專利名稱：包含馮維勒布蘭德因子(vWF)的制劑及其相關(guān)制備方法、試劑盒和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
提供了對于包含vWF的制劑的方法、組合物和試劑盒，包括此類制劑用于制備VIII因子(FVIII)的方法、試劑盒和用途。還提供了 VWF多肽和編碼它們的核酸分子。
背景技術(shù)：
由哺乳動物細胞表達的FVIII常常通過與表面成分(例如蛋白聚糖)相互作用或者通過受體介導的事件(例如與LRP受體相互作用)特異性地或者非特異性地吸收到細胞表面上。還有可能,所表達的FVIII在培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中被酶促切割和/或降解。隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中所表達的FVIII濃度降低，除非在表達后所分泌的物質(zhì)被迅速移出(例如通過灌注技術(shù))。在通常情況下，可以通過常規(guī)色譜方法，包括吸附至帶電荷基質(zhì)上或者通過假親和層析，從培養(yǎng)基中移出FVIII-vWF復合體。然后可以通過選擇性洗滌步驟從FVIII vffF復合體純化出FVIII，得到最低程度vWF污染的富含F(xiàn)VIII分子的群體。vWF通過組成型或者受激釋放而在血管內(nèi)皮細胞中形成，血管內(nèi)皮細胞是該血漿蛋白質(zhì)的主要來源，但是其還少量地由巨核細胞合成。據(jù)信，翻譯的初級產(chǎn)物由2813個氨基酸組成。在將信號肽(22個氨基酸)切下后，發(fā)生二聚化。在高爾基器中實現(xiàn)進一步加工，在切割和去除前肽(741個氨基酸)后二聚體聚合。前肽在二聚體的進一步連接中起著重要的作用，其中前肽催化在氨基末端上形成二硫鍵。因此，可以形成大小范圍在從500，000道爾頓的二聚體至高達2000萬道爾頓的大多聚體的不同大小的寡聚體。除了蛋白水解過程之外，VffF還經(jīng)歷其它翻譯后修飾，包括糖基化和硫酸化。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面中，本發(fā)明提供了包含在vWF多肽中存在的第一氨基酸序列和與第一氨基酸序列異源的第二氨基酸序列的多肽，其中多肽能夠結(jié)合FVIII。在另一方面中，本發(fā)明提供了包含含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽的組合物。在一些方面中，本發(fā)明提供了包含多肽和FVIII的蛋白質(zhì)復合體。在其它方面中，本發(fā)明提供了包含該蛋白質(zhì)復合體的組合物。在再一方面中，本發(fā)明提供了編碼包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在一個方面中，本發(fā)明提供了包含所述核苷酸序列的表達載體。
在另一方面中，本發(fā)明提供了表達包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽的細胞。在一些方面中，本發(fā)明提供了表達包含所述多肽和FVIII的蛋白質(zhì)復合體的細胞。在其它方面中，本發(fā)明提供了用于制備所述蛋白質(zhì)復合體的方法，方法包括使所述多肽與FVIII接觸。在一個方面中，本發(fā)明提供了用于制備FVIII的方法，方法包括使FVIII與包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽接觸以形成包含所述多肽和FVIII的蛋白質(zhì)復合體。在另一方面中，本發(fā)明提供了增強FVIII的血漿藥物代謝動力學特性的方法，方法包括向受試者施用包含含有所述多肽和FVIII的蛋白質(zhì)復合體的組合物。 在一些方面中，本發(fā)明提供了包含所述蛋白質(zhì)復合體和可藥用載體的組合物。在其它方面中，本發(fā)明提供了用于治療血液病的方法，方法包括施用包含含有所述多肽和FVIII的蛋白質(zhì)復合體的組合物，其中所述多肽包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列。在再一方面中，提供了試劑盒。


圖I顯示表示人馮維勒布蘭德因子(von Willebrand factor)蛋白結(jié)構(gòu)、加工和成熟的示意圖。(A) —級馮維勒布蘭德因子多肽的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)SS =信號肽；D1和D2 =前肽序列；D’-D3=包括標稱的VIII因子結(jié)合區(qū)；A1和A3=膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(和其它相互作用)；(B)在分泌和加工過程中，信號肽被去除并且隨后通過類似弗林蛋白酶的加工步驟將前肽從vWF多肽上切下，以得到正常情況下在D’結(jié)構(gòu)域連接處開始的成熟vWF多肽；(C)前肽與成熟vWF多肽的結(jié)合促進增強的FVIII結(jié)合和多聚化；和(D)由前肽-成熟的vWFIII復合體提供的半胱氨酸殘基提供了使得分子內(nèi)和分子間多聚體形成的共價結(jié)合。圖2顯示表示與IgG1Fc共價融合的人馮維勒布蘭德因子結(jié)構(gòu)域截斷物的示意圖。(A) —級馮維勒布蘭德因子多肽的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)SS =信號肽；D1和D2 =前肽序列；D’ -D3=包括標稱的VIII因子結(jié)合區(qū)；A1和A3 =膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(和其它相互作用)；⑶圖解顯示一級vWF截斷多肽與Fe，顯示信號肽切割后的預期的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。序列包括前肽，之后是D’ -D3、D’ -Al或者D’ -A3結(jié)構(gòu)域，每一個依次共價融合至IgG1恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)處；和(C)前肽與vWF截斷多肽-Fe融合體(即D’ D3-Fc、D’ -Al-Fc或者D’ A3_Fc)的結(jié)合促進FVIII結(jié)合增強和多聚化，在如在成熟vWF加工中出現(xiàn)的那樣。圖3顯示表示初級翻譯產(chǎn)物的截斷vWF-Fc融合物加工、成熟和多聚化的示意圖。(A)表示信號肽切下后的前肽和截斷的vWF結(jié)構(gòu)域-Fe融合產(chǎn)物。在該示意圖中，多肽衍生自如圖I所示的單個初級翻譯產(chǎn)物；(B)示意圖顯示在初級翻譯產(chǎn)物加工以及前肽與截斷的vWF結(jié)構(gòu)域-Fe多肽結(jié)合以促進正確折疊之后的前肽和vWF結(jié)構(gòu)域-Fe融合單體；和(C)IgG1Fc鉸鏈區(qū)內(nèi)包含的半胱氨酸殘基提供了分子內(nèi)結(jié)合以幫助產(chǎn)生還以與血漿來源vWF相似的方式結(jié)合FVIII的功能性vWF-Fc 二聚體；反過來，vWF前肽促進融合多肽的多聚化。圖4顯示表示來自獨立編碼區(qū)的兩個初級翻譯產(chǎn)物的截斷vWF-Fc融合物的加工、成熟和多聚化的示意圖。(A)表示在信號肽切下后前肽和截斷的vWF結(jié)構(gòu)域-Fe融合多肽的分開且獨立的初級翻譯產(chǎn)物；如在正常vWF加工中一樣，不需要弗林蛋白酶樣加工。在該示意圖中，多肽來源于兩個獨立啟動子盒從一個表達載體或者從在一個細胞內(nèi)共表達的兩個表達載體轉(zhuǎn)錄的兩個獨立初級翻譯產(chǎn)物，前一表達模式描述于例如圖6中；(B)顯示初級翻譯產(chǎn)物加工以及共表達的前肽和截斷的vWF結(jié)構(gòu)域-Fe多肽結(jié)合以促進正確折疊之后的前肽和vWF結(jié)構(gòu)域-Fe融合單體的示意圖；和(C) IgG1Fc鉸鏈區(qū)內(nèi)包含的半胱氨酸殘基提供了分子內(nèi)結(jié)合以幫助產(chǎn)生還以與血漿來源vWF相似的方式結(jié)合FVIII的功能性vWF-Fc二聚體；反過來，vWF前肽促進融合多肽的多聚化。圖5是圖解說明，在一些實施方案中，質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染進入哺乳動物細胞表達成熟vWF或者截斷的vWF結(jié)構(gòu)域-Fe融合多肽的示意圖。(A)具有編碼vWF或者截斷的vWF結(jié)構(gòu)域-Fe融合蛋白的編碼序列的表達質(zhì)粒，每一個包含作為初級翻譯產(chǎn)物部分的信號肽序列和前肽結(jié)構(gòu)域；(B)表示質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染并在選擇壓力下被吸收進入哺乳動物細胞內(nèi)，以產(chǎn)生穩(wěn)定的表達細胞系；(C)使用與(A)中不同的選擇標志物(新霉素)的具有VIII因子 編碼盒的表達質(zhì)粒；和(D)表示FVIII (C)和vWF或vWF-Fc (D)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染并且在選擇壓力下被吸收進入哺乳動物細胞內(nèi)以產(chǎn)生表達FVIII和vWF-Fc (或vWF)的穩(wěn)定細胞系。圖6是圖解說明，在另外的實施方案中，質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染進入哺乳動物細胞，從或者在同一質(zhì)粒載體上或者在不同質(zhì)粒載體上的獨立啟動子表達成熟的vWF或者截斷的vWF結(jié)構(gòu)域-Fe融合多肽和前肽序列的示意圖。(A)具有來自獨立啟動子的編碼vWF或者截斷vWF結(jié)構(gòu)域-Fe融合蛋白的編碼盒(不表達前肽結(jié)構(gòu)域作為其部分初級翻譯產(chǎn)物)和vWF前肽結(jié)構(gòu)域表達盒的表達質(zhì)粒(每一個具有各自的信號肽序列)；(B)表示前肽缺失vWF或vWF-Fc融合多肽和前肽多肽質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染并在選擇壓力下被吸收進入哺乳動物細胞內(nèi)，以產(chǎn)生共表達vWF或vWF-Fc蛋白質(zhì)和前肽多肽兩者的穩(wěn)定細胞系；(C)使用與㈧中不同的選擇標志物(新霉素)的具有VIII因子編碼盒的表達質(zhì)粒；和(D)表示FVIII (C)和具有前肽的vWF或vWF-Fc (D)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染并且在選擇壓力下被吸收進入哺乳動物細胞內(nèi)以產(chǎn)生表達FVIII和vWF-Fc或vWF以及獨立的vWF前肽的穩(wěn)定細胞系。圖7顯示直接來自表達培養(yǎng)基上清液的㈧或者來自對㈧的培養(yǎng)上清液中所存在蛋白質(zhì)進行G蛋白免疫沉淀的⑶，經(jīng)還原和變性條件下4-12%雙-TrisPAGE凝膠電泳的所表達蛋白質(zhì)的考馬斯染色蛋白質(zhì)。以包含截斷vWF-Fc構(gòu)建體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PER. C6細胞使用抗生素選擇選擇出穩(wěn)定培養(yǎng)物作為庫。對于直接的上清液樣品，將20微升加載在凝膠上。對于免疫沉淀，將20微升G蛋白珠或者加入到具有D’ -D3-Fc的Iml培養(yǎng)基中，或者加入到具有D’ -Al-Fc或D’ -A3-Fc的O. 2ml培養(yǎng)基中。兩個凝膠中的泳道代表著泳道I :分子量標準；泳道2 :D，-D3-Fc ;泳道3 :pro_D’ _D3_Fc ;泳道4 :D，-Al-Fc ;泳道5 pro-D’ -Al-Fc ;泳道6 :D’ _A3_Fc ;泳道7 :pro_D’ _A3_Fc ;和泳道8 :作為對照的未轉(zhuǎn)染PER. C6條件培養(yǎng)基。在泳道3、5和8中更高的分子量條帶代表著仍然與相應vWF結(jié)構(gòu)域連接的未加工的前肽。圖8顯示使用vWF-Fc融合蛋白或者血漿來源vWF蛋白質(zhì)回收的FVIII活性的柱形圖。虛線標示高于對照(即沒有加入vWF蛋白質(zhì)的BDD-FVIII)的增加的回收。包含所表達的截斷vWF-Fc融合蛋白質(zhì)或全長vWF的細胞上清液與表達重組FVIII的BDD-078細胞混合。兩天后，使用顯色FVI11分析法分析樣品的FVIII表達。
圖9是顯示prο-vWF-Fc融合蛋白質(zhì)多聚化與正常血漿來源vWF多聚體相比較的凝膠。血漿來源VIII因子(Koate-DVF1:)作為多聚化的標準在變性的、但非還原性1.6% (泳道I)和2 % HGT⑵(泳道2)瓊脂糖凝膠上運行，而pro-D’ _D3_Fc (泳道3)、pro-D’ -Al-Fc (泳道4)和pro_D’ _A3_Fc (泳道5)蛋白質(zhì)樣品在I. 6 %凝膠上電泳以顯示階梯大小差異。括號標示vWF 二聚體的三聯(lián)體在泳道I中的位置和泳道2中的相應位置。如所預期，pro-vWF-Fc多肽鏈大小的增加導致產(chǎn)生分子量增加的多聚體條帶，順序為pro—D’ -D3~Fc < pro—D’ -Al-Fc < pro_D’ A3-Fc0圖10顯示FVIII從包含pro-D’ A3_Fc/FVIII復合體的上清液中的純化⑷在不同緩沖液條件過程中洗脫峰的色譜軌跡；和(B)具有來自(A)中所示柱軌跡的樣品的考馬斯染色的7. 5% PAGE凝膠顯示從泳道4中的pro-D’ A3-Fc/FVIII復合體特異性洗脫FVIII。泳道1-9分別表示，(I)原材料，(2)流過物，(3)0. IMCaCl2洗脫物，(4)0. 3M CaCl2洗脫物，(5)pH 5. 5檸檬酸鹽洗脫物，(6)濃縮的BDD-FVIII制備物，(7)分子量標準(右側(cè)上為大小)，(8)來自表達pro-D’ -A3-Fc的PER. C6細胞的上清液，(9)商品化的BDD-FVIII (Xyntha )，星號顯示大約170,90和80kd的3個條帶，分別對應于全長BDD-FVIII、重鏈和輕鏈(一個或多個)。圖11顯示FVIII從包含商品化重組B-結(jié)構(gòu)域-缺失FVIII (Xyntha)的上清液與包含pro-D’ D3-Fc蛋白質(zhì)的上清液中的純化。在使用不同緩沖液組合物從凝膠洗脫后，級分在7% NuPAGE還原性/變性聚丙烯酰胺凝膠上分析并用考馬斯亮藍染色。泳道7顯示在從與A蛋白結(jié)合的pro-D’ -D3-Fc/FVIII復合體洗脫之后回收的基本上純的FVIII。泳道1_9分別表不，(I)在左側(cè)列出分子量的多肽分子量標準，(2)pro_D’-D3_Fc細胞上清液，
(3)商品化的B-結(jié)構(gòu)域-缺失FVIII (XyiItha*),⑷Xynthapro-D，-D3上清液混合，
(5)加載在 A 蛋白柱上的上清液(pro-D，D3-Fc+ Xyntha ), (6)使用 20mM Tris-HCl, pH
7.O洗滌的流過物，(7)0. 3M CaCl2洗脫物，和(8)用于將額外的A蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)從柱上洗滌下來的PH 3. 9甘氨酸洗滌物。泳道3中的三個星號與分別對應于全長BDD-FVIII、重鏈和輕鏈(一個或多個)的大約170、90和80kd的蛋白質(zhì)條帶對齊。
具體實施例方式在一個方面中，本發(fā)明提供了包含在vWF多肽中存在的第一氨基酸序列和與第一氨基酸序列異源的第二氨基酸序列的多肽，其中多肽能夠結(jié)合FVIII。如本文所使用，術(shù)語“能夠結(jié)合”考慮了其中多肽與FVIII結(jié)合的能力被更高級別蛋白質(zhì)組裝和/或一種或更多種翻譯后修飾，例如諸如信號肽切割、前肽切割、前肽結(jié)合、磷酸化、糖基化等等影響的實施方案。例如，在一些實施方案中，多肽能夠作為二聚體、三聚體、四聚體或者更高級別聚合復合體“結(jié)合”FVIII，隨后形成多肽多聚化。或者，例如，在另外的實施方案中，在前肽與多肽結(jié)合之后的多聚化之后，多肽“能夠結(jié)合”FVIII。“多聚化”和“寡聚化”在本文中可互換使用并且指兩個或者兩個以上蛋白質(zhì)分子通過共價(例如分子間二硫鍵)和/或非共價相互作用介導的結(jié)合。因此，“一個或更多個多聚體”和“一個或更多個寡聚體”在本文中也可以互換使用。本發(fā)明考慮了人和非人(例如靈長類、狗、貓、馬、豬、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、牛、其他脊椎動物)來源的vWF和FVIII多肽，包括天然的、人工合成的和重組的蛋白質(zhì)。對應于野生型蛋白質(zhì)或者其突變體、變異體和/或截斷變體的vWF和FVIII多肽也處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，在一些實施方案中，第一氨基酸序列對應于人來源的vWF多肽片段，其中異源性的第二氨基酸序列包含在人或其他來源的任何vWF蛋白質(zhì)中不存在的序列或者由其組成。FVIII和/或vWF包括天然蛋白質(zhì)，及其衍生物，例如通過缺失、替代或插入突變的蛋白質(zhì)、或者其化學衍生物或片段。I.第一氨基酸序列在一個實施方案中，第一氨基酸序列定義為與能夠特異性結(jié)合包含F(xiàn)VIII結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VWF多肽區(qū)域的單克隆抗-vWF抗體反應的結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，單克隆抗體是例如 Foster 等，JBC, 262 8443 (1987)和 Fulcher 等，J. Clin. Invest. ,76 117(1985)中描述的單克隆抗體C3，該兩篇參考文獻關(guān)于單克隆抗體C3和制備單克隆抗體，特別是單克隆抗體C3的方法的教導通過參考并入本文。vWF氨基酸序列和編碼vWF的核酸序列或其部分的非限定性實例公開于例如 GenBank 登錄號NP_000543、NM_000552、AAE20723、AAB59512、P04275、EAW88815、ACP57027、EAW88816 和 AAD04919 ;美國專利號 5，260，274 ；Titani 等，Biochemistry, 25 3171-84 (1986);和 Sadler 等，PNAS，82 :6391_6398 (1985)，每一篇參考文獻關(guān)于對應于 vWF的氨基酸和核酸序列的教導通過參考并入本文。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，典型的preprop-vWF是2813個氨基酸的多肽，具有22個氨基酸的信號肽和重復性的功能結(jié)構(gòu)域A、B、C、D和CK，從氨基末端開始以“D1”、“D2”、“0’”、“03”、11”、12”、13”、“04”、“81”、“82”、13(后三個總稱為“8”)”、“(1”、“02”和“CK”的順序分布?！俺墒斓摹眝WF亞基由從N-末端至C-末端的順序的結(jié)構(gòu)域D’ -D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK 組成。示例性的全長人vWF的氨基酸序列示于SEQ ID N0:29中，其由SEQ ID N0:30的核苷酸251-8689編碼。關(guān)于SEQ ID NO :29，vWF的“信號肽”部分橫跨氨基酸位置I至Cys_22，“前肽”部分(D1-D2)橫跨氨基酸位置23至Arg-763，并且“成熟的” vWF部分橫跨氨基酸位置 764 至 2813。各個結(jié)構(gòu)域大致定位為 D，:764_865 ；D3 :866_1242 ；A1 1260-1479 ；A2 1480-1672 ；A3 :1673_1874 ；D4 =1947-2298 ；B =2296-2399 ；C1 =2400-2516 ；C2 =2544-2663 ；以及 CK :2720_2813。EXPASY 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫規(guī)范(worldwideweb. uniprot. org/uniprot/P04275)還使用另一種vWF結(jié)構(gòu)域定位和命名系統(tǒng)，其為Dl 34-240 ；D2 :387_598 ;D，776-827；D3 :866_1074 ；A1 :1277_1453 ；A2 :1498_1665 ；A3 :1691_1871 ；D4 :1949_2153 ；B =2255-2328 (其在 EXPASY 中命名為 Cl) ；C1 =2429-2495 (在 EXPASY 中命名為 C2) ；C2 2580-2645 (在 EXPASY 中命名為 C3);以及 CK :2724_2812。FVIII氨基酸和核酸序列的非限定性實例公開于例如GenBank登錄號1012296A、AAA52420. I、CAA25619. I、AAA52484. 1、1012298A、FAW72647. I、EAW72646. I、ΧΡ_001498954. I、ACK44290. I、AC095359. I、ΝΡ_001138980. I、ABZ10503. I、NP_032003. 2、美國專利號6，307，032以及Wood等，Nature, 312 =330-7(1984)中，每一篇參考文獻關(guān)于FVIII序列的教導通過參考并入本文。FVIII的變異體、衍生物、修飾形式和復合體也是本領(lǐng)域已知的，并包括在本發(fā)明之中。例如，如美國專利號5，668，108中描述的VIII因子的變異體公開了其中位置1241上的天冬氨酸被谷氨酸替換的FVIII變異體以及相應的核酸、改變；美國專利號5，149，637描述了包含或者糖基化或者非糖基化的C-末端部分的FVIII變異體；以及美國專利號5，661，008描述了包含通過3個氨基酸殘基與氨基酸1649至2332相連的氨基酸1-740的FVIII變異體；每一篇參考文獻關(guān)于FVIII變異體序列的每一教導通過參考并入本文。在一個實施方案中，F(xiàn)VIII是血漿或者血清來源的FVIII。在另一實施方案中，F(xiàn)VIII是重組體FVIII，例如在培養(yǎng)的來自重組DNA克隆的哺乳動物細胞中表達的活性人FVIII。用于產(chǎn)生VIII因子的表達系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，并且包括如通過美國專利號5，633，150,5, 804，420和 5，422，250所例證的原核和真核細胞，每一篇參考文獻關(guān)于產(chǎn)生FVIII的教導整合入本文中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知多肽結(jié)合FVIII的能力可以通過多種方式確定。具體而言，可以使用本文所述的技術(shù)和/或本領(lǐng)域已知的適宜技術(shù)測定本發(fā)明的多肽結(jié)合FVIII的能力。例如，為了分析/確定結(jié)合，可以采用免疫測定法，包括但不限于，使用技術(shù)例如western印跡、放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫沉淀測定、沉淀素反應、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散測定、凝集測定、補體結(jié)合測定、免疫放射測定、熒光免疫測定等的競爭和非競爭性測定系統(tǒng)(參見例如Ausubel等，編者，1994，Current Protocols in Molecular Biology,第 I 卷，John ffiley&Sons, Inc., New York,該文獻全部內(nèi)容通過參考并入本文)。例如，包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽可以在適宜緩沖液例如TBS中于偶聯(lián)至Sepharose的單克隆抗體存在條件下與FVIII接觸。抗體可以針對這樣的多肽區(qū)域，即抗體與多肽的結(jié)合不干擾多肽與FVIII的結(jié)合(例如抗體可以針對第二氨基酸序列或者多肽中也存在的vWF的“Al”或“A2”或“A3”重復區(qū)。在接觸之后，可以通過例如離心分離與多肽/抗體結(jié)合的FVIII和非結(jié)合的FVIII，并且FVIII可以使用例如顯色底物測定法測量(Factor VIII Coatest ;Chromogenix,默恩達爾,瑞典)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽的第一氨基酸序列是截斷的vWF多肽。例如，在一些實施方案中，截斷形式的vWF包括⑴缺乏“前肽”序列的截斷的vWF多肽；和(ii)缺乏成熟序列 “A1”、“A2”、“A3”、“D4”、“B” (也稱作 “B1”、“B2” 和 “B3”)、“C1”、“C2” 和 /或“CK”結(jié)構(gòu)域的截斷vVF多肽。還考慮了其它截斷的或者其它修飾形式的vWF。在一個實施方案中，第一氨基酸序列如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO
3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:
15、SEQ ID NO 33, SEQ ID N0:34、或 SEQ ID NO :35 中所述。II.第二氨基酸序列在另外的實施方案中，多肽的第二氨基酸序列提供對結(jié)合配偶體具有親和性的結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)域。第二氨基酸序列與第一氨基酸序列是異源性的。在一個實施方案中，異源性的第二氨基酸序列包含在任何vWF蛋白質(zhì)中不存在的序列或者由其組成。在一個實施方案中，異源性第二氨基酸序列的至少一部分(例如連續(xù)的部分)對應于任何vWF多肽中不存在的序列。優(yōu)選地，在一些實施方案中，第二氨基酸序列對應于抗體Fe多肽例如，例如人IgGlFc區(qū)。例如，第二氨基酸序列可以對應于從N-末端鉸鏈區(qū)延伸至天然C-末端的氨基酸殘基，即基本上全長抗體Fe區(qū)。還可以采用Fe區(qū)的片段，例如在C-末端截斷的那些。在一些實施方案中，片段優(yōu)選包含一個或更多個半胱氨酸殘基(至少鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基)以使得在本發(fā)明兩個單獨多肽的Fe多肽部分間形成鏈間二硫鍵，從而形成二聚體。其它抗體Fe區(qū)可以被人IgGlFc區(qū)替代。例如，其它適宜的Fe區(qū)是可以親和性結(jié)合A蛋白或G蛋白或者其它相似Fe-結(jié)合性基質(zhì)的那些，并且包括鼠IgG、IgA、IgE、IgD、IgM的Fe區(qū)或者人IgG、IgA、IgE、IgD、IgM Fe區(qū)的片段，例如包含至少鉸鏈區(qū)的片段以致于可以形成鏈間二硫鍵。IgG1Fc區(qū)公開于例如GenBank登錄號X70421中，其全部內(nèi)容通過參考并入本文。在一個實施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO 16中所述序列。在一些實施方案中，第二氨基酸序列優(yōu)選位于第一氨基酸序列的C-末端。包含 與另一氨基酸序列不同部分融合的異源性氨基酸序列的融合多肽的制備由例如Ashkenazi等，PNAS，88 :10535 (1991)和 Byrn 等，Nature 344 677(1990)描述，每一篇參考文獻的全部內(nèi)容通過參考并入本文。例如，可以將編碼包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽的基因融合序列插入到適宜表達載體中。使所表達的融合蛋白裝配，由此在多肽之間形成鏈間二硫鍵，得到二聚體。在另外的實施方案中，可以表達具有或者不具有間隔氨基酸連接基團的本發(fā)明的融合聚合物。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽還包含位于第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之間的連接體，其中連接體包含一個或者更多個氨基酸殘基，以將第一序列和第二序列分隔開。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO 17,SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO:19,SEQ ID NO 20,SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :38、或SEQ IDNO 39中所述的氨基酸序列。在一個實施方案中，多肽由具有SEQID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQID NO 26,SEQ ID NO 27,SEQ ID NO 28,SEQ ID NO 37,SEQ ID N0:42、或 SEQ ID NO 43
中所述核苷酸序列的核酸編碼。本文所公開的序列的變異體也處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。多肽變異體指一個或更多個氨基酸被改變的氨基酸序列。變異體可以具有“保守”改變，其中取代的氨基酸具有相似的結(jié)構(gòu)或化學特性，例如以異亮氨酸取代亮氨酸。備選地，變異體可以具有“非保守”改變，例如以色氨酸取代甘氨酸。類似的較少改變還可包括氨基酸缺失或者插入，或者兩者。特定形式的“變異體”多肽是“功能等效的”多肽，即表現(xiàn)出與本發(fā)明的多肽實例具有基本相似的體內(nèi)或體外活性和/或結(jié)合的多肽?？梢允褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的計算機程序，例如DNASTAR軟件(DNASTAR，Inc. ,Madison, WI)找到確定哪些氨基酸殘基可以被替代、插入或缺失而不喪失生物學或免疫學活性的指導。此外，在下面提供特定的指導，包括在所引用參考文獻內(nèi)提供那些，所述參考文獻通過參考并入本文。在另外的實施方案中，所命名殘基的特定位置可以稍微變化而仍然存在于多肽的結(jié)構(gòu)和功能類似位置上(參見 Chang，Y.，等，Biochemistry37 =3258-3271 (1998)) 此外，本發(fā)明的特定實施方案可以在功能上表征為在FVIII結(jié)合能力方面與vWF多肽或其片段相關(guān)。在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽表現(xiàn)出對FVIII的結(jié)合能力小于、大約等于或者大于能夠結(jié)合FVIII蛋白質(zhì)(例如野生型內(nèi)源FVIII)的參照vWF蛋白質(zhì)(例如野生型內(nèi)源vWF)或其片段的結(jié)合能力。因此，本發(fā)明包括本文所公開多肽的此類改變。此類改變包括缺失、插入、倒轉(zhuǎn)、重復和替代。關(guān)于氨基酸改變有可能是表現(xiàn)型沉默的更多的指導可以在Bowie，J.U.，等，“Deciphering the Message in Protein Sequences Tolerance to Amino AcidSubstitutions，，，Science 247 1306-1310 (1990)中找到。因此，本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物包括具有這樣序列的片段、衍生物或類似物，即所述序列與本發(fā)明的多肽相比，具有(i) 一個或更多個以保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)替代的氨基酸殘基(例如1、3、5、8、10、15或20個殘基)。此類替代的氨基酸殘基可以是或者可以不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基；或者(ii) 一個或更多個包括取代基的氨基酸殘基(例如1、3、5、8、10、15或20個殘基)。在另外的實施方案中，本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物包括例如與另一化合物(例如，聚乙二醇)偶聯(lián)以提高多肽半衰期的本發(fā)明的多肽，或者其中多肽與額外氨基酸融合的本發(fā)明的多肽。根據(jù)本文的教導，此類片段、衍生物和類似物被認為處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍內(nèi)。 如所標明，優(yōu)選性質(zhì)較小的改變，例如沒有明顯影響折疊或者FVIII結(jié)合能力的保守性氨基酸替代。當然，技術(shù)人員將做出的氨基酸替代的數(shù)量依賴于許多因素，包括上面描述的那些。在一些實施方案中，對于任何給定多肽的取代的數(shù)量將不會超過50、40、30、
25、20、15、10、5、3、2 或 I。對于與FVIII結(jié)合必需的(本發(fā)明多肽的)氨基酸殘基可以通過本領(lǐng)域已知的方法鑒定，例如位點定向突變或者丙氨酸掃描突變(Cunningham和Wells，Science 244 1081-1085(1989))。后一個過程在分子的每一個殘基位置上引入一個丙氨酸突變。然后測試所得到的突變體分子結(jié)合FVI11的能力，例如如本文所述。對于結(jié)合FVI11至關(guān)重要的位點也可以通過結(jié)構(gòu)分析確定，例如結(jié)晶作用、核磁共振或者光親和標記(Smith,等，J. Mol.Biol. 224 =399-904(1992)和 deVos，等 Science 255 :306_312(1992))。在一個實施方案中，重組多肽具有與本文所述氨基酸序列中的任何一個具有至少70 %、80 %、90 %、95 %、98 %或者更大同一性的氨基酸序列。在另一實施方案中，第一氨基酸序列存在于包含SEQ ID NO :29中所述氨基酸序列或其變異體或片段的vWF多肽中。在另外的實施方案中，第一氨基酸序列存在于由SEQ ID NO :30所述核酸序列或其變異體或片段編碼的vWF多肽中。在其它方面中，本發(fā)明提供了重組的vWF-Fc融合蛋白，其中融合蛋白的vWF部分是缺少成熟全長vWF多肽的至少一個結(jié)構(gòu)域的截斷vWF，其中融合蛋白能夠形成能夠結(jié)合FVIII蛋白質(zhì)的多聚體。在一個實施方案中，截斷的vWF具有結(jié)構(gòu)域D’和D3，但是截斷的vWF缺乏結(jié)構(gòu)域Al、A2、A3、D4、BI、B2、B3、Cl、C2、CK或其組合。在另一實施方案中，截斷的vWF具有結(jié)構(gòu)域D’、D3和Al，但是截斷的vWF缺乏結(jié)構(gòu)域A2、A3、D4、BI、B2、B3、Cl、C2和CK。在一些實施方案中，截斷的vWF具有結(jié)構(gòu)域D’、D3、Al和A2，但是截斷的vWF缺乏結(jié)構(gòu)域A3、D4、BI、B2、B3、Cl、C2和CK。在另外的實施方案中，截斷的vWF具有結(jié)構(gòu)域D’、D3、A1、A2和A3，但是截斷的vWF缺乏結(jié)構(gòu)域D4、B1、B2、B3、C1、C2和CK。在再一實施方案中，截斷的￥肝缺乏結(jié)構(gòu)域04、81、82、83、(1、〇2和CK0III.核酸、載體和表達系統(tǒng)
在其它方面中，本發(fā)明提供了用于表達包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽的重組表達載體，以及以表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞?？梢圆捎萌魏芜m宜的表達系統(tǒng)。載體包含與適宜轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)性核苷酸序列例如來源于哺乳動物、微生物、病毒或者昆蟲基因的那些有效連接的、分別編碼第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的第一 DNA序列和第二 DNA序列。調(diào)節(jié)序列的實例包括轉(zhuǎn)錄啟動子、操縱子或增強子、mRNA核糖體結(jié)合位點、和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止的合適序列。當調(diào)節(jié)序列與編碼DNA序列功能性相關(guān)時則核苷酸序列有效連接。因此，如果啟動子核苷酸序列控制編碼DNA序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子核苷酸序列與編碼DNA序列有效連接。通常由復制起點賦予的在所希望宿主細胞中復制的能力和用于鑒定轉(zhuǎn)化體的選擇基因可以額外整合入表達載體中。在再一實施方案中，編碼相對第一氨基酸序列而言天然或者非天然的適宜信號肽的DNA序列可以整合入表達載體中。例如，可以與第一序列在同一讀碼框內(nèi)提供信號肽(分泌前導序列)的DNA序列，以致于所表達的多肽最初翻譯成為包含信號肽的融合蛋白質(zhì)。在預期宿主細胞內(nèi)具有功能的信號肽增強了包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽的細胞外分泌。在一些實施方案中，當多肽從細胞中分泌時，信號肽從多肽上切下。在 另外的實施方案中，相對第一氨基酸序列而言非天然的適宜信號肽可以作為天然信號序列的替代物提供或者除了天然信號序列之外額外提供。在一些實施方案中，信號肽具有如SEQ ID NO 40所示氨基酸序列。用于表達本發(fā)明多肽的適宜宿主細胞包括原核、酵母、絲狀真菌或高等真核細胞。與細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞宿主一起使用的適宜克隆和表達載體描述于，例如，Pouwels 等 Cloning Vectors A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)中。還可采用無細胞翻譯系統(tǒng)以使用來源于DNA構(gòu)建體的RNA產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。原核生物包括革蘭氏陰性或者革蘭氏陽性生物，例如，大腸桿菌(枯草芽孢桿菌)。用于轉(zhuǎn)化的適宜的原核宿主細胞包括，例如，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)內(nèi)的多個其他種。在原核宿主細胞中使用的表達載體通常包含一個或更多個表型選擇標記基因。表型選擇標記基因為例如編碼賦予抗生素抗性的蛋白質(zhì)的基因或者提供自養(yǎng)需求的基因。優(yōu)選用于細菌的載體當中包括例如可從Novagen, Madison得到的pET24b或pET22b、WI (pET-24b (+)和pET-22b (+)，分別為pET表達系統(tǒng)24b (目錄號69750)和22b (目錄號 70765), EMD Biosciences, Inc. , Novagen Brand, Madison, WI ;關(guān)于載體 pET_24b 和pET_22b 的詳細信息見 http://worldwideweb. emdbiosciences. com 產(chǎn)品信息部分)、可從Qiagen Inc.，Valencia, CA 得到的 pQE70、pQE60 和 pQE_9 ;可從 Stratagene, LaJolla, CA得到的 pBS 載體、Phagescript 載體、Bluescript 載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A ;以及可從 Pharmacia (now Pfizer, Inc. , New York, NY)得到的 ptrc99a、pKK223-3、pKK233_3、pDR540、pRIT5。當中優(yōu)選的真核載體是可從Stratagene得到的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl和pSG ;和可從Pharmacia得到的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它適宜的載體對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。適宜在本發(fā)明中使用的細菌啟動子包括大腸桿菌IacI和IacZ啟動子、T3和T7啟動子、gpt啟動子、lambda PR和PL啟動子以及trp啟動子。適宜的真核啟動子包括CMV立刻早期啟動子、HSV胸腺嘧啶核苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子，例如勞氏肉瘤病毒(RSV)的那些啟動子、以及金屬硫蛋白啟動子，例如小鼠金屬硫蛋白-I啟動子。例如，用于重組原核宿主細胞表達載體的啟動子序列包括，但不限于，β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)啟動子、乳糖啟動子、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、和tac啟動子(Maniatis,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1982)。特別有用的原核宿主細胞表達系統(tǒng)采用噬菌體入？1^啟動子和(1857^不耐熱阻抑物序列。可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type Culture Collection)獲得的整合有λ PL啟動子衍生物的質(zhì)粒載體包括質(zhì)粒pHUB2 (居于大腸桿菌JMB9株中(ATCC37092))和 pPLc28(居于大腸桿菌 RRl 株中(ATCC 53082))。本發(fā)明的多肽還可以在酵母宿主細胞，優(yōu)選來自酵母菌屬(Saccharomyces)的酵母(例如啤酒酵母(S. cerevisiae))宿 主細胞中表達。其它酵母屬，例如畢赤酵母屬(Pichia)或克魯維酵母屬(Kluyveromyces)也可采用。酵母載體常常包含來自2 μ酵母質(zhì)粒的復制起點序列、自主復制序列(ARS)、啟動子區(qū)、多腺苷化序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、和選擇標記基因。用于酵母載體的適宜啟動子序列尤其包括金屬硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶或者其它糖酵解酶如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶的啟動子。用于酵母表達的其它適宜載體和啟動子包括葡萄糖抑制性ADH2啟動子?？稍诮湍负痛竽c桿菌中復制的穿梭載體可以通過向酵母載體中插入用于選擇和在大腸桿菌中復制的PBR322的DNA序列(Ampr基因和復制起點)構(gòu)建。在一些實施方案中，可以采用酵母α-因子前導序列以指導多肽的分泌。α-因子前導序列可以插入到啟動子序列和結(jié)構(gòu)基因序列之間。適于促進重組多肽從酵母宿主分泌的其它前導序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。前導序列可以在接近其3'末端被修飾成包含一個或更多個限制位點。這將促進前導序列與結(jié)構(gòu)基因的融合。酵母轉(zhuǎn)化方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一個此種方案描述于Hinnen等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 75 :1929，1978中。Hinnen等的方案在選擇培養(yǎng)基中選擇Trp+轉(zhuǎn)化體，其中選擇培養(yǎng)基包含O. 67%酵母氮源、O. 5%酪蛋白氨基酸、2%葡萄糖、10 μ /mi腺嘌呤和20 μ g/ml尿嘧啶。被包含ADH2啟動子序列的載體轉(zhuǎn)化的酵母宿主細胞可以在豐富培養(yǎng)基中生長用于誘導表達。豐富培養(yǎng)基的一個實例是包含1%酵母提取物、2%蛋白胨和1%葡萄糖并補充有80 μ g/ml腺嘌呤和80 μ g/ml尿嘧啶的一種培養(yǎng)基。當培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡時發(fā)生ADH2啟動子的去阻抑。還可以采用哺乳動物或者昆蟲宿主細胞培養(yǎng)系統(tǒng)以表達重組多肽。用于在昆蟲細胞中產(chǎn)生異源性蛋白質(zhì)的桿狀病毒系統(tǒng)綜述于Luckow等，Bio/Technology 6 47 (1988)中。還可使用建立的哺乳動物來源細胞系。適宜的哺乳動物宿主細胞系實例包括猴腎細胞的C0S-7系(ATCC CRL 1651)、L細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL 163)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞和BHK(ATCC CRL 10)細胞系、以及從非洲綠猴腎細胞系CVI衍生的CV-1/EBNA-1 細胞系(ATCC CCL 70)，如 McMahan 等，EMBO J. 10:2821(1991)中所述。其它適宜的細胞系包括，但不限于，HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(C0S-1)、人肝癌細胞(例如H印G2)、人腺病毒轉(zhuǎn)化的293細胞、小鼠L-929細胞、HaK倉鼠細胞系、從SwiSS，Balb-c或者NIH小鼠衍生的鼠3T3細胞以及許多其它細胞系。另一種適宜的哺乳動物細胞系是CV-I細胞系。正常的二倍體細胞、從原代組織體外培養(yǎng)衍生的細胞株、以及原代外植體也是適合的。候選細胞基因型可以是選擇基因缺陷型的，或者候選細胞包含優(yōu)勢的活性選擇基因。在一些實施方案中，載體構(gòu)建體引入到培養(yǎng)的宿主細胞中可以通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導、感染或其它方法實現(xiàn)。此類方法描述于許多標準實驗室手冊中，例如Davis等，Basic Methods In MolecularBiology,第 2 版(1995)。例如，宿主細胞可以以攜帶DNA的一個或更多個載體通過本領(lǐng)域已知的方法轉(zhuǎn)化，所述DNA包含編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，然后可以根據(jù)需要在適宜條件下培養(yǎng)，其 中一個或者兩個所引入基因擴增。然后通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將所表達的多肽從培養(yǎng)基(或者從細胞中，例如當在細胞內(nèi)表達時)中回收并純化。在一些實施方案中，所表達的多肽可以作為蛋白質(zhì)復合體制備，例如作為通過在兩個包含或不包含F(xiàn)VIII的單獨多肽之間的一個或更多個鏈間二硫鍵結(jié)合的異二聚體。用于哺乳動物宿主細胞表達載體的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可以衍生自病毒基因組。通常使用的啟動子序列和增強子序列衍生自多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)和巨細胞病毒(CMV)。從SV40病毒基因組衍生的DNA序列，例如，SV40復制起點、早期和晚期啟動子、增強子、剪接位點和多腺苷化位點可用于提供用于在哺乳動物宿主細胞中表達結(jié)構(gòu)基因序列的其它遺傳元件。病毒早期和晚期啟動子是特別有用的，因為兩者均可以容易地從病毒基因組中作為也包含病毒復制起點的片段得到。適宜在哺乳動物細胞中復制的載體可以包括病毒復制子，或者保證編碼多肽的序列整合入宿主基因組中的序列。適宜的載體可以包括，例如，衍生自猿猴病毒SV40、反轉(zhuǎn)錄病毒、牛乳頭瘤病毒、痘苗病毒和腺病毒的那些。載體的構(gòu)成元件，例如復制子、選擇基因、增強子、啟動子等等可以從天然來源得到或者通過已知方法合成。例如，適宜的載體可以是衍生自痘苗病毒的載體。在該種情況下，異源性DNA插入到牛痘基因組中。用于將外源DNA插入到痘苗病毒基因組中的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且利用例如同源重組。通常將異源DNA插入到在性質(zhì)上為非必需的基因中，例如，胸腺嘧啶核苷激酶基因(tk)，其也提供了可選擇標記。因此，哺乳動物表達載體可以包含一個或更多個能夠在哺乳動物細胞中表達的真核轉(zhuǎn)錄單位。例如，轉(zhuǎn)錄單位可以包含至少啟動子元件以介導外源DNA序列的轉(zhuǎn)錄。在一些實施方案中，用于哺乳動物細胞的啟動子包括病毒啟動子，例如來自SV40、CMV、勞氏肉瘤病毒(RSV)、腺病毒(ADV)和牛乳頭瘤病毒(BPV)的啟動子。轉(zhuǎn)錄單位還可以包含與編碼多肽的序列有效連接的終止序列和聚(A)添加序列。轉(zhuǎn)錄單位還可以包含用于增強表達的增強子序列。任選地，還可包括使基因擴增的序列，如編碼選擇標記的序列可使基因擴增。用于哺乳動物細胞的選擇標記是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如，胸腺嘧啶核苷激酶、二氫葉酸還原酶(與甲氨蝶呤一起作為DHFR擴增子)、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶、天冬酰胺合成酶、腺苷脫氨酶、金屬硫蛋白以及抗生素抗性基因例如新霉素。或者，例如，載體DNA可以包含全部或者部分的牛乳頭瘤病毒基因組，并且可以在細胞系例如C127小鼠細胞中作為穩(wěn)定的附加型元件攜帶。
用于在哺乳動物宿主細胞中使用的表達載體和系統(tǒng)的非限定性實例可以如Okayama 等,MoI. Cell. Biol. 3 280 (1983)，Cosman 等,MoI. Immunol. 23 935 (1986)(用于在C127鼠乳腺上皮細胞中穩(wěn)定高水平表達DNA的系統(tǒng))，Cosman等，Nature 312 768 (1984)(表達載體 PMLSV N1 /N4 ；ATCC 39890)，EP-A-0367566 以及美國專利號 5，350, 683 等所公開來構(gòu)建，每一篇參考文獻關(guān)于表達載體和/或系統(tǒng)的教導通過參考并入本文。載體可以衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒。在一些實施方案中，可以包括異源性信號序列代替天然信號序列，例如美國專利號4，965，195中描述的白細胞介素_7 (IL-7)的信號序列；例如Cosman等，Nature312 =768(1984)中描述的白細胞介素_2受體的信號序列；例如EP 367，566中所述的白細胞介素_4信號肽；例如美國專利號4，968，607中所述的I型白細胞介素_1受體信號肽；以及EP 460, 846中所述的II型白細胞介素_1受體信號肽，每一參考文獻關(guān)于信號序列的教導通過參考并入本文。在一個實施方案中，重組多肽可以使用PER.C6 技術(shù)(Crucell，Holland，荷蘭)制備。重組蛋白的表達公開于例如美國專利號6，855，544中，該參考文獻關(guān)于用于在人細胞系中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法和組合物的教導通過參考并入本文。還考慮了本發(fā)明的多肽可以通過固相合成方法制備。見Houghten, R. A. , Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82 :5131_5135 (1985)；以及 Houghten 等(1986)的美國專利號4，631，211。在另外的實施方案中，本發(fā)明還包括包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的重組多肽，其中多肽在翻譯過程中或者翻譯后被差異性修飾，例如通過糖基化、乙?；?、磷酸化、酰胺化、通過已知保護基/封閉基的衍生化、蛋白水解切割、與抗體分子或其他細胞配體連接等?？梢酝ㄟ^已知技術(shù)實現(xiàn)眾多的化學修飾，包括但不限于，通過溴化氫進行的特異性化學斷裂、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、金黃色葡萄球菌(s. aureus)V8蛋白酶、NaBH4 ;乙酰化、脫酰胺作用、甲?；?、甲基化、氧化、還原；在衣霉素存在下的代謝合成等。本發(fā)明包括的額外的翻譯后修飾包括例如，N-連接或O-連接糖鏈、N-末端或C-末端的加工、化學部分與氨基酸主鏈的連接、N-連接或O-連接糖鏈的化學修飾以及N-末端甲硫氨酸殘基的加入，結(jié)果產(chǎn)生適合于表達重組多肽，例如用于在培養(yǎng)的原核宿主細胞中表達的載體和構(gòu)建體。在一些實施方案中，其中不溶解的多肽從宿主細胞分離(例如原核宿主細胞)，宿主細胞可置于適宜離子強度的緩沖液中以溶解大多數(shù)的宿主蛋白質(zhì)，但是凝集的目的多肽在其中基本上不溶解，并將細胞破裂以致于釋放包涵體，并使得它們可以通過例如離心回收。該技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并且一種改變形式的技術(shù)描述于例如美國專利號4，511，503中，該參考文獻關(guān)于使從重組宿主細胞培養(yǎng)物以不溶解的折射形式產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)增溶的方法教導通過參考并入本文。不希望被特定理論所束縛，據(jù)信重組蛋白質(zhì)在例如大腸桿菌中的表達會導致重組蛋白以稱作包涵體的不溶解聚集物形式在細胞內(nèi)沉積。重組蛋白在包涵體內(nèi)的沉積是有利的，這是因為包涵體積累高度純化的重組蛋白和因為隱藏在包涵體內(nèi)的蛋白質(zhì)免受細菌蛋白酶的作用。通常，宿主細胞(例如大腸桿菌細胞)在適宜量生長之后收獲，并且在使用技術(shù)例如機械方法(例如音波振蕩器)或者通過化學或酶學方法裂解破壞之前懸浮于適宜緩沖液中?；瘜W或酶學方法破壞細胞的實例包括原生質(zhì)球化，其包括使用溶菌酶裂解細胞壁，和滲透壓休克，其包括以高張力溶液處理活細胞和用低張力冷水洗滌以釋放多肽。
在宿主細胞破壞后，有代表性地將懸浮液離心以將包涵體沉淀。所得到的沉淀包含基本上所有不溶解的多肽部分，但是如果細胞破壞過程不完全，則可能還包含完整的細胞或者破碎的細胞碎片。細胞破壞的完全性可以通過將沉淀重懸于小量相同緩沖溶液中并用相差顯微鏡檢查懸浮液來鑒定。破碎細胞碎片或完整細胞的存在表明需要額外破壞以去除碎片或者細胞和相結(jié)合的非折射性多肽。在此種進一步的破壞之后，根據(jù)需要，可將懸浮液開始離心并將沉淀物回收、重懸浮并分析。該過程可以重復直到肉眼觀察顯示沉淀物中缺乏破碎的細胞碎片，或者直到進一步的處理不能減少所得到沉淀物的大小。一旦從增溶的包涵體得到多肽或者在純化后期階段時，多肽可以在適宜的重折疊緩沖液，例如本領(lǐng)域已知的那些緩沖液中適當?shù)刂卣郫B。任何解折疊的程度可以通過層析，包括反向高效液相層析(RP-HPLC)確定。如果重組表達的本發(fā)明多肽在它們重折疊之前不是可溶解形式，則可以通過在包含基本上溶解多肽所需量的離液劑(例如尿素、胍)和還原劑(例如谷胱甘肽、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱氨酸)的增溶緩沖液中孵育以增溶。在允許多肽增溶發(fā)生的多肽濃度、孵育 時間和孵育溫度條件下開展該孵育過程。增溶程度的測量可以通過濁度測定、通過在還原性SDS凝膠上離心后分析多肽在上清液和沉淀物之間的分級分離、通過蛋白質(zhì)測定(例如Bio-Rad蛋白質(zhì)測定試劑盒)、或者通過高效液相層析(HPLC)進行。增溶緩沖液的pH可以是堿性的，優(yōu)選至少大約pH 7. 5，其中優(yōu)選范圍為大約pH
7.5至大約pH 11。本發(fā)明的多肽在用于增溶的緩沖溶液中的濃度必須這樣的，以致于多肽將基本上溶解并部分或完全地還原并變性。備選地，重組多肽可以是最初不溶性的。所使用的確切量將取決于例如緩沖溶液中其它成分的濃度和類型，特別是還原劑的類型和數(shù)量、離液劑的類型和數(shù)量、和緩沖液的pH。例如，如果重組多肽的濃度增加，則還原劑例如谷胱甘肽的濃度同時增加。在再一實施方案中，本發(fā)明提供了包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的同質(zhì)的或者基本上同質(zhì)的多肽。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含在vWF多肽中存在的第一氨基酸序列和與第一氨基酸序列異源的第二氨基酸序列的分離多肽，其中多肽能夠結(jié)合FVIII。在另外的實施方案中，多肽被純化至基本上同質(zhì)性，如通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析時呈現(xiàn)單一蛋白質(zhì)帶所表明。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到的那樣，純化重組蛋白的過程將根據(jù)諸如所采用的宿主細胞類型和蛋白質(zhì)是否分泌到培養(yǎng)基中的因素而變化。例如，當采用分泌重組蛋白的表達系統(tǒng)時，首先使用商業(yè)上可得到的蛋白質(zhì)濃縮過濾器，例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元將培養(yǎng)基濃縮。在濃縮步驟之后，將濃縮液應用到純化基質(zhì)上，例如凝膠過濾介質(zhì)。備選地，可以采用陰離子交換樹脂，例如具有懸垂二乙基氨基乙基(DEAE)的基質(zhì)或物質(zhì)。基質(zhì)可以是丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或者通常在蛋白質(zhì)純化中采用的其它類型。備選地，可以采用陽離子交換步驟。適宜的陽離子交換劑包括多種包含磺丙基或羧基甲基的不溶性基質(zhì)?；潜莾?yōu)選的。最后，可以采用使用疏水RP-HPLC基質(zhì)(例如具有懸垂甲基或其它脂肪族基的硅膠)的一個或更多個反相高效液相層析(RP-HPLC)步驟，以進一步純化重組表達的多肽。可以以多種組合使用上述純化步驟的一些步驟或者全部步驟以提供基本上同質(zhì)的重組蛋白。在一些實施方案中，采用包含由第二氨基酸序列所限定結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)域的結(jié)合配偶體的親和柱，以親和純化所表達的重組多肽或包含它們的蛋白質(zhì)復合體。例如，其中第二氨基酸序列對應于抗體Fe多肽時，可使用包含A蛋白或G蛋白的親和柱用于親和純化多肽或者包含它們的蛋白質(zhì)復合體。在一些實施方案中，結(jié)合的多肽和/或復合體從高鹽洗脫緩沖液中的親和柱上去除，然后透析進入低鹽緩沖液中以便使用。在另一實例中，親和柱包含結(jié)合多肽或者結(jié)合包含多肽的蛋白質(zhì)復合體的抗體，例如針對由第一或第二氨基酸序列確定的結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)域的抗體。在其它方面中，提供了編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，其中多肽包含在vWF多肽中存在的第一氨基酸序列和與第一氨基酸序列異源的第二氨基酸序列，其中多肽能夠結(jié)合FVIIL·在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO:25,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 27,SEQ ID NO :28、37、42 和 43 中所述核苷酸序列的分離的 核酸分子。本發(fā)明的多核苷酸可以包括涉及具有一個或更多個核苷酸的替代、缺失和/或添加的變異體。變異體可以在編碼區(qū)、非編碼區(qū)或者兩者中發(fā)生改變。編碼區(qū)內(nèi)的改變可以產(chǎn)生保守性或非保守性氨基酸替代、缺失或添加。當中特別優(yōu)選的是不改變本發(fā)明多肽特性和FVIII結(jié)合能力的沉默替代、添加和缺失。本發(fā)明的更多的實施方案包括包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸具有與(a)編碼具有本文所述氨基酸序列的多肽的核苷酸序列和(b)與上面(a)中任意核苷酸序列互補的核苷酸序列具有至少90 %同一性、并且更優(yōu)選至少95 %、96 %、97 %、98 %或99 %同一'I"生的核苷酸序列。與編碼多肽的參照核苷酸序列具有至少例如95% “同一性”的核苷酸序列的多核苷酸旨在指，除了在多核苷酸序列中可以每100個編碼多肽的參照核苷酸序列中包括高達5個點突變之外，多核苷酸的核苷酸序列與參照序列是相同的。換句話說，為了得到具有與參照核苷酸序列至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸，在參照序列中高達5%的核苷酸可以缺失或者用另一核苷酸替代，或者高達參照序列總核苷酸5%數(shù)量的核苷酸可以插入到參照序列中。參照序列中的這些突變可以發(fā)生在參照核苷酸序列的5’或者3’末端位置或者這些末端位置之間的任何地方，可以在參照序列中的核苷酸當中各自散開或者在參照序列內(nèi)的一個或更多個連續(xù)組群中。兩個或者更多個多核苷酸序列可以通過確定它們的同一性百分數(shù)來比較。同樣，兩個或更多個氨基酸序列可以通過確定它們的同一性百分數(shù)來比較。兩個序列，不管是核酸序列還是肽序列的同一性百分數(shù)一般描述為，兩個對齊序列之間確切配對的數(shù)量除以較短序列的長度并乘以 100。通過 Smith 和 Waterman, Advances in Applied Mathematics2:482-489(1981)的局部同源性算法提供核酸序列的近似排列。使用由Dayhoff, Atlasof Protein Sequences and Structure，M. 0. Dayhoff ed. ,5suppl. 3 :353_358，NationalBiomedical Research Foundation，Washington, D. C.，USA 開發(fā)的并由 Gribskov，NucI.Acids Res. 14(6) :6745_6763 (1986)標準化的評分矩陣，可將該算法擴展應用至肽序列。通過Genetics Computer Group (Madison, Wis.)在他們的BestFit實用應用程序中提供對核酸和肽序列實施該算法。對于該方法的默認參數(shù)描述于Wisconsin序列分析包程序手冊第8 版(I"5)(可從 Genetics Computer Group, Madison, Wis.得到)中。例如，由于遺傳密碼的簡并性，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認識到，具有與本文所述任何一個核酸序利具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列的許多核酸分子可以編碼多肽。實際上，由于這些核苷酸序列的簡并變異體均編碼同一多肽，甚至無需開展本文所述的任何功能分析或者測定，這對技術(shù)人員而言是顯而易見的。在本領(lǐng)域中將進一步地認識到，對于不是簡并變異體的此類核酸分子，有相當?shù)臄?shù)量也將編碼具有FVIII結(jié)合能力的多肽。這是因為，技術(shù)人員完全知曉較少可能或者不可能顯著影響蛋白質(zhì)結(jié)合(例如以第二脂肪族氨基酸代替一脂肪族氨基酸)的氨基酸替代。最近，在合成性產(chǎn)生較長多核苷酸序列方面的進展已經(jīng)使得無需使用傳統(tǒng)的克隆技術(shù)可以合成性產(chǎn)生編碼明顯更長多肽的核酸。此類服務的商業(yè)提供商包括Blue Heron,Inc. , Bothell, WA(http://worldwidewe b. blueheronbio. com) ο Blue Heron, Inc.米用的技術(shù)描述于美國專利號 6，664，112 ;6，623，928 ;6，613，508 ;6，444，422 ;6，312，893 ；
4,652, 639 ;美國公布的專利申請?zhí)?0020119456A1 ；20020077471A1 ;和公布的國際專利申請(公布號)W003054232A3 ；W00194366A1 ；W09727331A2 ;和 W09905322A1 中，所有參考文獻通過參考并入本文。當然，傳統(tǒng)的分子生物學、微生物學、和重組核酸技術(shù)也可用于產(chǎn)生本發(fā)明的多核苷酸。這些技術(shù)是眾所周知的并且解釋于，例如，Current Protocols in MolecularBiology, F. M. Ausebel 編，第 I, II 和 III 卷(1997) ;Sambrook 等,Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N. Y. (1989) ；DNA Cloning A Practical Approach, D. N. Glover 編，第 I 和
11卷(1985) ；01igonucleotide Synthesis, M. L Gait 編，(1984) ；Nucleic AcidHybridization, Hames 和 Higgins 編,(1985) ；Transcriptionand Translation, Hames 和Higgins編，(1984) ；Animal Cell Culture,R. I. Freshney 編，(1986) ；Immobilized Cellsand Enzymes, IRL Press(1986) ;Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning，，;系列，Methods in Enzymology, Academic Press, Inc. (1984) ；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells,J. H. Miller 和 M. P. Calos 編，Cold Spring Harbor Laboratory (1987)；以及Methods in Enzymology,分別為Wu和Grossman和Wu編，第154和155卷中，所有參考文獻通過參考并入本文。在其它方面中還提供了包含編碼本發(fā)明多肽的核酸分子的表達載體。還提供了表達本發(fā)明多肽的宿主細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了表達包含在vWF多肽中存在的第一氨基酸序列和與第一氨基酸序列異源的第二氨基酸序列的多肽的細胞，其中多肽能夠結(jié)合FVIII，其中細胞還表達FVIII。在另一實施方案中，F(xiàn)VIII是重組FVIII。IV.蛋白質(zhì)復合體在另一方面中，本發(fā)明提供了包含多肽和FVIII的蛋白質(zhì)復合體，其中多肽包含在vWF多肽中存在的第一氨基酸序列和與第一氨基酸序列異源的第二氨基酸序列，其中多肽能夠結(jié)合FVIII。在一個實施方案中，復合體包含與FVIII復合的二聚體形式的兩個單獨的多肽鏈。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了包含兩個本發(fā)明多肽鏈的同二聚體蛋白質(zhì)復合體，其中在鏈間形成一個或更多個二硫鍵。在一個實施方案中，在兩個單獨鏈的第一氨基酸序列之間形成一個或更多個二硫鍵由此產(chǎn)生二聚體。在另一實施方案中，在兩個單獨鏈的Fe區(qū)之間形成一個或更多個二硫鍵，由此產(chǎn)生二聚體。在一些實施方案中，同二聚體復合體由或者基本上由兩個本發(fā)明的多肽鏈構(gòu)成。在再一實施方案中，異二聚體也處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了寡聚體，例如通過將二聚體進一步連接。在一些實施方案中，提供了優(yōu)選地在本發(fā)明多肽氨基末端形成二硫鍵的不同大小的寡聚體。因此，在另外的實施方案中，提供了大小范圍從至少大約100，000,250, 000,500, 000道爾頓或者更大的二聚體到包括大約 5，000，000,10, 000，000,20, 000，000,30, 000，000,40, 000，000或50，000，000道爾頓或者更大的大多聚體的不同大小的寡聚體。在再一實施方案中，寡聚體是同寡聚體或者異寡聚體。在另一實施方案中，二聚體是異二聚體。在另外的實施方案中，從表達多肽和FVIII的細胞或者組織培養(yǎng)表達系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)復合體。在一個實施方案中，多肽和FVIII在同一細胞中共表達。 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含與Fe多肽N-末端融合的第一氨基酸序列的可溶性融合蛋白質(zhì)，其中第一氨基酸序列存在于vWF多肽中，其中多肽能夠結(jié)合FVIII。在一些實施方案中，多肽作為包含通過二硫鍵連接的兩個可溶性融合蛋白質(zhì)的二聚體能夠結(jié)合FVIII。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了包含通過二硫鍵連接的兩個可溶性融合蛋白質(zhì)的二聚體，其中每一蛋白質(zhì)包含與Fe多肽N-末端融合的第一氨基酸序列，其中第一氨基酸序列存在于vWF多肽中，其中二聚體能夠結(jié)合FVIII。在其它方面中，本發(fā)明提供了包含含有兩個或者更多個具有所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽的二硫鍵連接的多聚體的蛋白質(zhì)復合體。在一個實施方案中，通過將所述多肽與vWF前肽片段接觸，由此vWF前肽片段以“反式”起作用指導所述二硫鍵連接的多聚體裝配，來制備二硫鍵連接的多聚體。在一些實施方案中，vWF前肽片段包含SEQ ID NO 31所示的氨基酸序列或其變異體。在另一實施方案中，接觸包括共表達多肽與vWF前肽片段。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含二硫鍵連接的多聚體的蛋白質(zhì)復合體，所述二硫鍵連接多聚體包含兩個或更多個具有所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列的多肽，其中所述第一氨基酸序列描述于SEQ ID NO USEQ ID NO :4、或SEQ ID NO 7中。在另外的實施方案中，第一氨基酸序列描述于SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :6、或SEQ IDNO :9中。在一些實施方案中，第一氨基酸序列描述于SEQ ID NO 17,SEQ ID N0:18、或SEQID NO: 19中。在另一實施方案中，通過使用重組表達系統(tǒng)共表達多肽與包含SEQ ID NO 31中所述氨基酸序列的vWF前肽片段，由此所述片段以“反式”起作用以指導包含所述多肽的二硫鍵連接的多聚體裝配，來制備蛋白質(zhì)復合體。V.方法在再一方面中，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明蛋白質(zhì)復合體的方法。在一些實施方案中，使用包含由所述第二氨基酸序列所確定結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)域的結(jié)合配偶體的親和柱親和純化復合體。例如，其中第二氨基酸序列對應于抗體Fe多肽，包含A蛋白或G蛋白的親和柱可用于親和純化復合體。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體被固定化。備選地，親和柱包含結(jié)合多肽Fe部分的抗體，或者結(jié)合由多肽第一氨基酸序列所確定結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)域的抗體。在一些實施方案中，待制備的復合體包含含有通過二硫鍵連接的兩個可溶性融合蛋白的二聚體，其中每一蛋白質(zhì)包含與Fe多肽N-末端融合的第一氨基酸序列，其中第一氨基酸序列存在于vWF多肽中，其中二聚體能夠結(jié)合FVIII。在另一實施方案中，復合體還包含結(jié)合至二聚體的FVIII。FVIII可以從復合體去除/解離，并且任選地進行一個或更多個額外的純化步驟以得到部分純的、基本上純的或者純的FVIII。在一個方面中，本發(fā)明提供了制備FVIII的方法，方法包括使FVIII與多肽接觸以形成包含F(xiàn)VIII和多肽的蛋白質(zhì)復合體，其中多肽包含在vWF多肽中存在的第一氨基酸序列和與第一氨基酸序列異源的第二氨基酸序列，其中多肽能夠結(jié)合FVIII以形成蛋白質(zhì)復合體。在一個實施方案中，方法還包括將復合體選擇性地附著至分離介質(zhì)上，所述分離介質(zhì)包含對由第二氨基酸序列所確定區(qū)域或者結(jié)構(gòu)域具有親和性的結(jié)合配偶體。在另一實 施方案中，第二氨基酸序列對應于免疫球蛋白Fe區(qū)。在另外的實施方案中，結(jié)合配偶體是A蛋白或G蛋白。在一個實施方案中，結(jié)合配偶體是抗體。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是針對免疫球蛋白Fe區(qū)的抗體。在再一實施方案中，復合體包含二聚體形式的兩個多肽鏈，其中二聚體親和性地結(jié)合至FVIII。對于結(jié)合配偶體的固定化，可以使用任何的不同固體支持物。例如，固體支持材料可以由多糖例如纖維素、淀粉、葡聚糖、瓊脂或瓊脂糖、或者親水的合成的聚合物例如取代或非取代聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯親水聚合物、聚苯乙烯、聚砜等組成?？梢杂米鞴腆w支持材料的其它適宜材料包括多孔礦物材料，例如硅石、氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯和其它陶瓷結(jié)構(gòu)。備選地，復合材料可以用作固體支持材料。此類復合材料可以通過兩種或者更多種上述實體的共聚合或者互穿網(wǎng)絡形成。適宜的復合材料的實例包括多糖-合成聚合物和/或多糖-礦物結(jié)構(gòu)和/或合成聚合物-礦物結(jié)構(gòu)，此類材料描述于美國專利號5，268，097,5, 234，991和5，075，371中，每一篇參考文獻關(guān)于復合材料的教導通過參考并入本文。本發(fā)明的固體支持材料可以是直徑大小范圍從大約O. Imm至IOOOmm的珠或不規(guī)則的顆粒、任何大小的纖維(中空或者其他)、膜、厚度范圍從大約O. Imm至Imm的扁平表面、和具有直徑從I μ m至數(shù)mm的孔的海綿樣材料。優(yōu)選地，通過在例如結(jié)合配偶體的巰基與固體支持物上存在的反應基之間形成的共價鍵將結(jié)合配偶體化學固定在固體支持物上。能夠與本發(fā)明的配體的巰基反應的活性基包括環(huán)氧基、甲苯磺酸基、三氟乙基磺酸單甲氧基、鹵化物和乙烯基。由于許多上述固體支持材料不包括上述反應基之一，可以使用既能夠與固體支持材料反應又能夠提供必需的反應基的雙功能活化劑。適宜的活化劑實例包括表氯醇、表溴醇、二溴丙醇和二氯丙醇、二溴丁烷、乙二醇二縮水甘油醚、丁二醇二縮水甘油醚、二乙烯砜等等。有代表性的適宜支持物實例是Sepharose 、瓊脂糖、來自Pharmacia(瑞典)的活化的-CH Sepharose 4B(包含N-羥基琥珀酰亞胺的瓊脂糖)樹脂、NHS-活化的Sepharose 4Fast Flow樹脂(以6_氨基己酸活化以形成活化的N-羥基琥珀酰亞胺酯；Amersham Biosciences)、CNBr-活化的 Sepahrose Fast Flow 樹脂(以溴化氰活化的；Amersham Biosciences) ,PROTEIN PAK 環(huán)氧-活化的親和樹脂(Waters，美國)、EUPERGIT C30N 樹脂(Rohm & Haas,德國)、UltraLink Biosupport Medium (Pierce)、TrisacrylGF-2000 (Pierce)、或者來自BioRad(美國)的AFFI-GEL 。優(yōu)選地，用于親和層析的支持物以環(huán)氧基預活化用于直接偶聯(lián)肽和蛋白質(zhì)。用于實施本發(fā)明方法的親和層析樹脂包括，但不限于，上述配體或化合物與任何上述支持物的任意組合。特異性親和層析樹脂的非限定性實例是A蛋白-Sephar0SeTM、A蛋白-瓊脂糖、A蛋白-瓊脂糖CL-4B、G蛋白-Sepharose 、G蛋白-瓊脂糖、G蛋白-瓊脂糖CL-4B、A/G蛋白瓊脂糖(上面所有樹脂的不同形式的樹脂可以從多個生產(chǎn)商獲得，例如Sigma-Aldrich、Amersham 和 Pierce)、A 蛋白 Ultraf low (Sterogene)、A 蛋白 Ce 11 thru 300 (Sterogene)、QuickMab (Sterogene)、QuickProtein A (Sterogene)、Thruput 和Thruput Plus (Sterogene) > PROSEP-A 或 PROSEP-G (Millipore)、以及上面的任何變體。用于親和層析的方法至少部分地依賴于所使用的特定試劑，并且有代表性地由生產(chǎn)商提供或者是本領(lǐng)域中已知的。例如，親和層析試劑可以包裝在以能夠促進蛋白質(zhì)復合體與結(jié)合配偶體之間相互作用的緩沖液平衡的層析柱內(nèi)，然后與包含復合體的混合物接觸。然后將柱用能夠洗脫雜質(zhì)而不干擾復合物與親和性配體之間相互作用的至少一種溶液洗滌。然后，包含多肽和FVIII的整個復合體可以使用合適的洗脫液洗脫以得到復合體。備選地，F(xiàn)VIII可以從復合體上解離下來，由此復合體仍然結(jié)合至結(jié)合配偶體上。例如，在制備包含多肽(例如多肽二聚體)和與其結(jié)合的FVIII或者無FVIII的蛋白質(zhì)復合體的方法中，包含復合體的混合物可以與具有A蛋白作為配體的至少一種親和層析樹脂，在允許復合體與樹脂結(jié)合的條件下接觸。希望的是，A蛋白是天然存在的或者重組形式的A蛋白。然后可以用一系列具有漸增酸度(例如pH 7. 0、6. 5、6. 0、5. 8、5. 5、5. 2、
5.0、4. 8、4. 6、4. 5、4. 4或4. 0)的洗滌緩沖液洗滌層析樹脂，以致于洗滌導致非復合體物質(zhì)從樹脂上解離但是復合體基本上不解離?？梢杂孟礈炀彌_液洗滌樹脂至少一次，優(yōu)選至少2次，并且最優(yōu)選至少3次，其中第一次的洗滌緩沖液具有大約5. O至6. O的pH，優(yōu)選大約
5.2，并且隨后每一次的洗滌緩沖液具有比先前的洗滌緩沖液酸性更大的pH。在優(yōu)選的實施方案中，洗滌緩沖液將不會使超過80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或者5%的復合體從樹脂上解離。在一些實施方案中，在洗滌樹脂之后，使用具有大約2. 5至3.5 (例如pH 2. 5、3. O、
3.5)的酸性pH并且比任何洗滌緩沖液酸性更強的洗脫液，將復合體從層析樹脂上洗脫下來。洗脫物包含純化的、部分純化的、或者基本上純化的復合體，優(yōu)選純度至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或者95%或更高。在另外的實施方案中，其中待制備的蛋白質(zhì)復合體包含結(jié)合至二聚體形式的多肽的FVIII，樹脂結(jié)合和洗滌在如此條件下開展以致于FVIII仍然親和結(jié)合至二聚體，并且二聚體仍然結(jié)合至樹脂。然后，從樹脂-結(jié)合的二聚體分離FVIII以提供包含F(xiàn)VIII的組合物，其中組合物是部分的、基本上、或者完全沒有二聚體。因此，在一些實施方案中，包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽可以用于根據(jù)它們結(jié)合FVIII以形成包含多肽與FVIII的蛋白質(zhì)復合體的能力來制備FVIII。在一些實施方案中，此種蛋白質(zhì)復合體可進行親和層析以制備復合體和/或與其結(jié)合的任何 FVIII。、
在其它方面中，本發(fā)明提供了包含F(xiàn)VIII的組合物，其中FVIII根據(jù)本文所述方法制備。還提供了包含蛋白質(zhì)復合體和結(jié)合至復合體多肽的FVIII或者不含F(xiàn)VIII的組合物，所述蛋白質(zhì)復合體包含具有所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列的多肽。在ー個實施方案中，組合物包含與FVIII結(jié)合的含有ニ聚體(例如同ニ聚體或異ニ聚體)形式的兩個多肽的蛋白質(zhì)復合體。因此，在ー些方面中，本發(fā)明提供了組合物(例如截斷的重組VWF融合蛋白)，和用于通過保護所表達的重組FVIII不被去除和/或降解而增強哺乳動物細胞表達重組FVIII，以及通過使用整合入本發(fā)明重組vWF多肽內(nèi)的融合蛋白柄(例如第二氨基酸序列)快速層析純化所得到的FVIII :重組vWF復合體的方法。因此，在多個實施方案中，提供了使用與免疫球蛋白(例如免疫球蛋白Gl)Fc部分 偶聯(lián)的截斷形式vWF的強大且簡單的方法，以與完整vWF分子類似的方式在表達和生產(chǎn)過 程中與FVIII復合并保護FVIII。本文所述的獨特方法是更有效的，至少因為本發(fā)明的vWF融合多肽更小且表達更容易，和/或(2)可以通過融合蛋白上的Fe區(qū)可快速純化FVIII vWF融合復合體，由此選擇性地富集所希望的FVIII分子而同時來自其他蛋白質(zhì)以及來自vWF的污染較少。此外，F(xiàn)e區(qū)的高親和性結(jié)合提供了，F(xiàn)VIII vffF融合復合體也可以通過內(nèi)聯(lián)A蛋白柱原位去除，以便例如增加產(chǎn)量和純度。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了在灌注過程中使用內(nèi)聯(lián)純化，以便通過選擇性地將vWF融合Fe區(qū)親和附著于A蛋白(或者其他相似)基質(zhì)上來連續(xù)純化FVIII :重組vWF融合復合體的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明利用了兩個觀察結(jié)果產(chǎn)生了用于FVIII純化的優(yōu)良方法(a)使用重組的vWF多肽，具體而言是仍然結(jié)合FVIII但顯著小于全長分子的重組的截斷vWF多肽，和(b)產(chǎn)生具有以高親和性結(jié)合配體A蛋白的免疫球蛋白(例如IgGDFc區(qū)的融合蛋白。該組合提供了在哺乳動物細胞系統(tǒng)中強大表達，而同時可以快速收集FVIII recvWF復合體，而無需考慮表達上清液中的培養(yǎng)基和其它成分以及與離子強度相關(guān)的問題等等。其還使得可以使用多種試劑/溶液去除FVIII而同時保留完全活性的且具有優(yōu)良回收率的產(chǎn)物。Fe部分與A蛋白(或高親和性抗體)柱的高親和性結(jié)合不干擾FVIII :vWF相互作用，因為它是分開的且獨立的分子實體。在再一方面中，本發(fā)明提供了用于重組制備本發(fā)明多肽的方法。在一些實施方案中，方法包括(a)通過以編碼本發(fā)明多肽的表達載體轉(zhuǎn)化細胞系產(chǎn)生哺乳動物細胞系；(b)使細胞系在足以表達多肽的條件下生長；和(C)從步驟(b)純化所表達的蛋白質(zhì)以得到vWF-Fc融合蛋白，其中融合蛋白的vWF部分是缺少成熟全長vWF多肽的至少ー個結(jié)構(gòu)域的截斷vWF，其中融合蛋白能夠形成能夠結(jié)合FVIII蛋白質(zhì)的多聚體。在一個實施方案中，截斷的vWF具有結(jié)構(gòu)域D’和D3，但截斷vWF缺乏結(jié)構(gòu)域Al、A2、A3、D4、B、Cl、C2、CK或其組合。在另ー實施方案中，截斷的vWF具有結(jié)構(gòu)域D’、D3和Al，但是截斷的vWF缺乏結(jié)構(gòu)域A2、A3、D4、B、C1、C2和CK。在一些實施方案中，截斷的vWF具有結(jié)構(gòu)域D’、D3、Al和A2，但是截斷的vWF缺乏結(jié)構(gòu)域A3、D4、B、C1、C2和CK。在另外的實施方案中，截斷的vWF具有結(jié)構(gòu)域D’、D3、A1、A2和A3，但是截斷的vWF缺乏結(jié)構(gòu)域D4、B、C1、C2和CK。在再一實施方案中，截斷的vWF缺乏結(jié)構(gòu)域D4、B、C1、C2和CK。在另外的實施方案中，方法還包括共表達重組前肽，其中vWF-Fc融合蛋白作為還缺乏前肽序列的重組融合蛋白表達，其中重組前肽與重組vWF-Fc融合蛋白在重組表達之后結(jié)合形成前肽/VWF-Fc復合體。VI.其它組合物和方法在其它方面中，本發(fā)明提供了用于具有延長的血漿半衰期的FVIII的方法和組合物。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的重組vWF-Fc融合多肽可以用作重組或者血漿來源FVIII的添加劑促進延長FVIII和/或組合復合體的半衰期。根據(jù)本發(fā)明，在一些實施方案中，F(xiàn)e區(qū)融合至截斷的vWF部分以提供FVIII結(jié)合并且Fe區(qū)還提供給復合物以額外的半衰期。例如，在一個實施方案中，重組FVIII :重組vWF-Fc融合復合體可以直接從表達的培養(yǎng)基中純化，然后作為藥物制劑，例如與或不與過量重組vWF-Fc融合蛋白(即本發(fā)明的多肽)一起注射(例如靜脈內(nèi))進入患者內(nèi)。在一些實施方案中，以過量vWF-Fc融合蛋白(以摩爾濃度計例如2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多)補充復合體以便增加血漿中的融合多肽濃度，并且當在血漿中解離時提供FVIII以再結(jié)合至vWF-Fc融合蛋白。 在再一實施方案中，本發(fā)明的融合多肽可以以高濃度與FVIII配制，通過靜脈內(nèi)或者其它途徑施用至人或者非人受試者，由此使得FVIII在其循環(huán)過程中和被凝血酶切割之前與vWF融合蛋白結(jié)合，在損傷部位釋放。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽和/或包含它們的蛋白質(zhì)復合體，可以配制成用于治療。例如，本發(fā)明的多肽和/或蛋白質(zhì)復合體可以根據(jù)已知方法配制以制備優(yōu)選在混合物中與可藥用載劑混合的可藥用組合物。適宜的載劑和其制劑，包括其他人蛋白質(zhì)例如人血清白蛋白，描述于例如E. W. Hartin編的Remington1 s PharmaceuticalSciences中，該參考文獻通過參考并入本文。在一個實施方案中,此類組合物將包含有效量的與重組vWF多肽復合的FVIII蛋白質(zhì)，以及適宜量的載劑以制備適宜向受試者有效施用的可藥用組合物，例如腸胃外施用至患有例如血友病A的受試者。用于治療血友病患者的當前平均劑量隨著出血發(fā)作的嚴重性而變。例如，靜脈內(nèi)施用的平均劑量可以在如下范圍對于術(shù)前適應證大約40單位FVIII/kg，對于少量出血大約15至大約20単位/kg，并且對于維持劑量大約20至大約40単位/kg施用大約8-小時的時間段施用。其它劑量和方案可以容易地由血友病治療領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。VII.試劑盒在再一方面中，還提供了包含本發(fā)明多肽、核酸序列、蛋白質(zhì)復合體和/或組合物的試劑盒。試劑盒可以具有単一容器，或者可以對于每一目的成分具有不同的容器。還考慮了包含對于制備重組多肽和/或衍生自重組多肽的蛋白質(zhì)復合體所必需試劑的試劑盒，例如試劑例如，但不限于，表達載體、包含表達載體的重組宿主細胞、和純化試劑。此外，其中試劑盒中的成分在ー個或更多個液體溶液中提供，液體溶液是水性溶液，其中特別優(yōu)選無菌水性溶液。然而，試劑盒的成分可以作為一種或多種干燥粉末提供。當試劑或者成分作為干燥粉末提供時，可通過加入適宜的溶劑將粉末重構(gòu)?？紤]了還可提供溶剤。給出下列實施例僅僅為了說明本發(fā)明方法而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道給出的實施例僅僅說明什么是要求專利保護的并且本發(fā)明在范圍上僅由后附權(quán)利要求書限定。實施例實施例I用于截斷vWF-Fc融合多肽的表達質(zhì)粒的構(gòu)建
商業(yè)性合成(GENEART AG, Regensburg,德國)6個DNA分子,姆一個具有編碼截斷vWF-Fc融合多肽的核苷酸序列。對于DNA分子的核苷酸序列和相應的編碼氨基酸序列的序列標識符示于表I中。表I :截斷vWF-Fc多肽的核苷酸和氨基酸序列
權(quán)利要求
1.多肽，其包含在VWF多肽中存在的第一氨基酸序列和與該第一氨基酸序列異源的第二氨基酸序列，其中所述多肽能夠結(jié)合FVIII，前提條件是所述多肽缺乏vWF結(jié)構(gòu)域Al、A2、A3、D4、BI、B2、B3、Cl、C2、CK 或其組合。
2.權(quán)利要求I的多肽，其中所述第一氨基酸序列示于SEQID NO USEQ ID NO :2、SEQID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ IDN0:9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO : 14、SEQ IDNO 15,SEQ ID NO 33,SEQ ID NO:34、或 SEQ ID NO :35。
3.權(quán)利要求I的多肽，其中所述多肽包含示于SEQID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ IDNO 19,SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :38 或 SEQID NO 39的序列。
4.權(quán)利要求I的多肽，其中所述多肽能夠形成二聚體。
5.權(quán)利要求I的多肽，其中所述第二氨基酸序列對應于免疫球蛋白Fe。
6.權(quán)利要求I的多肽，其中所述第二氨基酸序列具有示于SEQID NO:16中的序列。
7.包含權(quán)利要求I的多肽的組合物。
8.包含權(quán)利要求I的多肽和FVIII的蛋白質(zhì)復合體。
9.包含權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)復合體的組合物。
10.編碼權(quán)利要求I的多肽的核苷酸序列。
11.權(quán)利要求10的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列示于SEQID NO 23, SEQ ID NO:24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :37、SEQ IDNO :42、或 SEQ ID NO :43。
12.包含權(quán)利要求10的核苷酸序列的表達載體。
13.表達權(quán)利要求I的多肽的細胞。
14.表達權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)復合體的細胞。
15.制備權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)復合體的方法，所述方法包括使所述多肽與FVIII接觸。
16.權(quán)利要求15的方法，其中接觸包括在表達FVIII的細胞中重組表達所述多肽。
17.制備FVIII的方法，所述方法包括使FVIII與權(quán)利要求I的多肽接觸以形成包含所述多肽和FVIII的蛋白質(zhì)復合體。
18.權(quán)利要求17的方法，還包括選擇性地將所述復合體附著于包含結(jié)合配偶體的樹月旨，所述結(jié)合配偶體對通過所述第二氨基酸序列限定的結(jié)構(gòu)域具有親和性。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述第二氨基酸序列對應于免疫球蛋白Fe。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述結(jié)合配偶體是A蛋白或G蛋白。
21.增加FVIII的血漿藥物代謝動力學特性的方法，所述方法包括向受試者施用包含權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)復合體的組合物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述特性是延長的血漿半衰期。
23.包含權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)復合體和可藥用載體的組合物。
24.治療血液疾病的方法，所述方法包括向受試者施用權(quán)利要求23的組合物。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述疾病是血友病。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制備FVIII和使用它們的方法、組合物和試劑盒。還提供了vWF多肽和編碼它們的核酸分子。
文檔編號A61P7/00GK102648212SQ201080051549
公開日2012年8月22日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日
發(fā)明者T·巴奈特 申請人:基立福療法公司