凝血因子viii聚合物偶聯(lián)物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含經(jīng)由凝血因子VIII中的碳水化物部分而被偶聯(lián)至水溶性聚合物的凝血因子VIII分子，本發(fā)明還涉及其制備方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，水溶性聚合物選自下組：聚乙二醇(PEG)、多聚唾液酸(PSA)或者葡聚糖。
【專利說(shuō)明】凝血因子Vl I I聚合物偶聯(lián)物
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年7月29日、申請(qǐng)?zhí)枮?00980130950. 3(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮?PCT/US2009/052103)、名稱為凝血因子VIII聚合物偶聯(lián)物的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 本申請(qǐng)為于2007年3月29日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)11/729,625的部分后續(xù)申請(qǐng)， 美國(guó)專利申請(qǐng)11/729,625要求分別在2006年6月6日及2006年3月21日申請(qǐng)的美國(guó)臨 時(shí)專利申請(qǐng)60/790, 239及60/787, 968的優(yōu)先權(quán)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及一種包含與至少一種水溶性聚合物（包括聚環(huán)氧烷，例如聚乙二醇） 相結(jié)合的凝血因子Vin(FVIII)的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。此外，本發(fā)明還涉及用于延長(zhǎng)患有與 FVIII功能缺陷或缺乏相關(guān)的出血性疾病的哺乳動(dòng)物的血液中FVIII的體內(nèi)半衰期的方 法。

【背景技術(shù)】
[0004] 血漿中的凝血因子VIII (FVIII)以很低的濃度循環(huán)并且非共價(jià)地結(jié)合于馮威勒 布蘭特因子（von Willebrand factor，VWF)。在止血期間，F(xiàn)VIII與VWF分開，并作為協(xié)同 因子，在鈣和磷脂或者細(xì)胞膜存在的情況下，通過(guò)提高活化速度，用于受被活化的凝血因子 IX(FIXa)調(diào)節(jié)的凝血因子X(jué)(FX)的活化。
[0005] FVIII被合成為具有結(jié)構(gòu)域A1-A2-B-A3-C1-C2的大約270-330kD的單鏈前體。當(dāng) FVIII被從血漿中純化時(shí)（比如是"來(lái)源于血漿的"或者"血漿的")，F(xiàn)VIII由重鏈（A1-A2-B) 和輕鏈（A3-C1-C2)組成。輕鏈分子量是80kD，然而由于B結(jié)構(gòu)域內(nèi)的蛋白質(zhì)水解，重鏈分 子量在90-220kD的范圍內(nèi)。
[0006] FVIII也可被合成為重組蛋白質(zhì)用于出血性疾病的治療使用。已經(jīng)設(shè)計(jì)了不同的 體外試驗(yàn)來(lái)確定重組體FVIII (rFVIII)作為治療藥物的潛在有效性。這些試驗(yàn)?zāi)M內(nèi)源性 FVIII的體內(nèi)效果。正如體外分析所測(cè)定的那樣，F(xiàn)VIII的體外凝血酶處理導(dǎo)致它的促凝血 活性急劇增加和隨后的減少?；罨褪Щ钆c重鏈和輕鏈兩者中的特異的限制性蛋白質(zhì)水解 一致，限制性蛋白質(zhì)水解可改變FVIII中的不同結(jié)合表位的可用性，比如允許FVIII與VWF 分離并且結(jié)合至磷脂表面、或者改變與某些單克隆抗體的結(jié)合能力。
[0007] FVIII的缺乏或者功能障礙與最常見的出血性疾病即甲型血友病相關(guān)。甲型血友 病的治療手段選擇是采用來(lái)源于血漿的濃縮物或者rFVIII濃縮物的替代療法。FVIII水平 低于1%的重癥甲型血友病患者通常采用預(yù)防性療法，目的是在給藥之間保持FVIII在1% 以上?？紤]到血液循環(huán)中不同的FVIII產(chǎn)物的平均半衰期，該目的通常通過(guò)每周給藥兩至 三次FVIII來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0008] 在市場(chǎng)上有許多濃縮物用于甲型血友病的治療。這些濃縮物之一是重組體產(chǎn)物 Advatc?，其在CHO細(xì)胞中被生產(chǎn)出來(lái)，并且由巴克斯特保健公司制造。在細(xì)胞培養(yǎng)工藝、 純化、或該產(chǎn)品的最終配制中沒(méi)有加入人或動(dòng)物血漿蛋白或者白蛋白。
[0009] 目前許多FVIII濃縮物和治療性多肽類藥物的制造商的目標(biāo)是開發(fā)下一代產(chǎn)品， 該產(chǎn)品具有增強(qiáng)的藥效和藥物動(dòng)力學(xué)特性，同時(shí)保持所有其他的產(chǎn)品特征。
[0010] 治療性多肽類藥物可被蛋白水解酶快速降解并被抗體中和。這降低了它們的半衰 期和循環(huán)時(shí)間，因此限制了它們的療效。已經(jīng)有研宄顯示，添加可溶性聚合物或者碳水化合 物至多肽可以抑制降解并延長(zhǎng)多肽的半衰期。例如，將多肽類藥物聚乙二醇化可保護(hù)它們 并且增強(qiáng)它們的藥效和藥物動(dòng)力學(xué)特性（Harris J M et Chess R B, Nat Rev Drug Discov 2003;2:214-21)。聚乙二醇化方法可將聚乙二醇（PEG)的重復(fù)單元連接至多肽藥物。分子 的聚乙二醇化可以導(dǎo)致藥物對(duì)酶降解的抗性增加、體內(nèi)半衰期增加、給藥頻率降低、免疫原 性降低、物理和熱穩(wěn)定性增加、溶解性增加、液體穩(wěn)定性增加和凝聚減少。
[0011] 因此，比如通過(guò)聚乙二醇化，添加可溶性聚合物是提高FVIII產(chǎn)物性能的一種方 法?，F(xiàn)有技術(shù)狀況已有不同的專利和專利申請(qǐng)記載：
[0012] 美國(guó)專利申請(qǐng)6, 037, 452描述了聚（環(huán)氧烷）FVIII或者FIX偶聯(lián)物，其中蛋白質(zhì) 通過(guò)所述FVIII的羰基被共價(jià)連接至聚（環(huán)氧烷）上。
[0013] EP1258497B1描述了一種制備FVIII與生物相容性聚合物的偶聯(lián)物的方法。該專 利被R^tin等人的出版物（Bioconj Chem 2000;11:387-96)進(jìn)行了補(bǔ)充。偶聯(lián)物包括被 刪除的且被單甲氧基聚乙二醇修飾的重組FVIII。偶聯(lián)物降低了 FVIII功能，并且促凝血活 性隨著修飾度的增加而快速地降低。
[0014] WO 4075923 A3描述了一種共聚物-FVIII分子偶聯(lián)物，其包含多個(gè)偶聯(lián)物，其中 每個(gè)偶聯(lián)物都有一至三個(gè)被共價(jià)連接至FVIII分子上的水溶性聚合物。該FVIII分子的B 結(jié)構(gòu)域已被刪除。
[0015] 美國(guó)專利4, 970, 300描述一種被修飾的FVIII，其中包含具有FVIII活性的蛋白質(zhì) 的不溶性偶聯(lián)物被共價(jià)連接至無(wú)抗原性配體。
[0016] 美國(guó)專利6, 048, 720描述了多肽和生物相容性聚合物的偶聯(lián)物。
[0017] W094/15625描述了連接于聚乙二醇的FVIII，該聚乙二醇具有不超過(guò)5000道爾頓 的優(yōu)選分子量。
[0018] 仍需要一種含有被連接的可溶性聚合物以便延長(zhǎng)FVIII體內(nèi)半衰期的FVIII，比 如聚乙二醇化的FVIII，如含有被偶聯(lián)的大于10000道爾頓的PEG的全長(zhǎng)FVIII，與非聚乙 二醇化的FVIII相比，其保留了功能活性同時(shí)提供延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含經(jīng)由凝血因子VIII中的碳水化物部分而 偶聯(lián)至水溶性聚合物的凝血因子VIII分子。本發(fā)明還涉及其制備方法。
[0020] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種將水溶性聚合物偶聯(lián)至FVIII中被氧化的 碳水化物部分的方法，包括在允許偶聯(lián)的條件下將被氧化的碳水化物部分與被活化的水溶 性聚合物相接觸。在一個(gè)相關(guān)的方面，所述水溶性聚合物選自下組：PEG、PSA和葡聚糖。在 另一方面，所述被活化的水溶性聚合物選自下組：PEG-酰肼、PSA-肼和醛活化的葡聚糖。在 本發(fā)明的另一方面，所述碳水化物部分是通過(guò)在包含NaIO 4的緩沖液中溫育被氧化的。而 在另一方面，所述FVIII中被氧化的碳水化物部分位于FVIII的B結(jié)構(gòu)域。
[0021] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供根據(jù)如上所述方法中的任一方法所產(chǎn)生的被 修飾的FVIII。而在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含：(a)凝血因子VIII 分子；和（b)至少一個(gè)連接至所述凝血因子VIII分子的水溶性聚合物，其中所述水溶性聚 合物通過(guò)一個(gè)以上位于凝血因子VIII的B結(jié)構(gòu)域中的碳水化物部分而被連接于凝血因子 VIII。在本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)的方面，所述水溶性聚合物選自下組：PEG、PSA和葡聚糖。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1顯示用SDS-PAGE及隨后的免疫印跡法測(cè)定的rFVIII與PEG偶聯(lián)后的條帶變 寬和質(zhì)量增加。
[0023] 圖2顯示在血友病小鼠中PEG-rFVIII偶聯(lián)物與未偶聯(lián)FVIII相比的藥物動(dòng)力學(xué)。 空心正方形：PEGrFVIII，200IU FVIII/kg 劑量。實(shí)心菱形：天然 rFVIII，200IU FVIII/kg 劑量。
[0024] 圖3顯示通過(guò)使用不同抗FVIII抗體的SDS-PAGE進(jìn)行的聚乙二醇化位點(diǎn)的詳細(xì) 分析。
[0025] 圖4顯示凝血酶誘導(dǎo)的天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的活化和失活。
[0026] 圖5顯示表示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的結(jié)構(gòu)域的條帶。
[0027] 圖6顯示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的不同結(jié)構(gòu)域的聚乙二醇化程度。
[0028] 圖7顯示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的凝血酶失活速度。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明是一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含含有至少一部分完整B結(jié)構(gòu)域的FVIII分 子，該FVIII分子連接至水溶性聚合物上，水溶性聚合物包括：聚環(huán)氧烷、聚乙烯基吡咯 烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇蛘咛妓衔锶缇弁僖核幔≒SA)或者葡聚 糖。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，水溶性聚合物是分子量大于10000道爾頓的聚乙二醇分 子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，水溶性聚合物的分子量從大于10000道爾頓至大約125000道爾 頓，大約15000道爾頓至20000道爾頓，或者大約18000道爾頓至大約25000道爾頓。在 一個(gè)實(shí)施方式中，構(gòu)建體保留了標(biāo)準(zhǔn)的治療性FVIII產(chǎn)品的全部功能活性，并且與標(biāo)準(zhǔn)治 療性FVIII產(chǎn)品相比較，體內(nèi)半衰期得到延長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，相對(duì)于天然凝血因 子 VIII，構(gòu)建體保留至少 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140 或 150 百分比（％)的生物活性。在一個(gè) 相關(guān)方面，構(gòu)建體和天然凝血因子VIII的生物活性通過(guò)顯色活性與FVIII抗原值的比值 (FVIII :Chr:FVIII:Ag)來(lái)確定。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，相對(duì)于天然凝血因子VIII 的體內(nèi)半衰期，構(gòu)建體的半衰期減少或者增加〇. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1. 2、1. 3、 1. 4、1· 5、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 倍。
[0030] 本發(fā)明的起始物質(zhì)是FVIII，可以來(lái)源于人血漿或者通過(guò)重組工程技術(shù)產(chǎn)生，如同 在美國(guó)專利 4, 757, 006、5, 733, 873、5, 198, 349、5, 250, 421、5, 919, 766、EP306968 中所描述 的那樣。
[0031] 此處，術(shù)語(yǔ)"凝血因子VIII"或者"FVIII"指的是含有至少一部分完整B結(jié)構(gòu)域的 任何FVIII分子，并且可展示出與天然FVIII相關(guān)的生物活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式 中，F(xiàn)VIII分子是全長(zhǎng)凝血因子VIII。FVIII分子是蛋白質(zhì)，被能與編碼因子VIIIC的DNA 雜交的DNA序列所編碼。這種蛋白質(zhì)可以在A1-A2-B-A3-C1-C2結(jié)構(gòu)域之間或者域內(nèi)的不 同位點(diǎn)處含有氨基酸缺失（美國(guó)專利4, 868, 112)。FVIII分子也可以是天然FVIII的類似 物，其中一個(gè)以上的氨基酸殘基通過(guò)定點(diǎn)突變而被替代。
[0032] 用于本發(fā)明的FVIII分子包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的前體、蛋白質(zhì)生物活性或功 能性的亞基或片斷、它們功能性衍生物、以及如下所述的它們的變體。提及的FVIII指的是 包括這種蛋白質(zhì)的所有可能形式，并且其中FVIII的每個(gè)形式含有至少一部分或者完整 的天然B結(jié)構(gòu)域序列。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"重組凝血因子VIII"(rFVIII)可以包括任何通過(guò)重組DNA技術(shù) 獲得的異源的或者天然產(chǎn)生的rFVIII，或者它們的生物活性衍生物。在某些實(shí)施方式中，該 術(shù)語(yǔ)包括如上所述的蛋白質(zhì)和編碼本發(fā)明rFVIII的核酸。這種核酸包括，比如但不限于： 基因、前mRNA、mRNA、多態(tài)性變體、等位基因、合成的和自然產(chǎn)生的突變體。術(shù)語(yǔ)rFVIII包含 的蛋白質(zhì)包括，比如但不限于：上述那些蛋白質(zhì)和多肽、被上述核酸編碼的蛋白質(zhì)、種間同 源物和如下的其它多肽：（1)在至少約25、約50、約100、約200、約300、約400個(gè)或者更多 個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)（直至成熟的天然蛋白質(zhì)的406個(gè)氨基酸的全長(zhǎng)序列），含有的氨基酸序 列相較于此處描述的標(biāo)準(zhǔn)核酸編碼的多肽或者氨基酸序列具有約60%、約65%、約70%、 約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約98%、約99%或者更大的氨基酸序列一致性；和/或（2)特異性結(jié)合抗體，比如多 克隆或者單克隆抗體，該抗體是針對(duì)包含此處描述的引用的氨基酸序列的免疫原、它的免 疫原片斷和/或它的保守修飾的變體而產(chǎn)生的抗體。
[0034] 本發(fā)明的編碼rFVIII的聚核苷酸，包括但不限于：（1)在嚴(yán)格雜交條件下可與編 碼此處描述的引用的氨基酸序列進(jìn)行特異性雜交的聚核苷酸和它的保守修飾變體；（2)在 至少約25、約50、約100、約150、約200、約250、約500、約1000個(gè)或者更多個(gè)核苷酸的范圍 內(nèi)（直至成熟蛋白質(zhì)的1218個(gè)核苷酸的全長(zhǎng)序列），含有的核酸序列相較于此處描述的引 用的核酸序列具有約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或者更高的核苷酸序列一致 性。
[0035] 此處使用的術(shù)語(yǔ)"內(nèi)源性FVIII "包括來(lái)源于準(zhǔn)備接受治療的哺乳動(dòng)物的FVIII。 該術(shù)語(yǔ)還包括由存在于所述哺乳動(dòng)物中的轉(zhuǎn)基因或者其它任何外源DNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)的 FVIII。此處使用的"外源性FVIII "包括并非來(lái)源于所述哺乳動(dòng)物的FVIII。
[0036] 變體（或者類似物）多肽包括插入型變體，其中一個(gè)以上氨基酸殘基被添加至本 發(fā)明的FVIII氨基酸序列中。插入可以位于蛋白質(zhì)的任一末端或者兩個(gè)末端，并且/或者 可以位于FVIII氨基酸序列的內(nèi)部區(qū)域內(nèi)。在任一末端或者兩個(gè)末端具有附加的殘基的插 入型變體，包括比如，融合蛋白質(zhì)或者包括氨基酸標(biāo)記物或者其他氨基酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。在 一個(gè)方面，F(xiàn)VIII分子可以任選地含有N-末端蛋氨酸，尤其是當(dāng)分子在細(xì)菌細(xì)胞比如大腸 桿菌（E. coli)中被重組表達(dá)時(shí)。
[0037] 在缺失型變體中，去除此處所描述的FVIII多肽中一個(gè)以上氨基酸殘基。缺失可 以在FVIII多肽的一個(gè)末端或者兩個(gè)末端發(fā)生，并且/或者在FVIII氨基酸序列內(nèi)去除一 個(gè)以上的殘基。因此缺失型變體包括FVIII多肽序列的所有片段。
[0038] 在取代型變體中，F(xiàn)VIII多肽中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被去除并且用可選 的殘基來(lái)取代。在一個(gè)方面，取代實(shí)際上是保守性的，并且這種保守性取代在本領(lǐng)域 中是已知的?？蛇x擇地，本發(fā)明還包括那些非保守性的取代。典型的保守性取代在 Lehninger[Biochemistry,第 2 版；Worth Publishers 公司，New York(1975),第 71-77 頁(yè)]中被描述，并且列在下文中。
[0039] 保守件取代
[0040] 側(cè)鏈特征 氨基酸
[0041] 非極性（疏水性）：
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含： (a) 凝血因子VIII分子；和 (b) 至少一個(gè)連接于所述凝血因子VIII分子的PSA或者PEG，其中所述PSA或者PEG 經(jīng)由一個(gè)或一個(gè)以上的位于凝血因子VIII的B結(jié)構(gòu)域中的碳水化物部分而連接于凝血因 子VIII，其中所述分子保留了至少50%的天然凝血因子VIII活性。
2. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中所述分子保留了至少80%的天然凝血因子 VIII活性。
3. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中凝血因子VIII是重組凝血因子VIII或血 漿凝血因子VIII。
4. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中所述PSA或者PEG經(jīng)由連接物而連接于碳 水化物部分，其中所述連接物優(yōu)選為可釋放的或可水解的，更優(yōu)選為4-[4-N-馬來(lái)酰亞胺 基苯基]丁酸肼（MBPH)。
5. -種組合物，其包含權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)中所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。
6. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述組合物基本上不含白蛋白。
7. 如權(quán)利要求4所述的組合物，其進(jìn)一步包含未偶聯(lián)的凝血因子VIII部分。
8. -種用于治療出血性疾病的組合物，其中所述組合物包含： (i) 如權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)中所述的組合物；和 (ii) 藥學(xué)上可接受的賦形劑。
9. 如權(quán)利要求8中所述的組合物在制備治療出血性疾病的藥物中的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述治療包含： (i) 根據(jù)出血性疾病的類型和個(gè)體臨床病史確定組合物的劑量；和 (ii) 給藥組合物。
11. 使得凝血因子VIII分子在患有出血性疾病個(gè)體內(nèi)有效維持在至少1%水平的藥物 組合物的單位劑量，其包含： (i) 如權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)中所述的組合物； (ii) 藥學(xué)上可接受的賦形劑。
12. 如權(quán)利要求8所述的組合物或如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用或如權(quán)利要求11所述的單 位劑量，其中所述出血性疾病是血友病A。
13. 如權(quán)利要求11所述的單位劑量，其中所述藥物組合物呈適于注射的形式。
14. 如權(quán)利要求11所述的單位劑量，其中所述藥物組合物被包裝在器皿中。
15. -種包含藥物組合物的試劑盒，其包含： (i) 如權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)中所述的組合物；和 (ii) 藥學(xué)上可接受的賦形劑， 被包裝在含有標(biāo)簽的容器內(nèi)，該標(biāo)簽描述了所述藥物組合物的用途。
16. -種包含第一容器和第二容器的試劑盒，第一容器包含： (i) 如權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)中所述的組合物；和 (ii) 藥學(xué)上可接受的賦形劑； 第二容器包含用于第一容器中的組合物的生理學(xué)上可以接受的復(fù)配溶液，其中所述試 劑盒和描述所述組合物用途的標(biāo)簽一起被包裝。
17. 如權(quán)利要求15或16所述的試劑盒，其中所述藥物組合物以單位劑量的形式被包 裝。
18. -種制備如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，其中所述方法包含在允許偶 聯(lián)的條件下，令至少一個(gè)PSA或PEG經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)位于凝血因子VIII的B結(jié)構(gòu)域中的碳 水化物部分而連接于凝血因子VIII。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述分子保留了至少50%的天然凝血因子VIII 活性，優(yōu)選至少80%的天然凝血因子VIII活性。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK104479006SQ201410817617
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2008年8月1日
【發(fā)明者】皮特·圖雷切克, 于爾根·西科曼 申請(qǐng)人:巴克斯特國(guó)際公司, 巴克斯特保健股份有限公司