專(zhuān)利名稱(chēng)：特非那定在制備斑馬魚(yú)心功能損傷模型中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特非那定在制備斑馬魚(yú)心功能損傷模型中的應(yīng)用，特別涉及利用特非那定制備斑馬魚(yú)心功能損傷模型，用于篩選心臟保護(hù)作用藥物中的應(yīng)用，屬于藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心功能損傷是各種心臟腔室結(jié)構(gòu)改變或心肌受損所導(dǎo)致心臟功能進(jìn)行性障礙綜合征。臨床表現(xiàn)為心臟擴(kuò)大、心律失常及心力衰竭等。心功能損傷是心臟整體機(jī)能異常的綜合反映。病毒感染、自身免疫反應(yīng)、遺傳、藥物中毒和代謝異常等都可以引起心功能損傷。開(kāi)發(fā)具有防止、延緩心功能損傷的發(fā)生和/或緩解臨床心功能損傷癥狀作用的藥物，將會(huì)帶來(lái)顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。藥物篩選是 發(fā)現(xiàn)、開(kāi)發(fā)藥物過(guò)程中的一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心功能損傷模型的建立對(duì)評(píng)價(jià)和篩選心功能損傷預(yù)防/治療藥物至關(guān)重要。目前，心功能損傷動(dòng)物模型以嚙齒類(lèi)為主的哺乳動(dòng)物體內(nèi)評(píng)價(jià)模型，大多采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)，建立大鼠心功能損傷動(dòng)物模型。哺乳動(dòng)物體內(nèi)評(píng)價(jià)模型可從整體水平直觀地反映藥物的心臟保護(hù)作用，但不適合新藥研發(fā)早期藥物毒性的高通量篩選。由于哺乳類(lèi)動(dòng)物模型建模方法的局限性，越來(lái)越多的研究人員使用斑馬魚(yú)進(jìn)行藥物心功能損傷的評(píng)價(jià)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，利用斑馬魚(yú)模型進(jìn)行化合物心功能損傷評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，斑馬魚(yú)與哺乳動(dòng)物的心臟對(duì)藥物的反應(yīng)非常相似[Sukardi H, Chng HT, ChanEYj Gong Zj Lam SH.Zebrafish for drug toxicity screening:bridging the in vitrocell—based models and in vivo mammalian models.Expert Opin.Drug Metab.Toxicol.2011，7 (5): 579-589.]。斑馬魚(yú)個(gè)體小，成魚(yú)體長(zhǎng)3_4厘米，樣品用量少；斑馬魚(yú)基因組與人類(lèi)基因組同源性達(dá)到85%左右；易于養(yǎng)殖，養(yǎng)殖成本低；體外發(fā)育，胚胎透明，胚胎發(fā)育快，受精后48小時(shí)，心臟就已經(jīng)發(fā)育成熟；產(chǎn)卵量大，每對(duì)親魚(yú)每周可產(chǎn)200-300個(gè)卵，利于大規(guī)模的檢測(cè)。斑馬魚(yú)的心臟包含心房、心室和靜脈竇，心電圖譜也與哺乳動(dòng)物類(lèi)似，這說(shuō)明利用斑馬魚(yú)建立心功能損傷模型切實(shí)可行。然而，目前將斑馬魚(yú)用來(lái)心功能損傷評(píng)價(jià)都是基于正常的斑馬魚(yú)。方芳等[方芳，趙杰，余林中，羅佳波。烏頭堿對(duì)斑馬魚(yú)心臟毒性的初步研究。中藥藥理與臨床，2012，28
(2):31-33.]觀察了烏頭堿對(duì)斑馬魚(yú)心臟的影響，王思鋒等[王思鋒，劉可春，王希敏，何秋霞，韓利文，侯海榮。雷公藤紅素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心臟毒性的初步研究。中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009,25 (5):634-636。]研究了雷公藤紅素對(duì)斑馬魚(yú)心臟的損傷作用。他們都是以正常發(fā)育的2天的斑馬魚(yú)為模型，觀察斑馬魚(yú)心臟形態(tài)和心率的變化。該方法的優(yōu)勢(shì)是根據(jù)斑馬魚(yú)心臟形態(tài)和心率的變化能夠直接快速的發(fā)現(xiàn)化合物潛在的致心臟功能受損特性。但是在藥物篩選過(guò)程中，致心功能受損特性大多屬于副作用，要盡可能避免。因此，心功能損傷模型在藥物篩選領(lǐng)域應(yīng)用對(duì)于篩選具有保護(hù)心臟作用的藥物可能更有意義。然而感到遺憾的是，在斑馬魚(yú)這個(gè)新生模式生物上尚未建立一個(gè)穩(wěn)定并被認(rèn)可的心功能損傷模型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一是提供特非那定在制備斑馬魚(yú)心功能損傷模型中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之二是利用建立的斑馬魚(yú)心功能損傷模型，篩選、定性或定量評(píng)價(jià)用于保護(hù)心臟的藥物的方法。特非那定在制備斑馬魚(yú)心功能損傷模型中的應(yīng)用。上述應(yīng)用，步驟如下:將受精后2 3天的發(fā)育正常的斑馬魚(yú)置于含有特非那定濃度為5 20 y mol噸―1的養(yǎng)殖用水溶液中，28°C下恒溫培養(yǎng)24 48小時(shí)，制得斑馬魚(yú)心功能損傷模型。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的養(yǎng)殖用水溶液是向養(yǎng)殖用水中加入二甲基亞砜配制的體積濃度不大于0.5%的溶液。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，特非那定濃度為Wmol L'利用上述制備斑馬魚(yú)心功能損傷模 型篩選用于保護(hù)心臟的藥物的方法，步驟如下:(I)將受精后2 3天的發(fā)育正常的斑馬魚(yú)置于含有特非那定濃度為5 20 u mol L—1的養(yǎng)殖用水溶液中，28°C下恒溫培養(yǎng)4 24小時(shí)后，加入待測(cè)化合物，使待測(cè)化合物濃度為0.1 1000 u mol L—1，繼續(xù)培養(yǎng)20 24小時(shí)，得到給藥斑馬魚(yú)；或者，將受精后2 3天的發(fā)育正常的斑馬魚(yú)置于含有特非那定濃度為5 20 u mol L'待測(cè)化合物濃度為0.1 IOOOiimol L—1的養(yǎng)殖用水溶液中，28°C下恒溫培養(yǎng)24 48小時(shí)，得到給藥斑馬魚(yú)；(2)將步驟(I)制得的給藥斑馬魚(yú)用質(zhì)量濃度為0.3%。的三卡因麻醉，然后用3%甲基纖維素固定于載玻片上，在顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)心臟形態(tài)，或者，顯微鏡下觀察記錄斑馬魚(yú)心率和測(cè)量動(dòng)脈球-靜脈竇距離；(3)取斑馬魚(yú)心功能損傷模型，用質(zhì)量濃度為0.3%。的三卡因麻醉，然后用3%甲基纖維素固定于載玻片上，在顯微鏡下觀察模型斑馬魚(yú)心臟形態(tài)，或者，顯微鏡下觀察記錄模型斑馬魚(yú)心率和測(cè)量動(dòng)脈球-靜脈竇距離；(4)將步驟(2)得到的斑馬魚(yú)心臟形態(tài)與步驟(3)得到的模型斑馬魚(yú)心臟形態(tài)進(jìn)行比較；待測(cè)化合物組的斑馬魚(yú)心臟水腫面積和血細(xì)胞淤積面積與心臟損傷模型組的心臟水腫面積和血細(xì)胞淤積面積相比減少20%以上或者與溶劑對(duì)照組/空白對(duì)照組的心臟水腫面積和血細(xì)胞淤積面積相當(dāng)，則待測(cè)化合物具有心臟保護(hù)作用；或者，將步驟(2)得到的斑馬魚(yú)心率和測(cè)量動(dòng)脈球-靜脈竇距離長(zhǎng)度數(shù)據(jù)與步驟
(3)得到的模型斑馬魚(yú)心率和測(cè)量動(dòng)脈球-靜脈竇距離長(zhǎng)度進(jìn)行比較；經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后，化合物處理組的心率與心臟損傷模型組的心率相比升高且滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)上的p值< 0.05，動(dòng)脈球-靜脈竇距離縮短且滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)上的P值< 0.05，則待測(cè)化合物具有心臟保護(hù)作用。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中特非那定濃度為5 y mol L'根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中養(yǎng)殖用水溶液是向養(yǎng)殖用水中加入二甲基亞砜配制的體積濃度不大于0.5%的溶液。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)或步驟(3)中，顯微鏡下觀察的溫度為25°C。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)或步驟(3)中，心臟形態(tài)為心包水腫形態(tài)和心臟出血形態(tài)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)或步驟(3)中，測(cè)量動(dòng)脈球-靜脈竇距離的方法如下，使待測(cè)量斑馬魚(yú)胚胎呈側(cè)臥狀態(tài)，使兩側(cè)眼、體節(jié)重合，尾部與身體處于同一水平面，通過(guò)體視顯微鏡的目鏡中的測(cè)微尺測(cè)量動(dòng)脈球與靜脈竇之間的距離。
上述養(yǎng)殖用水為本領(lǐng)域常用斑馬魚(yú)養(yǎng)殖用水,養(yǎng)殖用水中含有:摩爾濃度為5mM的NaCl、摩爾濃度為0.17mM的KC1、摩爾濃度為0.33mM的CaCl2、摩爾濃度為0.33mM的Mg2SO4,以及質(zhì)量百分濃度為10_5%的甲基藍(lán)，去離子水配制而成。有益效果1、本發(fā)明首次利用特非那定建立斑馬魚(yú)心功能損傷模型，建立的斑馬魚(yú)心功能損傷模型具有制作簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定可靠和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，降低了心功能損傷模型的制作成本，提高了實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的可靠性。2、本發(fā)明提供利用斑馬魚(yú)心功能損傷模型篩選具有心功能損傷保護(hù)作用藥物的方法，該方法通過(guò)觀察斑馬魚(yú)心臟形態(tài)實(shí)現(xiàn)了定性分析，通過(guò)記錄斑馬魚(yú)心率和測(cè)量動(dòng)脈球-靜脈竇距離進(jìn)行定量分析。


圖1:特非那定對(duì)斑馬魚(yú)心功能損傷的形態(tài)學(xué)照片其中:A、空白對(duì)照組，B、溶劑對(duì)照組，C、I μ mol.Γ1的特非那定處理組，D、5 μ mol.L-1的特非那定處理組，E、10 μ mol.L-1的特非那定處理組，F(xiàn)、15 μ mol.L-1的特非那定處理組，G、20 μ mol.Γ1的特非那定處理組；圖2:尼卡地爾對(duì)特非那定引起斑馬魚(yú)心功能損傷的修復(fù)作用形態(tài)學(xué)照片。 其中:Α、空白對(duì)照組，B、溶劑對(duì)照組，C、5 μ mol.Γ1的特非那定處理組，D、5 μ mol.L—1的特非那定+1 μ mol.L—1尼卡地爾處理組，Ε、5 μ mol.L—1的特非那定+10 μ mol.L—1尼卡地爾處理組，F(xiàn)、5 μ mol.L—1的特非那定+100 μ mol.L—1尼卡地爾處理組；圖3:卡維地洛對(duì)特非那定引起斑馬魚(yú)心功能損傷的預(yù)防作用形態(tài)學(xué)照片。其中:A、空白對(duì)照組，B、溶劑對(duì)照組，C、5 μ mol.Γ1的特非那定處理組，D、5 μ mol.L—1的特非那定+1 μ mol.L—1卡維地洛處理組，Ε、5 μ mol.L—1的特非那定+10 μ mol.Γ1卡維地洛處理組，F(xiàn)、5 μ mol.Γ1的特非那定+100 μ mol.Γ1卡維地洛處理組。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)驗(yàn)材料養(yǎng)殖用水(EmbryoMedium)養(yǎng)殖用水配方如表I所示表1.養(yǎng)殖用水的配方
權(quán)利要求
1.特非那定在制備斑馬魚(yú)心功能損傷模型中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下: 將受精后2 3天的發(fā)育正常的斑馬魚(yú)置于含有特非那定濃度為5 20 μ mo 1-Γ1的養(yǎng)殖用水溶液中，28°C下恒溫培養(yǎng)24 48小時(shí)，制得斑馬魚(yú)心功能損傷模型。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的養(yǎng)殖用水溶液是向養(yǎng)殖用水中加入二甲基亞砜配制的體積濃度不大于0.5%的溶液。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，特非那定濃度為δμπιο .ΙΑ
5.利用斑馬魚(yú)心功能損傷模型篩選用于保護(hù)心臟的藥物的方法，其特征在于，步驟如下: (1)將受精后2 3天的發(fā)育正常的斑馬魚(yú)置于含有特非那定濃度為5 20μ mo 1-Γ1的養(yǎng)殖用水溶液中 ，28°C下恒溫培養(yǎng)4 24小時(shí)后，加入待測(cè)化合物，使待測(cè)化合物濃度為0.1 1000 μ mo I.ιΛ繼續(xù)培養(yǎng)20 24小時(shí)，得到給藥斑馬魚(yú)； 或者，將受精后2 3天的發(fā)育正常的斑馬魚(yú)置于含有特非那定濃度為5 20 μ mo I.L'待測(cè)化合物濃度為0.1 IOOOymol.Γ1的養(yǎng)殖用水溶液中，28°C下恒溫培養(yǎng)24 48小時(shí)，得到給藥斑馬魚(yú)； (2)將步驟(I)制得的給藥斑馬魚(yú)用質(zhì)量濃度為0.3%。的三卡因麻醉，然后用3%甲基纖維素固定于載玻片上，在顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)心臟形態(tài)，或者，顯微鏡下觀察記錄斑馬魚(yú)心率和測(cè)量動(dòng)脈球-靜脈竇距離； (3)取斑馬魚(yú)心功能損傷模型，用質(zhì)量濃度為0.3%。的三卡因麻醉，然后用3%甲基纖維素固定于載玻片上，在顯微鏡下觀察模型斑馬魚(yú)心臟形態(tài)，或者，顯微鏡下觀察記錄模型斑馬魚(yú)心率和測(cè)量動(dòng)脈球-靜脈竇距離； (4)將步驟(2)得到的斑馬魚(yú)心臟形態(tài)與步驟(3)得到的模型斑馬魚(yú)心臟形態(tài)進(jìn)行比較；待測(cè)化合物組的斑馬魚(yú)心臟水腫面積和血細(xì)胞淤積面積與心臟損傷模型組的心臟水腫面積和血細(xì)胞淤積面積相比減少20%以上或者與溶劑對(duì)照組/空白對(duì)照組的心臟水腫面積和血細(xì)胞淤積面積相當(dāng)，則待測(cè)化合物具有心臟保護(hù)作用； 或者，將步驟(2)得到的斑馬魚(yú)心率和測(cè)量動(dòng)脈球-靜脈竇距離長(zhǎng)度數(shù)據(jù)與步驟(3)得到的模型斑馬魚(yú)心率和測(cè)量動(dòng)脈球-靜脈竇距離長(zhǎng)度進(jìn)行比較；經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后，化合物處理組的心率與心臟損傷模型組的心率相比升高且滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)上的P值< 0.05，動(dòng)脈球-靜脈竇距離縮短且滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)上的P值< 0.05，則待測(cè)化合物具有心臟保護(hù)作用。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中特非那定濃度為5 μ mo I.L 1。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中養(yǎng)殖用水溶液是向養(yǎng)殖用水中加入二甲基亞砜配制的體積濃度不大于0.5%的溶液。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)或步驟(3)中，顯微鏡下觀察的溫度為25°C。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)或步驟(3)中，心臟形態(tài)為心包水腫形態(tài)和心臟出血形態(tài)。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)或步驟(3)中，測(cè)量動(dòng)脈球-靜脈竇距離的方法如下，使待測(cè)量斑馬魚(yú)胚胎呈側(cè)臥狀態(tài)，使兩側(cè)眼、體節(jié)重合，尾部與身體處于同一水平面， 通過(guò)體視顯微鏡的目鏡中的測(cè)微尺測(cè)量動(dòng)脈球與靜脈竇之間的距離。
全文摘要
本發(fā)明涉及特非那定在制備斑馬魚(yú)心功能損傷模型中的應(yīng)用，步驟如下將受精后2～3天的發(fā)育正常的斑馬魚(yú)置于含有特非那定的養(yǎng)殖用水溶液中，28℃下恒溫培養(yǎng)24～48小時(shí)，制得斑馬魚(yú)心功能損傷模型。本發(fā)明首次利用特非那定建立斑馬魚(yú)心功能損傷模型，建立的斑馬魚(yú)心功能損傷模型具有制作簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定可靠和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，降低了心功能損傷模型的制作成本，提高了實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的可靠性。
文檔編號(hào)A61K31/445GK103230397SQ20131016343
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月6日
發(fā)明者何秋霞, 劉可春, 韓利文, 彭維兵, 陳錫強(qiáng), 張?jiān)? 王雪, 侯海榮, 王希敏, 楚杰 申請(qǐng)人:山東省科學(xué)院生物研究所