一種斑馬魚(yú)體內(nèi)ros檢測(cè)模型的建立方法及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS檢測(cè)模型的建立方法，同時(shí)提供一種利用該模型篩選抗氧化藥物的方法。模型的構(gòu)建方法主要包括：斑馬魚(yú)的發(fā)育階段的確定，檢測(cè)用斑馬魚(yú)數(shù)量的確定，陽(yáng)性對(duì)照化合物GSH的濃度確定微孔板分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析幾個(gè)步驟。應(yīng)用斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS檢測(cè)模型進(jìn)行抗氧化藥物的篩選具有可靠、快速、高效、經(jīng)濟(jì)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)高通量篩選抗氧化藥物。本發(fā)明對(duì)抗氧化藥物的開(kāi)發(fā)有著重要的意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS檢測(cè)模型的建立方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種藥物篩選模型，具體的說(shuō)，涉及一種簡(jiǎn)單、快速和高效的抗氧化藥物篩選的斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS檢測(cè)模型的建立方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]活性氧簇(reactive oxygen species, R0S)是生物體內(nèi)影響信號(hào)傳導(dǎo)的重要物質(zhì)，包括:02_.,H2O2及HO2.、.0H等，與許多衰老相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展預(yù)防和治療相關(guān)，如心血管疾病、老年癡呆、腫瘤、糖尿病等。大量人群和實(shí)驗(yàn)研究表明，采用有效的預(yù)防手段，特別是合理服用抗氧化劑或自由基清除劑，均可有效控制這些疾病的發(fā)生，發(fā)揮良好的預(yù)防作用[1]。
[0003]目前，抗氧化藥物篩選模型常為分子與細(xì)胞水平的篩選模型，這些體外抗氧化藥物篩選模型，都不涉及 藥物在生物體內(nèi)的吸收分布代謝情況，所以都不能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)藥物的體內(nèi)抗氧化能力[2_3]。此外，一些體內(nèi)的抗氧化篩選模型，由于檢測(cè)方法復(fù)雜，檢測(cè)指標(biāo)較多，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高等不利因素，未能廣泛應(yīng)用于抗氧化藥物的篩選[4_5]。所以，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速的體內(nèi)抗氧化藥物篩選模型意義重大。
[0004]斑馬魚(yú)是一種新穎的模式生物。與傳統(tǒng)的體內(nèi)和體外篩選模型相比較，活體斑馬魚(yú)篩選模型具有諸多優(yōu)勢(shì)，克服了原有體外模型在吸收、分布、代謝和排泄環(huán)節(jié)驗(yàn)證的欠缺及傳統(tǒng)體內(nèi)篩選模型實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、成本高的弊端。斑馬魚(yú)是一種脊椎動(dòng)物，與人類(lèi)基因的相似度高達(dá)85%左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性強(qiáng)。與鼠類(lèi)等哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚(yú)胚胎透明，可同時(shí)觀察分析多個(gè)器官，實(shí)驗(yàn)周期短，樣本容量大，結(jié)果可信度高，所需費(fèi)用低[6]。更重要的是，斑馬魚(yú)模型具有與生俱來(lái)的優(yōu)點(diǎn)[6_7]:①飼養(yǎng)成本低，性成熟周期短繁殖能力強(qiáng)，一尾雌魚(yú)每次可產(chǎn)200?300枚卵；③生長(zhǎng)發(fā)育速度快，在受精24h后，斑馬魚(yú)主要的組織器官原基已形成，可為研究提供大量的樣本和較短的實(shí)驗(yàn)周期；④胚胎及幼魚(yú)透明，體外受精，體外發(fā)育，可直接觀察，并可同時(shí)分析多個(gè)器官系統(tǒng)；⑤胚胎有可以提供營(yíng)養(yǎng)的卵黃，第一周內(nèi)不需喂食，可避免化合物處理時(shí)化合物與食物成份的相互作用；⑥胚胎體積小，幼魚(yú)體長(zhǎng)只有1-4 _，能夠在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的6、12、24、48或96孔板內(nèi)進(jìn)行分析；⑦給藥方式簡(jiǎn)單:溶于水的小分子物質(zhì)可直接經(jīng)皮膚、鰓及消化系統(tǒng)進(jìn)入斑馬魚(yú)體內(nèi)；不溶于水的物質(zhì)、大分子物質(zhì)及蛋白質(zhì)可進(jìn)行顯微注射。因此斑馬魚(yú)可作為很好的疾病模型研究材料。
[0005]5- (and-6)-carboxy-2 ' , I ' -dichiorodihydrofluorescein diacetate(carboxy-H2DCFDA)是一種常用的ROS特異性熒光檢測(cè)試劑，無(wú)熒光Carboxy-H2DCFDA通過(guò)與斑馬魚(yú)體內(nèi)的ROS反應(yīng)，生成熒光活性的2' ,T -dichlorofluorescein (DCF);使用酶標(biāo)儀定量檢測(cè)DCF的熒光信號(hào)，從而相對(duì)定量測(cè)定生物體內(nèi)ROS的量[8]。
[0006]本發(fā)明提供的斑馬魚(yú)ROS檢測(cè)模型有利于簡(jiǎn)單、高效、快速篩選抗氧化藥物，對(duì)抗衰老和預(yù)防衰老相關(guān)疾病有著重要意義。與以往的模型相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
I)活體內(nèi)一實(shí)驗(yàn)材料為活體斑馬魚(yú)，作為一種脊椎動(dòng)物，其篩選模型屬體內(nèi)模型，能夠真實(shí)反映藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄，真正反映藥物的整體生物活性。[0007]2)高通量一斑馬魚(yú)幼魚(yú)很小，只有1-4毫米，能夠在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的6，12，24，48，96或384孔板內(nèi)進(jìn)行分析和實(shí)驗(yàn)周期短，使斑馬魚(yú)成為一種能進(jìn)行高通量自動(dòng)化體內(nèi)藥物致敏性評(píng)價(jià)的理想模型。
[0008]3)經(jīng)濟(jì)一所需費(fèi)用低，以猴子為實(shí)驗(yàn)載體的篩選實(shí)驗(yàn)每只每天耗費(fèi)大于10美元，以小鼠為實(shí)驗(yàn)載體的篩選實(shí)驗(yàn)每只每天耗費(fèi)大于I美元，而以斑馬魚(yú)為實(shí)驗(yàn)載體的篩選實(shí)驗(yàn)每只每天耗費(fèi)小于0.01美元。
[0009]4)化合物用量少一檢測(cè)化合物用量少，通常只需幾毫克，而傳統(tǒng)的篩選實(shí)驗(yàn)則需幾毫克以上的化合物。
[0010]5)簡(jiǎn)便一實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，斑馬魚(yú)經(jīng)化合物處理可定量分析化合物抗氧化活性，而傳統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程復(fù)雜，判斷指標(biāo)主觀，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。
[0011]6)快速一實(shí)驗(yàn)周期短，可在I小時(shí)內(nèi)完 成。斑馬魚(yú)在第一個(gè)72小時(shí)以?xún)?nèi)完成胚胎發(fā)育。多數(shù)的內(nèi)部器官，包括心血管系統(tǒng)、腸、肝臟和腎，在24-48小時(shí)內(nèi)快速成型，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)載體老鼠和猴子則分別需要21天和9個(gè)月方可完成胚胎發(fā)育。
[0012]7)可靠的預(yù)測(cè)性一斑馬魚(yú)的基因與人類(lèi)基因的相似度高達(dá)85%左右，其生物學(xué)功能與哺乳動(dòng)物及人類(lèi)高度相似，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性強(qiáng)，預(yù)測(cè)性好。
[0013]8)敏感性高一Carboxy-H2DCFDA能與ROS特異性的反應(yīng)，可以快速檢測(cè)斑馬魚(yú)體內(nèi)的ROS水平。
[0014]9)穩(wěn)定性高、重復(fù)性好一本發(fā)明重復(fù)實(shí)驗(yàn)十幾次，所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同。
[0015]本發(fā)明應(yīng)用價(jià)值
應(yīng)用斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS檢測(cè)模型進(jìn)行抗氧化藥物的篩選具有可靠、快速、高效、經(jīng)濟(jì)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)高通量篩選抗氧化藥物。本發(fā)明對(duì)抗氧化藥物的開(kāi)發(fā)有著重要的意義。
[0016]試劑及儀器
carboxy-H2DCFDA(C400, Invitrogen)、多功能微孔板分析儀(Mithras LB940, BerthoIdTechno1gies)>96 孔板(Nest Biotech)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明的目的在于提供一種斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS檢測(cè)模型的建立方法，同時(shí)提供一種利用該模型篩選抗氧化藥物的方法。本發(fā)明提供的方法具有可靠、快速、經(jīng)濟(jì)、高效、高通量等優(yōu)點(diǎn)。
[0018]內(nèi)容一:本發(fā)明提供一種斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS檢測(cè)模型的建立方法，設(shè)計(jì)方案為:
I斑馬魚(yú)選取
取4?5對(duì)斑馬魚(yú)親本交配，按照Westerf ield[9]的方法孵化胚胎。將處于最佳處理階段的斑馬魚(yú)置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚(yú)移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根據(jù)微孔板規(guī)格放入不同數(shù)量的斑馬魚(yú)。
[0019]2斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS檢測(cè)模型建立條件的確定
(I)斑馬魚(yú)的發(fā)育階段的確定。
[0020](2)檢測(cè)用斑馬魚(yú)數(shù)量的確定。
[0021](3)陽(yáng)性對(duì)照化合物谷胱甘肽(GSH)的濃度確定。[0022]本發(fā)明的實(shí)施例一中，對(duì)上述的建模條件進(jìn)行確定。其中，斑馬魚(yú)的發(fā)育階段為3dpf,檢測(cè)用斑馬魚(yú)數(shù)量為I尾，GSH濃度為100 μ M0
[0023]內(nèi)容二:本發(fā)明提供一種利用斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS檢測(cè)模型篩選抗氧化藥物的方法，設(shè)計(jì)方案為:
I斑馬魚(yú)選取
取4?5對(duì)斑馬魚(yú)親本交配，按照Westerf ield[9]的方法孵化胚胎。將處于最佳處理階段的斑馬魚(yú)置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚(yú)移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根據(jù)微孔板規(guī)格放入不同數(shù)量的斑馬魚(yú)。
[0024]2化合物處理
化合物初篩濃度為30 μ M ;檢測(cè)試劑對(duì)照組(Control)為不含斑馬魚(yú)的反應(yīng)液；以Carboxy-H2DCFDA處理的斑馬魚(yú)作為模型組(Model )，以100 μ M GSH處理模型組斑馬魚(yú)作為陽(yáng)性對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)在96孔板中進(jìn)行，每孔I尾斑馬魚(yú)，100 μ I反應(yīng)液，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組處理6個(gè)孔。
[0025]3酶標(biāo)儀分析:
各實(shí)驗(yàn)組28 V反應(yīng)I小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，使用多功能微孔分析儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組的熒光值。ROS清除率公式如下:
【權(quán)利要求】
1.一種斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS檢測(cè)模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)斑馬魚(yú)的發(fā)育階段的確定；(2)檢測(cè)用斑馬魚(yú)數(shù)量的確定；(3)陽(yáng)性對(duì)照化合物谷胱甘肽(GSH)的濃度確定。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟:(4)微孔板分析。
3.如權(quán)利要求1所述的建立方法，其特征在于:優(yōu)選的，步驟(I)中斑馬魚(yú)的發(fā)育階段為受精后3天(3 dpf)斑馬魚(yú)；優(yōu)選的，步驟(2)中檢測(cè)用斑馬魚(yú)數(shù)量為I尾斑馬魚(yú)；優(yōu)選的，步驟(3)中陽(yáng)性對(duì)照化合物谷胱甘肽(GSH)的濃度為100 μ M ;優(yōu)選的，所述養(yǎng)殖用水其溶解氧濃度為6-8 mg/L、水溫為28°C、pH為7.2-7.6、總硬度為200_250mg/L。
4.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于:優(yōu)選的，步驟(4)微孔板分析具體步驟為:將斑馬魚(yú)放入96孔板，然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測(cè)熒光值。
5.權(quán)利要 求1-4所述構(gòu)建方法得到的斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS檢測(cè)模型用于抗氧化藥物篩選的用途。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于:還包括以下步驟:設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組:8個(gè)化合物處理組，I個(gè)對(duì)照組，I個(gè)模型組，I個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組；化合物以溶解的方式給藥；所有的實(shí)驗(yàn)組含有相同的反應(yīng)液(5 μ g/ml的Carboxy-H2DCFDA);于28<€恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I小時(shí)；使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組的熒光值；統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以I 土SE表示，多組間比較采用單因子方差分析，兩組間比較采用Dunnett’ S T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p<0.05為差異性顯著。
【文檔編號(hào)】A61K49/00GK103430890SQ201310398791
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】勞喬聰, 李春?jiǎn)? 朱鳳, 俞航萍 申請(qǐng)人:杭州環(huán)特生物科技有限公司