專利名稱：具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-CD137L4及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-CD137L4及其基因，以及含有該基因的表達(dá)載體以及由該載體轉(zhuǎn)化的菌株，還涉及該蛋白的制備方法，同時(shí)涉及該蛋白及其基因在制備血管生成抑制劑、各種腫瘤相關(guān)疾病(如黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、大腸癌、腎癌、膀胱癌等)、視網(wǎng)膜病變、細(xì)胞增殖、機(jī)體細(xì)胞因子合成與分泌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等藥物，以及該重組蛋白或基因在制備以口服或注射等相關(guān)劑型藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大量研究已證明免疫原性差與豐富的血管生成是腫瘤組織的兩大特征，同時(shí)也是腫瘤治療預(yù)后差、容易復(fù)發(fā)的主要原因?；诖搜芯咳藛T發(fā)現(xiàn)了腫瘤治療的新契機(jī)一生物療法，即借助生物學(xué)知識(shí)與手段實(shí)施對(duì)腫瘤組織或者腫瘤形成過程的定向打擊。抑制腫瘤血管生成與腫瘤的免疫治療是目前廣受關(guān)注的兩大熱點(diǎn)。1.抑制腫瘤血管生成
隨著腫瘤血管生成理論的完善和臨床研究迅速發(fā)展，抗血管生成治療已成為腫瘤輔助治療的一個(gè)重要組成部分。Tumstatin是近年來發(fā)現(xiàn)的一種能夠抑制新生血管生成的蛋白藥物，在抗腫瘤領(lǐng)域也發(fā)揮極大的作用。Tumstatin來源于血管基底膜IV型膠原a 3鏈C-末端的腫瘤新生血管抑制因子，由244個(gè)氨基酸組成，分子量為28kD。Tumstatin能夠與內(nèi)皮細(xì)胞上a VP 3整合蛋白結(jié)合，干擾其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞粘附、遷移和內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制血管生成。其分子機(jī)制為:tumstatin經(jīng)與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的a V P 3整合素結(jié)合進(jìn)而抑制FAK、PI3K、PKB/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)·通路的活化，降低了哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶體(mTOR)活性，最終通過阻斷真核翻譯起始因子(eIF4E)和它的結(jié)合蛋白的解離來介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞特異性的mRNA帽子依賴性的蛋白質(zhì)合成，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的血管新生和抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。Maeshima 等人(J Biol Chem.2000Jul 14; 275 (28): 21340-8)發(fā)現(xiàn)，tumstatin有兩個(gè)不同的抗腫瘤活性區(qū)，分別具有直接和間接的抗腫瘤作用。一個(gè)是54到132位的N-末端肽(Tum-5)，既能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，又能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而具有抗血管生成作用。進(jìn)一步研究證實(shí)第74-98位的25個(gè)氨基酸是Tum-5抗血管生成的活性中心。Tumstatin在腫瘤的基因治療方面有一定的研究。Luo等(IUBMBLife.2006Nov;58(ll):647-53)構(gòu)建的雙功能融合蛋白TNF-tumstatin有望克服TNF應(yīng)用劑量高、毒副作用強(qiáng)的缺點(diǎn)，發(fā)揮兩者聯(lián)合抗腫瘤作用。Goto T等(Int JOncol.2008Jul;33(l):33-40)選取了 tumstatin 的 54-244 位氨基酸的基因(Tuml)構(gòu)建哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pSecTag2B-tum-l，然后研究者將此構(gòu)建的目的基因分別轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞HCCcells, PLC/PRF/5，Huh-7中，通過增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pSecTag2B-tum-l的導(dǎo)入能夠抑制以上肝癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)也能夠明顯的抑制HUVEC細(xì)胞的增殖和遷移，研究者在接種有腫瘤的小鼠細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了基因治療實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行相關(guān)基因治療的小鼠中其腫瘤體積明顯受到控制。2.⑶137/⑶137L在腫瘤免疫治療中的研究
T細(xì)胞的激活需要兩個(gè)信號(hào):一個(gè)是抗原遞呈細(xì)胞提供的MHC-抗原肽復(fù)合物信號(hào)；另一個(gè)是由細(xì)胞膜表面黏附分子如CD28-B7提供的協(xié)同刺激信號(hào)，即第二信號(hào)。CD137/CD137L信號(hào)系統(tǒng)在第二信號(hào)中發(fā)揮極大的作用，如其能夠刺激T細(xì)胞增殖等。⑶137/⑶137L信號(hào)參與多種細(xì)胞免疫，研究最為透徹的當(dāng)屬⑶137/⑶137L在T細(xì)胞免疫中所發(fā)揮的作用。當(dāng)有適量抗CD3抗體存在的情況下，抗CD137的單克隆抗體、可溶性的CD137L或者能夠表達(dá)CD137L的細(xì)胞均能有效的激活T細(xì)胞，且能夠有效的促進(jìn)T細(xì)胞增殖、釋放相關(guān)的細(xì)胞因子，同時(shí)能夠延長已經(jīng)活化的T細(xì)胞的生存周期，從而使得T細(xì)胞的殺傷作用更加強(qiáng)勁。其反向信號(hào)在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫時(shí)更加精確與快速。研究發(fā)現(xiàn)，CD137能夠招募TRAF2 (TNF受體相關(guān)因子2)，激活細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶I (ASK1 )，致使JNK/SAPK,P38MAPK(P38有絲分裂絲裂原活化蛋白激酶)以及NF- k B途徑的激活，從而上調(diào)抗凋亡基因bcl-xL與bf 1-1的表達(dá)，保護(hù)激活的T細(xì)胞免于凋亡的命運(yùn)。⑶137L與抗⑶137抗體類似，也可以激活⑶8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)其增殖、分泌細(xì)胞因子IFN- y，并維持T細(xì)胞的存活。⑶137/⑶137L信號(hào)可以通過以上作用發(fā)揮其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。因而⑶137/⑶137L輔助信號(hào)對(duì)腫瘤治療有重要意義。該信號(hào)不僅能輔助第一信號(hào)高效激活機(jī)體的細(xì)胞免疫，而且還能延長激活的⑶8+T細(xì)胞的生存期，并且誘導(dǎo)細(xì)胞持續(xù)表達(dá)⑶137分子，從而持久殺傷腫瘤細(xì)胞。綜上所述，⑶137/⑶137L信號(hào)通過激活T細(xì)胞免疫并維持T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)達(dá)到抑制腫瘤生長的效果，而tumstatin則通過抑制腫瘤血管生成間接阻斷腫瘤的生長。目前許多研究人員分別對(duì)這兩個(gè)途徑作了深入的研究`和探討，然而，聯(lián)合應(yīng)用免疫系統(tǒng)與抗血管生成治療腫瘤的研究更有意義。盡管有研究使用兩種性質(zhì)的疫苗達(dá)到這一效果，但是目前還沒有研究將⑶137L與tumstatin融合制成一個(gè)具有雙功能、雙靶點(diǎn)的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過短的連接肽將⑶137L胞外區(qū)與tumstatin抗血管生成活性片段融合成一個(gè)同時(shí)具有增強(qiáng)T細(xì)胞免疫與抗血管生成的雙功能、雙靶點(diǎn)的分子，并且在本發(fā)明中選取了 tumstatin不同的相關(guān)活性位點(diǎn)(tumstatin氨基酸序列第45-98位、第60-132位、第60-98位氨基酸序列中的一種)與⑶137L胞外區(qū)蛋白氨基酸序列第50-240位通過連接肽相連接，利用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)制備，此方法具有制備簡單及避免了全長tumstatin的副作用問題，本發(fā)明將在制備血管生成抑制劑、各種腫瘤相關(guān)疾病(如黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、大腸癌、腎癌、膀胱癌等)、視網(wǎng)膜病變、細(xì)胞增殖、機(jī)體細(xì)胞因子合成與分泌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等藥物，以及在制備以口服或注射等相關(guān)劑型藥物中有很好的應(yīng)用前景與市場價(jià)值。本發(fā)明的目的是提供一組具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-Q)137L4。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼上述具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstat in-CD 137L4 的基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-Q)137L4 的制備方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4及其基因在制備血管生成抑制劑、各種腫瘤相關(guān)疾病(如黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、大腸癌、腎癌、膀胱癌等)、視網(wǎng)膜病變、細(xì)胞增殖、機(jī)體細(xì)胞因子合成與分泌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等藥物中的應(yīng)用，且該組蛋白可用于制備以口服或者注射等相關(guān)劑型藥物。本發(fā)明具體技術(shù)方案如下:
一種具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-Q)137L4,其特征在于該蛋白具有tumstatin活性片段氨基酸序列和具有⑶137L胞外區(qū)氨基酸序列,所述tumstatin活性片段氨基酸序列選自SEQ ID N0.13至SEQ ID N0.15所示的氨基酸序列中的一種，所述CD137L胞外區(qū)氨基酸序列如SEQ ID N0.16所示，所述tumstatin活性片段氨基酸序列和⑶137L胞外區(qū)氨基酸序列通過連接肽氨基酸序列相連接。上述連接肽氨基酸序列可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段進(jìn)行設(shè)計(jì)，優(yōu)選SEQ ID N0.17或 SEQ ID N0.18。本發(fā)明所述重組蛋白Tumstatin-CD137L4氨基酸序列優(yōu)選SEQ ID N0.7-SEQ IDN0.12中的一種。本發(fā)明還提供了編碼上述具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4基因，包括編碼tumstatin活性片段的基因和編碼⑶137L胞外區(qū)的基因，其中所述包括編碼tumstatin活性片段的基因選自SEQ ID N0.19-SEQ ID N0.21中的一種，所述編碼CD137L胞外區(qū)的基因選自SEQ ID N0.22，編碼tumstatin活性片段的基因和編碼CD137L胞外區(qū)的基因通過編碼連接肽的基因相連接。上述編碼連接肽的基因優(yōu)選SEQ ID N0.23或SEQ ID N0.24。上述重組蛋白基因，其優(yōu)選具有SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.6之一的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種編碼上述重組蛋白Tumstatin-⑶137L4的基因，與上述的核苷酸序列相比具有70%及以上的同源性，能編碼本發(fā)明所述重組蛋白或其保守性變異多肽或其活性片段或其活性衍生物。本發(fā)明還提供了上述的具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4的制備方法，包括如下步驟:
(1)設(shè)計(jì)得到本發(fā)明所述編碼具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4基因序列；
(2)構(gòu)建含上述基因序列表達(dá)系統(tǒng)，包括構(gòu)建表達(dá)載體再將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，形成可表達(dá)本發(fā)明所述具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4的重組細(xì)胞；
(3)通過本領(lǐng)域普通技術(shù)手段培養(yǎng)以上所述的重組細(xì)胞，使其表達(dá)目的蛋白；
(4)分離純化得到本發(fā)明所述具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-Q)137L4。上述表達(dá)系統(tǒng)可選用原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)或枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，這兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)普遍適應(yīng)于本發(fā)明所述重組蛋白的表達(dá)，其中大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)載體優(yōu)選pET-lla、pET-28a或pET-22b，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)載體優(yōu)選p P43-tum-⑶137L ;真核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選酵母表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)載體優(yōu)選pPIC9K、pPICZ a A 或 pPIC9，酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選 GSl 15 或 SMDl 168。上述制備方法的一種優(yōu)選方案為:將編碼上述具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-CD137L4的基因通過Ndel及Nhel雙酶切，然后連接至表達(dá)載體pET_l Ia的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)液體培養(yǎng)工程菌獲得包涵體形式的目的蛋白。通過將包涵體進(jìn)行稀釋復(fù)性的方法，即用含低濃度尿素的溶液多次洗滌包涵體蛋白，然后用含8M尿素的變性液在50°C溶解包涵體，最后用含0.4M L-Arg的復(fù)性液稀釋復(fù)性包涵體，本發(fā)明中復(fù)性所得重組蛋白即為純度較高的蛋白，無需再另外純化。從而得到本發(fā)明所述重組蛋白。上述制備方法的一種優(yōu)選方案為:將編碼上述具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin_CD137L4的基因通過EcoRl及Notl雙酶切，然后連接至表達(dá)載體pPICZ a A的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，再轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞SMD1168中，通過胞外分泌表達(dá)得到三聚體形式的目的蛋白，然后在分別通過硫酸銨沉淀、陰離子交換層析柱(DEAE-Sepharose)手段獲得純的目的蛋白。上述制備方法的一種優(yōu)選方案為:將編碼上述具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstat in-CD 137L4的基因通過Pst I和Hind III雙酶切，構(gòu)建表達(dá)載體pP43-tum_CD137L,再轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌中，通過胞外分泌表達(dá)得到三聚體形式的目的蛋白，然后在分別通過硫酸銨沉淀、陰離子交換層析柱(DEAE-Sepharose)手段獲得純的目的蛋白。本發(fā)明還提供了上述具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4在制備血管生成抑制劑、各種腫瘤相關(guān)疾病、視網(wǎng)膜病變、細(xì)胞增殖、機(jī)體細(xì)胞因子合成與分泌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4基因在制備血管生成抑制劑、各種腫瘤相關(guān)疾病、視網(wǎng)膜病變、細(xì)胞增殖、機(jī)體細(xì)胞因子合成與分泌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力藥物中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，本發(fā)明所述的重組蛋白可以單獨(dú)使用或以藥物組合物的形式使用。藥物組合物包括作為活性成分的本發(fā)明所述的重組蛋白和可藥用載體。較佳的，藥物組合物有0.1-99.9%重量百分比的作為活性成分本發(fā)明所述的重組蛋白。“可藥用載體”不會(huì)破壞本發(fā)明重組蛋白的藥學(xué)活性，同時(shí)其有效用量，即能夠起藥物載體作用時(shí)的用量對(duì)人體 母?！翱伤幱幂d體”包括但不限于:離子交換材料、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物傳遞系統(tǒng)(SEDDS^n d-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐溫或其他類似聚合介質(zhì)等藥物制劑用的表面活性劑、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、鹽、電解質(zhì)如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、硅酸鎂等。聚乙烯吡咯酮、纖維素物質(zhì)、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛脂、環(huán)糊精如a-、0_、Y-環(huán)糊精或其經(jīng)化學(xué)修飾的衍生物如2-和3-羥丙基-3 -環(huán)糊精等羥烷基環(huán)糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促進(jìn)本發(fā)明所述重組蛋白的藥物傳遞。其他可藥用輔料如填充劑(如無水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合劑(如微晶纖維素)、崩解劑(如交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素和交聯(lián)PVP)、潤滑劑(如硬脂酸 鎂)、吸收促進(jìn)劑、香味劑、甜味劑、稀釋劑、賦形劑、潤濕劑、溶劑、增溶劑和著色劑等也可加入本發(fā)明的藥物組合物中。在上述的藥物組合物中，沒有限制可以任選使用的任何劑型。例如，可舉例說明的有口服給藥形式如片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑或液體制劑，或胃腸外給藥形式如注射、局部產(chǎn)品或栓劑，他們可以以常規(guī)方法配制或非常規(guī)方法如脂質(zhì)體等。當(dāng)使用本發(fā)明所述重組蛋白作為治療劑時(shí)，其使用量對(duì)于成人大致每天0.0lmg至Ig的范圍內(nèi)，這取決于各患者的年齡、性別、體重和癥狀程度，并且日劑量可分為幾個(gè)劑量。本發(fā)明所述的重組蛋白還包括采用現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法對(duì)本發(fā)明所述重組蛋白進(jìn)行修飾的修飾蛋白。對(duì)于蛋白質(zhì)和肽類藥物，在多數(shù)情況下，機(jī)體內(nèi)的氨肽酶及羧肽酶很容易從常見的直鏈肽的兩端進(jìn)行逐步的切割分解，使直鏈肽被降解。多肽修飾是改變肽鏈主鏈結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈基團(tuán)的重要手段，已有大量文獻(xiàn)表明經(jīng)過修飾后的多肽藥物可以顯著降低免疫原性、減少毒副作用、增加水溶性、延長體內(nèi)作用時(shí)間、改變其生物分布狀況等等，明顯改善藥物的療效。 本發(fā)明所述重組蛋白常用修飾方法包括中間殘基的修飾、氨基酸替換、糖基化修飾及PEG修飾等，基本原理都是增加多肽分子的相對(duì)分子量和空間位阻，提高其對(duì)多肽水解酶的穩(wěn)定性，減少腎小球的濾過作用。替換肽鏈中的某幾個(gè)氨基酸是另一種推遲酶降解使多肽藥物的半衰期延長的方式，替換對(duì)象通常為肽鏈中的易酶解的氨基酸。具體的說，可對(duì)重組蛋白中間殘基進(jìn)行糖基化、磷酸化、甲基化、乙?；?、硝基化、磺酸化或者連接PEG修飾或者偶聯(lián)蛋白質(zhì)，其中:
糖基化修飾最常用的為N-糖基化和0-糖基化。糖基化修飾肽優(yōu)選在本發(fā)明所述重組蛋白氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)Tyr、Ser或Thr殘基上的氧與糖相連或本發(fā)明所述重組蛋白的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺側(cè)鏈的酰胺氮與糖相連。磷酸化修飾肽優(yōu)選在本發(fā)明所述重組蛋白氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)Tyr、Ser或Thr位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化。甲基化修飾肽包括側(cè)鏈甲基化修飾肽和N端甲基化修飾肽，側(cè)鏈甲基化優(yōu)選在本發(fā)明所述重組蛋白氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)Lys、Tyr或Arg側(cè)鏈上進(jìn)行甲基化,如Lys (For), Lys(Me), Lys(Me)2, Lys(Me)3, Arg(Me)2symmetrical, D-Tyr(Me), D-Tyr (Et)；
乙?；揎楇膬?yōu)選在本發(fā)明所述重組蛋白氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)Lys或Ser側(cè)鏈進(jìn)行乙酰化，如Ser (Ac)或Lys (Ac)。硝基化或磺酸化修飾肽優(yōu)選在本發(fā)明所述重組蛋白氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)Tyr側(cè)鏈上進(jìn)行硝基化或磺酸化，Tyr(3-N02)，Tyr(SO3H2)。中間殘基的PEG修飾優(yōu)選在本發(fā)明所述重組蛋白氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)Lys側(cè)鏈的氨基進(jìn)行PEG修飾，PEG分子量優(yōu)選為2000-10000。或者，將本發(fā)明所述重組蛋白或其上述修飾蛋白的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸替換成相應(yīng)的氨基酸衍生物或特殊氨基酸，如將丙氨酸替換成P -丙氨酸、高苯丙氨或萘基丙氨酸，將脯氨酸替換成羥脯氨酸，亮氨酸替換成正亮氨酸，纈氨酸替換成正纈氨酸，蘇氨酸替換成別蘇氨酸，異亮氨酸替換成別異亮氨酸，天冬酰胺替換成2-乙酰氨基-2-脫氧-P -D-吡喃葡萄糖基天冬酰胺(Asn (GlcNac (Ac) 3- ^ _D))，賴氨酸替換成Lys(palmitoyl)0 或者，將本發(fā)明所述重組蛋白或其上述修飾蛋白的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸替換成相應(yīng)的D型氨基酸。本發(fā)明中編碼上述具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-Q)137L4的基因(Tumstatin GenBank:AAF72632.1，含有CD137L全長序列的質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存，參考Wang S，Tan A,Lv J, Wang P,Yin X, Chen Y.Soluble expression of recombinant humanCD1371igand in Escherichia coli by co-expression of chaperones.J Ind MicrobiolBiotechnol.2012Mar; 39 (3):471-6.do1:10.1007/sl0295-011-1045-l.制得)通過常規(guī)方法通過全基因合成、PCR方法或其兩者結(jié)合的方法獲得。本發(fā)明所述重組蛋白的體外生物學(xué)活性進(jìn)行初步檢測和分析結(jié)果表明可以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖，同時(shí)輔助刺激小鼠T細(xì)胞的增殖及存活。綜上所述，本發(fā)明提供了一組具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-Q)137L4,體外活性實(shí)驗(yàn)表明表達(dá)的重組蛋白Tumstatin-Q)137L4能很好的抑制HUVEC細(xì)胞增殖，因而提示該重組蛋白可能有效抑制體內(nèi)異常血管生成，并且截短的Tumstatin片段可以避免全長Tumstatin蛋白在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中引起的副作用。同時(shí),該重組蛋白Tumstatin-⑶137L4能有效輔助抗⑶3抗體刺激T細(xì)胞增殖，因而可以增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答。另外，本發(fā)明中的重組蛋白使用大腸桿菌表達(dá)，該表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量大、操作簡單、純化簡便等優(yōu)點(diǎn)，可以有效的大批量生產(chǎn)。因此，本發(fā)明可為大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白Tumstatin-⑶137L4提供新的、安全的途徑，為開發(fā)新的高效、無毒、雙靶向性抗腫瘤藥物奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)，本發(fā)明具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值及市場前景。


圖1為氨基酸序 列如SEQ ID N0.7-SEQ ID N0.12所示的重組蛋白Tumstatin-Q)137L4在酵母中的表達(dá)。圖2所不為Western blot鑒定目的蛋白在酵母中確已表達(dá)。圖3為氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)。圖4為氨基酸序列如SEQ ID N0.7-SEQ ID N0.12所示的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4在大腸桿菌中的表達(dá)。圖5為具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4的包涵體在包涵體溶解液中溶解及變性蛋白在復(fù)性液中復(fù)性情況。圖6為具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4的包涵體在包涵體溶解液中溶解及變性蛋白在復(fù)性液中復(fù)性情況。圖7為具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4的包涵體在包涵體溶解液中溶解及變性蛋白在復(fù)性液中復(fù)性情況。圖8為本發(fā)明所述重組蛋白Tumstatin-⑶137L4對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響。(左圖中SEQ ID N0.7-SEQ ID N0.12分別代表具有此氨基酸序列的重組蛋白。其中右圖為陽性對(duì)照TNP-470作用效果，其濃度分別為I μ g/ml, 5 μ g/ml)
圖9為本發(fā)明所述重組蛋白Tumstatin-⑶137L4刺激T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(SEQ IDN0.7-SEQ ID N0.12代表具有此所包含的氨基酸序列的蛋白)。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料和試劑:
本發(fā)明共設(shè)計(jì)6種具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4表達(dá)載體,其核苷酸序列為SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.6所示序列，翻譯編碼氨基酸序列為SEQ ID N0.7至SEQ ID N0.12所示序列。該組蛋白具有tumstatin第45-98位、60-132位、60-98位的氨基酸序列中的任一種，并具有全長CD137L胞外區(qū)蛋白的50-240位氨基酸序列，兩者通過Linker連接肽連接融合而成，其中Linker氨基酸序列如SEQ ID N0.17至SEQ ID N0.18所示。本發(fā)明在連接有上述Tumstatin活性片段基因(如SEQ ID N0.19-SEQ ID N0.21所示)和連接肽基因的5’端和3’設(shè)計(jì)EcoR I及BamH I酶切位點(diǎn)，交由上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行全合成，并由連入具有相應(yīng)酶切位點(diǎn)pbluescript II SK (-)載體，重組載體由上海捷瑞生物工程有限公司提供。DH5a和BL21 (DE3)菌株由天根生化有限公司購得，pMD18_T載體、solution I連接酶、限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司，pET-1 Ia由Novagen公司購得，pPICZ a A載體由Invitrogen公司購得，含有⑶137L全長序列的質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存(參考WangS，Tan A, Lv Jj Wang P，Yin X，Chen Y.Soluble expression of recombinant humanCD137ligand in Escherichia coli by co-expression of chaperones.J Ind MicrobiolBiotechnol.2012Mar; 39 (3):471-6.do1:10.1007/sl0295-011-1045_l.制得)，核苷酸序列測序由南京思普金生物工程有限公司完成，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清等購自Gibco公司?？耿?和抗⑶28單克隆抗體購自Santa Cruz公司。RosetteSqj 人T細(xì)胞富集試劑盒購自Stem cell公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

實(shí)施例1:具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4在酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)純化
(I)具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4酵母表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明共設(shè)計(jì)6種具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4表達(dá)載體,其核苷酸序列為SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.6所示序列，氨基酸序列為SEQ ID N0.7至SEQID N0.12所示序列。該組蛋白或多肽由三組不同活性位點(diǎn)的tumstatin(三組具有全長tumstatin45-98位、60-132位、60-98位的氨基酸序列)與CD137L (具有全長CD137L胞外區(qū)蛋白的50-240位氨基酸序列)分別通過Linker連接肽連接融合而成。其中Linker氨基酸序列為:GGGGSGGGGSGGGGS 或 AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA。其中 tumstatin 及 Linker 相關(guān)序列(具有SEQ ID N0.25-SEQ ID N0.30所示序列)由上海捷瑞生物公司合成，CD137L胞外區(qū)蛋白(具有全長CD137L胞外區(qū)蛋白的50-240位氨基酸序列)由PCR方法擴(kuò)增得到。以含有CD137L全長序列的質(zhì)粒為模板，PCR反應(yīng)體系為:
模板 DNA: I u I IOXBuffer: 5 U I dNTP:4u I
上游引物: iyi 下游引物: iyiTaq:0.5 μ I
ddH20:37.5μ I
Total:50 μ I
上游引物為:5’ -CGGGATCCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTC-3’
下游引物為:5’ -GCGGCCGCCACCCGGAAGAGTCCCAAGAC-3’
以上上游引物帶有BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物帶有Not I酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件:先95°C預(yù)變性2min，然后以94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin30s，反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行30次，最后于72°C再延伸lOmin。將PCR產(chǎn)物回收后，與pMD_18T載體連接。連接體系為:
目的片段:3μ1 PMD-18T: 2 μ I 溶液1: 5μ1 Total:10 μ I
連接條件為16°C連接16h。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a中，在含有氨芐的LB培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)后挑取單克隆提取質(zhì)粒并測序，將測序正確的質(zhì)粒分別用BamH I及Not I酶切，回收雙酶切產(chǎn)物，再與含有SEQ ID N0.19-SEQ ID N0.21所示核苷酸序列的pbluescript II SK(-)-Tumstatin-Linker的載體進(jìn)行連接,連接體系及反應(yīng)條件同上。進(jìn)而轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a中提取質(zhì)粒交由南京思普金測序公司測序。獲得正確的測序質(zhì)粒后通過EcoR I及Not I雙酶切，然后連接至表達(dá)載體pPICZ a A的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，再轉(zhuǎn)化入酵母SMDl 168宿主菌中，篩選并得到陽性菌株 。(2)具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-Q)137L4在酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)純化
從酵母YPD平板上挑選已經(jīng)篩選的陽性菌株，接種于裝有IOml YPD培養(yǎng)基的IOOml搖瓶中，于28° C 30° C/250rpm 300rpm培養(yǎng)至0D_=2 6。取300 μ I菌液接種于裝300mlBMGY 培養(yǎng)基的 IL 搖瓶中，28° C 30。C/250rpm 300rpm 培養(yǎng)至 0D6(I(I=2 6。將搖瓶中菌液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，室溫下1500 X g 3000 X g離心5min，收集菌體。用適量的無菌水重懸細(xì)胞，室溫下1500Xg 3000Xg離心5min，收集菌體。用適量的BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將菌液轉(zhuǎn)移至IL搖瓶中，BMMY培養(yǎng)基補(bǔ)足300ml，28° C 30° C/250rpm 300rpm培養(yǎng)。每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0.5%。取72h樣品4°C，13000rpm離心3min，留上清，待SDS-PAGE分析。經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)目的蛋白確已在酵母中表達(dá)，并且目的蛋白是以三聚體的形式表達(dá)的，如圖1所示，其中A)圖為具有SEQ ID N0.7氨基酸序列蛋白表達(dá)狀況，泳道I為陰性對(duì)照，泳道2箭頭所示即為目的蛋白表達(dá)情況，B)圖為具有SEQ ID N0.8氨基酸序列蛋白表達(dá)狀況，泳道I為陰性對(duì)照，泳道2箭頭所示即為目的蛋白表達(dá)情況，C)圖為具有SEQ ID N0.9氨基酸序列蛋白表達(dá)狀況，泳道3為陰性對(duì)照，泳道1-2箭頭所不即為目的蛋白表達(dá)情況，D)圖為具有SEQ ID N0.10氣基酸序列蛋白表達(dá)狀況，泳道I為陰性對(duì)照，泳道2箭頭所示即為目的蛋白表達(dá)情況，E)圖為具有SEQ IDN0.11氨基酸序列蛋白表達(dá)狀況，泳道I為陰性對(duì)照，泳道2箭頭所示即為目的蛋白表達(dá)情況，F(xiàn))圖為具有SEQ ID N0.12氨基酸序列蛋白表達(dá)狀況，泳道I為陰性對(duì)照，泳道2箭頭所示即為目的蛋白表達(dá)情況。表達(dá)的蛋白經(jīng)western blot及質(zhì)譜分析鑒定確是目的蛋白。Western blot結(jié)果如圖2所示。目的蛋白隨后分別經(jīng)別硫酸沉淀、陰離子交換層析柱(DEAE-Sepharose)進(jìn)行純化。實(shí)施例2:具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)純化
(I)具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4枯草芽孢桿菌表達(dá)載體的構(gòu)
建
本發(fā)明共設(shè)計(jì)6種具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4表達(dá)載體,其核苷酸序列為SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.6所示序列，氨基酸序列為SEQ ID N0.7至SEQIDN0.12所示序列。該組蛋白或多肽由三組不同活性位點(diǎn)的tumstatin (三組具有全長tumstatin45-98位、60-132位、60-98位的氨基酸序列)與CD137L (具有全長CD137L胞外區(qū)蛋白的50-240位氨基酸序列)分別通過Linker連接肽連接融合而成。其中Linker氨基酸序列為:GGGGSGGGGSGGGGS或AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA。以實(shí)施例1中構(gòu)建的含有目的基因的質(zhì)粒pPICZ a A為模板，擴(kuò)增得到目的基因。PCR反應(yīng)體系為:
模板 DNA: I u I IOXBuffer: 5 U I dNTP:4u I
上游引物: iyi 下游引物: iyi Taq:0.5 U I
ddH20:37.5 ill
Total:50 u I
SEQ ID N0.1 與 SEQ ID N0.4 上游引物為:5，-CCTGCAGGGTTTTTCTTTCTTATTTGTT-3’SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6 上游引物為:
5，-CCTGCAGCAAGATTTAGGTACTTTGGG-3，
6組菌株共同使用以下下游引物:
下游引物為:5’ -AAGCTTCACCCGGAAGAGTCCCAAGAC-3’
以上上游引物帶有Pst I酶切位點(diǎn)，下游引物帶有Hind III酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件:先95°C預(yù)變性2min，然后以94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin30s，反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行30次，最后于72°C再延伸lOmin。將PCR產(chǎn)物回收后，與pMD_18T載體連接。連接體系為:
目的片段:3iU PMD-18T: 2u I 溶液1: 5 ill Total: 10 u I
連接條件為16°C連接16h。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a中，在含有氨芐的LB培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)后挑取單克隆提取質(zhì)粒并測序，將測序正確的質(zhì)粒分別用Pst I及Hind III酶切，回收雙酶切產(chǎn)物，然后連接至穿梭表達(dá)載體pP43-tum-⑶137L中，再轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌中，篩選并得到陽性菌株。(2)具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-Q)137L4在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)純化
將以上篩選得到的陽性克隆菌在2XYT培養(yǎng)基(pH7.0)中37°C的條件下培養(yǎng)96h后提取發(fā)酵液上清成分。通過SDS-PAGE檢測目的蛋白表達(dá)情況，經(jīng)對(duì)照確定蛋白確已表達(dá)，如圖3所示，泳道I為陰性對(duì)照，泳道2、3箭頭所示即為目的蛋白表達(dá)情況，其他幾種重組蛋白表達(dá)同上，可為本領(lǐng)域普通技術(shù)實(shí)現(xiàn)。表達(dá)的蛋白經(jīng)western blot及質(zhì)譜分析鑒定確是目的蛋白。目的蛋白隨后分別經(jīng)硫酸沉淀、陰離子交換層析柱(DEAE-Sepharose)進(jìn)行純化得到純化。實(shí)施例3:具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4在大腸桿菌表達(dá)載體的表達(dá)及包涵體蛋白復(fù)性、純化
(I)具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4大腸桿菌表達(dá)載體中的構(gòu)建本發(fā)明共設(shè)計(jì)6種具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4表達(dá)載體,其核苷酸序列為SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.6所示序列，氨基酸序列為SEQ ID N0.7至SEQID N0.12所示序列。該組蛋白或多肽由三組不同活性位點(diǎn)的tumstatin(三組具有全長tumstatin45-98位、60-132位、60-98位的氨基酸序列)與CD137L (具有全長CD137L胞外區(qū)蛋白的50-240位氨基酸序列)分別通過Linker連接肽連接融合而成。其中Linker氨基酸序列為:GGGGSGGGGSGGGGS或AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA。以實(shí)施例1中構(gòu)建的含有目的基因的質(zhì)粒pPICZ a A為模板，擴(kuò)增得到目的基因。PCR反應(yīng)體系為:
模板 DNA: I μ I IOXBuffer: 5 μ I dNTP:4μ I
上游引物:1μl 下游引物:1μl Taq:0.5 μ I
ddH20: 37.5μ I Total: 50 μ I
SEQ ID N0.1 與 SEQ ID N0.4 上游引物為:5，-CCATATGGGTTTTTCTTTCTTATTTGTT-3，SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6 上游引物為:
5，-CCATATGCAAGATTTAGGTACTTTGGG-3，
6組菌株共同使用以下下游引物:
下游引物為:5’ -GCTAGCCACCCGGAAGAGTCCCAAGAC-3’
以上上游引物帶有Nde I酶切位點(diǎn)，下游引物帶有Nhe I酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件:先95°C預(yù)變性2min，然后以94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin30s，反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行30次，最后于72°C再延伸lOmin。將PCR產(chǎn)物回收后，與pMD_18T載體連接。連接體系為:
目的片段: 3μ1 PMD-18T: 2 μ I 溶液1: 5μ1 Total:10 μ I
連接條件為16°C連接16h。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a中，在含有氨芐的LB培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)后挑取單克隆提取質(zhì)粒并測序，將測序正確的質(zhì)粒分別用Nde I及Nhe I酶切，回收雙酶切產(chǎn)物，然后連接至表達(dá)載體pET-1 Ia的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。(2)具有 Tumstatin 活性的重組蛋白 Tumstatin_CD137L4 在大腸桿菌 BL21 (DE3)中的表達(dá)
無菌條件下，在50ML LB培養(yǎng)基(含有IOOii g/ml的氨芐青霉素)中接種上述BL21 (DE3)菌種，置于37°C，250rpm條件下培養(yǎng)過夜，作為活化菌種。將活化后的菌種轉(zhuǎn)接入適量新的LB培養(yǎng)基(含有IOOii g/ml的氨芐青霉素)中，轉(zhuǎn)接種量為1%轉(zhuǎn)接量，待OD值達(dá)到0.8-1.0時(shí)加入0.1mM的IPTG，37°C培養(yǎng)4h_5h后離心收菌。收菌完畢后按菌體濕重Ig加IOmlPBS吹懸，使用高壓細(xì)胞破碎儀破菌，收集破碎液，4°C，IOOOrpm離心50min，棄上清，留沉淀備做包涵體變性用。具體表達(dá)情況見圖4，其中A)圖為具有SEQ ID N0.7氨基酸序列蛋白表達(dá)狀況，泳道I為陰性對(duì)照，泳道2箭頭所示即為目的蛋白表達(dá)情況，B)圖為具有SEQ IDN0.8氨基酸序列蛋白表達(dá)狀況，泳道I為陰性對(duì)照，泳道2箭頭所示即為目的蛋白表達(dá)情況，C)圖為具有SEQ ID N0.9氨基酸序列蛋白表達(dá)狀況，泳道I為陰性對(duì)照，泳道2箭頭所不即為目的蛋白表達(dá)情況，D)圖為具有SEQ ID N0.10氣基酸序列蛋白表達(dá)狀況,泳道I為陰性對(duì)照，泳道2箭頭所示即為目的蛋白表達(dá)情況，E)圖為具有SEQ ID N0.11氨基酸序列蛋白表達(dá)狀況，泳道I為陰性對(duì)照，泳道2箭頭所示即為目的蛋白表達(dá)情況，F(xiàn))圖為具有SEQID N0.12氨基酸序列蛋白表達(dá)狀況，泳道2為陰性對(duì)照，泳道5箭頭所示即為目的蛋白表達(dá)情況。由圖可見以上所述蛋白均已在大腸桿菌BL21 (DE3)中表達(dá)。表達(dá)的蛋白經(jīng)westernblot及質(zhì)譜分析鑒定確是目的蛋白。(3)具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-Q)137L4的變性溶解 將上述離心后的沉淀分別用以下兩種溶液各洗滌兩次:
溶液 A:50mM Tris-HCl, 5mMEDTA, 0.5M NaCl pH8.5溶液 B:20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 2M 尿素，2%Triton pH8.5將以上溶液洗滌之后 ，IOOOOrpm, 40min離心，棄上清留沉淀，將沉淀于以下溶液中50°C過夜溶解，變性液:20mM Tris-HCl,0.5M NaCl，8M尿素pH8.5。過夜溶解后于13000rpm，離心20min，取上清，進(jìn)行SDS-PAGE檢測包涵體蛋白變性情況。包涵體蛋白變性具體情況見圖5-圖7。由圖可見以上所述包涵體蛋白變性溶解情況良好，且變性蛋白純度較純，可以進(jìn)行包涵體復(fù)性研究。(4)具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-Q)137L4包涵體復(fù)性 本發(fā)明中所涉及的蛋白包涵體復(fù)性方法均采用稀釋復(fù)性進(jìn)行，稀釋復(fù)性液為:
20mM Tris-HCl, 0.4M L-精氨酸，3mM還原型谷胱甘肽，0.9mM氧化型谷胱甘肽，ImMEDTA, 2M 尿素，pH8.5
將變性后蛋白取約15 U I每隔30秒加入約200ml復(fù)性液中，并在冰浴條件下使用磁力攪拌器適當(dāng)攪拌復(fù)性液，待加入合適量的變性蛋白后，冰浴條件下攪拌過夜。16h后于4°C，4100rpm,離心濃縮蛋白。濃縮后將其置換入細(xì)胞培養(yǎng)PBS中，4°C保存，備活性鑒定用。變性后復(fù)性蛋白具體復(fù)性情況見圖5-圖7。圖5中泳道1、泳道2、泳道3為包涵體在包涵體溶解液中溶解情況，泳道4、泳道5、泳道6為變性蛋白在復(fù)性液中復(fù)性情況。泳道1、泳道4包含SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列，泳道2、泳道5包含SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列，泳道3、泳道6包含SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列，泳道M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；圖6中其中泳道1、泳道2為包涵體在包涵體溶解液中溶解情況，泳道3、泳道4為變性蛋白在復(fù)性液中復(fù)性情況。泳道1、泳道3包含SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列，泳道2、泳道4包含SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列，泳道M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；圖7中泳道I為包涵體在包涵體溶解液中溶解情況，泳道2為變性蛋白在復(fù)性液中復(fù)性情況。泳道1、泳道2包含SEQID N0.11所示的氨基酸序列，泳道M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量。由圖可見以上所述變性包涵體蛋白復(fù)性情況良好。包涵體復(fù)性后的蛋白純度約在90%_98%之間，可進(jìn)行下一步研究。實(shí)施例4:氨基酸序列如SEQ ID N0.7至SEQ ID N0.12所示的具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響
人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC細(xì)胞)用含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素及100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。接下來使用MTT比色法測定實(shí)施例1-3所述方法制得的氨基酸序列如SEQ IDN0.7 至 SEQ ID N0.12 所示的具有 Tumstatin 活性的重組蛋白 Tumstatin_CD137L4 對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔約5000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液100 μ 1，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)(約12h)，待細(xì)胞貼壁后加入100 μ I不同濃度的重組蛋白，使其終濃度為:10 μ g/ml,20 μ g/ml陽性對(duì)照為TNP-470，負(fù)對(duì)照組加入相同體積的PBS，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別處理48h。培養(yǎng)結(jié)束后4h于96孔培養(yǎng)板中加入5g/L的MTT液20 μ 1，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后輕輕吸去培養(yǎng)基，然后每孔加入DMS0150l.! 1，震蕩IOmin使藍(lán)紫色沉淀充分溶解，于酶標(biāo)儀490nm下測定吸光值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)表明如圖8所示，表達(dá)的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4能很好的抑制HUVEC細(xì)胞增殖，且不同菌株之間有一定差異。實(shí)施例6:氨基酸序列如SEQ ID N0.X至SEQ ID N0.X所示的具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4對(duì)小鼠外`周血T細(xì)胞增殖的影響
1.包被平板
5 μ g/mL抗⑶3抗體(或與不同濃度人重組tumstatin-⑶137L4蛋白)包被96孔板，50 μ L/ 孔，4°C過夜。2.分離小鼠脾淋巴細(xì)胞
(1)將6 8周清潔級(jí)BALB/c小鼠頸椎脫臼處死后，浸泡于75%酒精中5min；
(2)將小鼠固定于解剖板上，無菌打開腹部的皮膚，暴露腹膜，用眼科剪剪開腹膜，小心取出脾臟，置于盛有IOmL PBS的無菌平皿中；
(3)將脾臟置于200目細(xì)胞篩上剪碎，使用玻璃注射器針芯適度研磨過濾；
(4)收集細(xì)胞懸液再緩慢過濾一次200目尼龍網(wǎng)，將濾液轉(zhuǎn)移至離心管中，IOOOrpmlOmin 收集細(xì)胞；
(5)將細(xì)胞沉淀重懸于IOmLPBS中，洗滌I次，IOOOrpmlOmin ；
(6)用4mL含2%FBS的PBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整至IO8個(gè)/mL。3.富集小鼠T淋巴細(xì)胞
(I)取2mL細(xì)胞懸液至離心管中，加10(^1^小鼠血清，10(^1^&5>&口 Mouse T CellEnrichment Cocktail,混勻，4。。15min ；(2)加200iiL EasySep Biotin Selection Cocktail，混勻，4°C 15min ；
(3)將EasySep Magnetic Nanoparticles 吹懸數(shù)次，取 100 u L,混勻，4°C 15min ；
(4)將上述離心管置于磁鐵中，靜置5min；
(5)傾斜離心管，將細(xì)胞懸液一次性倒出；
(6)將所得細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋至IO6個(gè)/mL，100u L/孔鋪板。4.刺激T細(xì)胞增殖
加入終濃度為2 u g/mL的抗⑶28抗體(或與不同濃度⑶137L蛋白)，37°C培養(yǎng)箱孵育140h后加IOiiL AlamarBlue/孔，4h后測定A570和A600。根據(jù)如下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率:
(117216 X A570) — (80586XA600)
細(xì)胞增殖率二 (117216XP570)-( 80586XP600)
其中:A570和A600為不同濃度tumstatin-CD137L4蛋白或等量體積Buffer聯(lián)合抗⑶3和⑶28單克隆抗體刺激組在570nm和600nm下的吸光度；P570和P600分別為抗⑶3和CD28抗體聯(lián)合刺激組(CD3+CD28)在570nm和600nm下的吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，表明本發(fā)明重組蛋白Tumstatin-⑶137L4能有效輔助抗⑶3抗體刺激T細(xì)胞增殖，因而可以增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方法，是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方法對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能因此理解為本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。除此之夕卜，實(shí)施例僅選取了不同活性位點(diǎn)的tumstatin基因與⑶137L胞外區(qū)相連接，不能理解為本發(fā)明中的tumstatin基因只與CD137L胞外區(qū)相連接，其也能夠與其他蛋白或多肽相連接，或者不與其他蛋白基因相連接。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，對(duì)實(shí)施例做出的若干簡單推演或替換，都應(yīng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-Q)137L4,其特征在于該蛋白具有tumstatin活性片段氨基酸序列和具有⑶137L胞外區(qū)氨基酸序列,所述tumstatin活性片段氨基酸序列和⑶137L胞外區(qū)氨基酸序列通過連接肽氨基酸序列相連接，所述tumstatin活性片段氨基酸序列選自SEQ ID N0.13至SEQ ID N0.15所示的氨基酸序列中的一種，所述CD137L胞外區(qū)氨基酸序列如SEQ ID N0.16所示。
2.如權(quán)利要求1所述的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4,其特征在于所述連接肽氨基酸序列選自 SEQ ID N0.17 或 SEQ ID N0.18。
3.如權(quán)利要求2所述的重組蛋白Tumstatin-CD137L4，其特征在于具有SEQID N0.7至SEQ ID N0.12所述的氨基酸序列。
4.編碼如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的Tumstatin活性的重組蛋白基因，其特征在于包括編碼tumstatin活性片段的基因和編碼⑶137L胞外區(qū)的基因，其中所述包括編碼tumstatin活性片段的基因選自SEQ ID N0.19-SEQ ID N0.21中的一種，所述編碼CD137L胞外區(qū)的基因選自SEQ ID N0.22。
5.如權(quán)利要求4所述的重組蛋白基因，其特征在于還包括編碼連接肽的基因，選自SEQID N0.23 或 SEQ ID N0.24。
6.如權(quán)利要求5所述的重組蛋白基因，其特征在于具有SEQID N0.1至SEQ ID N0.6之一的核苷酸序列。
7.一種編碼重組蛋白Tumstatin-⑶137L4的基因，其特征在于與權(quán)利要求4_6任一項(xiàng)所述的核苷酸序列相比具有70%及以上的同源性。
8.—種如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶13 7L4的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)設(shè)計(jì)得到如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的核苷酸序列； (2)構(gòu)建含如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的核苷酸序列表達(dá)系統(tǒng),包括構(gòu)建表達(dá)載體并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，形成可表達(dá)如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4的重組細(xì)胞； (3)培養(yǎng)以上含有4-6任一項(xiàng)所述的核苷酸序列表達(dá)系統(tǒng)的重組細(xì)胞，使其表達(dá)目的蛋白； (4)分離純化得到如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-CDI37L4o
9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于所述表達(dá)系統(tǒng)為原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)，所述原核表達(dá)系統(tǒng)選自大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)或芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)；所述真核表達(dá)系統(tǒng)選自酵母表達(dá)系統(tǒng)。
10.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4在制備血管生成抑制劑、各種腫瘤相關(guān)疾病、視網(wǎng)膜病變、細(xì)胞增殖、機(jī)體細(xì)胞因子合成與分泌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力藥物中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L4基因在制備血管生成抑制劑、各種腫瘤相關(guān)疾病、視網(wǎng)膜病變、細(xì)胞增殖、機(jī)體細(xì)胞因子合成與分泌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組具有Tumstatin活性的重組蛋白Tumstatin-CD137L4及其制備方法以及相關(guān)基因和應(yīng)用。該組蛋白具有tumstatin活性片段氨基酸序列和具有CD137L胞外區(qū)氨基酸序列，tumstatin活性片段氨基酸序列選自SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列中的一種，CD137L胞外區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。該重組蛋白兼有抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和協(xié)同刺激T細(xì)胞增殖的活性，可用于制備血管生成抑制劑、各種腫瘤相關(guān)疾病、視網(wǎng)膜病變、細(xì)胞增殖、機(jī)體細(xì)胞因子合成與分泌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等藥物。
文檔編號(hào)A61P9/00GK103232543SQ20131016340
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月6日
發(fā)明者王淑珍, 高振月, 何東洋, 陳依軍 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)