斑馬魚卵黃原蛋白免疫印跡試劑盒及其檢測(cè)方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生態(tài)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種斑馬魚卵黃原蛋白免疫印跡試劑盒及其檢測(cè)方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國工業(yè)化程度和人民群眾生活水平的不斷提高，大量的工業(yè)廢水和生活污水排入到江河湖海中，造成了嚴(yán)重的水環(huán)境污染，不僅危害了野生生物的生存，也嚴(yán)重威脅我國人民的健康。雖然這些污染物在環(huán)境中的濃度很低，但是能夠干擾人和動(dòng)物體內(nèi)激素的合成、釋放、運(yùn)輸、代謝，以及激素與受體的結(jié)合、功能的表達(dá)等一系列生物過程，從而擾亂人和動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的機(jī)能，甚至對(duì)生物后代的生殖功能造成潛在影響，這一類化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱為內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)。其中，環(huán)境雌激素對(duì)野生動(dòng)物和人類生殖系統(tǒng)的影響受到了廣泛關(guān)注，已成為繼臭氧層、氣候變暖之后的第三大環(huán)境問題。環(huán)境雌激素種類繁多，包括多氯聯(lián)苯類、二惡英類、農(nóng)藥類、雙酚類、金屬化合類、類固醇類等，其中塑化劑、殺蟲劑、避孕藥等被人們廣泛利用，它們的雌激素效應(yīng)已引起了人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。近年來，關(guān)于環(huán)境雌激素污染的報(bào)道越來越多。早在1985年，人們就在英國城市污水處理廠下游河流中捕獲到了具有雌雄兩性特征的斜齒鳊魚，我國武漢市東湖部分魚類出現(xiàn)了“雄魚雌化”現(xiàn)象，并且在長(zhǎng)江、太湖、珠三角河流中都檢測(cè)到了雌激素類物質(zhì)。環(huán)境雌激素除了造成魚蝦生長(zhǎng)速度減慢、畸形等現(xiàn)象外，還能夠通過生物濃縮、生物積累和生物放大等途徑增大濃度，對(duì)生物和人類造成更大危害。因此，為了減少環(huán)境雌激素的危害，有必要建立化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境雌激素活性篩選體系，制備能夠快速檢測(cè)雌激素活性的試劑盒。
[0003]美國、歐盟和日本相繼建立起以魚類為模式生物的環(huán)境雌激素篩選評(píng)價(jià)體系，其中卵黃原蛋白(Vitellogenin, Vtg)作為重要的生物篩選指標(biāo)，已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。魚類卵黃原蛋白是卵黃蛋白的前體，是一種大分子量的脂磷聚糖蛋白。通常，卵黃原蛋白只能在卵黃形成期的雌魚體內(nèi)檢測(cè)到，但是雄魚和幼魚體內(nèi)也含有卵黃原蛋白基因，在環(huán)境雌激素的誘導(dǎo)下，也能合成和分泌卵黃原蛋白。因此，卵黃原蛋白是環(huán)境雌激素篩選的特異性生物標(biāo)志物，通過檢測(cè)雄魚體內(nèi)卵黃原蛋白水平可以評(píng)價(jià)環(huán)境化合物的雌激素活性。
[0004]斑馬魚(Dan1ree1)，屬于福鰭亞綱(Actinopterygii)鯉科(Cyprinidae)短擔(dān)尼魚屬(Dan1)的一種硬骨魚，具備以下獨(dú)特優(yōu)點(diǎn):(I)價(jià)格便宜，容易獲得，并且易于管理；(2)體型小，在較小空間內(nèi)就可飼養(yǎng)大量斑馬魚(2L的燒杯中就可飼養(yǎng)10條左右)，便于毒理學(xué)試驗(yàn)得到較大樣本量；(3)斑馬魚對(duì)內(nèi)分泌干擾物反應(yīng)敏感，內(nèi)分泌干擾物結(jié)構(gòu)多樣，種類眾多，并且新的內(nèi)分泌干擾物不斷出現(xiàn)，研宄表明斑馬魚可以作為評(píng)價(jià)內(nèi)分泌干擾物的一個(gè)模型；(4)斑馬魚的雌雄魚在體形上較易分辨。雌魚體型通常較大，腹部較鼓脹；雄魚體型稍小，腹部平坦。仔細(xì)對(duì)照可以看出雌魚臀鰭的條紋是藍(lán)白相間的，而雄魚臀鰭是藍(lán)紋間夾著深黃色的條紋。目前，斑馬魚已成為一些生態(tài)毒理標(biāo)準(zhǔn)(如OE⑶和ISO標(biāo)準(zhǔn))的推薦測(cè)試物種，被廣泛地應(yīng)用于環(huán)境毒性試驗(yàn)、環(huán)境危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)、環(huán)境污染物生物累積效應(yīng)的研宄中。
[0005]研宄表明，環(huán)境激素暴露可導(dǎo)致雄性斑馬魚卵黃原蛋白生成、發(fā)育遲緩、雌性化、雌雄同體、產(chǎn)卵量減少、受精率降低以及性比失衡等變化，其中卵黃原蛋白可能是最敏感的指標(biāo)。卵黃原蛋白的測(cè)定通常采用免疫學(xué)方法，其分離純化是制備抗體、定性定量檢測(cè)魚類卵黃原蛋白的基礎(chǔ)。研宄者多通過17 β-雌二醇(17 β-estrad1l，E2)腹腔注射的方法誘導(dǎo)卵黃原蛋白的產(chǎn)生，而斑馬魚體型小，注射困難，血液量少，取血困難，無法獲得足夠的血漿用于卵黃原蛋白的純化，這大大制約了斑馬魚卵黃原蛋白抗體的制備。
[0006]目前，研宄者對(duì)斑馬魚卵黃原蛋白的定性或定量檢測(cè)多采用鯉魚卵黃原蛋白抗體，由于卵黃原蛋白的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)存在差異，且空間結(jié)構(gòu)也會(huì)制約抗原的免疫原性，Watts等(2002)認(rèn)為大量的轉(zhuǎn)譯后修飾會(huì)影響魚類卵黃原蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，改變抗原決定簇的暴露情況，從而影響不同魚種卵黃原蛋白之間的種間交叉反應(yīng)敏感性，使得魚類卵黃原蛋白抗體在用于其它魚類卵黃原蛋白檢測(cè)時(shí)受到限制。因此，為了準(zhǔn)確反映環(huán)境雌激素的存在水平，對(duì)不同各類的魚類，需要制備其相應(yīng)的卵黃原蛋白抗體。斑馬魚卵黃原蛋白純品已有國外公司出售，價(jià)格為1500元(5yg)，過于昂貴，并且如此小的劑量無法達(dá)到抗體制備要求?？梢?，建立斑馬魚卵黃原蛋白的純化方法，將成為制備抗體與建立斑馬魚卵黃原蛋白檢測(cè)的重要前提。
[0007]中國專利201210559592.1提供了一種利用卵黃脂磷蛋白抗體定性檢測(cè)魚類卵黃原蛋白的試劑盒，具有顯著的檢測(cè)效果。然而，魚類卵黃原蛋白是一種種特異性蛋白，不同魚類的卵黃原蛋白存在較大差異，異源抗體用于其它魚類卵黃原蛋白檢測(cè)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出較差的特異性與敏感性，影響檢測(cè)的效果。因此，為了保證斑馬魚卵黃原蛋白的準(zhǔn)確檢測(cè)，有必要開發(fā)一種高效純化斑馬魚卵黃原蛋白的方法，并制備出具有較高特異性和敏感性的抗斑馬魚卵黃原蛋白抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)斑馬魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒及其應(yīng)用，以滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。
[0009]一種檢測(cè)斑馬魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒，包括一個(gè)盒體，該盒體內(nèi)裝有:1)PVDF膜2張；2)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗I支；3)封閉液、洗滌液、顯色液各I支，所述的洗滌液為TBST ;封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST ;顯色液為含0.06% (m/V)3’ - 二氨基聯(lián)苯胺的1mM Tris-HCl ;其特征在于該盒體還裝有:斑馬魚卵黃原蛋白純品I支，兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體I支。
[0010]所述的斑馬魚卵黃原蛋白純品為100 μ g/ml的斑馬魚卵黃原蛋白溶液。
[0011]所述的斑馬魚卵黃原蛋白純品的制備方法如下:
[0012]采用水體暴露17 β -雌二醇的方式誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生卵黃原蛋白，將斑馬魚置于2L的玻璃缸中，每缸放入10尾斑馬魚，17 β -雌二醇的暴露濃度為200 μ g/L，每天全部換水，并重新加入相應(yīng)的17 β -雌二醇，早晚投喂飼料，水溫26°C ；7天后將斑馬魚放入50%的酒精中，待斑馬魚麻醉后，取出稱重，并加入3倍體積4°C預(yù)冷的PBS緩沖液(內(nèi)含ImM PMSF,PH 7.5)，在冰浴條件下用玻璃勻漿器勻漿，4°C、8000g離心10分鐘，收集上清液；將收集的所有上清液用于離子交換層析(DEAE-Sepharose Fast Flow)，用分別含0.07M、0.1M、0.2M和1.0M NaCl的25mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)進(jìn)行不連續(xù)洗脫，收集0.2M洗脫組分，裝入截留分子量為10kDa的Millipore超濾離心管，4°C、3000g離心30分鐘，加入Iml PBS,收集截留在超濾離心管膜上的蛋白；取Iml收集液加入Sephadex G-200層析柱，用25mMTris-HCl緩沖液(pH 7.5)洗脫，收集第一個(gè)主洗脫峰，即為斑馬魚卵黃原蛋白。
[0013]所述的兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備方法如下:
[0014]取600 μ g純化的斑馬魚卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射0.1ml，兩周后再次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為600 μ g/只，用弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行背部皮下注射，此后，每隔10天按以上方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫；第5次注射后于第5天從心臟取血，6000r/min離心20分鐘，收集上清，獲得了兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗血清；抗體的純化分為以下幾步，上樣前向多克隆抗血清中加入1/3的對(duì)照陰性樣品(雄魚勻漿液)，低溫振蕩2h，4°C過夜，次日離心取上清；向上清中加入等體積的PBS緩沖液；在冰浴條件下加入等體積飽和硫酸銨，0°C震蕩2h后，低溫離心(8000rpm，15min)，棄上清，沉淀用1ml PBS緩沖液溶解；用0.45微米孔徑的濾膜過濾后，上Hitrap Protein G柱，以PBS緩沖液洗脫10個(gè)柱體積后，用0.1M甘氨酸(ρΗ2.7)洗脫，即獲得兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體。
[0015]所述的檢測(cè)斑馬魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒，在環(huán)境雌激素類物質(zhì)篩選與內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明的試劑盒利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合能力，可靈敏、準(zhǔn)確、方便地檢測(cè)斑馬魚血漿中、肝臟組織和肝細(xì)胞培養(yǎng)液中的卵黃原蛋白，最低檢出限可達(dá)60ng/ml，為內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)篩選、檢測(cè)和生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供了一個(gè)有效的手段。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0018]目前，國內(nèi)外多采用異源性(鯉魚)抗體用于斑馬魚卵黃原蛋白的測(cè)定，然而有研宄表明，異源性抗體達(dá)不到同源性抗體的檢測(cè)敏感性。關(guān)于斑馬魚卵黃原蛋白抗體制備已有外文文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)enske等(2001)通過乙炔基雌二醇(17 a-ethiny-lestrad1l，EE2)水體暴露66天的方法誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生卵黃原蛋白，然后取血，用于卵黃原蛋白的純化及抗體的制備，本發(fā)明利用200 μ g/L 17 β -雌二醇水體暴露7天的方法即可誘導(dǎo)雄性斑馬魚產(chǎn)生足量的卵黃原蛋白，極大地降低了誘導(dǎo)時(shí)間和工作量，并且，本發(fā)明直接將斑馬魚勻漿液用于卵黃原蛋白的純化，不僅減少了實(shí)驗(yàn)用魚的數(shù)量(6條斑馬魚即可達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，還簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)方法。此外，經(jīng)多個(gè)濃度及暴露時(shí)間相比較，本發(fā)明證實(shí)200 μ g/L暴露七天，既達(dá)到了斑馬魚的耐受極限，又保證了卵黃原蛋白的較大誘導(dǎo)量。在純化過程，本發(fā)明先通過離子交換層析，經(jīng)超濾濃縮后，再進(jìn)分子篩層析，最后再進(jìn)行超濾濃縮。本實(shí)驗(yàn)方案不僅避免了斑馬魚勻漿液堵塞分子篩帶來的麻煩，還極大提高了純化蛋白的濃度，本發(fā)現(xiàn)的試劑盒利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合能力，能夠靈敏、方便地定性檢測(cè)斑馬魚在不同污染物暴露下體內(nèi)卵黃原蛋白的生成水平，為評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境雌激素效應(yīng)提供了快捷的手段。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明的斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體對(duì)雄性與雌性斑馬魚勻漿液的檢測(cè)結(jié)果(泳道I為雌性斑馬魚勻漿液；泳道2為雄性斑馬魚勻漿液)；
[0020]圖2為本發(fā)明的斑馬魚卵