專利名稱：生產(chǎn)含有g(shù)la殘基的絲氨酸蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)、純化和配制蛋白酶蛋白的方法。
背景技術(shù)：
許多涉及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的蛋白，包括，例如因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和 因子XIII，被證明是有用的醫(yī)治各種病理學(xué)狀況的治療藥物。通常，參與被稱作凝血“級(jí) 聯(lián)反應(yīng)”的血液組份是酶原或酶原(zymogens)，所述酶原是可通過(guò)激活劑作用轉(zhuǎn)化成蛋白 水解酶的酶促無(wú)活性蛋白，所述激活劑自身就是被激活的凝血因子。從事這類轉(zhuǎn)化的凝 血因子通常稱為“激活因子”，并且通過(guò)加上小寫字母“a”作后綴來(lái)表示(例如，激活因子 VII(FVIIa))ο因?yàn)槭褂萌搜獫{作為藥物產(chǎn)品來(lái)源有許多不利方面，所以優(yōu)選地用重組系統(tǒng)生產(chǎn) 這些蛋白。然而，凝血蛋白要經(jīng)受各種翻譯中和翻譯后修飾，包括，例如，天冬酰胺連接的 (N-連接的)糖基化；0-連接的糖基化和谷氨酸的Y-羧化作用。由于這個(gè)原因，優(yōu)選地在 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)這些蛋白，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以正確地修飾所述重組蛋白。在從微生物或細(xì)胞系培養(yǎng)物生產(chǎn)凝血蛋白的過(guò)程中，最終的生產(chǎn)步驟是回收和任 意濃縮目的產(chǎn)物。除了其它污染物例如培養(yǎng)成份、核酸等，細(xì)胞生長(zhǎng)和含有分泌蛋白的培養(yǎng) 基以及特別是含有細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的細(xì)胞裂解物也或多或少地含有由所述細(xì)胞生產(chǎn)的其 它蛋白。為了獲得純化的蛋白產(chǎn)物，因而必需將所述目的蛋白從存在于含有所述目的蛋白 的粗材料中的其它蛋白和多肽以及其它雜質(zhì)中分離出來(lái)。美國(guó)專利5，700，914涉及用于FVII純化的方法，其中鋅至少存在于其中的一步純 化步驟中。在傳統(tǒng)的培養(yǎng)、純化步驟和傳統(tǒng)的配制過(guò)程中，由于激活的凝血蛋白的蛋白酶解 功能使所述蛋白易于自降解。因而，在本領(lǐng)域需要改進(jìn)用于培養(yǎng)、純化和配制被激活的凝血 蛋白的方法以在生產(chǎn)凝血蛋白特別是重組人因子VII或因子VII相關(guān)多肽的過(guò)程中減少其 自身降解。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明在廣義上涉及蛋白酶的純化。此處描述的方法可用于純化包括凝血因子 FXII/FXIIa、FXI/FXIa、FX/FXa、FIX/FIXa、FVII/FVIIa、凝血酶以及抗凝血蛋白 C 在內(nèi)的任 何蛋白酶。優(yōu)選地所述方法用于純化在細(xì)胞培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的重組蛋白酶。優(yōu)選地所述 方法用于純化含有GLA( γ -羧基谷氨酸)殘基的絲氨酸蛋白酶、維生素K依賴性凝血因子 Vila、IXa、Xa、活化蛋白C和凝血酶。更優(yōu)選地含有具有GLA( Y-羧基谷氨酸)殘基的結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶是因子IX 多肽例如FIXa。甚至更優(yōu)選地含有具有GLA( γ-羧基谷氨酸)殘基的結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白 酶是因子VII多肽例如FVIIa。本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及用于生產(chǎn)純化的含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法， 所述方法包括(i)在適合于表達(dá)含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的宿主細(xì)胞；(ii)回收包含所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的所有或部分培養(yǎng)基；并且(iii)從所述培養(yǎng)基中純化所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶；其中在步驟(iii)中的游離鈣離子濃度高于1. 2mM或低于0. IOmM ；和/或其中在步驟(iii)中除了鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬離子的游離離子濃度高于0. 025mM ；和/或其中在步驟(iii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及用于生產(chǎn)純化的因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)在適合于表達(dá)因子VII多肽的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)因子VII多肽的宿 主細(xì)胞；(ii)回收包含因子VII多肽的所有或部分培養(yǎng)基；并且(iii)從所述培養(yǎng)基中純化因子VII多肽；其中在步驟(iii)中游離鈣離子濃度高于1.2mM或低于0. IOmM;和/或其中在步 驟(iii)中除了鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬離子的游離離子濃度高于0.025mM;和/或 其中在步驟(iii)中PH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及用于生產(chǎn)純化的含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法， 所述方法包括(i)在適合于表達(dá)含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)含 有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的宿主細(xì)胞；(ii)回收包含所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的所有或部分培養(yǎng)基；并且(iii)從所述培養(yǎng)基中純化所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶；其中在步驟(iii)中鈣離子與含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的摩爾比(Ca2+ 含 有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶)高于20或低于0.50;和/或其中在步驟(iii)中除了鋅離 子和鈣離子外的二價(jià)金屬離子的游離離子濃度高于0.025mM;和/或其中在步驟(iii)中 pH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及用于生產(chǎn)純化的因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)在適合于表達(dá)因子VII多肽的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)因子VII多肽的宿 主細(xì)胞。(ii)回收包含因子VII多肽的所有或部分培養(yǎng)基；并且(iii)從所述培養(yǎng)基中純化因子VII多肽；其中在步驟(iii)中鈣離子與因子VII多肽的摩爾比(Ca2+ FVII多肽)高于20 或低于0. 50 ；和/或其中在步驟(iii)中除了鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬離子的游離離 子濃度高于0. 025mM ；和/或其中在步驟(iii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及用于純化含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法，所述方法 包括(i)回收包含所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的所有或部分溶液；并且(ii)從所述溶液中純化所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶；其中在步驟(ii)中鈣離子與含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的摩爾比(Ca2+ 含有 GLA殘基的絲氨酸蛋白酶)高于20或低于0.50;和/或其中在步驟(ii)中除了鋅離子和 鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM;和/或其中在步驟(ii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及用于純化因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)回收包含因子VII多肽的所有或部分溶液；并且(ii)從所述溶液中純化因子VII多肽；其中在步驟(ii)中鈣離子與因子VII多肽的摩爾比(Ca2+ FVII多肽)高于20 或低于0.50;和/或其中在步驟(ii)中除了鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離 離子濃度高于0. 025mM ；和/或其中在步驟(ii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及用于純化含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法，所述方法 包括(i)回收包含所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的所有或部分溶液；并且(ii)從所述溶液中純化所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶；其中在步驟(ii)中游離鈣離子的濃度高于1. 2mM或低于0. IOmM ；和/或其中在 步驟(ii)中除了鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0.025mM;和/ 或其中在步驟(ii)中PH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及用于純化因子VII多肽的方法，所述方法包括⑴回收包含因子VII多肽的所有或部分溶液；并且(ii)從所述溶液中純化因子VII多肽；其中在步驟(ii)中游離鈣離子的濃度高于1. 2mM或低于0. IOmM ；和/或其中在 步驟(ii)中除了鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0.025mM;和/ 或其中在步驟(ii)中PH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及用于純化含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法，其中含有 GLA殘基的絲氨酸蛋白酶溶液要經(jīng)過(guò)多個(gè)純化步驟，其中在至少一個(gè)純化步驟中所述游離 鈣離子濃度高于1. 2mM或低于0. ImM ；和/或其中在至少一個(gè)純化步驟中除了鋅離子和鈣 離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM ；和/或其中在至少一個(gè)純化步驟 中PH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及用于純化因子VII多肽方法，其中因子VII多肽溶液要經(jīng) 過(guò)多個(gè)純化步驟，其中在至少在一個(gè)純化步驟中所述游離鈣離子濃度高于1.2mM或低于 0. ImM ；和/或其中在至少一個(gè)純化步驟中除了鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游 離離子濃度高于0. 025mM ；和/或其中在至少一個(gè)純化步驟中pH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及用于純化含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法，其中含有 GLA殘基的絲氨酸蛋白酶溶液要經(jīng)過(guò)多個(gè)純化步驟，其中在至少一個(gè)純化步驟中鈣離子與 含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的摩爾比(Ca2+ 含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶)高于20或 低于0. 50 ；和/或其中在至少一個(gè)純化步驟中除了鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的 游離離子濃度高于0. 025mM ；和/或其中在至少一個(gè)純化步驟中pH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及用于純化因子VII多肽的方法，其中因子VII多肽溶 液要經(jīng)過(guò)多個(gè)純化步驟，其中在至少一個(gè)純化步驟中鈣離子與因子VII多肽的摩爾比 (Ca2+ FVII多肽)高于20或低于0.50;和/或其中在至少一個(gè)純化步驟中除了鋅離子和 鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM ；和/或其中在至少一個(gè)純化步 驟中PH低于7. 5或高于8. 6。
本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及在包含含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的溶液中穩(wěn)定含有 GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法，其中將所述包含含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的溶液經(jīng) 過(guò)下列步驟加入鈣以獲得高于1. 2mM或低于0. IOmM的游離鈣離子濃度；和/或加入除了 鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子以獲得高于0. 025mM的鋅和鈣之外的二價(jià)金屬陽(yáng)離 子的游離離子濃度；和/或調(diào)節(jié)包含含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的溶液的pH以使PiHS 于7. 5或高于8. 6。 本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及在含有因子VII多肽的溶液中穩(wěn)定因子VII多肽的方 法，其中將所述含有因子VII多肽的溶液經(jīng)過(guò)下列步驟加入鈣以獲得高于1. 2mM或低于 0. IOmM的游離鈣離子濃度；和/或加入除了鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子以獲得高 于0. 025mM的陽(yáng)二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度；和/或調(diào)節(jié)含有因子VII多肽的溶液的 PH以使pH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及組合物，所述組合物包含(i)含有GLA殘基的絲氨酸蛋白 酶和(ii)濃度高于1. 2mM或低于0. IOmM的游離鈣離子；和/或除了鋅離子和鈣離子外的 濃度高于0. 025mM的游離二價(jià)金屬陽(yáng)離子；和/或其中所述組合物具有低于7. 5或高于8. 6 的pH。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及組合物，所述組合物包含(i)因子VII多肽和(ii)濃度高 于1. 2mM或低于0. IOmM的游離鈣離子；和/或除了鋅離子和鈣離子外的濃度高于0. 025mM 的游離二價(jià)金屬陽(yáng)離子；和/或其中所述組合物具有低于7. 5或高于8. 6的pH。發(fā)明詳述為了減少極度活躍的FVII (a)類似物，例如具有比野生型人FVIIa更高蛋白酶解 活性的FVII多肽變體，的自身降解，通過(guò)下列方式減低所述活性和易感性a)在純化過(guò)程 中在> 25mM 二價(jià)金屬陽(yáng)離子(除了鋅離子和鈣離子外)例如Cu2+存在的情況下，和/或b) 在純化過(guò)程中在> 1. 2mM Ca2+存在的情況下和/或c)在純化過(guò)程中在< 0. ImM Ca2+存在 的情況下和/或d)在純化過(guò)程中在pH低于7. 5的情況下和/或e)在純化過(guò)程中在pH高 于8. 6的情況下。在中性pH(pH= 7.5)時(shí)極度活躍的FVIIa類似物的自身降解非常嚴(yán)重并且在純 化過(guò)程中導(dǎo)致相當(dāng)大的產(chǎn)量損失。已知的解決辦法包括在純化方法中引入高毒性的蛋白酶 抑制劑或昂貴的“定制(tailored)，，的抑制劑或清除性肽/蛋白。由本發(fā)明的發(fā)明者進(jìn)行的在pH6的條件下穩(wěn)定培養(yǎng)上清液、免疫親和捕獲和通過(guò) 陰離子交換進(jìn)行純化的方法已顯示具有大量?jī)?yōu)于已知FVII純化方法的有利方面。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于生產(chǎn)純化的因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)在適合于表達(dá)因子VII多肽的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)因子VII多肽的宿 主細(xì)胞；(ii)回收包含因子VII多肽的所有或部分培養(yǎng)基；并且(iii)從所述培養(yǎng)基中純化因子VII多肽；其中在步驟(iii)中游離鈣離子濃度高于1. 2mM或低于0. IOmM ；和/或其中在步 驟(iii)中除了鋅離子和鈣離子外二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0.025mM;和/或其中在步驟(iii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及用于生產(chǎn)純化的因子VII多肽的方法，所述方法包括
(i)在適合于表達(dá)因子VII多肽的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)因子VII多肽的宿主細(xì)胞；(ii)回收包含所述因子VII多肽的所有或部分培養(yǎng)基；并且(iii)從所述培養(yǎng)基中純化因子VII多肽；其中在步驟(iii)中鈣離子與因子VII多肽的摩爾比(Ca2+ 因子VII多肽)高 于20或低于0. 50 ；和/或其中在步驟(iii)中除了鋅離子和鈣離子外二價(jià)金屬陽(yáng)離子的 游離離子濃度高于0. 025mM ；和/或其中在步驟(iii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及用于純化因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)回收含有因子VII多肽的所有或部分溶液；并且(ii)從所述溶液中純化因子VII多肽；其中在步驟(ii)中鈣離子與因子VII多肽的摩爾比(Ca2+ FVII多肽)高于20 或低于0.50;和/或其中在步驟(ii)中除了鋅離子和鈣離子外二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離 子濃度高于0. 025mM ；和/或其中在步驟(ii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及用于純化因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)回收含有因子VII多肽的所有或部分溶液；并且(ii)從所述溶液中純化因子VII多肽；其中在步驟(ii)中游離鈣離子濃度高于1. 2mM或低于0. ImM ；和/或其中在步驟 (ii)中除鋅離子和鈣離子外二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM ；和/或其中在 步驟(ii)中PH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及用于純化因子VII多肽的方法，其中因子VII多肽溶液要 經(jīng)過(guò)多個(gè)純化步驟，其中在至少一個(gè)純化步驟中所述游離鈣離子濃度高于1.2mM或低于 0. ImM;和/或其中在至少一個(gè)純化步驟中除了鋅離子和鈣離子外二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離 離子濃度高于0. 025mM ；和/或其中在至少一個(gè)純化步驟中pH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及用于純化因子VII多肽的方法，其中因子VII多肽溶液 要經(jīng)過(guò)多個(gè)純化步驟，其中在至少一個(gè)純化步驟中所述鈣離子和因子VII多肽的摩爾比 (Ca2+ FVII多肽)高于20或低于0.50;和/或其中在至少一個(gè)純化步驟中除了鋅離子和 鈣離子外二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM ；和/或其中在至少一個(gè)純化步驟 中PH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及在含有因子VII多肽的溶液中穩(wěn)定因子VII多肽的方 法，其中將所述含有因子VII多肽的溶液經(jīng)過(guò)下列步驟加入鈣以獲得高于1. 2mM或低于 0. IOmM的游離鈣離子濃度；和/或加入除鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子以獲得高于 0. 025mM的鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度；和/或調(diào)節(jié)含有因子VII 多肽的溶液的PH以使pH低于7. 5或高于8. 6。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及用于生產(chǎn)純化的含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法，所 述方法包括(i)在適合于表達(dá)含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)含 有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的宿主細(xì)胞；(ii)回收包含所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的所有或部分培養(yǎng)基；并且(iii)從所述培養(yǎng)基中純化所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶；
其中在步驟(iii)中pH具有在4. 5和6. 9之間的值或具有在8. 6和10之間的值。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及用于純化含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法，其中含有 GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的溶液要經(jīng)過(guò)多個(gè)步驟，其中在至少一個(gè)純化步驟中pH具有在 4. 5和6. 9之間的值或具有在8. 6和10之間的值。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及在包含含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的溶液中穩(wěn)定含有 GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法，其中所述包含含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的溶液要經(jīng) 過(guò)下列步驟加入鈣以獲得高于1. 2mM或低于0. IOmM的游離鈣離子濃度；和/或加入除鋅 離子和鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子以獲得高于0. 025mM的鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬 陽(yáng)離子的游離離子濃度；和/或?qū)蠫LA殘基的絲氨酸蛋白酶的溶液的pH值調(diào)節(jié)在 4. 5和6. 9之間或在8. 6和10之間。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及組合物，所述組合物包含存在于溶液(pH值為4. 5和6. 9 之間或8. 6和10之間)中的含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶”是指選自因子VII多肽、因 子IX多肽、因子X和其變體和衍生物、蛋白C和其變體和衍生物以及凝血酶原/凝血酶和 其變體和衍生物的蛋白，其中所述蛋白包含一個(gè)或更多個(gè)Y-羧基谷氨酸(GLA)氨基酸殘 基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶是所述蛋白的活化形式，例如因 子Vila、因子IXa、因子Xa、活化的蛋白C和凝血酶。在一個(gè)實(shí)施方案中所述含有GLA殘基 的絲氨酸蛋白酶的是人的絲氨酸蛋白酶。“穩(wěn)定”存在于包含絲氨酸蛋白酶的組合物中的含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶例 如因子VII多肽或因子IX多肽，是指減少組合物中所述絲氨酸蛋白酶的降解程度(即每 單位時(shí)間降解產(chǎn)物的量)，例如通過(guò)蛋白酶解的或化學(xué)的降解。優(yōu)選地如此處描述的在 ⑶-FVIIa形成速度測(cè)定中所測(cè)量的降解低于⑶-FVIIa形成最大值的60%、例如⑶-FVIIa 形成最大值的50%、例如⑶-FVIIa形成最大值的40%、例如⑶-FVIIa形成最大值的30%、 例如⑶-FVIIa形成最大值的20%、例如⑶-FVIIa形成最大值的10%。應(yīng)當(dāng)理解“穩(wěn)定”組合物中含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶，是指在重組蛋白生產(chǎn)過(guò) 程中的任何步驟增加其穩(wěn)定性，所述步驟選自收獲、捕獲、貯存、處理、加工、純化、大量預(yù)配 制(bulk preformulation)、大量配制(bulk formulation)、超/滲濾、離子交換、陰離子交 換捕獲、大小排阻層析、疏水相互作用層析、沉淀和親和純化。如此處所使用的術(shù)語(yǔ)“被純化的含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶”是指按重量計(jì)算 從至少大約50%的多核苷酸、脂類、糖類以及在真核宿主細(xì)胞表達(dá)后的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的任 何其它污染多肽或其它污染物中分離的含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶，所述污染物將干擾 其治療、診斷、預(yù)防或研究用途。通過(guò)使用各種方法學(xué)可將所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白 酶純化至基本不含來(lái)自培養(yǎng)基的天然污染物。也可將用于純化所述含有GLA殘基的絲氨酸 蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)層析分離技術(shù)用于某些純化步驟。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“純化的因子VII多肽”是指按重量計(jì)算從至少大約50%的多核苷酸、脂類、糖類以及在真核宿主細(xì)胞表達(dá)后的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的任何其它污染多肽或其 它污染物中分離的因子VII多肽，所述污染物將干擾其治療、診斷、預(yù)防或研究用途。通過(guò) 使用各種方法學(xué)可將所述因子VII多肽純化至基本不含來(lái)自培養(yǎng)基的天然污染物。也可將 用于純化所述因子VII多肽的標(biāo)準(zhǔn)層析分離技術(shù)用于某些純化步驟。
從包含多肽和一種或更多種污染物的組合物中“純化”多肽，是指通過(guò)從組合物中 除去(全部或部分地)至少一種污染物以增加所述多肽在組合物的純度。“純化步驟”可以 是部分或全部純化過(guò)程(產(chǎn)生“均一的”組合物的過(guò)程)，此處所使用的均一的組合物是指 基于所述組合物的總重量至少包含按重量計(jì)算大約70 %的目的多肽，優(yōu)選地按重量計(jì)算至 少大約80%。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“游離鈣離子濃度”是指被水分子包圍的二價(jià)正鈣離子(Ca2+) 的濃度。該術(shù)語(yǔ)不包括固體形式的鈣離子，即以晶體結(jié)構(gòu)或與蛋白例如FVII 結(jié)合形式存在 的鈣。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“除鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度”是 指被水分子包圍的二價(jià)正離子的濃度，所述離子不是鈣離子或鋅離子。該術(shù)語(yǔ)不包括固體 形式的二價(jià)正離子，即以晶體結(jié)構(gòu)或與蛋白結(jié)合形式存在的離子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，純化步驟是色譜純化步驟。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少有一個(gè)純化步驟是疏水相互作用層析。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少有一個(gè)純化步驟是大小排阻層析。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少有一個(gè)純化步驟是陰離子交換層析。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少有一個(gè)純化步驟是超濾。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少有一個(gè)純化步驟是免疫親和純化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少有一個(gè)純化步驟是滲濾。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(iii)中游離鈣離子濃度高于1.2mM。在本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(iii)中游離鈣離子濃度高于1.3mM，例如高于1. 4mM、例如 高于1. 5mM、例如高于1. 6mM、例如高于1. 7mM、例如高于1. 8mM、例如高于1. 9mM、例如高于 2. OmM、例如高于2. ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如高于2. 4mM、例如高于2. 5mM、 例如高于2. 6mM、例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高于5. OmM、例如高于6. OmM、例如 高于7. OmM、例如高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于10. OmM、例如高于20mM、例如高于 40. OmM、例如高于60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于0. 1M、例如高于1M、例如溶液飽和狀 態(tài)下的游離鈣離子濃度。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“溶液飽和狀態(tài)下的游離鈣離子濃度”是指當(dāng)溶解的游離鈣離 子與以固體形式存在的未溶解鈣離子以平衡形式存在時(shí)游離鈣離子的濃度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(iii)中游離鈣離子的濃度低于0. 10mM。在 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(iii)中游離鈣離子的濃度低于0.09、例如低于0.08、 例如低于0. 07、例如低于0. 06、例如低于0. 05、例如低于0. 04、例如低于0. 03、例如低于 0. 02、例如低于0. 01、例如低于0. 00。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(iii)中除了鋅離子和鈣離子外二價(jià)金屬陽(yáng) 離子的游離離子濃度高于0.025mM.。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述二價(jià)金屬陽(yáng)離子選 自 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+和 Uo2+。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中， 二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自Mg2+、Cu2+和Mn2+。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(iii)中除了 鋅離子和鈣離子外二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM、例如高于0. 03mM、例如 高于0. 035mM、例如高于0. 04mM、例如高于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例 如高于0. 06mM、例如高于0. ImM、例如高于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于0. 3mM、例如高于0. 5mM、例如高于1. OmM。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在另外的二價(jià)金屬離子螯合劑存在的情況下于步驟 (iii)中純化含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在另外的二價(jià)金屬離子螯合劑存在的情況下于步驟中純化因子VII多肽。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“二價(jià)金屬離子螯合劑”是指任何除去或結(jié)合二價(jià)金屬離子例 如鈣離子或鋅離子的試劑或化合物。所述二價(jià)金屬離子螯合劑可以是聚羧酸螯合劑、檸檬 酸、浴銅靈、紅菲繞啉、DTPA,乙二胺四乙酸(EDTA)、EGTA、青霉胺、TETA, TPEN和其衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在pH低于7.5的情況下于步驟(iii)中純化含有 GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，pH低于7. 4、例如低于7. 3、例如低 于7. 2、例如低于7. 1、例如低于7. 0、例如低于6. 8、例如低于6. 6、例如低于6. 4、例如低于 6. 2、例如低于6.0、例如5.5。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在pH高于8.6的情況下于步驟(iii)中純化含有 GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，pH高于8. 7、例如高于8. 8、例如高 于8. 9、例如高于9. 0、例如高于9. 1、例如高于9. 2、例如高于9. 4、例如高于9. 6、例如高于
9.8、例如高于10. 0、例如高于10. 2、例如高于10. 4、例如高于10. 8、例如11. 0。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在pH低于7.5的情況下于步驟(iii)中純化因子 VII多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，pH低于7. 4、例如低于7. 3、例如低于7. 2、例如低 于 . 1、例如低于7. 0、例如低于6. 8、例如低于6. 6、例如低于6. 4、例如低于6. 2、例如低于 6. 0、例如 5. 5。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在pH高于8.6的情況下于步驟(iii)中純化因子 VII多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，PH高于8. 7、例如高于8. 8、例如高于8. 9、例如高 于9. 0、例如高于9. 1、例如高于9. 2、例如高于9. 4、例如高于9. 6、例如高于9. 8、例如高于
10.0、例如高于10. 2、例如高于10. 4、例如高于10. 8、例如11. 0。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)pH在4. 5和6. 9之間時(shí)純化含有GLA殘基的絲 氨酸蛋白酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)pH在4. 5和6. 9之間時(shí)純化因子VII多肽。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，PH在4. 7到6. 8之間、例如在4. 9和6. 7之間、例如在5. 1和 6. 6之間、例如在5. 3和6. 5之間、例如在5. 5和6. 4之間、例如在5. 7和6. 3之間、例如在 5. 8禾Π 6. 2之間、例如在5. 9禾Π 6. 1之間、例如6. 0左右。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)pH在8. 6和10之間時(shí)純化含有GLA殘基的絲氨酸 蛋白酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)PH在8. 6和10之間時(shí)純化因子VII多肽。在本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，PH在8. 7到9. 9之間、例如在8. 8和9. 8之間、例如在8. 9和9. 7 之間、例如在9. 0和9. 6之間、例如在9. 1和9. 5之間、例如在8. 7和9. 8之間、例如在8. 7 禾口 9. 7之間、例如在8. 7和9. 6之間、例如在8. 8和9. 5之間、例如在8. 9和9. 4之間、例如 在9. 0和9. 2之間、例如9. 2左右。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在組氨酸存在的情況下純化含有GLA殘基的絲氨酸 蛋白酶。應(yīng)當(dāng)理解組氨酸可以用于將PH緩沖在5-7或8-10的范圍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在組氨酸存在的情況下純化因子VII多肽。應(yīng)當(dāng)理 解組氨酸可為緩沖液提供5-7或8-10的pH范圍。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是真核宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述真核宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自HEK細(xì)胞、BHK細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞和骨髓瘤細(xì) 胞例如SP2-0。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述因子VII多肽是野生型人因子VII。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述因子VII多肽具有高于野生型人因子FVIIa的 蛋白酶解活性(proteolytic activity)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述因子VII多肽是選自下列的因子VII相關(guān)多 肽L305V-FVII, L305V/M306D/ D309S-FVII,L305I-FVII, L305T-FVII， F374P-FVII， V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/ M298Q-FVII,K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII,V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/ M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII,L305V/K337A-FVII,L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII,L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII,L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V-FVII,L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/ K337A-FVII,S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII,S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII,K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII,K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII,K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII,S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII,S314E/L305V/E296V-FVII,S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII,S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII,
S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S3 14E/L305V/V158T/E296V/ M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S3 14E/L305V/V158T/E296V/ K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S3 14E/L305V/V158D/E296V/ K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII,K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/ K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII,K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII,K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII,K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K3 16H/L305V/V158T/K337A/ M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K3 16H/L305V/V158D/K337A/ M298Q-FVII,K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/ Κ337Α-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII,K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/ K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII,K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII,K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII,K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K3 16Q/L305V/V158T/K337A/ M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K3 16Q/L305V/V158D/K337A/ M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/ Κ337Α-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/ V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/ S314E-FVII,
F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII,F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII,F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII,F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII,F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII,F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII,F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII,F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII,F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII,F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII,F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII,F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII,F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/ S314E-FVII,F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/ S314E-FVII,F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/ S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/ S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII,F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/ S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/ S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII,F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,S52A-因子 VII、S60A-因子 VII ；R152E-因子VII、S344A-因子VII、缺失Gla結(jié)構(gòu)域的因子VIIa ；和PllQ/ K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G 291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ；和在從 233Thr 到 240Asn 的氨基酸序列上具有添加、缺失或取代的FVII、在從304Arg到329Cys的氨基酸序列上具有 添加、缺失或取代的FVII。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(iii)中鈣離子與因子VII多肽的摩爾比 (Ca2+ FVII多肽)高于20。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(iii)中鈣離子與因子 VII多肽的摩爾比(Ca2+ FVII多肽)高于20、例如高于22、例如高于24、例如高于26、例 如高于28、例如高于30、例如高于34、例如高于38、例如高于42、例如高于45、例如高于50、 例如高于55、例如高于60、例如高于65、例如高于70、例如高于76、例如高于82、例如高于 90、例如高于95、例如高于100。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(iii)中鈣離子與因子VII多肽的摩爾比 (Ca2+ FVII多肽)低于0.50。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(iii)中鈣離子與因 子VII多肽的摩爾比(Ca2+ FVII多肽)低于0. 50、例如低于0. 45、例如低于0. 40、例如 低于0. 35、例如低于0. 30、例如低于0. 25、例如低于0. 20、例如低于0. 15、例如低于0. 10、 例如低于0. 05、例如0. 00。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少在一個(gè)純化步驟中游離鈣離子濃度高于1. 2mM。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少在一個(gè)純化步驟中游離鈣離子濃度高于1. 3mM、例如高于1.4mM、例如高于1. 5mM、例如高于1. 6mM、例如高于1. 7mM、例如高于1. 8mM、例如高于1. 9mM、 例如高于2. OmM、例如高于2. ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如高于2. 4mM、例如 高于2. 5mM、例如高于2. 6mM、例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高于5. OmM、例如高于 6. OmM、例如高于7. OmM、例如高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于10. OmM、例如高于20mM、 例如高于40. OmM、例如高于60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于0. 1M、例如高于1M、例如在 溶液飽和狀態(tài)下的游離鈣離子濃度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少在一個(gè)純化步驟中游離鈣離子濃度低于 0. 10mM。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少在一個(gè)純化步驟中游離鈣離子濃度低于0.09、 例如低于0. 08、例如低于0. 07、例如低于0. 06、例如低于0. 05、例如低于0. 04、例如低于 0. 03、例如低于0. 02、例如低于0. 01、例如低于0. 00。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少在一個(gè)純化步驟中除了鋅離子和鈣離子外二價(jià) 金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述二價(jià)金屬陽(yáng)離 子選自 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+ 和 Uo2+。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方 案中，所述二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自Mg2+、Cu2+和Mn2+。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少在一個(gè)純化步驟中除了鋅離子和鈣離子外二價(jià) 金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM、例如高于0. 03mM、例如高于0. 035mM、例如高于 0. 04mM、例如高于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例如高于0. 06mM、例如高 于0. ImM、例如高于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于0. 3mM、例如高于 0. 5mM、例如高于1. OmM0在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少在一個(gè)純化步驟中在另外的二價(jià)金屬離子螯合 劑存在的情況下純化因子VII多肽。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少在一個(gè)純化步驟中在pH值低于7. 5時(shí)純化因子 VII多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，pH值低于7. 4、例如低于7. 3、例如低于7. 2、例如 低于7. 1、例如低于7. 0、例如低于6. 8、例如低于6. 6、例如低于6. 4、例如低于6. 2、例如低 于6.0、例如5.5。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少在一個(gè)純化步驟中在pH值高于8. 6時(shí)純化因子 VII多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，PH值高于8. 7、例如高于8. 8、例如高于8. 9、例如 高于9. 0、例如高于9. 1、例如高于9. 2、例如高于9. 4、例如高于9. 6、例如高于9. 8、例如高 于10. 0、例如高于10. 2、例如高于10. 4、例如高于10. 8、例如11. 0。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少在一個(gè)純化步驟中在組氨酸存在的情況下純化 因子VII多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，獲得的游離鈣離子濃度高于1. 2mM。在本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施方案中，獲得的游離鈣離子濃度高于1. 3mM、例如高于1. 4mM、例如高于1. 5mM、例如 高于1. 6mM、例如高于1. 7mM、例如高于1. 8mM、例如高于1. 9mM、例如高于2. OmM、例如高于
2.ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如高于2. 4mM、例如高于2. 5mM、例如高于2. 6mM、 例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高于5. OmM、例如高于6. OmM、例如高于7. OmM、例如 高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于10. OmM、例如高于20mM、例如高于40. OmM、例如高于 60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于0. 1M、例如高于1M、例如在溶液飽和狀態(tài)下的游離鈣離 子濃度。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，獲得的游離鈣離子濃度低于0. 10mM。在本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施方案中，獲得的游離鈣離子濃度低于0. 09、例如低于0. 08、例如低于0. 07、例如低于
0.06、例如低于0. 05、例如低于0. 04、例如低于0. 03、例如低于0. 02、例如低于0. 01、例如低 于 0. 00。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，除了鋅離子和鈣離子外所獲得的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的 游離離子濃度高于0. 025mM。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自Mg2+、CU2+、Mn2+、C02+、Fe2+、 Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+和Uo2+。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中所述二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自Mg2+、 Cu2+ 和 Mn2+。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，除了鋅離子和鈣離子外所獲得的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的 游離離子濃度高于0. 025mM、例如高于0. 03mM、例如高于0. 035mM、例如高于0. 04mM、例如高 于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例如高于0. 06mM、例如高于0. ImM、例如高 于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于0. 3mM、例如高于0. 5mM、例如高于
1.OmM。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在另外的二價(jià)金屬離子螯合劑存在的情況下穩(wěn)定因 子VII多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在pH低于7. 5時(shí)穩(wěn)定因子VII多肽。在本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施方案中，pH低于7. 4、例如低于7. 3、例如低于7. 2、例如低于7. 1、例如低于7. 0、例如 低于6. 8、例如低于6. 6、例如低于6. 4、例如低于6. 2、例如低于6. 0、例如5. 5。在本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施方案中，在pH值高于8. 6時(shí)穩(wěn)定因子VII多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，pH 值高于8. 7、例如高于8. 8、例如高于8. 9、例如高于9. 0、例如高于9. 1、例如高于9. 2、例如 高于9. 4、例如高于9. 6、例如高于9. 8、例如高于10. 0、例如高于10. 2、例如高于10. 4、例如 高于10. 8、例如11. 0。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在組氨酸存在的情況下穩(wěn)定因子VII多肽。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“因子IX多肽”是指人野生型因子IX和相對(duì)于野生型因子IX 表現(xiàn)出基本相同或提高的生物學(xué)活性的因子IX變體、因子IX相關(guān)的多肽以及因子IX衍生 物和因子IX綴合體。所述術(shù)語(yǔ)“因子IX”是指包括以其未切割(酶原)形式存在的因子 IX多肽以及已通過(guò)蛋白酶解處理產(chǎn)生其相應(yīng)生物活性形式的多肽，所述生物活性形式的因 子IX多肽表示為因子IXa。相對(duì)于人因子IX，這類因子IX的變體可能表現(xiàn)出不同的性質(zhì)， 包括穩(wěn)定性、磷脂結(jié)合性、改變的特異性活性等。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“因子VII多肽”是指野生型因子VII (例如具有公開于美國(guó)專 利號(hào)4，784，950的氨基酸序列的多肽)和相對(duì)于野生型因子VII表現(xiàn)出基本相同或提高的 生物學(xué)活性的因子VII變體、因子VII相關(guān)的多肽以及因子VII衍生物和因子VII綴合體。 所述術(shù)語(yǔ)“因子VII”是指包括以其未切割(酶原)形式存在的因子VII多肽以及已通過(guò)蛋 白酶解處理產(chǎn)生其相應(yīng)生物活性形式的多肽，所述生物活性形式的因子VII多肽表示為因 子Vila。通常，通過(guò)在殘基152和153之間切割因子VII來(lái)產(chǎn)生因子Vila。相對(duì)于人因子 VII，這類因子VII的變體可能表現(xiàn)出不同的性質(zhì)，包括穩(wěn)定性、磷脂結(jié)合性、改變的特異性 活性等。如此處所使用的“因子VII相關(guān)的多肽”包括多肽(包括變體)，在所述多肽中因子Vila的生物學(xué)活性相對(duì)于野生型因子Vila的活性已發(fā)生顯著改變或減小。這些多肽包 括，但不限于已經(jīng)引入特定氨基酸序列改變的因子VII或因子Vila，這些序列改變的引入 改變或破壞了所述多肽的生物活性。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“因子VII衍生物”是指野生型因子VII、相對(duì)于野生型因子VII 表現(xiàn)出基本相同或提高的生物學(xué)活性的因子VII的變體和因子VII相關(guān)多肽，其中一個(gè)或 更多個(gè)親本肽上的氨基酸已經(jīng)被化學(xué)修飾，例如通過(guò)烷基化、PEG化、?；Ⅴセ蝓０坊?等。這包括但不限于PEG化的人因子Vila、半胱氨酸-PEG化的人因子Vila和其變體。所述術(shù)語(yǔ)“PEG化的人因子Vila”是指具有綴合到人因子Vila多肽上的PEG分子 的人因子Vila。應(yīng)當(dāng)理解PEG分子可附著到因子Vila多肽的任何部分，包括所述因子Vila 多肽的任何氨基酸殘基或糖類部分。所述術(shù)語(yǔ)“半胱氨酸-PEG化的人因子Vila”是指具有 綴合到被引入到人因子Vila中的半胱氨酸的巰基上的PEG的因子Vila。因子Vila在血液凝結(jié)中的生物學(xué)活性來(lái)源于其(i)結(jié)合組織因子(TF)的能力和 (ii)催化因子IX或因子X蛋白酶解斷裂以產(chǎn)生被激活的因子IX或X(分別為因子IXa或 Xa)的能力。為了本發(fā)明目的，例如美國(guó)專利號(hào)5，997，864中所描述的，可通過(guò)使用因子VII 缺陷血漿和組織促凝血酶原激酶測(cè)量制劑提高血液凝結(jié)的能力來(lái)對(duì)因子Vila生物活性進(jìn) 行定量。在該測(cè)定中，生物學(xué)活性表示為相對(duì)于對(duì)照樣品凝結(jié)時(shí)間的減少并且通過(guò)與含有 1單位/ml因子VII活性的混合人血清標(biāo)準(zhǔn)比較被轉(zhuǎn)換成“因子VII單位”。可選擇地，⑴ 可通過(guò)測(cè)量因子Vila在包含嵌入脂膜的TF和因子X的系統(tǒng)中產(chǎn)生因子Xa的能力對(duì)因子 Vila 生物學(xué)活性進(jìn)行定量(Persson 等人，J. Biol. Chem. 272 :19919_19924，1997) ； (ii)可 通過(guò)測(cè)量因子X在水系統(tǒng)中的水解對(duì)因子Vila生物學(xué)活性進(jìn)行定量；(iii)可通過(guò)使用基 于表面等離子共振的儀器測(cè)量其與TF的物理結(jié)合(Persson，F(xiàn)EBS Letts. 413 =359-363, 1997)對(duì)因子Vila生物學(xué)活性進(jìn)行定量和(iv)通過(guò)測(cè)量合成底物的水解對(duì)因子Vila生物 學(xué)活性進(jìn)行定量。具有與野生型因子Vila基本相同或提高的生物學(xué)活性的因子VII變體包括下列 多肽，當(dāng)所述多肽在一個(gè)或更多個(gè)凝結(jié)測(cè)定、蛋白酶解測(cè)定或上述TF結(jié)合測(cè)定中被檢測(cè)時(shí) 表現(xiàn)出至少大約25%、優(yōu)選地至少大約50%、更優(yōu)選地大約75%和更優(yōu)選地至少大約90% 的由相同細(xì)胞類型產(chǎn)生的因子Vila的特異性活性。相對(duì)于野生型因子Vila具有顯著減小 的生物學(xué)活性的因子VII變體是下列多肽，當(dāng)所述多肽在一個(gè)或更多個(gè)凝結(jié)測(cè)定、蛋白酶 解測(cè)定或上述TF結(jié)合測(cè)定中被檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)出低于大約25%、優(yōu)選地低于大約10%、更優(yōu)選 地低于大約5%和最優(yōu)選地低于大約的由相同細(xì)胞類型產(chǎn)生的因子Vila的特異性活 性。相對(duì)于野生型因子VII具有顯著改變的生物學(xué)活性的因子VII變體包括但不限于表現(xiàn) TF非依賴性因子X蛋白酶解活性的因子VII變體和那些結(jié)合TF但不切割因子X的因子VII 變體。無(wú)論是表現(xiàn)與野生型因子VII基本相同或更好的生物活性、或相對(duì)于野生型因子 VII表現(xiàn)出顯著改變或減少的生物學(xué)活性的因子VII變體包括但不限于，具有不同于野生 型因子VII氨基酸序列的多肽，所述序列的不同是通過(guò)一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的插入、缺失 或取代獲得的。具有與野生型因子VII基本相同的生物學(xué)活性的因子VII變體的非限定例子 包括 S52A-FVIIa、S60A_FVIIa(Lino 等人，Arch. Biochem. Biophys. 352 182-192，1998)；
33如公開于美國(guó)專利號(hào)5，580，560的表現(xiàn)出增強(qiáng)的蛋白酶解穩(wěn)定性的FVIIa變體；在殘基290和291之間或在殘基315和316之間被蛋白酶解切割的因子Vila(Mollerup等人， Biotechnol. Bioeng. 48 :501_505，1995)；氧化形式的因子 Vila(Kornfelt 等人，Arch. Biochem. Biophys, 363 :43_54，1999)；公開于 PCT/DK 02/00189 的 FVII 變體；和公開于 WO 02/38162 (Scripps Research Institute)中的表現(xiàn)出增強(qiáng)的蛋白酶解穩(wěn)定性的FVII變體； 公開于WO 99/20767 (University of Minnesota)的具有修飾的Gla結(jié)構(gòu)域和表現(xiàn)出增強(qiáng) 的膜結(jié)合作用的FVII變體；和公開于WO 01/58935 (Maxygen ApS)中的FVII變體。相對(duì)于野生型因子VIIa具有增強(qiáng)生物學(xué)活性的VII變體的非限定例子包括 公開于 WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、PCT/DK 02/00635、丹麥專利申請(qǐng) PA 200201423、丹麥專利申請(qǐng) PA200101627 ;W0 02/38162 (Scripps Research Institute)中 的 FVII 變體；和公開于 JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)中的具有 增強(qiáng)活性的FVIIa變體。相對(duì)于野生型因子VII具有顯著減少或改變的生物學(xué)活性的因子 VII 變體的非限定例子包括 R152E-FVIIa (Wildgoose 等人，Biochem 29 :3413_3420，1990)、 S344A-FVIIa (Kazama 等人，J. Biol. Chem. 270 :66_72，1995)、FFR-FVIIa (Hoist 等人，Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 15 :515_520，1998)和缺少 Gla 結(jié)構(gòu)域的因子 Vila(Nicolaisen 等 人，F(xiàn)EBS Letts. 317 =245-249,1993) 因子VII或因子VII相關(guān)多肽的例子包括但不限于 野生型因子VII，L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII,F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/ M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII,V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII,V158D/E296V/M298Q/ K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/ M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII, L305V/ K337A-FVII,L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII,L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII,L305V/K337A/E296V-FVII,L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII,L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/ K337A-FVII,S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII,S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII,K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII,K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII,
K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII,S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII,S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII,
S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S3 14E/L305V/V158T/E296V/ M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S3 14E/L305V/V158T/E296V/ K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S3 14E/L305V/V158D/E296V/ K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII,K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/ K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII,K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII,K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII,K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K3 16H/L305V/V158T/K337A/ M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K3 16H/L305V/V158D/K337A/ M298Q-FVII,K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/ Κ337Α-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII,K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/ K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII,K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII,K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305VV/V158T/E296V-FVII,K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K3 16Q/L305V/V158T/K337A/ M298Q-FVII,
K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K3 16Q/L305V/V158D/K337A/ M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/ Κ337Α-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII,F374Y/ V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/ S314E-FVII,F374Y/L305V-FVII,F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII,F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII,F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII,F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII,F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII,F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII,F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，
F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII,F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII,F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII,F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII,F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII,F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII,F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII,F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296/K337A/S314E-FVII,F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/ S314E-FVII,F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/ S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/ S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/ S314E-FVII,F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/ S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/ S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII， F374Y/L305V/E296V/M298Q/ V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII,F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII， F374Y/L305V/M298Q/K337A/ V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/ K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,S52A-因子 VII，S60A-因子 VII ；R152E-因子VII，S344A-因子VII，缺少Gla結(jié)構(gòu)域的因子VIIa ；和PllQ/ K33E-FVII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G29IN-FVII， R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ；和在從 223Thr 到 240Asn 的氨基酸序 列中具有取代、添加或缺失的FVII、在從304Arg到329Cys的氨基酸序列中具有取代、添加 或缺失的FVII。所使用的用于氨基酸取代的術(shù)語(yǔ)如下。第一個(gè)字母表示天然存在于人野生型FVII 位置上的氨基酸。緊跟其后的數(shù)字表示在人野生型FVII中的位置。第二個(gè)字母表示取代 (代替)所述天然氨基酸的不同氨基酸。例如M298Q，其中位于人野生型FVII 298位置的 甲硫氨酸被谷氨酰胺取代。另一個(gè)例子，V158T/M298Q，位于人野生型FVII 158位置的纈氨 酸被甲硫氨酸取代并且在同一個(gè)因子VII多肽中位于人野生型FVII 298位置的甲硫氨酸 被谷氨酰胺取代。
在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述因子VII多肽是這樣的多肽，其中所述因子VII多肽活性與人野生型因子VIIa活性之間的比率至少是大約1.25。在一個(gè)實(shí)施方案中 所述因子VII多肽活性與人野生型因子VIIa活性之間的比率至少是大約2.0。在進(jìn)一步的 實(shí)施方案中所述因子VII多肽的活性與人野生型因子VIIa的活性之間的比率至少是大約 4. 0。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述因子VII多肽是這樣的多肽，其中當(dāng)進(jìn)行因 子VIIa活性測(cè)定時(shí)所述因子VII多肽活性與人野生型因子VIIa活性之間的比率至少是大 約1. 25。在一個(gè)實(shí)施方案中當(dāng)進(jìn)行因子VIIa活性測(cè)定時(shí)所述因子VII多肽活性與人野生 型因子VIIa活性之間的比率至少是大約2. 0。在進(jìn)一步實(shí)施方案中當(dāng)進(jìn)行因子VIIa活性 測(cè)定時(shí)所述因子VII多肽活性與人野生型因子VIIa活性之間的比率至少是大約4.0。所述 因子VIIa的活性可通過(guò)描述于“測(cè)定”標(biāo)題下的測(cè)定進(jìn)行測(cè)量。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述因子VII多肽是這樣的多肽，其中當(dāng)進(jìn)行“體 外水解測(cè)定”時(shí)所述因子VII多肽活性與人野生型因子VIIa活性之間的比率至少是大約 1.25。在一個(gè)實(shí)施方案中當(dāng)進(jìn)行“體外水解測(cè)定”時(shí)所述因子VII多肽活性與人野生型因 子VIIa活性之間的比率至少是大約2. 0。在進(jìn)一步實(shí)施方案中當(dāng)進(jìn)行“體外水解測(cè)定”時(shí) 所述因子VII多肽活性與人野生型因子VIIa活性之間的比率至少是大約4. 0。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述因子VII多肽是這樣的多肽，其中當(dāng)進(jìn)行“體 外蛋白酶解測(cè)定”時(shí)所述因子VII多肽活性與人野生型因子VIIa活性之間的比率至少是大 約1.25。在一個(gè)實(shí)施方案中當(dāng)進(jìn)行“體外蛋白酶解測(cè)定”時(shí)所述因子VII多肽活性與人野 生型因子VIIa活性之間的比率至少是大約2.0。在進(jìn)一步實(shí)施方案中當(dāng)進(jìn)行“體外蛋白酶 解測(cè)定”時(shí)所述因子VII多肽活性與人野生型因子VIIa活性之間的比率至少是大約4. 0。 在進(jìn)一步實(shí)施方案中當(dāng)進(jìn)行“體外蛋白酶解測(cè)定”時(shí)所述因子VII多肽活性與人野生型因 子VIIa活性之間的比率至少是大約8. 0。本發(fā)明適合于與野生型相比具有增強(qiáng)活性的因子Vll/VIIa變體?？赏ㄟ^(guò)在如下 描述的合適的測(cè)定方法中進(jìn)行檢測(cè)以發(fā)現(xiàn)具有增強(qiáng)活性的因子Vll/VIIa變體?？蓪⑦@些 測(cè)定當(dāng)作體外檢測(cè)中的簡(jiǎn)單預(yù)測(cè)定進(jìn)行。因而，所述“測(cè)定”章節(jié)公開了用于本發(fā)明因子 VIIa變體活性測(cè)定的簡(jiǎn)單檢測(cè)方法(冠以“體外水解測(cè)定”)?；谏厦嫠觯貏e感興趣 的因子VIIa變體是這樣的變體，其中當(dāng)進(jìn)行所述“體外水解測(cè)定”時(shí)所述變體活性和野生 型因子VII活性之間的比率大于1. 0，例如至少大約為1. 25，優(yōu)選地至少大約為2. 0，例如至 少大約為3. 0或甚至更優(yōu)選地至少大約為4. 0。也可通過(guò)使用合適濃度IOO-IOOOmM的生理學(xué)底物例如因子X( “體外蛋白酶解測(cè) 定”)(參見“測(cè)定”章節(jié))對(duì)所述變體的活性進(jìn)行測(cè)量，其中在加入合適的顯色底物(例如 S-2765)后對(duì)產(chǎn)生的因子Xa進(jìn)行測(cè)量。此外，所述活性測(cè)定可在生理學(xué)溫度下進(jìn)行?？稍跍y(cè)定法中測(cè)量所述因子VIIa變體產(chǎn)生凝血酶的能力，所述測(cè)定法包括以生 理學(xué)濃度存在的相關(guān)凝血因子和抑制劑(當(dāng)摸擬血友病A病癥時(shí)除去因子VIII)以及活化 的血小板(如Monroe等人(1997) Brit. J. Haematol. 99，542-547的第543頁(yè)所描述的，此 處引用作為參考)。此處描述的因子VII多肽可通過(guò)核酸重組技術(shù)產(chǎn)生。一般地，通過(guò)改造克隆的野 生型因子VII核酸序列以編碼想要的蛋白。然后將該改造過(guò)的序列插入表達(dá)載體，然后所述表達(dá)載體可被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。優(yōu)選地以高等真核細(xì)胞特別是培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物 細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。已知編碼人因子VII的完整核酸和氨基酸序列(參見美國(guó)4，784，950， 其中描述了人重組因子VII的克隆和表達(dá))。牛因子VII序列描述于Takeya等人，J. Biol. Chem. 263 14868-14872 (1988)中。 可通過(guò)各種技術(shù)改變所述氨基酸的序列?？赏ㄟ^(guò)定點(diǎn)突變改變所述核酸序列。 用于定點(diǎn)突變的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的并且描述于例如Zoller和Smith(DNA 3 479-488,1984)或"Splicing byextension overlap “，Horton 等人，Gene 77，1989， pp. 61-68。因而，使用所述因子VII的核酸或氨基酸序列可引入所選擇的改變。同樣，使用 特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)制備DNA構(gòu)建體的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是非常 熟悉的(cf. PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA)。編碼本發(fā)明因子VII多肽的核酸構(gòu)建體可以合適地來(lái)源于基因組或cDNA，例如根 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(cf. Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989),通過(guò)制備基因組或 cDNA文庫(kù)并通過(guò)使用合成的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交篩選出編碼完整或部分所述多肽的 DNA序列來(lái)獲得。所述編碼因子VII多肽的核酸構(gòu)建體也可通過(guò)已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備，例如 描述于 Beaucage 和 Caruthers，Tetrahedron Letters22 (1981)，1859-1869 中的磷酰胺方 法、或描述于Matthes等人，EMBO Journal 3 (1984)，801-805中的方法。根據(jù)磷酰胺方法， 合成(例如使用DNA自動(dòng)合成儀)、純化、退火、連接寡核苷酸并且將其克隆入合適的載體 上。此外，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，所述核酸構(gòu)建體可以是通過(guò)連接合成的、基因組或cDNA來(lái) 源的(如果合適)片段制備的合成的和基因組來(lái)源的混合物、合成的和cDNA來(lái)源的混合物 或基因組和cDNA來(lái)源的混合物，所述片段對(duì)應(yīng)于所述整個(gè)核酸構(gòu)建體的各個(gè)部分。所述核酸構(gòu)建體優(yōu)選地是DNA構(gòu)建體。用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的因子VII多肽的 DNA序列通常在因子VII的氨基端編碼前原多肽(pre-pro polypeptide)以獲得正確的翻 譯后加工(例如谷氨酸殘基的Y-羧化)和從宿主細(xì)胞中分泌。所述前原多肽可以是因子 VII或另外的維生素K依賴性血漿蛋白的前原多肽，例如因子IX、因子X、凝血酶原、蛋白C 或蛋白S。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，可以在所述因子VII多肽的氨基酸序列上進(jìn)行另外的 修飾，在所述氨基酸序列上進(jìn)行的上述修飾不會(huì)顯著損害所述蛋白充當(dāng)凝血?jiǎng)┑哪芰?。?如，也可以在激活切割位點(diǎn)上對(duì)所述因子VII多肽進(jìn)行修飾以阻止酶原因子VII轉(zhuǎn)化成其 活性雙鏈形式，如通常描述于美國(guó)5，288，629中。用于表達(dá)因子VIIa變體的表達(dá)載體包括能夠指導(dǎo)克隆的基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的啟 動(dòng)子。優(yōu)選的用于培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子包括病毒啟動(dòng)子和細(xì)胞啟動(dòng)子。病毒啟 動(dòng)子包括 SV40 啟動(dòng)子(Subramani 等人，Mol. Cell. Biol. 1 :854_864，1981)和 CMV 啟動(dòng)子 (Boshart等人，Cell 41 =521-530,1985)。特別優(yōu)選的病毒啟動(dòng)子是來(lái)自腺病毒2的主要 晚期啟動(dòng)子(Kaufman 和 Sharp，Mol. Cell. Biol. 2 1304-1319，1982)。細(xì)胞啟動(dòng)子包括小 鼠的 κ 基因啟動(dòng)子(Bergman 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :7041_7045，1983)和小 鼠VH啟動(dòng)子(Loh等人，Cell 33 :85_93，1983)。特別優(yōu)選的細(xì)胞啟動(dòng)子是小鼠金屬硫蛋 白-1啟動(dòng)子(Palmiter等人，Science 222 =809-814,1983)。表達(dá)載體也可包含一套R(shí)NA拼接位點(diǎn)，所述拼接位點(diǎn)位于所述啟動(dòng)子的下游和用于因子VII自身序列的插入位點(diǎn)的上游。優(yōu)選的RNA拼接位點(diǎn)可以從腺病毒和/或免疫球蛋白基因中獲得。表達(dá)載體也可在所 述插入位點(diǎn)的下游包含多聚腺苷酸化信號(hào)。特別優(yōu)選的多聚腺苷酸化信號(hào)包括來(lái)自SV40 的早期或晚期多聚腺苷酸化信號(hào)(Kaufman和Sharp，同上)、來(lái)自腺病毒5E Ib區(qū)域的多聚 腺苷酸信號(hào)、人生長(zhǎng)激素基因末端(DeNoto等人Nucl. Acids Res. 9 :3719_3730，1981)或來(lái) 自人因子VII基因或牛因子VII基因的多聚腺苷酸化信號(hào)。所述表達(dá)載體也可包含非轉(zhuǎn)錄 的病毒前導(dǎo)序列，例如位于啟動(dòng)子和RNA拼接位點(diǎn)之間的腺病毒2的三重前導(dǎo)序列；和增強(qiáng) 子序列，例如SV40增強(qiáng)子。通過(guò)例如磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Wigler等人，Cell 14 =725-732,1978 ；Corsaro和 Pearson,Somatic Cell Genetics 7 :603_616,1981 ;Graham禾口Van der Eb,Virology 52d 456-467，1973)或電穿孔(Neumann 等人，EMBO J. 1 :841_845，1982)將克隆的 DNA 序列導(dǎo) 入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。為鑒定和選擇表達(dá)所述外源DNA的細(xì)胞，通常將賦予選擇表型 (選擇標(biāo)記)的基因和目的基因或cDNA—起導(dǎo)入細(xì)胞中。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括賦予對(duì)藥 物例如新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤抗性的基因。所述選擇標(biāo)記可以是可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記。 優(yōu)選的可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記是二氫葉酸還原酶(DHFR)序列。Thilly對(duì)選擇標(biāo)記進(jìn)行了綜述 (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA，此處弓I用作為參 考)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很容易地選擇合適的選擇標(biāo)記?？梢詫⑽挥诜珠_質(zhì)粒上的選擇標(biāo)記和目的基因同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞中或可將它們放入 相同質(zhì)粒中導(dǎo)入細(xì)胞。如果在相同的質(zhì)粒上，所述選擇標(biāo)記和目的基因可在不同或相同的 啟動(dòng)子控制之下，后一排列產(chǎn)生雙順?lè)醋有攀?。這種類型的構(gòu)建體在本領(lǐng)域是熟知的(例 如，Levinson和Simonsen,U. S. 4，713，339)。向?qū)爰?xì)胞的混合物中加入額外的DNA(稱作 “載體DNA”)，也是有利的。在所述細(xì)胞已經(jīng)吸收DNA后，將其培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基上，通常 1-2天，開始表達(dá)所述目的基因。用于培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何用于培養(yǎng)所述宿 主細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基，例如基本培養(yǎng)基或含有合適補(bǔ)充物的復(fù)合培養(yǎng)基(complexmedia)。 合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)提供者商業(yè)購(gòu)得或可以根據(jù)公開的配方進(jìn)行配制(例如在美國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的方法制備所述培養(yǎng)基(參見，例如， references forbacteria and yeast ；Bennett, J. W.禾口 LaSure, L. , editors, MoreGene Manipulations in Fungi,Academic Press，CA，1991)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基通常包含碳源、氮源、必 需氨基酸、必需糖、維生素、鹽、磷脂、蛋白質(zhì)和生長(zhǎng)因子。為了生產(chǎn)Y-羧化因子VII多肽， 所述培養(yǎng)基包含維生素K，優(yōu)選地濃度為大約0. lmg/ml到大約5mg/ml。然后進(jìn)行藥物選擇 以篩選出以穩(wěn)定方式表達(dá)所述選擇標(biāo)記的培養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)于已經(jīng)轉(zhuǎn)化了可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記的 細(xì)胞，可以增加藥物濃度以選擇增加的克隆序列拷貝數(shù)因此而增加了表達(dá)水平。然后篩選 表達(dá)想要的因子VII多肽的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞克隆。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括CHO(ATCC CCL 61)、C0S_1 (ATCC CRL1650)、幼小倉(cāng)鼠 腎(BHK)和 293(ATCC CRL 1573 ；Graham 等人，J. Gen. Virol. 36 :59_72，1977)細(xì)胞系。優(yōu) 選的 BHK 細(xì)胞系是 tk-tsl3BHK 細(xì)胞系(Waechter 和 Baserga，Proc. Natl. Acad. Sci. USA79 1106-1110，1982)，在后文中稱作BHK 570細(xì)胞。所述BHK 570細(xì)胞系可從美國(guó)典型培養(yǎng)物 保藏中心，12301 Parklawn Dr. , Rockville,MD 20852 商業(yè)購(gòu)得，ATCC保藏號(hào)為 CRL 10314。 tk-tsl3BHK細(xì)胞系也可按ATCC保藏號(hào)CRL 1632商業(yè)購(gòu)得。此外，可使用許多其它細(xì)胞系，包括 Rat Hep I (大鼠肝癌；ATCC CRL 1600)、RatH印 II (大鼠肝癌；ATCC CRL 1548)、 TCMK (ATCC CCL 139)、Humanlung (ATCC HB 8065) ,NCTC 1469 (ATCC CCL 9. 1)禾口 DUKX 細(xì)胞 (Urlaub 和 Chasin，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216_4220，1980)。也可應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的因子VII多肽。優(yōu)選地在雌性哺乳動(dòng)物宿 主的乳腺中生產(chǎn)所述蛋白。在乳腺中表達(dá)并隨后將目的蛋白分泌到奶中克服了從許多其它 來(lái)源中分離蛋白時(shí)遇到的困難。奶易于收集、可大量獲得并且可很好地鑒定生化特征。此 夕卜，主要的奶蛋白以高濃度存在于奶中(通常從大約1到15g/l)。從商業(yè)的角度看，很清楚優(yōu)選地使用大量產(chǎn)奶的品種作為宿主。盡管可以使用較 小的動(dòng)物例如小鼠和大鼠(并且優(yōu)選地用于原理階段的驗(yàn)證)，但優(yōu)選地使用牲畜哺乳動(dòng) 物，包括但不限于豬、山羊、綿羊和牛。綿羊是特別優(yōu)選的，這是因?yàn)榭紤]到該物種之前的轉(zhuǎn) 基因歷史、奶產(chǎn)量、成本以及易于獲得的用于收集綿羊奶的設(shè)備等因素(參見，例如，對(duì)影 響宿主物種選擇因素進(jìn)行比較的WO 88/00239)。通常想要的是選擇已經(jīng)用于奶產(chǎn)品用途而 飼養(yǎng)的宿主動(dòng)物品種，例如EastFriesland綿羊，或在將來(lái)通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因系引入產(chǎn)奶牲 畜。無(wú)論在什么情況下，所用動(dòng)物都應(yīng)當(dāng)使用熟知的、具有良好健康狀況的動(dòng)物。為了能在乳腺中獲得表達(dá)，使用來(lái)自奶蛋白基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。奶蛋白基因包括 那些編碼酪蛋白(參見美國(guó)5，304，489)、β乳球蛋白、乳清蛋白和乳清酸性蛋白的基因。 所述β乳球蛋白(BLG)啟動(dòng)子是優(yōu)選的。在綿羊β乳球蛋白基因的情況下，通常使用非?？拷龌?’側(cè)翼序列的至少406bp的區(qū)域，盡管高達(dá)大約5kbp的更大部分所述5’ 側(cè)翼序列是優(yōu)選的，例如包含β乳球蛋白基因的非編碼部分和5’側(cè)翼啟動(dòng)子的約4. 25kbp DNA片段(參見Whitelaw等人，Biochem. J. 286 :3139 (1992))。類似的來(lái)自其它物種的啟 動(dòng)子DNA片段也是合適的。只要所述基因的基因組區(qū)域可以表達(dá)，也可以將β乳球蛋白基因的其它區(qū)域整 合到構(gòu)建體中。本領(lǐng)域普便接受例如，缺少內(nèi)含子的構(gòu)建體與那些包含這類DNA序列的 構(gòu)建體相比表達(dá)較弱(參見 Brinster 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 836840 (1988)； Palmiter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 478482 (1991) ；Whitelaw 等人，Transgenic Res. 1 =313(1991) ；WO 89/01343 ；和WO 91/02318，每篇文獻(xiàn)在此引用作為參考)。在這個(gè)方 面，如果可能，使用包括編碼目的蛋白或多肽的基因的全部或部分天然內(nèi)含子的基因組序 列通常是優(yōu)選的，因此進(jìn)一步包含至少部分來(lái)自例如β乳球蛋白基因的內(nèi)含子是優(yōu)選的。 一個(gè)這樣的區(qū)域是來(lái)自綿羊β乳球蛋白基因3’非編碼區(qū)域并且提供內(nèi)含子拼接和RNA多 聚腺苷酸化的DNA片段。當(dāng)替代基因的天然3’非編碼序列后，該綿羊β乳球蛋白片段可 增強(qiáng)和穩(wěn)定所述目的蛋白或多肽的表達(dá)水平。在其它實(shí)施方案中，用來(lái)自奶特異性蛋白基 因相應(yīng)的序列替代存在于所述因子VII變體序列起始ATG周圍的區(qū)域。這種替代提供假定 的組織特異性起始環(huán)境以增強(qiáng)表達(dá)。用那些例如BLG基因的相應(yīng)序列取代因子VII變體的 整個(gè)前原和5’非編碼序列是很方便，盡管可取代更小的區(qū)域。為了在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)因子VII多肽，將編碼因子VII變體有效地連接到額外 的其表達(dá)以產(chǎn)生表達(dá)單位所需的DNA片段上。這種額外的片段包括上述啟動(dòng)子和提供mRNA 轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的序列。所述表達(dá)單位進(jìn)一步包括有效地連接到編碼改造過(guò)的 因子VII的片段上的編碼分泌信號(hào)的序列。所述分泌信號(hào)序列可以是天然的因子VII分 泌信號(hào)序列或可以是其它蛋白例如奶蛋白(參見，例如，vonHeijne，Nucl. Acids Res. 14:46834690(1986)；和Meade等人，U. S. 4，873，316，此處引用作為參考)的分泌信號(hào)序列。 盡管本質(zhì)上可通過(guò)連接任何序列構(gòu)建所述表達(dá)單位，但通過(guò)向包含所述額外DNA 片段的質(zhì)?；蚴删w載體中插入因子VII變體序列可很方便地進(jìn)行用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中 的表達(dá)單位的構(gòu)建。提供含有編碼奶蛋白的DNA片段的載體和用因子VII變體多肽取 代編碼所述奶蛋白的序列尤其方便；因此產(chǎn)生了包括奶蛋白基因表達(dá)調(diào)控序列的融合基 因。在任何情況下，在質(zhì)粒或其它載體中的所述表達(dá)單位的克隆有利于所述因子VII變 體序列的擴(kuò)增。在細(xì)菌(例如大腸桿菌)宿主細(xì)胞中可很容易地進(jìn)行擴(kuò)增，因此所述載 體通常包含在細(xì)菌宿主細(xì)胞中具有功能的復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記。然后將所述表達(dá)單位導(dǎo) 入所選擇的宿主物種的受精卵(包括早期胚胎)中。異源DNA的導(dǎo)入可通過(guò)幾條途徑中 的一條進(jìn)行，包括顯微注射(例如美國(guó)專利號(hào)4，873，191)、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(Jaenisch， Science 240 14681474(1988))或使用胚胎干(ES)細(xì)胞進(jìn)行的定點(diǎn)整合(Bradley等 人的綜述，Bio/TechnologylO =534539 (1992)) 0然后將所述卵植入假孕雌性的輸卵管 或子宮中并且允許發(fā)育至分娩。攜帶有所述導(dǎo)入其生殖細(xì)胞系中的DNA的后代可將所 述DNA以正常的、孟德爾遺傳方式傳遞給其后代，允許轉(zhuǎn)基因畜群的發(fā)展。用于生產(chǎn)轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物的普通方法在本領(lǐng)域是熟知的(參見，例如，Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory,1986 ；Simons 等 A, Bio/Technology 6 179183 (1988) ；Wall 等人，Biol. R印rod. 32 :645651 (1985); Buhler 等人，Bio/Technology 8 :140143 (1990) ;Ebert 等人，Bio/Technology 9 835838(1991) ；Krimpenfort 等人，Bio/Technology 9:844847(1991) ；Wall 等人，J. Cell. Biochem. 49 113120 (1992) ；U. S. 4, 873, 191 ；U. S. 4, 873, 316 ；WO 88/00239, WO 90/05188， WO 92/11757 JPGB 87/00458)。用于將外源DNA序列導(dǎo)入哺乳動(dòng)物和其生殖細(xì)胞的 技術(shù)最初是在小鼠上發(fā)展起來(lái)的(參見，例如，Gordon等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 73807384(1980) ；Gordon 禾口 Ruddle, Science 214 12441246 (1981) ；Palmiter 和 Brinster，Cell 41:343345(1985) ；Brinster 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 44384442(1985)；和Hogan等人(同上))。隨后這些技術(shù)被采納用于更大型的動(dòng)物，包括 家畜品種(參見，例如，WO 88/00239, WO 90/05188，和 WO 92/11757 ；和 Simons 等人，Bio/ Technology 6:179183(1988))。簡(jiǎn)而言之，在目前所使用的用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠或家畜 的最有效的途徑中，根據(jù)已建立的技術(shù)將數(shù)百個(gè)線性目的DNA分子注射到一個(gè)受精卵前核 中。也可將DNA注射到受精卵的細(xì)胞質(zhì)中。也可在轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)行生產(chǎn)。表達(dá)可以是系統(tǒng)性的或局限在特定器官中，例如 塊莖(參見，Hiatt, Nature 344 469479 (1990) ；Edelbaum 等人，J. Interferon Res. 12 449453(1992) ；Si jmons 等人，Bio/Technology 8:217221(1990)；和 EP 0255378)。從細(xì)胞培養(yǎng)基或奶中回收本發(fā)明的因子VII多肽?？赏ㄟ^(guò)各種本領(lǐng)域已知的方法 純化本發(fā)明的因子VII多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層 析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備性等電聚焦(IEF)、分級(jí)溶解(例如，硫酸銨沉 淀)或萃取(參見，例如，Protein Purification^. -C. Janson和 Lars Ryden，editors，VCH Publishers, New York, 1989)。優(yōu)選地，通過(guò)在抗因子VII抗體柱上進(jìn)行親和層析可純化其。 鈣依賴性單克隆抗體的使用描述于Wakabayashi等人，J. Biol. Chem. 261 :11097_11108， (1986)和 Thim 等人，Biochemistry 27:7785-7793，(1988)。通過(guò)常規(guī)的化學(xué)純化方法例如高效液相色譜可獲得進(jìn)一步的純化。其它純化方法包括檸檬酸鋇沉淀法在本領(lǐng)域是 熟知的，并且可用于純化此處描述的新的因子VII多肽(參見，例如，Scopes, R.，Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. ,1982)。為了治療目的，優(yōu)選地本發(fā)明的因子VII多肽要足夠純。因而，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí) 施方案中本發(fā)明的因子VII多肽要純化至至少達(dá)到大約90到95%的均一性，優(yōu)選地達(dá)到至 少大約98%的均一性?？赏ㄟ^(guò)例如凝膠電泳和氨基端氨基酸測(cè)序估計(jì)純度。
將所述因子VII多肽在其激活位點(diǎn)切斷以將其轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式?？筛鶕?jù)本 領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行激活，例如根據(jù)那些公開于Osterud，等人的，Biochemistry 11 2853-2857 (1972) ；Thomas, U.S.PatentNo. 4, 456, 591 ；Hedner 禾口 Kisiel， J.Cl in. Invest.71 1836-1841 (1983)；或 Kisiel 禾口 Fujikawa， Behring Inst.Mitt. 73 29-42(1983)的方法?？蛇x擇地，如 Bjoern 等人(Research Disclosure, 269 September 1986，pp. 564-565)所描述的，可通過(guò)將因子VII通過(guò)離子交換層析柱例如Mono Q(Pharmacia fine Chemicals)等進(jìn)行激活。然后可將所得的被激活的因子VII多肽按如 下所描述的進(jìn)行配制和施用。測(cè)定體外水解測(cè)定對(duì)野生型(天然)因子VIIa和因子VIIa變體(兩者在后文中稱為“因子Vila”) 進(jìn)行平行測(cè)定以直接比較其特異性活性。在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc, Denmark)上進(jìn) 行所述測(cè)定。向存在于50mM Hepes溶液(含有0. IM NaCl、5mM CaCl2和lmg/ml牛血清 白蛋白，PH 7.4)中的因子VIIa(終濃度IOOnM)中加入顯色底物D-Ile-Pro-Arg-對(duì)硝基 苯胺(S-2288，Chromogenix, Sweden)至終濃度為 ImM。在Spec t raMax 340 板讀數(shù)計(jì) (Molecular Devices, USA)上連續(xù)測(cè)量405nm的吸光率。將20分鐘溫育過(guò)程中產(chǎn)生的減 去不含酶空白孔的吸光率后的吸光率用來(lái)計(jì)算變體和野生型因子VIIa活性的比率比率=(因子VIIa變體的A405nm) / (野生型因子VIIa的A405nm)。體外蛋白酶解的測(cè)定對(duì)野生型(天然)因子VIIa和因子VIIa變體(兩者在后文中稱為“因子Vila”) 進(jìn)行平行測(cè)定以直接比較其特異性活性。在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)上進(jìn)行 所述測(cè)定。將存在于100微升50mM Hepes溶液(含有0. IM NaCl、5mM CaCl2和lmg/ml牛 血清白蛋白，PH 7.4)中的因子VIIa(IOnM)和因子X(0. 8 μ M)溫育15分鐘。然后通過(guò)加入 50μΙ^々50πιΜ H 印 es (含有 0. IM NaCl、20mM EDTA和 lmg/ml 牛血清白蛋白，pH 7. 4)停止對(duì) 因子X的切割。通過(guò)加入顯色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-對(duì)硝基苯胺(S-2765，Chromogenix， Swe-den)至終濃度為0. 5mM以測(cè)量所產(chǎn)生的因子Xa的量。在Spec t raMax 340板讀數(shù) 計(jì)(Molecular Devices, USA)上連續(xù)測(cè)量405nm的吸光率。將10分鐘內(nèi)產(chǎn)生的減去不含 FVIIa的空白孔中的吸光率后的吸光率用來(lái)計(jì)算變體和野生型因子VIIa蛋白酶解活性的 比率比率=(因子VIIa變體的A405nm)/(野生型因子VIIa的A405nm)。⑶-FVIIa形成速率的測(cè)定⑶-FVIIa (GLA結(jié)構(gòu)域缺失的FVIIa，39-406片段)形成速率被確定為在給定的一 段時(shí)間內(nèi)GD-FVIIa含量的相對(duì)增加量。將要確定GD-FVIIa形成速率的FVIIa溶液分兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣。一個(gè)起始樣品和一個(gè)在要考察的條件下(PH、濃度、溫度等)溫育后的樣品。在 所述樣品被取樣后立即將其用樣品緩沖液煮沸以在分析期間終止任何進(jìn)一步的降解。通過(guò) 非還原性SDS-PAGE對(duì)所述兩個(gè)樣品進(jìn)行分析并且測(cè)量⑶-FVIIa帶相對(duì)于FVIIa的面積。 然后可將從初始樣品到最終樣品的溫育期間GD-FVIIa含量的增加量除以溫育時(shí)間以給出 ⑶-FVIIa形成速率。對(duì)具有大約lmg/ml濃度的FVIIa的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，將所述樣品 與等量的上樣緩沖液混合并煮沸5分鐘。將所述樣品轉(zhuǎn)移至含有12% NuPAGE Bis-Tris的 MOPS電泳緩沖液中的上樣孔內(nèi)。加載電場(chǎng)直至所述樣品的前沿已遷移至凝膠的底部。將膠 盒打開，取出凝膠并轉(zhuǎn)移至固定液、考馬斯染色溶液中并最后在凝膠干燥前轉(zhuǎn)移至脫色液 中。存在于緩沖液(由125μΜ CaCl2, 75mM NaCl，IOmM甘氨酰甘氨酸，pH8.6組成)中 的1. 3mg/ml FVIIa溶液具有10%的初始⑶-FVIIa含量，溫育24小時(shí)后，⑶-FVIIa含量已 增至70%。因此形成速率確定為60%⑶-FVIIa/24小時(shí)。在24小時(shí)期間，含有2. 5mM濃度 CaCl2的類似樣品展現(xiàn)出⑶-FVIIa的含量從6. 8%增加至8. 2%，產(chǎn)生1. 6%⑶-FVIIa/24 小時(shí)的⑶-FVIIa形成速率。此處描述和要求權(quán)利保護(hù)的發(fā)明并受限于此處公開的特定實(shí)施方案的范圍，因?yàn)?這些實(shí)施方案是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的幾個(gè)方面的例子。任何等同的實(shí)施方案屬于該發(fā)明的范 圍。事實(shí)上，從前面的描述可看出除了此處顯示和描述的，本發(fā)明的各種改變對(duì)于本領(lǐng)域技 術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。這類改變也落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在遇到?jīng)_突的情況下， 以包含定義的本公開內(nèi)容為準(zhǔn)。通過(guò)下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制本發(fā)明的 范圍。附圖簡(jiǎn)述

圖1.缺失GLA結(jié)構(gòu)域(⑶-FVIIa)的FVIIa的形成。該圖顯示FVIIa對(duì)Ca2+的摩 爾比與GD-FVIIa形成的速率(鈣的當(dāng)量=FVIIa Ca2+)。條件是1.3mg/ml FVIIa,75mM NaCl，IOmM甘氨酰甘氨酸，pH 8. 5。
實(shí)施例在下列的實(shí)施例中應(yīng)當(dāng)理解，所述方法可用于根據(jù)本發(fā)明的任何FVII多肽。還應(yīng) 該理解在實(shí)施例2到實(shí)施例9中進(jìn)行的步驟可以任意順序組合使用以獲得一定純度的FVII 多肽。實(shí)施例1通過(guò)將Cu2+調(diào)節(jié)到200 μ M以穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)收獲物將500ml具有濃度為20mg/l的FVIIa類似物的BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)上清液通過(guò)死端 式0. 45微米過(guò)濾器過(guò)濾。通過(guò)加入硝酸銅(II)溶液至Cu2+濃度為200 μ M以進(jìn)一步穩(wěn)定 所述含有濃度為2mM的游離Ca2+的收獲物。在進(jìn)一步加工前將所述經(jīng)穩(wěn)定的培養(yǎng)上清液貯 存在5°C下。實(shí)施例2在Cu2+存在的情況下通過(guò)HIC純化FVII多肽并在低pH條件下進(jìn)行洗脫。在填充有Toyopearl MD-G Butyl樹脂的柱子(內(nèi)徑IcmX長(zhǎng)度7cm = 5. 5ml)上進(jìn)行疏水相互作用層析(HIC)。所述柱子用IOCV的35mMCaCl2、0. ImM Cu (NO3)2^H2OU. 5M NaClUOmM tris(pH 7.5)進(jìn)行平衡。平衡后，將42ml含有0. lmg/ml FVIIa的溶液加入柱 中。加載后，用IOCV的平衡緩沖液洗滌柱子。用20mM EDTA、50mM組氨酸、pH 6. 0洗脫所 述結(jié)合的FVII (a)。 實(shí)施例3在Cu2+存在的情況下進(jìn)行大小排阻層析將3ml存在于pH 6. 0的組氨酸緩沖溶液中的極度活躍的FVIIa類似物樣品(lmg/ ml)進(jìn)行大小排阻層析。在將所述樣品應(yīng)用到用緩沖液(由50mM NaCl,0. ImM硝酸銅(II)、 IOmM 組氨酸組成,pH 為 6. 0)平衡的 Toyopearl HW-55F(內(nèi)徑 IcmX 長(zhǎng)度 100cm = 79ml CV) 之前將所述樣品通過(guò)1微米死端式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。上樣緩沖液與平衡緩沖液相同。所有 純化環(huán)節(jié)皆在5°C下以12cm/小時(shí)的流速進(jìn)行。實(shí)施例4通過(guò)將pH調(diào)至6以穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)收獲物通過(guò)加入組氨酸至濃度為20mM接著調(diào)節(jié)pH至6. 0以穩(wěn)定500ml具有濃度為20mg/ 1的FVIIa類似物的CHO Kl細(xì)胞培養(yǎng)上清液。將所述經(jīng)穩(wěn)定的培養(yǎng)上清液通過(guò)死端式0. 45 微米過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾并在進(jìn)一步加工前貯存于5°C下。實(shí)施例5在pH6的條件下進(jìn)行陰離子交換層析在填充有 Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow 的柱子(內(nèi)徑 IcmX 長(zhǎng)度 IOcm = 7.85柱體積(CV))上進(jìn)行陰離子交換層析，所述柱子用5CV含有5mM EDTA、IOmM組氨酸、 PH6.0的溶液進(jìn)行平衡。用40CV的含有l(wèi)mg/ml FVIIa類似物的過(guò)濾溶液上樣，接著用5CV 的50mM NaClUOmM組氨酸(pH6. 0)進(jìn)行洗滌。用40CV pH6. 0、IOmM組氨酸緩沖液配制的 從50mM NaCl到750mM NaCl的NaCl梯度溶液進(jìn)行洗脫。在5°C下以20CV/小時(shí)的流速進(jìn) 行整個(gè)純化過(guò)程。實(shí)施例6在pH9進(jìn)行陰離子交換層析在填充有 Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow 的柱子(內(nèi)徑 IcmX 長(zhǎng)度 IOcm = 7.85柱體積(CV))上進(jìn)行陰離子交換層析，所述柱子用5CV含有5mM EDTA、IOmM組氨酸、 PH9.0的溶液進(jìn)行平衡。加載40CV含有l(wèi)mg/ml FVIIa類似物的過(guò)濾溶液，接著用5CV 50mM NaCl、10mM組氨酸、pH 9. 0的溶液進(jìn)行洗滌。用40CV pH 9. 0、IOmM組氨酸緩沖液配制的從 50mM NaCl到750mM NaCl的NaCl梯度溶液進(jìn)行洗脫。在5°C下以20CV/小時(shí)的流速進(jìn)行 整個(gè)純化。實(shí)施例7在pH6下進(jìn)行大小排阻層析將1.5ml存在于pH6.0的組氨酸緩沖溶液中的極度活躍的FVIIa類似物樣品 (lmg/ml)進(jìn)行大小排阻層析。在將所述樣品應(yīng)用到用緩沖液(由50mM NaClUOmM CaCl2, IOmM組氨酸組成，pH6. 0)平衡的 Pharmacia superdex 200 柱(內(nèi)徑 IcmX 長(zhǎng)度 60cm = 47ml CV)上之前，將所述樣品通過(guò)0.45微米死端式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。上樣緩沖液與平衡緩沖液 相同。在5°C下以0. 3CV/小時(shí)的流速進(jìn)行所有純化環(huán)節(jié)。
實(shí)施例8在pH9下進(jìn)行大小排阻層析將1.5ml存在于pH9. 0的組氨酸緩沖溶液中的極度活躍的FVIIa類似物樣品(lmg/ml)進(jìn)行大小排阻層析。在將所述樣品應(yīng)用到用緩沖液(由50mM NaClUOmM CaCl2, IOmM組氨酸組成，pH9. 0)平衡的 Pharmacia superdex 200 柱(內(nèi)徑 IcmX 長(zhǎng)度 60cm = 47ml CV)之前，將所述樣品通過(guò)0.45微米死端式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。上樣緩沖液與平衡緩沖液相 同。在5°C下以0. 3CV/小時(shí)的流速進(jìn)行所有純化環(huán)節(jié)。實(shí)施例9在pH6下進(jìn)行超濾使用 50cm2 30kDa Biomax 過(guò)濾盒在 Millipore lab scaleTangential Flow Filtration(TFF)系統(tǒng)上對(duì)含有過(guò)度活躍的FVIIa類似物的HEK293培養(yǎng)上清液進(jìn)行超濾。 加入組氨酸至濃度為20mM并將pH調(diào)節(jié)至6. 0以穩(wěn)定通過(guò)死端式過(guò)濾的收獲物。將500克 死端過(guò)濾和經(jīng)穩(wěn)定的收獲物在2巴的跨膜壓(TMP)下進(jìn)行超濾直至獲得質(zhì)量接近0. 25克 的終保留物，相當(dāng)于將極度活躍的FVIIa類似物濃縮20倍。在環(huán)境溫度(20°C)下進(jìn)行整 個(gè)過(guò)程。實(shí)施例10在pH6下進(jìn)行免疫親和純化在1500ml HEK293培養(yǎng)上清液中加入鈣至Ca2+濃度為IOmM和加入組氨酸緩沖液 至濃度為10mM、用HCl將pH調(diào)至6. 0并且將其通過(guò)0. 45微米死端式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾以穩(wěn) 定HEK293培養(yǎng)上清液。將所述經(jīng)穩(wěn)定的培養(yǎng)上清液加載到用固定在Pharmacia Sepharose 4B上的Ca2+依賴性抗FVIIa單克隆抗體填充的柱子(內(nèi)徑1. 6cmX長(zhǎng)度IOcm = 20ml CV) 上。加載前，用5CV的IOmM CaCl2UOmM組氨酸、pH 6. 0的溶液平衡所述柱子。加載后，用 IOCV 的 2M NaClUOmM CaCl2、IOmM 組氨酸、pH6. 0 的溶液洗滌柱子。用 10CV，s 30mM EDTA, 50mM組氨酸、pH6. 0的溶液洗脫結(jié)合的FVII (a)。在5°C下以12CV/小時(shí)的流速進(jìn)行整個(gè)純 化過(guò)程。實(shí)施例11 在pH9下進(jìn)行免疫親和純化在1500ml HEK293培養(yǎng)上清液中加入鈣至Ca2+濃度為IOmM和加入組氨酸緩沖液 至濃度為10mM、用HCl將pH調(diào)至9. 0并且將其通過(guò)0. 45微米死端式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾以穩(wěn) 定HEK293培養(yǎng)上清液。將所述經(jīng)穩(wěn)定的培養(yǎng)上清液加載到用固定在Pharmacia Sepharose 4B上的Ca2+依賴性抗FVIIa單克隆抗體填充的柱子(內(nèi)徑1. 6cmX長(zhǎng)度IOcm = 20ml CV) 上。加載前，用5CV的IOmM CaCl2UOmM組氨酸、pH9. 0的溶液平衡柱子。加載后，用IOCV 的 2M NaClUOmM CaCl2、IOmM 組氨酸、pH9. 0 的溶液洗滌柱子。用 IOCV 的 30mM EDTA、50mM 組氨酸、pH9. 0的溶液洗脫結(jié)合的FVII (a)。在5°C下以12CV/小時(shí)的流速進(jìn)行整個(gè)純化過(guò) 程。實(shí)施例12通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2+濃度至IOmM以穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)收獲物通過(guò)向450ml含有濃度為50mg/ml的FVIIa類似物和濃度大約為2mM的鈣離子的 HEK293細(xì)胞培養(yǎng)上清液中加入CaCl2溶液至Ca2+終濃度為IOmM以穩(wěn)定HEK293細(xì)胞培養(yǎng)上清液。將所述溶液通過(guò)0. 45微米死端式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾并在進(jìn)一步處理前貯存于5°C下。實(shí)施例I3在20mMCa2+存在的情況下進(jìn)行超濾和滲濾使用 50cm2 30kDa Biomax 過(guò)濾盒在 Millipore lab scaleTangential Flow Filtration(TFF)系統(tǒng)上對(duì)含有過(guò)度活躍的FVIIa類似物進(jìn)行超濾。通過(guò)加入鈣溶液至Ca2+ 濃度為20mM、加入組氨酸至濃度為IOmM并將pH調(diào)至6. O以穩(wěn)定FVIIa類似物洗脫液。將 400克經(jīng)穩(wěn)定的FVIIa類似物在2巴的跨膜壓(TMP)下進(jìn)行超濾直至獲得質(zhì)量大約為0. 25 克的終保留物，相當(dāng)于濃縮16倍。超濾后接著用3倍體積的20mM CaCl2、IOmM組氨酸、pH6. O 的緩沖液進(jìn)行顛倒?jié)B濾(turnoverdiafiltration)。在環(huán)境溫度(20°C )下進(jìn)行整個(gè)過(guò)程。實(shí)施例14在20mMCa2+存在的情況下進(jìn)行免疫親和純化將1000ml BHK-21培養(yǎng)上清液通過(guò)0. 45微米死端式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，所述BHK-21 培養(yǎng)上清液已通過(guò)加入鈣至Ca2+離子濃度為IOmM和加入tris緩沖液至濃度為IOmM以及 接著用HCl將pH調(diào)節(jié)至8得以穩(wěn)定。將經(jīng)穩(wěn)定的培養(yǎng)上清液加載到用固定在Pharmacia Sepharose4B上的Ca2+-依賴性抗FVIIa單克隆抗體填充的柱子(內(nèi)徑1. 6cmX長(zhǎng)度IOcm =20ml CV)上。在加載前，用5C的IOmM CaCl2UOmM tris、pH8的溶液平衡所述柱子。力口 載后，用 IOCV 的 2M NaClUOmM CaCl2UOmM tris、pH8 的溶液洗滌柱子。用 IOCV 的 30mM EDTA、50mM tris、pH8的溶液洗脫結(jié)合的FVII (a)。在5°C下以12CV/小時(shí)的流速進(jìn)行整個(gè) 純化過(guò)程。通過(guò)加入氯化鈣至終濃度為50mM立即對(duì)所述洗脫液進(jìn)行穩(wěn)定。實(shí)施例I5通過(guò)在20mMCa2+存在的情況下進(jìn)行加樣和洗滌接著于pH6下洗脫來(lái)進(jìn)行免疫親和純化。通過(guò)在800ml CHO Kl培養(yǎng)上清液中加入鈣至Ca2+濃度為IOmM來(lái)穩(wěn)定CHO Kl培養(yǎng) 上清液。接著，加入tris緩沖液至濃度為10mM，用HCl將pH調(diào)至7. 5并且通過(guò)0. 45微米 死端式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。將經(jīng)穩(wěn)定的培養(yǎng)上清液加載到用固定在Pharmacia Sepharose 4B 上的Ca2+-依賴性抗FVIIa單克隆抗體填充的柱子(內(nèi)徑1. 6cmX長(zhǎng)度2cm = 4ml CV)上。 在加載前，用5CV的IOmM CaCl2UOmM tris、pH7. 5的溶液平衡所述柱子。加載后，用IOCV 的2M NaClUOmM CaCl2UOmM tris、ρΗ7· 5的溶液洗滌柱子，接著用IOCV的含有2Μ NaCl、 IOmM CaCl2UOmM組氨酸、pH6. 0的溶液進(jìn)行第二次洗滌。用IOCV的30mM EDTA、50mM組氨 酸、PH6.0的溶液洗脫結(jié)合的FVII (a)。在5°C下以12CV/小時(shí)的流速進(jìn)行整個(gè)純化過(guò)程。實(shí)施例I6在Ca2+存在的情況下進(jìn)行大小排阻層析將5ml存在于pH6. 0的組氨酸緩沖溶液中的極度活躍的FVIIa類似物樣品(lmg/ ml)進(jìn)行大小排阻層析。在將所述樣品應(yīng)用到用緩沖液(由50mM NaCl、35mM CaCl2UOmM 組氨酸組成，PH 6. 0)平衡的 Pharmacia superdex 200 柱(內(nèi)徑 IcmX 長(zhǎng)度 80cm = 63ml CV)之前，將所述樣品通過(guò)1微米死端式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。上樣緩沖液與平衡緩沖液相同。 在5°C下以15cm/小時(shí)的流速進(jìn)行整個(gè)純化過(guò)程。實(shí)施例Π在pH6和高Ca2+濃度的條件下進(jìn)行超濾和滲濾
ji M 50cm2 30kDa Biomax ii ^ ^ Millipore lab scaleTangential Flow Filtration(TFF)系統(tǒng)上對(duì)含有過(guò)度活躍的FVIIa的HEK293培養(yǎng)上清液進(jìn)行超濾。通過(guò) 加入組氨酸至濃度為20mM并將pH調(diào)至6. O以穩(wěn)定所述通過(guò)死端式過(guò)濾的收獲物。向500 克死端式過(guò)濾的和經(jīng)穩(wěn)定的收獲物中加入鈣至鈣濃度為35mM，并在2巴的跨膜壓(TMP)下 進(jìn)行超濾直至獲得質(zhì)量大約為0. 25克的終保留物，相當(dāng)于將極度活躍的FVIIa類似物濃縮 20倍。超濾后接著用3倍體積的緩沖液(35mM CaCl2、IOmM組氨酸、pH6. 0)進(jìn)行顛倒?jié)B濾 (turnoverdiafiltration)。在兩個(gè)操作中使用相同的TMP。在環(huán)境溫度(20°C )下進(jìn)行整 個(gè)過(guò)程。 實(shí)施例18通過(guò)將pH調(diào)至6和添加Cu2+以穩(wěn)定收獲物將500ml含有濃度為50mg/l的FVIIa類似物的CH0-K1細(xì)胞培養(yǎng)上清液通過(guò)0. 45 微米死端式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。向所述含有2mM Ca2+的收獲物中加入組氨酸至濃度為10mM， 接著用HCl將pH調(diào)至6. 0。通過(guò)加入硝酸銅(II)溶液至Cu2+濃度為200 μ M以進(jìn)一步穩(wěn) 定所述收獲物。在進(jìn)一步處理前將所述經(jīng)穩(wěn)定的培養(yǎng)上清液貯存在5°C下。實(shí)施例19通過(guò)將pH調(diào)節(jié)至6和添加Ca2+以穩(wěn)定收獲物向IOOOml含有濃度為50mg/ml的FVIIa類似物和濃度大約為2mM的鈣離子的 HEK293細(xì)胞培養(yǎng)上清液中加入CaCl2溶液至Ca2+終濃度為IOmM以穩(wěn)定HEK293細(xì)胞培養(yǎng)上 清液。加入組氨酸至濃度為10mM，接著用HCl將pH調(diào)節(jié)至6.0。將所述溶液通過(guò)0. 45微 米死端式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾并且在進(jìn)一步處理前貯存于5°C下。實(shí)施例2O通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cu2+對(duì)FVII多肽穩(wěn)定性的影響，在所述實(shí)驗(yàn)中在各種濃度Cu2+存在 的情況下純化的FVII多肽被吸附在Q-S印harose FF基質(zhì)上。在1. 5ml試管中用800 μ 1 溶有 50 μ 1 Q-Sepharose FF 的緩沖液(IOmM Tris、50mM NaCl、2mM CaCl2 和各種濃度的硝 酸銅(II))溫育500 μ g FVII多肽。在1小時(shí)和2小時(shí)后通過(guò)離心將所述基質(zhì)沉淀并移走 上清液。加入800 μ 1 IOmM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl2、pH8. 0的緩沖液并且在混合和離 心后收回上清液樣品并通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。實(shí)施例2I通過(guò)下列4個(gè)層析步驟對(duì)FVII多肽進(jìn)行純化和激活步驟1:通過(guò)稀釋將含有FVII多肽的細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整到離子強(qiáng)度低于lOmS/cm并應(yīng)用到 用緩沖液A (1 OmM三羥基甲胺甲烷(Tri s)、150mMNaCl、pH8)預(yù)平衡的Q-S印harose柱子上。在用175mM溶解于相同緩沖液中的NaCl溶液洗滌后，用緩沖液B(10mM Tris, 150mM NaCl、25mM CaCl2 pH 8)洗脫 FVII 多肽。步驟2 將含有104mg/l FVII多肽的洗脫溶液調(diào)整至終組合物(IOmMTrisUM NaCl、25mM (Μη2、70μΜ硝酸銅(ΙΙ)ρΗ7. 5)并且應(yīng)用到固定有抗FVII單克隆抗體的S印harose柱子 上。所述抗體柱子用緩沖液C(10mM TrisUOOmM NaCl、20mM CaCl2、70 μ M 硝酸銅(ΙΙ)，ρΗ7· 5)預(yù)平衡。然后用 IOmM Tris、2M NaCl、20mMCaCl2、70 μ M硝酸銅(ΙΙ)ρΗ 7. 5 的 溶液洗滌柱子，接著用緩沖液C洗滌。之后用緩沖液(75mM撲化、30福檸檬酸三鈉、7(^1 硝酸銅(II)，PH7. 5)洗脫FVII多肽。步驟3 所述洗脫物立即應(yīng)用于用緩沖液(IOmM Tris ； 150mM NaCl ；70 μ M硝酸銅(ΙΙ)ρΗ 8. 6)預(yù)平衡的Q-S印harose柱子上。用相同緩沖液洗滌所述柱子并且用緩沖液A到緩沖液D (IOmMTris ；500mM NaCl ； 70 μ M硝酸銅(II)PH 8.6)的線性梯度洗脫FVII多肽。步驟4 通過(guò)稀釋將含有FVII多肽的級(jí)分調(diào)整至離子強(qiáng)度低于lOmS/cm并立即應(yīng)用 于用緩沖液(IOmM甘氨酰甘氨酸；150mM NaClJOyM硝酸銅(II)pH 8.6)預(yù)平衡的 Q-Sepharose 柱子上。在用緩沖液(IOmM甘氨酰甘氨酸；175mM NaCl ；70 μ M硝酸銅(II)ρΗ 8. 6)和緩沖 液E(IOmM甘氨酰甘氨酸；IOOmM NaCl ；70 μ M硝酸銅(II)，ρΗ 8.6)洗滌后，用緩沖液E到 緩沖液(IOmM甘氨酰甘氨酸；IOOmM NaCl ； 15mM CaCl2 ；70 μ M硝酸銅(II),ρΗ 8. 6)的線性 梯度洗脫FVII多肽。流速為1體積/小時(shí)。實(shí)施例22通過(guò)下列4個(gè)層析步驟對(duì)FVII多肽進(jìn)行純化和激活步驟1 通過(guò)稀釋將含有FVII多肽的細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整到離子強(qiáng)度低于lOmS/cm并應(yīng)用到 用緩沖液A (IOmM三羥基甲胺甲烷(Tris)、150mMNaCl、pH8)預(yù)平衡的Q-S印harose柱子上。在用175mM溶解于相同緩沖液中的NaCl溶液洗滌后，用緩沖液B(10mM Tris ； 150mM NaCl ；25mM CaCl2 pH8)洗脫 FVII 多肽。步驟2 將含有104mg/l FVII多肽的洗脫溶液調(diào)整至終組合物(IOmMTrisUM NaCl、25mM (Μη2、70μΜ硝酸銅(II)ρΗ 7. 5)并且應(yīng)用于固定有抗FVII單克隆抗體的S印harose柱子 上。所述抗體柱子用緩沖液C(IOmMTrisUOOmM NaCl、20mM CaCl2、70 μ M硝酸銅(II) ρΗ 7. 5)預(yù)平衡。然后用 IOmM Tris ；2Μ NaCl ；20mMCaCl2 ；70 μ M硝酸銅(ΙΙ)ρΗ7· 5 的溶液 洗滌柱子，接著用緩沖液C洗滌。之后用緩沖液(75mM 1^8、30福檸檬酸三鈉、7(^1硝酸 銅(II)pH7. 5)洗脫FVII多肽。步驟3:將所述洗脫物立即應(yīng)用于用緩沖液(IOmM Tris ； 150mM NaCl ；70 μ M硝酸銅(II) ρΗ 8. 6)預(yù)平衡的Q-S印harose柱子上。用相同緩沖液洗滌柱子并且用緩沖液A到緩沖液D(10mM Tris ；500mM NaCl ； 70 μ M硝酸銅(II)PH 8.6)的線性梯度洗脫FVII多肽。步驟4 通過(guò)稀釋將含有FVII多肽的級(jí)分調(diào)整至濃度為2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)并且 離子強(qiáng)度低于lOmS/cm，并立即應(yīng)用于用緩沖液(IOmM甘氨酰甘氨酸；150mM NaCl ρΗ 8.6)預(yù)平衡的Q-S印harose柱子上。在用緩沖液(IOmM甘氨酰甘氨酸；175mM NaCl ；pH 8. 6)和緩沖液E (IOmM甘氨酰 甘氨酸；IOOmM NaCl pH 8. 6)洗滌后，用緩沖液E到緩沖液(IOmM甘氨酰甘氨酸；IOOmM NaCl ； 15mM CaCl2 pH 8. 6)的線性梯度洗脫FVII多肽。流速為1體積/小時(shí)。 實(shí)施例23通過(guò)下列4個(gè)層析步驟對(duì)FVII多肽進(jìn)行純化和激活步驟1 通過(guò)稀釋將含有FVII多肽的細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整至離子強(qiáng)度低于lOmS/cm并應(yīng)用到 用緩沖液A (IOmM三羥基甲胺甲烷(Tris)、150mMNaCl、pH8)預(yù)平衡的Q-S印harose柱子上。在用175mM溶解于相同緩沖液中的NaCl溶液洗滌后，用緩沖液B(10mM Tris ； 150mM NaCl ；25mM CaCl2 pH 8)洗脫 FVII 多肽。步驟2 將含有104mg/l FVII多肽的洗脫溶液調(diào)整至終組合物(IOmMTris ；IM NaCl ；25mM CaCl2 ；70 μ M硝酸銅(ΙΙ)ρΗ7. 5)并且應(yīng)用于固定有抗FVII單克隆抗體的S印harose柱子 上。所述抗體柱子用緩沖液C(IOmM Tris ； IOOmM NaCl ；20mM CaCl2 ；70 μ M硝酸銅(II) ρΗ7· 5)預(yù)平衡。然后用 IOmM Tris ；2Μ NaCl ；20mMCaCl2 ；70 μ M 硝酸銅(ΙΙ)ρΗ7· 5 的溶液 洗滌柱子，接著用緩沖液C洗滌。之后用緩沖液(75mM Tris ；30mM檸檬酸三鈉；70 μ M硝酸 銅(ΙΙ)ρΗ7. 5)洗脫FVII多肽。步驟3 將所述洗脫物調(diào)整至濃度為2mM的EDTA并立即應(yīng)用于用緩沖液(IOmM Tris ； 150mM NaCl pH 8.6)預(yù)平衡的 Q-S印harose 柱子上。用相同緩沖液洗滌所述柱子并且用緩沖液A到緩沖液D (IOmMTris ；500mM NaCl PH 8.6)的線性梯度洗脫FVII多肽。步驟4 通過(guò)稀釋將含有FVII多肽的級(jí)分調(diào)整至離子強(qiáng)度低于lOmS/cm，并立即應(yīng)用于用 緩沖液(IOmM甘氨酰甘氨酸；150mM NaCl pH 8.6)預(yù)平衡的Q-S印harose柱子上。在用緩沖液(IOmM甘氨酰甘氨酸；175mM NaCl pH 8. 6)和緩沖液E (IOmM甘氨酰甘 氨酸；IOOmM NaCl pH 8. 6)洗滌后，用緩沖液E到緩沖液(IOmM甘氨酰甘氨酸；IOOmM NaCl ； 15mM CaCl2 pH 8. 6)的線性梯度洗脫FVII多肽。流速為1體積/小時(shí)。實(shí)施例24因子VII多肽的超濾和滲濾收獲130升含有因子VII多肽的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液。通過(guò)加入組氨酸至10mM、將pH調(diào)至6. 0以穩(wěn)定所述收獲物并加入ImM CaCl2。將 所述上清液通過(guò)包括3. 0 μ m、1. 0和0. 3 μ mMillipore cIarigard過(guò)濾器的一排過(guò)濾器 (filter train)中進(jìn)行過(guò)濾。將所述經(jīng)過(guò)濾的上清液通過(guò)0. 2m2的Millipore Biomax 50 膜進(jìn)行超濾直至體積減小10倍。使用32psi的TMP調(diào)定點(diǎn)和600ml/分鐘的交叉流調(diào)定點(diǎn) 進(jìn)行超濾。達(dá)到想要的保留體積后，進(jìn)行3倍體積的顛倒?jié)B濾。所述滲濾緩沖液由5mM組 氨酸，20mM NaCl, ImM CaCl2,0. 07g/l Tween 80, pH 6· 0 組成。
Wt-FVIIa的超濾和滲濾收獲100升含有人野生型VIIa的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液并且通過(guò)加入組氨酸至濃 度為10mM、將pH調(diào)節(jié)至6. O和加入ImM CaCl2予以穩(wěn)定。將所述上清液過(guò)濾并通過(guò)0. 2m2 的Millipore Biomax 50膜進(jìn)行超濾直至體積減小10倍。當(dāng)達(dá)到想要的保留體積后，進(jìn)行 3倍體積的顛倒?jié)B濾。所述滲濾緩沖液由5mM組氨酸，20mM NaCl, ImM CaCl2,0. 07g/l Tween 80，pH 6. O 組成 。
權(quán)利要求
用于生產(chǎn)經(jīng)純化的含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括(i)在適合于表達(dá)所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的宿主細(xì)胞；(ii)回收包含所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的所有或部分培養(yǎng)基；并且(iii)從培養(yǎng)基中純化所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶；其中在步驟(iii)中pH具有在4.5和6.9之間的值或具有在8.6和10之間的值。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(iii)中游離鈣離子濃度高于1.2mM。
3.權(quán)利要求2的方法，其中在步驟(iii)中所述游離鈣離子濃度高于1.3mM，例如高于 1. 4mM、例如高于1. 5mM、例如高于1. 6mM、例如高于1. 7mM、例如高于1. 8mM、例如高于1. 9mM、 例如高于2. OmM、例如高于2. ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如高于2. 4mM、例如 高于2. 5mM、例如高于2. 6mM、例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高于5. OmM、例如高于 6. OmM、例如高于7. OmM、例如高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于10. OmM、例如高于20mM、 例如高于40. OmM、例如高于60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于0. 1M、例如高于1M、例如溶 液飽和狀態(tài)下的游離鈣離子濃度。
4.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(iii)中游離鈣離子濃度低于0.10mM。
5.權(quán)利要求4的方法，其中在步驟(iii)中所述游離鈣離子濃度低于0.09，例如低于 0. 08、例如低于0. 07、例如低于0. 06、例如低于0. 05、例如低于0. 04、例如低于0. 03、例如低 于0. 02、例如低于0. 01、例如低于0. 00。
6.權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(iii)中除了鋅離子和鈣離子外的二 價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM.。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、 Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+ 和 Uo2+。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自Mg2+、Cu2+和Mn2+。
9.權(quán)利要求6到8中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(iii)中除了鋅離子和鈣離子外的二 價(jià)金屬陽(yáng)離子的所述游離離子濃度高于0. 025mM，例如高于0. 03mM、例如高于0. 035mM、例 如高于0. 04mM、例如高于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例如高于0. 06mM、 例如高于0. ImM、例如高于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于0. 3mM、例如 高于0. 5mM、例如高于1. OmM。
10.權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)的方法，其中在另外的二價(jià)金屬離子螯合劑存在的情況下 于步驟(iii)中純化所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
11.權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的方法，其中pH在4.5和6. 9之間于步驟(iii)中純化 所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
12.權(quán)利要求11的方法，其中pH在4.7到6. 8之間、例如在4. 9和6. 7之間、例如在 5. 1和6. 6之間、例如在5. 3和6. 5之間、例如在5. 5和6. 4之間、例如在5. 7和6. 3之間、 例如在5. 8和6. 2之間、例如在5. 9和6. 1之間、例如6. 0左右。
13.權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的方法，其中pH在8.6和10之間于步驟(iii)中純化 所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
14.權(quán)利要求13的方法，其中pH在8.7到9. 9之間、例如在8. 8和9. 8之間、例如在 8. 9和9. 7之間、例如在9. 0和9. 6之間、例如在9. 1和9. 5之間、例如在8. 7和9. 8之間、例如在8. 7和9. 7之間、例如在8. 7和9. 6之間、例如在8. 8和9. 5之間、例如在8. 9和9. 4 之間、例如在9. O和9. 2之間、例如9. 2左右。
15.權(quán)利要求11到14中任一項(xiàng)的方法，其中在組氨酸存在的情況下純化所述含有GLA 殘基的絲氨酸蛋白酶。
16.權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核宿主細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述真核宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自HEK細(xì)胞、BHK細(xì)胞、CHO細(xì)胞、 COS細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞例如SP2-0。
19.權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的方法，其中所述含有GLA-殘基的絲氨酸蛋白酶是因子 IX多肽。
20.權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的方法，其中所述含有GLA-殘基的絲氨酸蛋白酶是因子 VII多肽。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述因子VII多肽是野生型人因子VII。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述因子VII多肽具有高于野生型人因子FVIIa的蛋白 酶解活性。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述因子VII多肽是選自下列的因子VII相關(guān)多肽 L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII,V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII，M298Q-FVII, Vl 58D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII， V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, Kl 57A-FVII, E296V-FVII, E296V/ M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII,L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V1 58T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII， L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K 337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/ M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII， K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVVI, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII， K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/ M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII， K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/ V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII,F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D-FVII， F374Y/L305V/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158T-FVII， F374Y/L305V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/V158T-FVII， F374Y/K337A/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/V158D-FVII， F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII,F374Y/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/S314E/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/M298Q-FVII， F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/E296V-FVII， F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/V158T-FVII， F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V-FVII， F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/V158T-FVII， F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII， F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII， F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F3 74Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V58T/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII， F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,S52A-因子 VII、S60A-因子 VII ；R152E-因子 VII、S344A-因子 VII、缺失 Gla 結(jié)構(gòu)域的因子 Vila ；和 P11Q/K 33E-FVII、 T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/ V317T-FVII,K143N/N145T/R31 5N/V317T-FVII ；和在從 233Thr 到 240Asn 的氨基酸序列上具 有添加、缺失或取代的FVII、在從304Arg到329Cys的氨基酸序列上具有添加、缺失或取代 的 FVII。
24.用于純化含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法，其中含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶 的溶液要經(jīng)過(guò)多個(gè)純化步驟，其中在至少一個(gè)純化步驟中PH具有在4. 5和6. 9之間的值或 具有在8. 6和10之間的值。
25.權(quán)利要求24的方法，其中在至少一個(gè)純化步驟中游離鈣離子的濃度高于1.2mM。
26.權(quán)利要求25的方法，其中在至少一個(gè)純化步驟中所述游離鈣離子的濃度高于 1. 3mM，例如高于1. 4mM、例如高于1. 5mM、例如高于1. 6mM、例如高于`1. 7mM、例如高于1. 8mM、 例如高于1. 9mM、例如高于2. OmM、例如高于2. ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如 高于2. 4mM、例如高于2. 5mM、例如高于2. 6mM、例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高 于5. OmM、例如高于6. OmM、例如高于7. OmM、例如高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于 10. OmM、例如高于20mM、例如高于40. OmM、例如高于60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于 0. 1M、例如高于1M、例如溶液飽和狀態(tài)下的游離鈣離子濃度。
27.權(quán)利要求24的方法，其中在至少一個(gè)純化步驟中所述游離鈣離子的濃度低于 0.10mM。
28.權(quán)利要求27的方法，其中在至少一個(gè)純化步驟中所述游離鈣離子的濃度低于 0. 09，例如低于0. 08、例如低于0. 07、例如低于0. 06、例如低于0. 05、例如低于0. 04、例如低 于0. 03、例如低于0. 02、例如低于0. 01、例如低于0. 00。
29.權(quán)利要求24到28中任一項(xiàng)的方法，其中在至少一個(gè)純化步驟中除了鋅離子和鈣離 子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、 Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+ 和 Uo2+。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自Mg2+、Cu2+和Mn2+。
32.權(quán)利要求29到31中任一項(xiàng)的方法，其中在至少一個(gè)純化步驟中除了鋅離子和 鈣離子外的二價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM,例如高于0. 03mM、例如高于 0. 035mM、例如高于0. 04mM、例如高于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例如高 于0. 06mM、例如高于0. ImM、例如高于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于 0. 3mM、例如高于0. 5mM、例如高于1. OmM。
33.權(quán)利要求24到32中任一項(xiàng)的方法，其中在至少一個(gè)純化步驟中在另外的二價(jià)金屬 離子螯合劑存在的情況下純化所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
34.權(quán)利要求24到33中任一項(xiàng)的方法，其中pH在4.5和6. 9之間于步驟(iii)中純 化所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
35.權(quán)利要求34的方法，其中pH在4.7到6. 8之間、例如在4. 9和6. 7之間、例如在，5. 1和6. 6之間、例如在5. 3和6. 5之間、例如在5. 5和6. 4之間、例如在5. 7和6. 3之間、 例如在5. 8和6. 2之間、例如在5. 9和6. 1之間、例如，6. O左右。
36.權(quán)利要求24到33中任一項(xiàng)的方法，其中pH在8.6和10之間于步驟(iii)中純化 所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
37.權(quán)利要求36的方法，其中pH在8.7到9. 9之間、例如在8. 8和9. 8之間、例如在 8. 9和9. 7之間、例如在9. 0和9. 6之間、例如在9. 1和9. 5之間、例如在8. 7和9. 8之間、 例如在8. 7和9. 7之間、例如在8. 7和9. 6之間、例如在8. 8和9. 5之間、例如在8. 9和9. 4 之間、例如在9. 0和9. 2之間、例如9. 2左右。
38.權(quán)利要求34到37中任一項(xiàng)的方法，其中在至少一個(gè)純化步驟中在組氨酸存在的情 況下純化所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
39.權(quán)利要求24到38中任一項(xiàng)的方法，其中所述含有GLA-殘基的絲氨酸蛋白酶是因 子IX多肽。
40.權(quán)利要求24到38中任一項(xiàng)的方法，其中所述含有GLA-殘基的絲氨酸蛋白酶是因 子VII多肽。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述因子VII多肽是野生型人因子VII。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述因子VII多肽具有高于野生型人因子FVIIa的蛋白 酶解活性。
43.權(quán)利要求40的方法，其中所述因子VII多肽是選自下列的因子VII相關(guān)多肽 L305V-FVII,L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/ K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/ M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII,L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII， L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII， L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII,S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, Κ316H/L305V/K337A/158T-FVII, K316H/L305V/K337A/ M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII， K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/ M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII， K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/ V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII,F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D-FVII， F374Y/L305V/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158T-FVII， F374Y/L305V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/V158D-FVII， F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/S314E/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/M298Q-FVII， F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/E296V-FVII， F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/V158T-FVII， F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V-FVII， F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/V158T-FVII， F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII， F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII， F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII， F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVIIF374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,S52A-因子 VII、S60A-因子 VII ；R152E-因子 VII、S344A-因子 VII、缺失 Gla 結(jié)構(gòu)域的因子 VIIa ；和 P11Q/K33E-FVII、 T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/ V317T-FVII.K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ；和在從 233Thr 到 240Asn 的氨基酸序列上具 有添加、缺失或取代的FVII、在從304Arg到329Cys的氨基酸序列上具有添加、缺失或取代 的 FVII。
44.用于在溶液中穩(wěn)定含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法，所述溶液包含含有GLA殘 基的絲氨酸蛋白酶，其中所述包含含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的溶液要經(jīng)過(guò)下列步驟 加入鈣以獲得高于1.2mM或低于0. IOmM的游離鈣離子濃度；和/或加入除鋅離子和鈣離子 外的二價(jià)金屬離子以獲得高于0. 025mM的鈣離子和鋅離子之外的游離二價(jià)金屬陽(yáng)離子濃 度；和/或?qū)蠫LA殘基的絲氨酸蛋白酶的溶液的pH值調(diào)節(jié)在4. 5和6. 9之間或在 8. 6和10之間。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所獲得的游離鈣離子濃度高于1.2mM。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所獲得的游離鈣離子濃度高于1.3mM，例如高于1.4mM、 例如高于1. 5mM、例如高于1. 6mM、例如高于1. 7mM、例如高于1. 8mM、例如高于1. 9mM、例如 高于2. OmM、例如高于2. ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如高于2. 4mM、例如高于 2. 5mM、例如高于2. 6mM、例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高于5. OmM、例如高于6. OmM、 例如高于7. OmM、例如高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于10. OmM、例如高于20mM、例如高 于40. OmM、例如高于60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于0. 1M、例如高于1M、例如溶液飽和 狀態(tài)下的游離鈣離子濃度。
47.權(quán)利要求44的方法，其中所獲得的游離鈣離子濃度低于0.10mM。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所獲得的游離鈣離子濃度低于0.09，例如低于0. 08、例如 低于0. 07、例如低于0. 06、例如低于0. 05、例如低于0. 04、例如低于0. 03、例如低于0. 02、 例如低于0. 01、例如低于0. 00。
49.權(quán)利要求44到48中任一項(xiàng)的方法，其中所獲得的除了鋅離子和鈣離子外的二價(jià)金 屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自Mg2+、CU2+、Mn2+、C02+、Fe2+、Sm2+、 Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+ 和 Uo2+。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自Mg2+、Cu2+和Mn2+。
52.權(quán)利要求49到51中任一項(xiàng)的方法，其中所獲得的除了鋅離子和鈣離子外的二價(jià) 金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM，例如高于0. 03mM、例如高于0. 035mM、例如高于 0. 04mM、例如高于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例如高于0. 06mM、例如高 于0. ImM、例如高于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于0. 3mM、例如高于 0. 5mM、例如高于1. OmM0
53.權(quán)利要求44到52中任一項(xiàng)的方法，其中在另外的二價(jià)金屬離子螯合劑存在的情況 下穩(wěn)定所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
54.權(quán)利要求44到53中任一項(xiàng)的方法，其中pH在4.5和6. 9之間于步驟(iii)中純 化所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
55.權(quán)利要求54的方法，其中pH在4.7到6. 8之間、例如在4. 9和6. 7之間、例如在 5. 1和6. 6之間、例如在5. 3和6. 5之間、例如在5. 5和6. 4之間、例如在5. 7和6. 3之間、 例如在5. 8和6. 2之間、例如在5. 9和6. 1之間、例如6. O左右。
56.權(quán)利要求44到53中任一項(xiàng)的方法，其中pH在8.6和10之間于步驟(iii)中純化 所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
57.權(quán)利要求56的方法，其中pH在8.7到9. 9之間、例如在8. 8和9. 8之間、例如在 8. 9和9. 7之間、例如在9. 0和9. 6之間、例如在9. 1和9. 5之間、例如在8. 7和9. 8之間、 例如在8. 7和9. 7之間、例如在8. 7和9. 6之間、例如在8. 8和9. 5之間、例如在8. 9和9. 4 之間、例如在9. 0和9. 2之間、例如9. 2左右。
58.權(quán)利要求54到57中任一項(xiàng)的方法，其中在組氨酸存在的情況下穩(wěn)定所述含有GLA 殘基的絲氨酸蛋白酶。
59.權(quán)利要求44到58中任一項(xiàng)的方法，其中所述含有GLA-殘基的絲氨酸蛋白酶是因 子IX多肽。
60.權(quán)利要求44到58中任一項(xiàng)的方法，其中所述含有GLA-殘基的絲氨酸蛋白酶是因 子VII多肽。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述因子VII多肽是野生型人因子VII。
62.權(quán)利要求60的方法，其中所述因子VII多肽具有高于野生型人因子FVIIa的蛋白 酶解活性。
63.權(quán)利要求60的方法，其中所述因子VII多肽是選自下列的因子VII相關(guān)多肽 L305V-FVII,L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII,L305T-FVII,F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII, Vl58D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/ K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/ M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII， L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII， L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V 58D/E296V/M298Q/K337A-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/ M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII， K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/ M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII， K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII,F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D-FVII， F374Y/L305V/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158T-FVII， F374Y/L305V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/V158T-FVII， F374Y/K337A/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/V158D-FVII， F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/S314E/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/M298Q-FVII， F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/E296V-FVII， F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/V158T-FVII， F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V-FVII， F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/V158T-FVII， F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII， F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII， F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII， F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII,F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,S52A-因子 VII、S60A-因子 VII ；R152E-因子 VII、S344A-因子 VII、缺失 Gla 結(jié)構(gòu)域的因子 VIIa ；和 P11Q/K33E-FVII、 T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/ V317T-FVII,K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ；和在從 233Thr 到 240Asn 的氨基酸序列上具 有添加、缺失或取代的FVII、在從304Arg到329Cys的氨基酸序列上具有添加、缺失或取代 的 FVII。
64.包含含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶溶液的組合物，所述溶液的pH具有在4.5和6. 9 之間的值或具有在8. 6和10之間的值。
65.權(quán)利要求64的組合物，其中所獲得的游離鈣離子的濃度高于1.2mM。
66.權(quán)利要求65的組合物，其中所獲得的所述游離鈣離子的濃度高于1.3mM，例如高于 1. 4mM、例如高于1. 5mM、例如高于1. 6mM、例如高于`1. 7mM、例如高于1. 8mM、例如高于1. 9mM、 例如高于2. OmM、例如高于2. ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如高于2. 4mM、例如 高于2. 5mM、例如高于2. 6mM、例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高于5. OmM、例如高于 6. OmM、例如高于7. OmM、例如高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于10. OmM、例如高于20mM、 例如高于40. OmM、例如高于60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于0. 1M、例如高于1M、例如溶 液飽和狀態(tài)下的游離鈣離子濃度。
67.權(quán)利要求64的組合物，其中所獲得的游離鈣離子的濃度低于0.10mM。
68.權(quán)利要求67的組合物，其中所獲得的游離鈣離子的濃度低于0.09，例如低于0. 08、 例如低于0. 07、例如低于0. 06、例如低于0. 05、例如低于`0. 04、例如低于0. 03、例如低于 0. 02、例如低于0. 01、例如低于0. 00。
69.權(quán)利要求64到68中任一項(xiàng)的組合物，其中所獲得的除了鋅離子和鈣離子外的二價(jià) 金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM。
70.權(quán)利要求69的組合物，其中所述二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、 Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+ 和 Uo2+。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自Mg2+、Cu2+和Mn2+。
72.權(quán)利要求69到71中任一項(xiàng)的組合物，其中所獲得的除了鋅離子和鈣離子外的二 價(jià)金屬陽(yáng)離子的游離離子濃度高于0. 025mM，例如高于0. 03mM、例如高于0. 035mM、例如高 于0. 04mM、例如高于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例如高于0. 06mM、例如 高于0. ImM、例如高于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于0. 3mM、例如高于‘0. 5mM、例如高于1. OmMo
73.權(quán)利要求64到72中任一項(xiàng)的組合物，其中在另外的二價(jià)金屬離子螯合劑存在的情 況下穩(wěn)定所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
74.權(quán)利要求64到73中任一項(xiàng)的組合物，其中pH在4.5和6. 9之間于步驟(iii)中 純化所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
75.權(quán)利要求74的組合物，其中pH在4.7到6. 8之間、例如在4. 9和6. 7之間、例如在 5. 1和6. 6之間、例如在5. 3和6. 5之間、例如在5. 5和6. 4之間、例如在5. 7和6. 3之間、 例如在5. 8和6. 2之間、例如在5. 9和6. 1之間、例如6. O左右。
76.權(quán)利要求64到73中任一項(xiàng)的組合物，其中pH在8.6和10之間于步驟(iii)中純 化所述含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
77.權(quán)利要求66的組合物，其中pH在8.7到9. 9之間、例如在8. 8和9. 8之間、例如 在8. 9和9. 7之間、例如在9. O和9. 6之間、例如在9. 1和9. 5之間、例如在8. 7和9. 8之 間、例如在8. 7和9. 7之間、例如在8. 7和9. 6之間、例如在8. 8和9. 5之間、例如在8. 9禾口 9. 4之間、例如在9. O和9. 2之間、例如9. 2左右。
78.權(quán)利要求74到77中任一項(xiàng)的組合物，其中在組氨酸存在的情況下穩(wěn)定所述含有 GLA殘基的絲氨酸蛋白酶。
79.權(quán)利要求64到78中一項(xiàng)的組合物，其中所述含有GLA-殘基的絲氨酸蛋白酶是因 子IX多肽。
80.權(quán)利要求64到78中任一項(xiàng)的組合物，其中所述含有GLA-殘基的絲氨酸蛋白酶是 因子VII多肽。
81.權(quán)利要求80的組合物，其中所述因子VII多肽是野生型人因子VII。
82.權(quán)利要求80的組合物，其中所述因子VII多肽具有高于野生型人FVIIa的蛋白酶 解活性。
83.權(quán)利要求80的組合物，其中所述因子VII多肽是選自下列的因子VII相關(guān)多肽 L305V-FVII,L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII,L305T-FVII,F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII, Vl58D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/ K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/ M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII， L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII， L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVI I, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/ M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII， K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII， K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/ M298Q-FVII,K31 6Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/ V158D- FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII,F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D-FVII， F374Y/L305V/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158T-FVII， F374Y/L305V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/V158T-FVII， F374Y/K337A/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/V158D-FVII， F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/S314E/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/M298Q-FVII， F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/E296V-FVII， F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/V158T-FVII， F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V-FVII， F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/V158T-FVII， F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII， F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII， F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII， F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,S52A-因子 VII、S60A-因子 VII ；R152E-因子 VII、S344A-因子 VII、缺失 Gla 結(jié)構(gòu)域的因子 VIIa ；和 P11Q/K33E-FVII、 T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/ V317T-FVII,K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ；和在從 233Thr 到 240Asn 的氨基酸序列上具 有添加、缺失或取代的FVII、在從304Arg到329Cys的氨基酸序列上具有添加、缺失或取代 的 FVII。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于蛋白酶純化的方法。特別是，本發(fā)明涉及生產(chǎn)含有GLA殘基的絲氨酸蛋白酶的方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101818138SQ20091020839
公開日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2004年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月18日
發(fā)明者E·佩森, J·克拉魯普 申請(qǐng)人:諾和諾德醫(yī)療保健公司