人凝血因子viii基因22號(hào)內(nèi)含子倒位型突變的原位修復(fù)質(zhì)粒、試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人凝血因子VIII基因22號(hào)內(nèi)含子倒位型突 變的原位修復(fù)質(zhì)粒、試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血友病A (Hemophilia A，HA)是最常見的X連鎖出血性遺傳病，發(fā)病率較高，重型 血友病具有致殘致死性，尚無根治方法。HA-直被學(xué)術(shù)界認(rèn)為是最有可能通過基因治療治 愈的遺傳病之一，其病因是由于人凝血因子VIII基因（以下簡(jiǎn)稱F8)缺陷而導(dǎo)致人凝血 因子VIII蛋白（FVIII)含量不足或功能缺陷，從而引起凝血功能障礙，在出生男嬰中的發(fā) 病率約為1/5000。HA的主要癥狀為自發(fā)性出血或創(chuàng)傷后出血不止。關(guān)節(jié)反復(fù)出血?？芍?殘，重型血友?。‵VIIK1%，約占血友病患者的50% -60% )患者甚至可能由于顱內(nèi)出血 而危及生命。目前針對(duì)該病主要使用含F(xiàn)VIII的血漿制品行替代治療，早期的血漿制品存 在病毒污染（艾滋病病毒、丙型肝炎病毒等）等問題，工藝改進(jìn)后以及重組的FVIII制品價(jià) 格昂貴，由于FVIII在血漿中的半衰期只有12小時(shí)，因此血友病患者常需終身反復(fù)輸注，這 給患者及家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)。另外，一部分HA患者會(huì)由于反復(fù)輸注而產(chǎn)生 FVIII抑制性抗體，導(dǎo)致替代治療無效。
[0003] 基因治療作為一種全新的治療方式，為類似血友病這樣的嚴(yán)重單基因遺傳病帶來 了新的希望。而血友病也一直被學(xué)術(shù)界認(rèn)為是最有可能實(shí)現(xiàn)基因治療的遺傳病之一?；?治療最理想的方式是原位修復(fù)，即在缺陷基因的原位點(diǎn)通過同源重組的途徑進(jìn)行精確的基 因修復(fù)。這樣修復(fù)的好處是顯而易見的：不僅保留了基因的完整性，同時(shí)還保留了基因的 調(diào)控元件，修復(fù)后的基因能夠像正常人的一樣發(fā)揮作用，但是該方法對(duì)技術(shù)要求較高。另一 種基因治療方式是基因替代，就是將帶有啟動(dòng)子的治療基因隨機(jī)或者定點(diǎn)整合到缺陷細(xì)胞 中，從而達(dá)到治療的目的。由于技術(shù)的限制，目前進(jìn)行的絕大部分基因治療研宄都是采用基 因替代策略。
[0004] F8于1984年被成功克隆，該基因長(zhǎng)達(dá)186kb，包含26個(gè)外顯子，是已克隆的最大 基因之一。其cDNA長(zhǎng)達(dá)9kb，這對(duì)目前的載體系統(tǒng)是一個(gè)比較大的挑戰(zhàn)。即使是采用廣泛使 用的B區(qū)缺失策略，編碼序列也有約4. 5kb，這直接導(dǎo)致使用常規(guī)的基因治療手段，很難達(dá) 到較高的治療基因整合效率。這是導(dǎo)致目前HA的基因治療研宄未取得突破的一個(gè)原因。 血友病B (hemophilia B，HB)的發(fā)病率只有HA的約四分之一，但是目前已有較有效的針對(duì) HB的基因治療研宄，一定程度上是因?yàn)槿四蜃覫X基因（F9)的編碼序列只有1.4kb，比 較易于操作。
[0005] F8的突變類型非常多，至今人類突變數(shù)據(jù)庫（The Human Gene Mutation Database，HGMD)記錄的突變種類已有2800多種，包括錯(cuò)義突變、無義突變、小片段缺失與 插入等。Lakich等在1993年發(fā)現(xiàn)，約有45%的重型患者為22號(hào)內(nèi)含子倒位型突變。機(jī)制 如圖1所示，F(xiàn)8的22號(hào)內(nèi)含子內(nèi)部含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄的基因，A基因和B基因。在F8基因外 部，位于X染色體的遠(yuǎn)端還有兩個(gè)與A基因高度同源的拷貝。在男性減數(shù)分裂過程中，F(xiàn)8 基因內(nèi)的A基因可能與F8外的任何一個(gè)A基因配對(duì)，從而導(dǎo)致同源重組介導(dǎo)的倒位發(fā)生， 中間倒位的片段長(zhǎng)達(dá)〇. 6Mb，直接導(dǎo)致F8基因被完全破壞，進(jìn)而導(dǎo)致患者呈現(xiàn)重型HA的表 型。
[0006]從圖1我們可以發(fā)現(xiàn)，該倒位對(duì)F8的直接結(jié)果是導(dǎo)致22號(hào)內(nèi)含子以后的部分與 前一部分完全分開。另外雖然牽涉了大片段的倒位，但是F8前22個(gè)外顯子以及啟動(dòng)子區(qū) 域是完全保留的，而通過比對(duì)我們發(fā)現(xiàn)后面4個(gè)外顯子的編碼序列僅有627bp。
[0007]人體中FVIII由肝臟分泌，主要是肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs)。這 類細(xì)胞由于取材難度以及增殖能力的限制，并不適合直接用來進(jìn)行基因打靶。而人誘導(dǎo)多 潛能干細(xì)胞由于具有無限增殖能力以及多向分化潛能，非常適合用于驗(yàn)證這種修復(fù)策略。 最近國際上在iPSCs誘導(dǎo)方面取得了一些突破性進(jìn)展，比如北京大學(xué)的鄧宏魁實(shí)驗(yàn)室建立 了僅使用小分子化合物成功誘導(dǎo)出了小鼠iPSCs。這種技術(shù)完全避免了病毒感染和其它轉(zhuǎn) 基因誘導(dǎo)的使用，大大地提高了 iPSCs的安全性。雖然這些前沿性技術(shù)現(xiàn)在還僅僅在小鼠 細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，但是縱觀干細(xì)胞的發(fā)展史，我們有理由相信在不久的將來很有可能會(huì)出現(xiàn)相對(duì) 安全的人iPSCs誘導(dǎo)技術(shù)，屆時(shí)iPSCs在再生醫(yī)學(xué)以及基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用將翻開新的篇 早。
[0008] 進(jìn)兩年興起的類轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)TALENs是一種人工核酸酶，與上一代人工核酸酶鋅指酶 (zinc finger nucleases，ZFNs)相比，具有易于設(shè)計(jì)以及較高的有效率等特點(diǎn)。TALENs與 ZFNs類似，可以特異性切割DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂（double strand break，DSB)。由于細(xì)胞修 復(fù)DSB主要是通過不精確的非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ)機(jī)制修 復(fù)，所以目前TALEN被廣泛用來做基因敲除。另一方面，DSB可以激活位點(diǎn)附近的同源重組 (homologous recombination)活性，在打祀載體存在的情況下，可提高基因打革E效率達(dá)3 個(gè)數(shù)量級(jí)之多。
[0009]目前針對(duì)血友病的基因治療研宄都是采用基因替代的方法，就是將一個(gè)完整的外 源人凝血因子VIII基因（F8基因）表達(dá)框?qū)氲饺毕菁?xì)胞內(nèi)，從而發(fā)揮作用替代缺陷的基 因，而缺陷的基因本身并沒有得到修復(fù)。針對(duì)突變基因最理想的策略是原位修復(fù)，HA當(dāng)中 最常見的突變類型是22號(hào)內(nèi)含子倒位型突變，約有45%的重度HA患者的都這種突變類型， 開發(fā)一種針對(duì)這種突變的原位修復(fù)方法對(duì)疾病的研宄是很有意義的。目前在其他基因的原 位修復(fù)研宄中，一般是針對(duì)點(diǎn)突變的修復(fù)，還沒有針對(duì)F8基因22號(hào)內(nèi)含子倒位突變的原位 修復(fù)策略。
[0010] 如上所述，目前還沒有針對(duì)22號(hào)內(nèi)含子倒位型F8突變的原位修復(fù)策略。如果把 范圍擴(kuò)大的話，目前HA的基因治療研宄倒是有不少，都是使用的隨機(jī)整合策略。這種策略 是一種比較粗放的基因治療方式，就是使用一個(gè)質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染F8缺陷的細(xì)胞，這個(gè)質(zhì)粒包含 了 F8的整個(gè)編碼序列以及一個(gè)啟動(dòng)子序列。F8表達(dá)框有一定幾率整合到基因組中，從而表 達(dá)FVIII蛋白發(fā)揮作用。其缺點(diǎn)有：
[0011] a. F8很大，編碼序列為8kb左右，即使是一種B區(qū)缺失的版本也有4k多，再加上啟 動(dòng)子序列，那么這個(gè)質(zhì)粒很大，一般來說質(zhì)粒越大，構(gòu)建也越麻煩，整合效率也很低。
[0012] 而我們的策略最終整合的片段只有627bp的編碼序列和一個(gè)polyA信號(hào)，總長(zhǎng)為 893bp，技術(shù)上非常容易實(shí)現(xiàn)；
[0013] b.如果基因隨機(jī)整合到基因組中，基因的表達(dá)可能會(huì)受到位置效應(yīng)的影響，有可 能表達(dá)效率低，甚至不能表達(dá)。
[0014] 我們的策略是原位修復(fù)，就是將原來的突變的基因修復(fù)，這樣可以在基因原有的 啟動(dòng)子以及調(diào)控元件下，像正常人的那樣表達(dá)；
[0015] c.如果質(zhì)粒整合到其他內(nèi)源性基因則有可能破壞內(nèi)源性基因或者激活原來不表 達(dá)的有害基因，從而導(dǎo)致不好的后果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種人凝血因子VIII基因22號(hào)內(nèi)含子倒 位型突變的原位修復(fù)質(zhì)粒、試劑盒及方法。
[0017] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0018] 本發(fā)明提供了一種人凝血因子VIII基因22號(hào)內(nèi)含子倒位型突變的原位修復(fù)質(zhì) 粒，所述質(zhì)粒序列如SEQ ID N0. 29所示，命名為質(zhì)粒F8-22-PGK-Neo。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建上述質(zhì)粒的試劑盒，所述試劑盒包括序列如SEQ ID NO. 7至SEQ ID NO. 18所示的引物。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種人凝血因子VIII基因22號(hào)內(nèi)含子倒位型突變的原位修復(fù)試 劑盒，所述試劑盒包括序列如SEQ ID NO. 1至SEQ ID N0. 28所示的引物。所述試劑盒中還 包括質(zhì)粒 F8-22-PGK-Neo。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種人凝血因子VIII基因22號(hào)內(nèi)含子倒位型突變的原位修復(fù)方 法，所述方法是采用人凝血因子VIII基因22號(hào)內(nèi)含子倒位型突變的原位修復(fù)試劑盒將人 凝血因子VIII基因23-26號(hào)外顯子的編碼序列及polyA信號(hào)通過同源重組的方式添加到 人凝血因子VIII基因22號(hào)外顯子和22號(hào)內(nèi)含子的交界處，將22號(hào)內(nèi)含子倒位型突變的 人凝血因子VIII基因遺傳信息補(bǔ)全。具體包括如下步驟：
[0022] (1)構(gòu)建TALENs表達(dá)質(zhì)粒；
[0023] (2)構(gòu)建質(zhì)粒 F8-22-PGK_Neo;
[0024] (3)用TALENs表達(dá)質(zhì)粒和質(zhì)粒F8-22-PGK-Neo轉(zhuǎn)染人凝血因子VIII基因22號(hào)內(nèi) 含子倒位型突變的人誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞中進(jìn)行原位修復(fù)。
[0025] 下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0026] 本發(fā)明試劑盒所涉及的引物如表1所示：
[0027]表1
[0028]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人凝血因子VIII基因22號(hào)內(nèi)含子倒位型突變的原位修復(fù)質(zhì)粒，其特征在于，所 述質(zhì)粒序列如SEQIDNO. 29所示，命名為質(zhì)粒F8-22-PGK-Neo。
2. 構(gòu)建權(quán)利要求1所述質(zhì)粒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括序列如SEQID NO. 7至SEQIDNO. 18所示的引物。
3. -種人凝血因子VIII基因22號(hào)內(nèi)含子倒位型突變的原位修復(fù)試劑盒，其特征在于， 所述試劑盒包括序列如SEQIDNO. 1至SEQIDNO. 28所示的引物。
4. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括權(quán)利要求1所述的質(zhì) 粒。
5. -種人凝血因子VIII基因22號(hào)內(nèi)含子倒位型突變的原位修復(fù)方法，其特征在于，所 述方法是采用權(quán)利要求3所述的試劑盒將人凝血因子VIII基因23-26號(hào)外顯子的編碼序 列及PolyA信號(hào)通過同源重組的方式添加到人凝血因子VIII基因22號(hào)外顯子和22號(hào)內(nèi) 含子的交界處，將22號(hào)內(nèi)含子倒位型突變的人凝血因子VIII基因遺傳信息補(bǔ)全。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述采用權(quán)利要求3所述的試劑盒將人凝血 因子VIII基因23-26號(hào)外顯子的編碼序列及polyA信號(hào)通過同源重組的方式添加到人凝 血因子VIII基因22號(hào)外顯子和22號(hào)內(nèi)含子的交界處包括如下步驟： (1) 構(gòu)建TALENs表達(dá)質(zhì)粒； (2) 構(gòu)建質(zhì)粒F8-M-PGK-Neo; (3) 用TALENs表達(dá)質(zhì)粒和質(zhì)粒F8-22-PGK-Neo轉(zhuǎn)染人凝血因子VIII基因22號(hào)內(nèi)含子 倒位型突變的人誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞中進(jìn)行原位修復(fù)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人凝血因子VIII基因22號(hào)內(nèi)含子倒位型突變的原位修復(fù)質(zhì)粒、試劑盒及方法。本發(fā)明構(gòu)建了針對(duì)性的原位修復(fù)治療，針對(duì)性地修復(fù)這種類型的F8突變，并且聯(lián)合應(yīng)用TALEN技術(shù)在血友病病人特異的iPSCs中驗(yàn)證了這種原位修復(fù)策略。這是國際上第一個(gè)針對(duì)內(nèi)含子22倒位這種常見HA突變的原位修復(fù)策略。原位修復(fù)策略導(dǎo)入的序列是精確的定點(diǎn)導(dǎo)入，相對(duì)安全，不存在現(xiàn)有技術(shù)中的不確定性。
【IPC分類】C12N15-55, C12N15-12, C12N15-85
【公開號(hào)】CN104762318
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510053175
【發(fā)明人】梁德生, 吳涌, 鄔玲仟
【申請(qǐng)人】中南大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年2月2日