凝血反應的評價方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及評價具有凝血因子VIII (FVIII)功能代替活性的物質(zhì)介導的凝血反 應的方法。另外，本發(fā)明涉及包含活化凝血因子XI (FXIa)的用于評價凝血反應的試劑、以 及包含該試劑的用于評價具有凝血因子VIII (FVIII)功能代替活性的物質(zhì)介導的凝血反 應的試劑盒等。
【背景技術(shù)】
[0002] 血友病是凝血因子VIII (FVIII)或凝血因子IX (FIX)先天缺乏或功能不全引起 的出血性疾病。前者稱為血友病A，后者稱為血友病B。它們的基因都存在于X染色體上， 基因異常通過性連鎖隱性遺傳傳遞，因此發(fā)病患者中99%以上是男性。已知患病率是出生 男子1萬人中大約1人，血友病A與血友病B的比率大約是5:1。
[0003] 血友病患者中主要的出血部位可列舉關(guān)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、口腔內(nèi)、顱內(nèi)、消化 道、鼻腔內(nèi)等。其中關(guān)節(jié)內(nèi)反復出血進展為關(guān)節(jié)障礙、伴有步行困難的血友病性關(guān)節(jié)病，有 時最終需要關(guān)節(jié)置換術(shù)。因此，是降低血友病患者的QOL的主要原因。
[0004] 血友病的嚴重程度與血液中FVIII活性或FIX活性密切相關(guān)?；钚圆蛔?%的患 者歸類為重度、活性為1%以上不足5%的患者歸類為中度、活性為5%以上不足40%的患者 歸類為輕度。占血友病患者約半數(shù)的重度患者中，每月出現(xiàn)幾次出血癥狀，這是與中度患者 以及輕度患者相比顯著高的頻率。因此認為，重度血友病患者中，通過FVIII或FIX補充療 法將血液中FVIII活性或FIX活性維持在1%以上，對于阻止出血癥狀出現(xiàn)是有效的（非專 利文獻1)。
[0005] 作為相關(guān)的出血異常，除血友病、后天性血友病之外，還已知馮維勒布蘭德因子 (von Willebrand factor，vWF)功能異?；蛉狈σ鸬鸟T維勒布蘭德病。vWF不僅對于血 小板與血管壁的損傷部位的內(nèi)皮下組織正常粘附是必須的，對血小板與FVIII形成復合物 保持血液中FVIII水平正常也是必須的。馮維勒布蘭德病患者中，這些功能降低，引起止血 功能異常。
[0006] 為了預防和/或治療血友病患者中的出血，主要應用從血漿純化或通過基因重組 技術(shù)制備的凝血因子。
[0007] 作為監(jiān)測FVIII等凝血因子的藥效的方法，已知活化部分凝血活酶時間 (activated partial thromboplastin time， APTT)、基于 APTT 的一段式凝血法 (APTT-based one-stage coagulation method)、凝血酶生成試驗（TGA)等。APTT 和一段 式凝血法長期廣泛地用作監(jiān)測FVIII制劑藥效的方法。APTT為下列方法，在被測血漿中加 入APTT試劑后，加入CaCl 2，測定纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白的時間，即至凝固起始的 時間。一段式凝血法為下列方法，將用緩沖液以固定比例稀釋的被測血漿加入FVIII缺乏 血漿中，以與APTT相同的方法測定凝固時間，由應用連續(xù)稀釋的正常血漿代替被測血漿得 到校準曲線求出被測血漿的FVIII活性。TGA為下列試驗，應用針對凝血酶的熒光底物，以 酶活性隨時間測定凝血反應亢進中生成的凝血酶量（非專利文獻2)。TGA中，能夠評價從 凝血反應的凝血酶生成起始階段至凝血反應擴增時的凝血酶生成的一系列凝血反應。進一 步，對用于TGA的凝固起始試劑，報告了以低濃度的磷脂溶液（4 yM)為基礎(chǔ)組合低濃度的 組織因子的試劑（非專利文獻2)、組合FIXa的試劑（非專利文獻3、4)、組合FXII活化劑 (鞣花酸）的試劑（非專利文獻5)、組合低濃度的組織因子及FXII活化劑(鞣花酸）的混合 溶液的試劑（非專利文獻5)。
[0008] 近年來，發(fā)現(xiàn)了與活化凝血因子IX (FIXa)以及第X因子（FX)二者結(jié)合、具有代 替FVIII的輔因子功能、即促進FIXa介導的FX活化的功能的功能的雙特異性抗體（專利 文獻1-3)。但是，該雙特異性抗體雖然代替FVIII的功能，其作用表現(xiàn)機制與FVIII的該機 制不完全相同。例如，F(xiàn)VIII僅在由FXa、凝血酶活化后開始顯示輔因子活性，但上述雙特異 性抗體無需該活化過程顯示輔因子活性。因此，現(xiàn)有FVIII的藥效監(jiān)測方法不一定能夠適 用。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)文獻 非專利文獻 非專利文獻1:AstermarkJ.Haemophilia. 2003 9 (Suppl.l) 32非專利文獻2 :PathophysiolHaemostThromb. 2003;33(1):4 非專利文獻3: JThrombHaemost. 2011Aug;9(8):1549_55 非專利文獻4: JThrombHaemost. 2003May;1 (5): 1005-11 非專利文獻5 :IntJHematol. 2009Dec;90(5):576-82 專利文獻 專利文獻1 :W02005/035756 專利文獻2 :W02006/109592 專利文獻3 :W02012/067176。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明要解決的問題 本發(fā)明是鑒于這種狀況作出的。本發(fā)明的目的是，提供評價具有凝血因子VIII (FVIII) 代替活性的物質(zhì)在凝血反應中的藥效的方法、用于該方法的凝血起始試劑、以及包含該試 劑的試劑盒。
[0011] 解決問題的手段 本發(fā)明人為了解決上述問題，以各種止血效果評價方法和各種凝血起始試劑為對象， 嘗試構(gòu)建評價具有凝血因子VIII (FVIII)代替活性的物質(zhì)介導的凝血反應的方法。結(jié)果， 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用包含活化凝血因子XI (FXIa)的凝血起始試劑，以血液樣品中凝血 酶生成量為指標，能夠以適當靈敏度評價具有凝血因子VIII (FVIII)代替活性的物質(zhì)在凝 血反應中的效果。另外，本發(fā)明人成功地發(fā)現(xiàn)了，應用包含活化凝血因子XI (FXIa)的凝血 起始試劑的凝血酶生成試驗方法。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)，涉及以下[1]至[9]。
[0012] [1]評價具有凝血因子VIII代替活性的物質(zhì)介導的凝血反應的方法，其包含步驟 ⑴以及（ii): (i)向包含具有凝血因子VIII代替活性的物質(zhì)的、從被測者分離的血液來源樣品中， 加入包含活化凝血因子XI的凝血起始試劑， (ii)測定步驟（i)得到的血液來源樣品的凝血酶生成量。
[0013] [2] [1]中記載的方法，其中具有凝血因子VIII代替活性的物質(zhì)是與凝血因子IX 或活化凝血因子IX、以及與凝血因子X結(jié)合的雙特異性抗體。
[0014] [3] [1]或[2]中記載的方法，其中被測者是出血性疾病患者。
[0015] [4] [3]中記載的方法，其中出血性疾病是以凝血因子VIII或活化凝血因子VIII 活性降低或缺乏為原因的疾病。
[0016] [5] [3]或[4]中記載的方法，其中出血性疾病是選自血友病、后天性血友病、以及 馮維勒布蘭德因子（vWF)功能異?；蛉狈σ鸬鸟T維勒布蘭德病的疾病。
[0017] [6] [1]至[5]的任一項中記載的方法，其中凝血起始試劑是包含活化凝血因子XI 以及磷脂的試劑。
[0018] [7]用于在[1]至[6]的任一項中記載的方法中使用的凝血起始試劑，其包含活化 凝血因子XI。
[0019] [8] [7]中記載的凝血起始試劑，其進一步包含磷脂。
[0020] [9]用于在[1]至[6]的任一項中記載的方法中使用的試劑盒，其包含[7]或[8] 中記載的凝血起始試劑。
[0021] 發(fā)明效果 通過本發(fā)明，提供了以血液來源樣品的凝血酶生成量為指標評價具有凝血因子VIII 代替活性的物質(zhì)介導的凝血反應的方法。具有凝血因子VIII代替活性的物質(zhì)、特別是與凝 血因子IX或活化凝血因子IX、以及凝血因子X結(jié)合的雙特異性抗體的輔因子活性的表現(xiàn)機 制與凝血因子VIII的該機制不完全相同。因此，用雙特異性抗體治療血友病等出血性疾病 中，廣泛應用的藥效評價方法不一定能夠適用，有可能無法適當評價雙特異性抗體的效果。 通過本發(fā)明，即使在利用上述雙特異性抗體的出血性疾病治療中，也能準確評價其效果。
[0022] 附圖簡述 圖1示出與活化凝血因子IX以及凝血因子X結(jié)合的雙特異性抗體之一 hBS23的FVIII 功能代替活性。hBS23在FIXa/FX/磷脂存在下顯示FXa產(chǎn)生促進活性。
[0023] 圖2示出FVIII缺乏血漿、或具有抑制劑的FVIII缺乏血漿的凝血酶生成試驗參 數(shù)(峰高度（A)以及ETP(B))中，hBS23以及基因重組人凝血因子VIII (rhFVIII)的效果。 各血漿批次得自確認了重度血友病A (血漿1，2，3)或具有抑制劑的重度血友病A (具有 抑制劑的血漿1，2)的單一供體。抑制劑滴度是，具有抑制劑的血漿1、2分別是292、148貝 提斯達單位（Bethesda units)。在FVIII缺乏血漿以及具有抑制劑的FVIII缺乏血漿中， hBS23在FXIa/磷脂試劑誘導條件下濃度依賴性地增加峰高度（Peak height)以及ETP。
[0024] 實施本發(fā)明的方式 本發(fā)明涉及評價具有凝血因子VIII代替活性的物質(zhì)介導的凝血反應的方法，其包含 以下步驟（i)以及（ii): (i) 在包含具有凝血因子VIII代替活性的物質(zhì)的、從被測者分離的血液來源樣品中， 加入包含活化凝血因子XI的凝血起始試劑， (ii) 測定步驟（i)得到的血液來源樣品的凝血酶生成量。
[0025] 通過使用本發(fā)明方法，能夠適當評價具有凝血因子VIII代替活性的物質(zhì)介導的 輔因子活性。特別地，與作為凝血因子的藥效監(jiān)測方法的之前廣泛使用的利用活化部分凝 血活酶時間（APTT)值的方法、利用包含低濃度組織因子的凝固起始試劑誘導的凝血酶生成 試驗比較，認為本發(fā)明能夠以適當靈敏度監(jiān)測止血效果。
[0026] 本發(fā)明的"評價具有凝血因子VIII代替活性的物質(zhì)介導的凝血反應的方法"可稱 為"評價具有凝血因子VIII代替活性的物質(zhì)介導的輔因子活性的方法"。另外，也可稱為 "評價具有凝血因子VIII代替活性的物質(zhì)介導的出血性疾病治療效果的方法"?；蛘?，也可 稱為"評價具有凝血因子VIII代替活性的物質(zhì)介導的出血性疾病的預防效果的方法"。進 一步地，"評價方法"也可表達為"判定方法"、"測定方法"。
[0027] 凝血因子VIII是牽涉凝血的一系列分子之一，被凝血酶或活化凝血因子X活化時 表現(xiàn)輔因子活性，促進活化凝血因子IX介導的凝血因子X活化反應。本發(fā)明的具有凝血因 子VIII代替活性的物質(zhì)在促進活化凝血因子IX介導的凝血因子X活化方面與凝血因子 VIII共通，但在例如不需要凝血酶、活化凝血因子X的活化方面與凝血因子VIII不同。
[0028] 本發(fā)明的具有凝血因子VIII代替活性的物質(zhì)也可稱為具有凝血因子VIII樣活 性的物質(zhì)。本發(fā)明中"代替凝血因子VIII的功能"意味著，識別凝血因子IX (FIX)或凝 血因子IXa (FIXa)、和凝血因子X (FX)，促進FIXa介導的FX活化(促進FIXa介導的FXa 產(chǎn)生)。FXa產(chǎn)生促