗原)顯示將PIKA佐劑加入炭疽菌抗原可以促進(jìn)被培養(yǎng)的脾細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子干擾素-γ、IL-2和IL-4。所觀察到的細(xì)胞因子表達(dá)顯示PIKA佐劑的存在促進(jìn)了體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。
表12-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生細(xì)胞因子的小鼠脾細(xì)胞
單位斑點(diǎn)形成脾細(xì)胞 FACS分析的結(jié)果顯示在下表13(也請(qǐng)一并參見(jiàn)圖16)。產(chǎn)生干擾素-γ的CD4+T細(xì)胞只存在于含有PIKA和rPA抗原的配方的事實(shí)確認(rèn)了適應(yīng)性免疫反應(yīng)已到達(dá)成熟階段且PIKA能幫助這個(gè)過(guò)程的完成。
表13-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用FACS法來(lái)分析小鼠脾細(xì)胞
對(duì)于處死前所采血液樣品所進(jìn)行的ELISA測(cè)驗(yàn)結(jié)果(下表14以及圖16和17)顯示PIKA的存在明顯地促進(jìn)了免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)是通過(guò)血清中所測(cè)得的特異性抗體效價(jià)來(lái)測(cè)量。
初次施打疫苗之后16周，利用標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)驗(yàn)法來(lái)評(píng)估來(lái)自于原始A和B組小鼠的血液樣品中的特異性抗體存在量，可以觀察到一致性的結(jié)果。再次，PIKA和炭疽菌抗原的共同存在可誘導(dǎo)顯著較高的免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)是通過(guò)血清中所測(cè)得的特異性抗體效價(jià)來(lái)測(cè)量。
表14-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特異性IgG效價(jià)
得到的結(jié)論是PIKA佐劑的加入促進(jìn)了對(duì)于rPA的整體免疫反應(yīng)，特別是特異性免疫反應(yīng)，更特別是適應(yīng)性免疫反應(yīng)，又更特別是細(xì)胞免疫反應(yīng)。
實(shí)施例1.52型單純皰疹病毒gD抗原重組蛋白 下表15所顯示的結(jié)果是利用重組型單純皰疹病毒抗原來(lái)檢測(cè)干擾素-γ、IL-2和IL-4的存在量的ELISPOT測(cè)驗(yàn)結(jié)果。表15中的數(shù)據(jù)(也請(qǐng)一并參見(jiàn)圖19、20和21)代表ELISPOT讀數(shù)和斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目，也就是細(xì)胞因子產(chǎn)生量的直接測(cè)量值。
斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)目隨著PIKA佐劑的加入而顯著增加(相較于僅加入抗原)顯示將PIKA佐劑加入單純皰疹病毒抗原可以促進(jìn)被培養(yǎng)的脾細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子干擾素-γ、IL-2和IL-4。所觀察到的細(xì)胞因子表達(dá)顯示PIKA佐劑的存在促進(jìn)了體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。
表15-以含有PIKA和/或HSV 2gD抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生細(xì)胞因子的小鼠脾細(xì)胞
單位斑點(diǎn)形成脾細(xì)胞 FACS分析的結(jié)果顯示在下表16(也請(qǐng)一并參見(jiàn)圖22)。產(chǎn)生干擾素-γ的CD4+T細(xì)胞只存在于含有PIKA和HSV抗原的配方的事實(shí)確認(rèn)了適應(yīng)性免疫反應(yīng)已到達(dá)成熟階段且PIKA能幫助這個(gè)過(guò)程的完成。
表16-以含有PIKA和/或HSV 2gD抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用FACS法來(lái)分析小鼠脾細(xì)胞
對(duì)于處死前所采血液樣品所進(jìn)行的ELISA測(cè)驗(yàn)結(jié)果(下表17以及圖23)顯示PIKA的存在明顯地促進(jìn)了免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)是通過(guò)血清中所測(cè)得的特異性抗體效價(jià)來(lái)測(cè)量。
表17-以PIKA和/或HSV2gD疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特異性IgG效價(jià)
得到的結(jié)論是PIKA佐劑的加入促進(jìn)了對(duì)于HSV抗原的整體免疫反應(yīng)，特別是特異性免疫反應(yīng)，更特別是適應(yīng)性免疫反應(yīng)，又更特別是細(xì)胞免疫反應(yīng)。
實(shí)施例1.6滅活H5N1全病毒(禽流感)抗原 下表18所顯示的結(jié)果是利用滅活未純化型H5N1抗原來(lái)檢測(cè)干擾素-γ、IL-2和IL-4的存在量的ELISPOT測(cè)驗(yàn)結(jié)果。表18中的數(shù)據(jù)(也請(qǐng)一并參見(jiàn)圖24、25和26)代表ELISPOT讀數(shù)和斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目，也就是細(xì)胞因子產(chǎn)生量的直接測(cè)量值。
斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)目隨著PIKA佐劑的加入而顯著增加(相較于僅加入抗原)顯示將PIKA佐劑加入H5N1抗原可以促進(jìn)被培養(yǎng)的脾細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子干擾素-γ、IL-2和IL-4。所觀察到的細(xì)胞因子表達(dá)顯示PIKA佐劑的存在促進(jìn)了體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。
表18-以含有PIKA和/或滅活H5N1抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生細(xì)胞因子的小鼠脾細(xì)胞
FACS分析的結(jié)果顯示在下表19(也請(qǐng)一并參見(jiàn)圖27)。產(chǎn)生干擾素-γ的CD4+T細(xì)胞只存在于含有PIKA和H5N1抗原的配方的事實(shí)確認(rèn)了適應(yīng)性免疫反應(yīng)已到達(dá)成熟階段且PIKA能幫助這個(gè)過(guò)程的完成。
表19-以含有PIKA和/或滅活H5N1抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用FACS法來(lái)分析小鼠脾細(xì)胞
單位斑點(diǎn)形成脾細(xì)胞 對(duì)于處死前所采血液樣品所進(jìn)行的ELISA測(cè)驗(yàn)結(jié)果(下表20以及圖28)顯示PIKA的存在明顯地促進(jìn)了免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)是通過(guò)血清中所測(cè)得的特異性抗體效價(jià)來(lái)測(cè)量。
表20-以含有PIKA和/或滅活H5N1抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特異性IgG效價(jià)
得到的結(jié)論是PIKA佐劑的加入促進(jìn)了對(duì)于H5N1抗原的整體免疫反應(yīng)，特別是特異性免疫反應(yīng)，更特別是適應(yīng)性免疫反應(yīng)，又更特別是細(xì)胞免疫反應(yīng)。
實(shí)施例2滅活型全病毒SARS抗原 這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)在于顯示將PIKA加入SARS抗原能促進(jìn)免疫反應(yīng)并刺激宿主免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生SARS特異性保護(hù)抗體。
在這個(gè)研究計(jì)劃中，6個(gè)各含4只Balb/c小鼠的群組(經(jīng)腹腔注射)被接種以SARS抗原組合、抗原加上PIKA(一種由主要位在約66kDa至1200000kDa的重量分布范圍內(nèi)的PIKA分子所構(gòu)成的異質(zhì)組合物)、PIKA或?qū)φ战M。參見(jiàn)下表21(請(qǐng)一并參見(jiàn)圖29)。
在第0天、第14天和第28天時(shí)將相同劑量給予各群組。第6周時(shí)抽取一血液樣品并測(cè)驗(yàn)血清中的IgG的存在量，以此為疾病特異性抗體的存在測(cè)量值。將血清稀釋16,000倍，接著利用ELISA讀數(shù)器來(lái)測(cè)量IgG的存在量，這個(gè)過(guò)程是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知悉的。輸出的數(shù)值為光學(xué)密度(O.D.)的讀數(shù)，其中該數(shù)值愈高表示IgG的存在量愈高。
各群組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值呈現(xiàn)在表21，該數(shù)據(jù)顯示PIKA佐劑的存在和IgG表達(dá)的增加之間具有相關(guān)性。
表21-以含有PIKA和/或完整滅活SARS抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特異性IgG效價(jià)
得到的結(jié)論是PIKA和SARS抗原的共同存在能以劑量相依賴(lài)的方式來(lái)增加IgG的表達(dá)，從而促進(jìn)宿主的免疫反應(yīng)。
實(shí)施例3PIKA疫苗提供對(duì)抗H5N1感染的免疫保護(hù)作用 這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)在于顯示含有PIKA佐劑的禽流感疫苗能夠保護(hù)雞只免于禽流感活病毒的感染。
這個(gè)研究是在2個(gè)各具有24只SPF雞的群組中進(jìn)行。在10天齡雞只的頸部通過(guò)皮下接種以一劑700ul的含PIKA(一種由主要位在66kDa至660kDa的重量范圍內(nèi)的PIKA分子所構(gòu)成的異質(zhì)組合物)和二株禽流感病毒(H5N1和H9N2)的疫苗。該組合物含有呈現(xiàn)約為2∶1的比例的抗原和PIKA佐劑。
在第7、14和21天時(shí)在雞只的翼下部分采取數(shù)個(gè)血液樣品。測(cè)驗(yàn)來(lái)自于各雞只的血液樣品中的特異性H5和H9抗體的存在量。
在第21天時(shí)，以活的H5N1病毒來(lái)攻毒雞只，再觀察14天。記錄暴露在活的H5N1病毒后第14天的雞只存活率。
各群組的平均結(jié)果(表22，請(qǐng)一并參見(jiàn)圖30和31)顯示PIKA的存在誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生。
表22-以含有PIKA和/或滅活H5N1抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于雞血清的特異性抗體效價(jià) 單位ELISA分析所得到的光密度值 在施打抗原/PIKA組合物疫苗的24只雞中，有21只(83％)在暴露于活的H5N1病毒后第14天仍存活。在沒(méi)有接受疫苗但仍暴露于活的H5N1病毒的對(duì)照組24只雞中，14天后僅有4只(17％)存活。
得到的結(jié)論是PIKA疫苗能夠提供顯著的免疫保護(hù)作用水平以對(duì)抗H5N1病毒。
實(shí)施例4PIKA疫苗提供對(duì)抗狂犬病感染的免疫保護(hù)作用 這個(gè)研究的目標(biāo)在于顯示含有PIKA佐劑的狂犬病疫苗能夠提供對(duì)抗狂犬病感染的免疫保護(hù)作用。
4個(gè)群組(分別編號(hào)I、ii、iii和iv)各包含20只Balb/c SPF Kunming小鼠，各只小鼠被攻毒以100ul的野生型狂犬病病毒株CQ92。各群組接受不同種類(lèi)疫苗的接種i)一由PIKA(一種由主要位在66kDa至660kDa的重量范圍內(nèi)的PIKA分子所構(gòu)成的異質(zhì)組合物)和倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原所構(gòu)成的組合物，其中該P(yáng)IKA和狂犬病抗原呈現(xiàn)1比4的體積比；ii)Sanofi-Aventis藥廠的Veroabvero細(xì)胞滅活型狂犬病疫苗；iii)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病疫苗和鋁佐劑(alum adjuvant)；以及iv)磷酸鹽緩沖溶液對(duì)照組。感染后第30至40分鐘、第3天、第6天和第9天通過(guò)皮下注射動(dòng)物大腿而給予60ul的疫苗。
各群組的存活率顯示在表23。(請(qǐng)一并參見(jiàn)圖32)。
表23-暴露于野生型狂犬病毒后再接受狂犬病疫苗治療的小鼠的存活率
得到的結(jié)論是PIKA的存在顯著地增進(jìn)了倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原所提供的免疫保護(hù)作用。
實(shí)施例5PIKA和乙型肝炎疫苗誘導(dǎo)血清中特異性抗體的產(chǎn)生 這個(gè)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程涉及將3個(gè)群組的Balb/c小鼠(每組3只小鼠)通過(guò)皮下注射施打下列組合物疫苗第A組，僅有4ug的乙型肝炎adw型表面抗原；第B組，4ug抗原和75ug的PIKA佐劑(一種由主要位在約66kDa至1,200kDa的重量分布范圍內(nèi)的PIKA分子所構(gòu)成的異質(zhì)組合物)；以及第C組，僅有100ug PIKA。
在初次注射后第10至14天，通過(guò)皮下注射給予小鼠相同的加強(qiáng)劑疫苗。在加強(qiáng)劑注射后第10至14天采取血液樣品，并利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知悉的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)驗(yàn)法來(lái)檢驗(yàn)特異性抗體的效價(jià)。
各群組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值呈現(xiàn)在下表24(以及圖33)，這些數(shù)據(jù)顯示PIKA的存在促進(jìn)了對(duì)于乙型肝炎抗原的免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)是通過(guò)觀測(cè)血清樣品中的特異性抗體效價(jià)來(lái)測(cè)量。
表24-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特異性抗體效價(jià)
從這個(gè)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論是含有PIKA和乙型肝炎抗原的免疫原物質(zhì)誘導(dǎo)了顯著免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，該免疫反應(yīng)是通過(guò)血清樣品中的特異性抗體效價(jià)來(lái)測(cè)量。
實(shí)施例6PIKA和流感疫苗誘導(dǎo)血清中特異性抗體的產(chǎn)生 這個(gè)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程涉及將2個(gè)群組的Balb/c小鼠(每組3只小鼠)通過(guò)皮下注射施打下列組合物疫苗第A組，僅有4ug的Sanofi VAXIGRIP流感疫苗；以及第B組，4ug抗原和100ug的PIKA佐劑(一種由主要位在約66kDa至1,200kDa的重量分布范圍內(nèi)的PIKA分子所構(gòu)成的異質(zhì)組合物)。
在初次注射后第20天，通過(guò)皮下注射給予小鼠相同的加強(qiáng)劑疫苗。在初次施打疫苗后第35天采取血液樣品，并利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知悉的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)驗(yàn)法來(lái)檢驗(yàn)特異性抗體的效價(jià)。
各群組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值呈現(xiàn)在下表25(以及第34圖)，這些數(shù)據(jù)顯示PIKA的存在促進(jìn)了對(duì)于流感疫苗抗原的免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)是通過(guò)觀測(cè)血清樣品中的特異性抗體效價(jià)來(lái)測(cè)量。
表25-以含有PIKA和/或滅活裂解型流感抗原的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特異性抗體效價(jià)
從這個(gè)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論是含有PIKA和流感抗原的免疫原物質(zhì)誘導(dǎo)了顯著免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，該免疫反應(yīng)是通過(guò)血清樣品中的特異性抗體效價(jià)來(lái)測(cè)量。
實(shí)施例7PIKA和乙型肝炎(adw型表面抗原)疫苗誘導(dǎo)治療性免疫反應(yīng) 這個(gè)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程涉及將數(shù)個(gè)各含有4只6至10周齡的Balb/c小鼠的群組接種以商業(yè)上可購(gòu)得的adw型HbsAg組合物，該組合物含有或不含有PIKA佐劑(一種由主要位在約66kDa至1,200kDa的重量分布范圍內(nèi)的PIKA分子所構(gòu)成的異質(zhì)組合物)；PIKA；或是含有磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的對(duì)照組。
在小鼠背部?jī)蓚?cè)給予初次皮下注射各100ul。實(shí)際劑量提供于下表所顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中。接著在初次注射后第21天給予小鼠相同的加強(qiáng)劑疫苗。在第42天時(shí)采取二個(gè)血液樣品，隨后處死小鼠并從脾臟取得細(xì)胞以供測(cè)試之用。
進(jìn)行ELISPOT分析法以篩選出分泌抗原特異性干擾素-γ的T細(xì)胞。令來(lái)自于HBsAg的CD8T細(xì)胞肽表位(IPQSLDSWWTSL)在5ug/ml的濃度下活體外刺激取自于各只小鼠的一個(gè)脾細(xì)胞樣品，以測(cè)量IPQSLDSWWTSL-特異性CD8+細(xì)胞的存在量。
以2ug/ml的HBsAg肽IPQSLDSWWTSL在活體外再刺激第二個(gè)脾細(xì)胞樣品歷時(shí)6天。利用5ug/ml的HBsAg肽IPQSLDSWWTSL作為活體外刺激劑進(jìn)行ELISPOT分析以檢測(cè)干擾素-γ。進(jìn)行這個(gè)分析是為了檢測(cè)免疫之后的中心記憶細(xì)胞反應(yīng)。
利用ELISA分析來(lái)測(cè)量HBV抗原特異性抗體(特別是IgG1和IgG2a抗體)在血清中的存在量。在攝氏4度下，將數(shù)個(gè)Nunc Immunoplate Maxisorp培養(yǎng)板涂布以HBsAg(6ug/ml，配在PBS/0.01％Tween 20內(nèi))過(guò)夜。以PBS/Tween洗滌這些培養(yǎng)板，并以配在PBS內(nèi)的5％FCS進(jìn)行封閉處理2小時(shí)。加以洗滌后，加入配在PBS/Tween內(nèi)的血清稀釋液2小時(shí)。加以洗滌后，加入綴合有生物素(biotin)的大鼠抗小鼠IgG1單克隆抗體的1/3000稀釋液，或是綴合有生物素的大鼠抗小鼠IgG2a單克隆抗體的1/1500稀釋液。加以洗滌后，加入鏈霉親和素HRP(streptavidinHRP)(1/10,000稀釋于PBS/Tween)歷時(shí)1小時(shí)。加以洗滌后，以ABTS和過(guò)氧化氫(1000∶1)加入，歷時(shí)20分鐘。接著測(cè)量在405nm下的光密度(OD)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是以各群組的平均值來(lái)呈現(xiàn)。
以配有PIKA佐劑的HBsAg進(jìn)行免疫的小鼠的IgG1反應(yīng)相較于僅以HBsAg進(jìn)行免疫的小鼠反應(yīng)高出約5倍。IgG1的效價(jià)是以劑量相依賴(lài)形式增加(表26和圖35)。
表26以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特異性IgG1效價(jià)
單位光密度平均值 以配有PIKA佐劑的HBsAg進(jìn)行免疫的小鼠的IgG2a反應(yīng)相較于僅以HBsAg進(jìn)行免疫的小鼠反應(yīng)顯著為高。IgG2a的效價(jià)是以劑量相依賴(lài)形式增加，提示以Th1為主的免疫反應(yīng)增加(表27和第36圖)。
表27以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISA法檢測(cè)來(lái)自于小鼠血清的特異性IgG1效價(jià)
單位光密度平均值 CD8肽表位特異性活體外刺激的ELISPOT分析顯示對(duì)于僅以HBsAg進(jìn)行免疫的小鼠無(wú)法測(cè)得反應(yīng)。相對(duì)地，在利用配有PIKA的HBsAg進(jìn)行免疫之后，表達(dá)干擾素-γ的細(xì)胞可以容易地測(cè)得且呈現(xiàn)劑量相依賴(lài)形式，提示PIKA促進(jìn)了治療性免疫反應(yīng)(表28和圖37)。
表28以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗進(jìn)行免疫之后，利用ELISPOT法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生干擾素-γ的小鼠脾細(xì)胞

單位斑點(diǎn)形成脾細(xì)胞 培養(yǎng)脾細(xì)胞6天之后所進(jìn)行的ELISPOT分析顯示來(lái)自被含有HbsAg和PIKA佐劑的配方所免疫的小鼠中能夠產(chǎn)生干擾素-γ的脾細(xì)胞數(shù)目是兩倍于來(lái)自僅給予HBsAg的小鼠的脾細(xì)胞數(shù)目。這結(jié)果確認(rèn)了PIKA的存在能夠促進(jìn)中心記憶細(xì)胞的活化(表28和圖38)。
權(quán)利要求
1.一種免疫原組合物，其包含(a)聚核苷酸佐劑，該佐劑包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、至少一種抗生素以及至少一個(gè)正價(jià)離子；以及(b)至少一種抗原；其中該組合物被配制成供持續(xù)釋放使用。
2.一種免疫原組合物，其包含(a)聚核苷酸佐劑，該佐劑包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、至少一種抗生素以及至少一個(gè)正價(jià)離子；以及(b)至少一種病毒抗原；其中該抗原是腺病毒(adeniviridae)、沙粒病毒(arenaviridae)、星狀病毒(astroviridae)、本揚(yáng)病毒(bunyaviridae)、杯狀病毒(cliciviridae)、黃病毒(flaviviridae)、D型肝炎病毒(hepatitis delta virus)、肝炎病毒(hepeviridae)、單分子負(fù)鏈RNA病毒(mononegavirales)、巢病毒(nidovirales)、小RNA病毒(piconaviridae)、正黏液病毒(orthomyxoviridae)、乳頭瘤病毒(papillomaviridae)、細(xì)小病毒(parvoviridae)、多瘤病毒(polyomaviridae)、痘病毒(poxviridae)、呼腸孤病毒(reoviridae)、反轉(zhuǎn)錄病毒(retroviridae)或披膜病毒(togaviridae)中的一個(gè)抗原。
3.一種免疫原組合物，其包含(a)聚核苷酸佐劑，該佐劑包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、至少一種抗生素以及至少一個(gè)正價(jià)離子；以及(b)至少一種細(xì)菌抗原；其中該抗原是放線菌(actinobacteria)、衣原體(chlamydiae)、革蘭式陽(yáng)性菌(firmicutes)、變形菌(proteobacteria)或螺旋體(spirochaetes)中的一個(gè)抗原。
4.一種免疫原組合物，包含(a)聚核苷酸佐劑，該佐劑包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、至少一種抗生素以及至少一個(gè)正價(jià)離子；以及(b)至少一種真菌抗原；其中該抗原是子囊菌(ascomycota)或擔(dān)子菌(basidiomycota)中的一個(gè)抗原。
5.一種免疫原組合物，其包含(a)聚核苷酸佐劑，該佐劑包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、至少一種抗生素以及至少一個(gè)正價(jià)離子；以及(b)至少一種寄生蟲(chóng)抗原；其中該抗原是肉足鞭毛門(mén)(phylum sarcomastigophora)、頂覆門(mén)(phylumapicomplexa)、纖毛門(mén)(phylum ciliophora)、扁形動(dòng)物門(mén)(phylum plathyhelminthes)、線蟲(chóng)門(mén)(phylum nematode)或節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(phylum arthropoda)中的一個(gè)抗原。
6.一種免疫原組合物，其包含(a)聚核苷酸佐劑，該佐劑包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、至少一種抗生素以及至少一個(gè)正價(jià)離子；以及(b)至少一種癌腫抗原；其中該抗原是骨胳、腦部、乳房、消化道/腸胃道、內(nèi)分泌、眼部、泌尿生殖器、生殖細(xì)胞、婦科、頭頸部、血液、肺部、骨胳肌肉、神經(jīng)、呼吸系統(tǒng)/胸腔或皮膚癌中的一種癌腫抗原。
7.一種免疫原組合物，其包含(a)聚核苷酸佐劑，該佐劑包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、至少一種抗生素以及至少一個(gè)正價(jià)離子；以及(b)由二或更多種抗原所構(gòu)成的組合；其中這些抗原是腺病毒(adeniviridae)、沙粒病毒(arenaviridae)、星狀病毒(astroviridae)、本揚(yáng)病毒(bunyaviridae)、杯狀病毒(cliciviridae)、黃病毒(flaviviridae)、D型肝炎病毒(hepatitis delta virus)、肝炎病毒(hepeviridae)、單分子負(fù)鏈RNA病毒(mononegavirales)、巢病毒(nidovirales)、小RNA病毒(piconaviridae)、正黏液病毒(orthomyxoviridae)、乳頭瘤病毒(papillomaviridae)、細(xì)小病毒(parvoviridae)、多瘤病毒(polyomaviridae)、痘病毒(poxviridae)、呼腸孤病毒(reoviridae)、反轉(zhuǎn)錄病毒(retroviridae)、披膜病毒(togaviridae)、放線菌(actinobacteria)、衣原體(chlamydiae)、厚壁菌(firmicutes)、變形菌(proteobacteria)、螺旋體(spirochaetes)、子囊菌(ascomycota)、擔(dān)子菌(basidiomycota)、肉足鞭毛門(mén)(phylum sarcomastigophora)、頂覆門(mén)(phylumapicomplexa)、纖毛門(mén)(phylum ciliophora)、扁形動(dòng)物門(mén)(phylum plathyhelminthes)、線蟲(chóng)門(mén)(phylum nematode)和/或節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(phylum arthropoda)中的抗原。
8.如權(quán)利要求第1至7項(xiàng)中任一項(xiàng)的免疫原組合物，其中該組合物包含聚核苷酸佐劑組合物，該聚核苷酸佐劑組合物中的分子在分子量上是異質(zhì)的，其中該分子量為至少66,000道爾頓。
9.如權(quán)利要求第1至8項(xiàng)中任一項(xiàng)的免疫原組合物，其中該組合物包含聚核苷酸佐劑組合物，該聚核苷酸佐劑組合物中的分子在分子量上是異質(zhì)的，其中該分子量為約66,000道爾頓至1,200,000道爾頓。
10.如權(quán)利要求第1至9項(xiàng)中任一項(xiàng)的免疫原組合物，其中該組合物包含聚核苷酸佐劑組合物，該聚核苷酸佐劑組合物中的分子在分子量上是異質(zhì)的，其中該分子量為至少150,000道爾頓。
11.如權(quán)利要求第1至10項(xiàng)中任一項(xiàng)的免疫原組合物，其另外包含至少一個(gè)免疫調(diào)節(jié)物。
12.如權(quán)利要求第1至11項(xiàng)中任一項(xiàng)的免疫原組合物，其中該抗原為滅活微生物、減毒微生物、重組型多肽和/或合成型多肽。
13.如權(quán)利要求第1至12項(xiàng)中任一項(xiàng)的免疫原組合物，其中該免疫原組合物或是該免疫原組合物中所含有的PIKA佐劑是呈現(xiàn)液體、溶液、滴液、固體、膠囊、乳劑、懸浮液、酏劑、油膏、栓劑、凝膠、軟膠囊、噴劑、吸入劑、氣霧劑、片劑、包衣片、微膠囊、栓劑、糖衣錠(dragees)、糖漿、漿液、灌腸劑、顆粒、粉末、片劑或菱錠(lozenges)的形式。
14.如權(quán)利要求第1至12項(xiàng)中任一項(xiàng)的免疫原組合物，其中該佐劑組合物或免疫原組合物中的至少一者被冷凍干燥。
15.一種組合套裝，包含如權(quán)利要求第1至14項(xiàng)中任一項(xiàng)的免疫原組合物。
16.一種用以促進(jìn)宿主體內(nèi)對(duì)于抗原的免疫反應(yīng)的方法，該方法包含將如權(quán)利要求第1至14項(xiàng)中任一項(xiàng)的免疫原組合物給予該宿主。
17.如權(quán)利要求第16項(xiàng)的方法，其中該宿主罹患傳染病，且給予該抗原化合物激發(fā)免疫反應(yīng)以對(duì)抗造成該傳染病的病原體。
18.如權(quán)利要求第16或17項(xiàng)的方法，其中該給藥是通過(guò)胃腸道外注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、靜脈注射、皮下注射、局部給藥、透皮給藥或皮內(nèi)給藥來(lái)進(jìn)行。
19.一種如權(quán)利要求第1至14項(xiàng)中任一項(xiàng)的免疫原組合物在制造藥物上的用途，該藥物是用以促進(jìn)宿主對(duì)于該抗原的免疫反應(yīng)。
20.如權(quán)利要求第19項(xiàng)的用途，其中該宿主罹患傳染病，且給予該抗原激發(fā)免疫反應(yīng)以對(duì)抗造成該傳染病的病原體。
21.如權(quán)利要求第20項(xiàng)的用途，其中該給予是通過(guò)胃腸道外注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、靜脈注射、皮下注射、局部傳輸、透皮傳輸或皮內(nèi)傳輸來(lái)進(jìn)行。
22.如權(quán)利要求第16至18項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法以及如權(quán)利要求第19至21項(xiàng)中任一項(xiàng)的用途，其中該宿主是人類(lèi)。
23.如權(quán)利要求第16至18項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法以及如權(quán)利要求第19至21項(xiàng)中任一項(xiàng)的用途，其中該宿主是非人類(lèi)動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供聚核苷酸佐劑組合物以及引發(fā)免疫反應(yīng)的使用方法。本發(fā)明亦提供一種免疫原組合物，包含該聚核苷酸佐劑組合物和抗原等其它免疫原組合物(例如此二種成份位于一疫苗內(nèi))。本發(fā)明更涉及這些佐劑組合物的使用方法，特別是誘導(dǎo)對(duì)于抗原化合物的免疫反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101166559SQ200680000776
公開(kāi)日2008年4月23日 申請(qǐng)日期2006年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月13日
發(fā)明者林海祥, 李烈濤 申請(qǐng)人:申益皮卡生物技術(shù)有限公司