斑馬魚造血干細(xì)胞缺陷模型的建立及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及斑馬魚造血干細(xì)胞缺陷模型的建立及應(yīng)用。首次分別通過化學(xué)誘導(dǎo)和morpholino敲除兩種途徑獲得了斑馬魚造血干細(xì)胞缺陷模型，其可作為篩藥模型，應(yīng)用于篩選可改善造血干細(xì)胞缺陷的藥物。本發(fā)明的方法操作方便，成本低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠準(zhǔn)確。
【專利說明】斑馬魚造血干細(xì)胞缺陷模型的建立及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，本發(fā)明涉及一種CCCTC結(jié)合因子基因功能 缺失斑馬魚在造血缺陷方面的研究模型建立及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 斑馬魚作為一個(gè)脊椎動(dòng)物造血模型，既優(yōu)于其它的動(dòng)物模型，又與哺乳類造血具 有高度保守性。斑馬魚造血系統(tǒng)的發(fā)生分為兩波，原始造血和定向造血。原始造血產(chǎn)生一 過性細(xì)胞群，主要是紅細(xì)胞和一些髓系細(xì)胞，而定向造血產(chǎn)生能自我更新的造血干細(xì)胞，這 些細(xì)胞生成所有造血系，包括淋巴細(xì)胞。在斑馬魚中，原始造血起源于兩個(gè)胚外造血位點(diǎn)， 前部側(cè)板中胚層和尾部側(cè)板中胚層，繼而形成中間細(xì)胞團(tuán)。前部側(cè)板中胚層是原始巨噬細(xì) 胞的初始位點(diǎn)，中間細(xì)胞團(tuán)是多潛力血液祖細(xì)胞產(chǎn)生位點(diǎn)，主要產(chǎn)生紅細(xì)胞和一些粒細(xì)胞。 24hpf (受精后時(shí)間（小時(shí)））循環(huán)開始后，一過性的紅髓祖細(xì)胞在后部血島形成。定向造血 出現(xiàn)于30hpf，這時(shí)造血干細(xì)胞在背部動(dòng)脈內(nèi)壁形成，這是一個(gè)類似于哺乳動(dòng)物大血管-性 腺-中腎的區(qū)域。隨后干細(xì)胞遷移至尾部造血組織，從那里移于腎臟和胸腺。造血干細(xì)胞 是唯一能產(chǎn)生髓紅血小板和淋系的細(xì)胞，被認(rèn)為維持成體造血，在成魚的腎髓中。
[0003] CTCF(CCCTC-binding factor，CCCTC結(jié)合因子）是廣泛存在于真核生物的多功能 轉(zhuǎn)錄因子。其N端11個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)可以形成不同的組合，使CTCF調(diào)控多種靶基因的表達(dá)?；?于它的能力是結(jié)合大范圍的不同序列，與特異的共調(diào)節(jié)蛋白通過不同鋅指組合，ctcf起初 被描述為多價(jià)因子。這一特異的結(jié)構(gòu)提供了第一個(gè)線索，暗示其區(qū)別于大部分鋅指在基因 組調(diào)節(jié)中的功能。一系列的證據(jù)表明了 ctcf在不同細(xì)胞過程的關(guān)鍵作用。Ctcf純合敲除 小鼠展現(xiàn)了早期胚胎著床前致死表型。母源性敲除卵母細(xì)胞中ctcf明顯破壞了正常的進(jìn) 行囊胚階段。目前的研究譜系繪制了基因組范圍的占據(jù)，分布譜式在多細(xì)胞類型，進(jìn)一步強(qiáng) 化了概念，即細(xì)胞下游的影響是ctcf在基因組調(diào)控的結(jié)果。使用chip-seq，在人⑶4+T細(xì) 胞中發(fā)現(xiàn)了 20, 262個(gè)ctcf潛在的基因結(jié)合位點(diǎn)。然而，其對造血的影響還需要較好的模 型研究予以闡明并應(yīng)用于醫(yī)藥研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供斑馬魚造血干細(xì)胞缺陷模型的建立及應(yīng)用。
[0005] 在本發(fā)明的第一方面，提供CCCTC結(jié)合因子下調(diào)劑的用途，用于制備構(gòu)建斑馬魚 造血干細(xì)胞缺陷模型的試劑。
[0006] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的CCCTC結(jié)合因子下調(diào)劑是核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 示的寡核苷酸。
[0007] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種CCCTC結(jié)合因子下調(diào)劑，其是核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的寡核苷酸。
[0008] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備斑馬魚造血干細(xì)胞缺陷模型的方法，所述方 法包括：在斑馬魚中下調(diào)CCCTC結(jié)合因子的表達(dá)（包括使之不表達(dá)），從而獲得斑馬魚造血 干細(xì)胞缺陷模型；較佳地，通過化學(xué)誘變、基因定點(diǎn)突變及morpholine敲除下調(diào)CCCTC結(jié)合 因子的表達(dá)。
[0009] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的制備斑馬魚造血干細(xì)胞缺陷模型的方法中，應(yīng)用所述的 CCCTC結(jié)合因子下調(diào)劑來制備斑馬魚造血干細(xì)胞缺陷模型。
[0010] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種斑馬魚模型，其中CCCTC結(jié)合因子不表達(dá)或低表 達(dá)；如表達(dá)量僅為野生型正常斑馬魚的20%或更低。
[0011] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選治療造血干細(xì)胞缺陷疾病的潛在藥物的方 法，所述方法包括：
[0012] (1)提供斑馬魚CCCTC結(jié)合因子突變型（純合體）胚胎；
[0013] ⑵按照受精后時(shí)間計(jì)算，從受精后5±0. 5小時(shí)起，用候選藥物處理⑴的胚胎；
[0014] (3)藥物處理后（較佳地為處理24-48小時(shí)后），檢測斑馬魚胚胎中runxl和/或 cmyb的表達(dá)和定位；
[0015] 其中，若runxl和/或cmyb表達(dá)顯著提高（如提高20% ;更佳地提高40% ;更佳地 提高60%)，則所述的候選藥物是治療造血干細(xì)胞缺陷疾病的潛在藥物。
[0016] 在一個(gè)優(yōu)選例中，應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測runxl和/或cmyb的表達(dá)和定位。
[0017] 在另一優(yōu)選兩種，所述的篩選方法中，步驟（2)包括：在測試組中，從受精后 5±0. 5小時(shí)起，用候選藥物處理（1)的胚胎；和/或
[0018] 步驟⑶包括：檢測斑馬魚胚胎中runxl和/或cmyb的表達(dá)和定位，并與對照組 比較，其中所述的對照組是不用所述候選藥物處理的、同步發(fā)育的斑馬魚CCCTC結(jié)合因子 突變型（純合體）胚胎；
[0019] 若與對照組相比，測試組runxl和/或cmyb表達(dá)顯著提高（如提高20% ;更佳地 提高40% ;更佳地提高60%或更高），則所述的候選藥物是治療造血干細(xì)胞缺陷疾病的潛在 藥物。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述對照組僅包括候選藥物的溶劑；較佳地，所述的溶劑是 DMSO。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的篩選方法還包括：對獲得的潛在藥物進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選藥物中進(jìn)一步選擇和確定對于治療造血干細(xì)胞缺陷疾病有 用的物質(zhì)。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的篩選方法中，所述的候選藥物包括（但不限于）：小分子 化合物、肽。
[0023] 在本發(fā)明的另一方面，提供化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療造血干細(xì)胞 缺陷疾病的藥物組合物中的用途，所述化合物選自：
[0024]

【權(quán)利要求】
1. CCCTC結(jié)合因子下調(diào)劑的用途，用于制備構(gòu)建斑馬魚造血干細(xì)胞缺陷模型的試劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CCCTC結(jié)合因子下調(diào)劑是核苷酸序列 如SEQ ID NO: 1所示的寡核苷酸。
3. -種CCCTC結(jié)合因子下調(diào)劑，其特征在于，其是核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的寡 核苷酸。
4. 一種制備斑馬魚造血干細(xì)胞缺陷模型的方法，其特征在于，所述方法包括：在斑馬 魚中下調(diào)CCCTC結(jié)合因子的表達(dá)，從而獲得斑馬魚造血干細(xì)胞缺陷模型；較佳地，通過化學(xué) 誘變、基因定點(diǎn)突變及morpholine敲除下調(diào)CCCTC結(jié)合因子的表達(dá)。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，應(yīng)用權(quán)利要求3所述的CCCTC結(jié)合因子下調(diào) 劑來制備斑馬魚造血干細(xì)胞缺陷模型。
6. -種篩選治療造血干細(xì)胞缺陷疾病的潛在藥物的方法，其特征在于，所述方法包 括： (1) 提供斑馬魚CCCTC結(jié)合因子突變型胚胎； (2) 按照受精后時(shí)間計(jì)算，從受精后5±0. 5小時(shí)起，用候選藥物處理（1)的胚胎； (3) 藥物處理后，檢測斑馬魚胚胎中runxl和/或cmyb的表達(dá)和定位； 其中，若runxl和/或cmyb表達(dá)顯著提高,則所述的候選藥物是治療造血干細(xì)胞缺陷 疾病的潛在藥物。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（2)包括：在測試組中，從受精后 5±0. 5小時(shí)起，用候選藥物處理（1)的胚胎；和/或 步驟（3)包括：檢測斑馬魚胚胎中runxl和/或cmyb的表達(dá)和定位，并與對照組比較， 其中所述的對照組是不用所述候選藥物處理的、同步發(fā)育的斑馬魚CCCTC結(jié)合因子突變型 胚胎； 若與對照組相比，測試組runxl和/或cmyb表達(dá)顯著提高，則所述的候選藥物是治療 造血干細(xì)胞缺陷疾病的潛在藥物。
8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括：對獲得的潛在藥物進(jìn)行 進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選藥物中進(jìn)一步選擇和確定對于治療造血干細(xì) 胞缺陷疾病有用的物質(zhì)。
9. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的候選藥物包括：小分子化合物、肽。
10. 化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療造血干細(xì)胞缺陷疾病的藥物組合物中的 用途，所述化合物選自：
【文檔編號】A61P7/06GK104278026SQ201310293787
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月12日
【發(fā)明者】周勇, 井長斌, 鄧敏, 陳漪 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院