可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚及其制備方法和應(yīng)用，其中制備方法包括：將重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP與Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA共同導(dǎo)入野生型斑馬魚中；以及培養(yǎng)獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，所述穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系即為可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，其中，所述重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP中攜帶的mbp基因啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。利用該方法能夠有效制備獲得可特異性清除髓鞘組織、引起髓鞘脫失且能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，并且在甲硝唑的作用下，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚的少突膠質(zhì)細(xì)胞可以被特異性清除，使其出現(xiàn)髓鞘脫失的病理改變，并伴有運(yùn)動功能下降，進(jìn)而，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚能夠?yàn)榛铙w研究髓鞘損傷與再生的調(diào)控機(jī)制，以及相關(guān)藥物篩選提供有力的動物模型。
【專利說明】可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及斑馬魚模型的制備方法與應(yīng)用，具體地，涉及可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚及其制備方法和應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及制備可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法、可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚及其在髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或再生機(jī)制研究，以及篩選用于治療髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或用于髓鞘再生的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]髓鞘是保護(hù)、支持和營養(yǎng)軸突的膜性結(jié)構(gòu)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，髓鞘由成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞伸出突起包繞軸突形成；而在外周神經(jīng)系統(tǒng)則由施萬細(xì)胞構(gòu)成。髓鞘的主要功能是起絕緣作用，介導(dǎo)神經(jīng)沖動的正常、快速傳遞，是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在人類，當(dāng)髓鞘在遺傳因素和/或外在環(huán)境因素作用下受到損傷，即引起以多發(fā)性硬化為主要表現(xiàn)的脫髓鞘疾病，除髓鞘脫失外，還出現(xiàn) 神經(jīng)軸突退化，患者出現(xiàn)不同程度的感覺、運(yùn)動和識別等功能喪失。
[0003]截至目前，髓鞘脫失的機(jī)制不明，利用動物模型深入研究髓鞘的損傷與再生是一個有效途徑。然而，目前用于髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或髓鞘再生機(jī)制和相關(guān)藥物篩選研究的動物模型，仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:
[0005]斑馬魚發(fā)育快速、胚胎透明，髓鞘結(jié)構(gòu)特征、形成過程及基因表達(dá)方式與哺乳動物高度相似，是研究髓鞘損傷與再生的理想動物模型。然而，目前還未見關(guān)于髓鞘損傷或髓鞘脫失的斑馬魚模型的報道，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立髓鞘損傷或髓鞘脫失的斑馬魚模型是活體研究髓鞘損傷和再生機(jī)制的新途徑。
[0006]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠有效制備可特異性清除髓鞘組織、獲得髓鞘脫失的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的方法。
[0007]進(jìn)而，發(fā)明人做了大量工作，最終發(fā)現(xiàn)將重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP與Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA共同導(dǎo)入野生型斑馬魚，髓鞘堿性蛋白基因啟動子驅(qū)動綠色熒光蛋白，能夠成功構(gòu)建可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg (mbp:nfsB::EGFP)0進(jìn)而，在甲硝唑的作用下，可以特異性清除幼魚的少突膠質(zhì)細(xì)胞，使其出現(xiàn)髓鞘脫失的病理改變，并伴有運(yùn)動功能下降。該轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg (mbp:nfsB::EGFP)將為深入活體研究髓鞘損傷與再生的調(diào)控機(jī)制提供有力的動物模型。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種制備可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括如下步驟:將重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP與Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA共同導(dǎo)入野生型斑馬魚中；以及培養(yǎng)獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，所述穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系即為可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，其中，所述重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP中攜帶的mbp基因啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]具體地，所述mbp基因(即髓鞘堿性蛋白基因)啟動子的核苷酸序列如下所示:
[0010]ataataacaa tcccaactcc atgttgcaga tgctgagatg tgactactgc aaatgaacac 60
[0011]ggtgtgatat tgatgccgaa acaatatatt gtgcagccct acaataaacc ttggattaaa 120
[0012]gtgcatattg acggtcctat gaatttactt tagatgatta catttcaaat ggaatgacag 180 [0013]aaatatttca gattttgtta caaataatga ataataaata taaattaata aactcaatgt 240
[0014]ctgattagta ctttgcactg ctacagtaat acttaatttg ttcagattta aaggtgattt 300
[0015]ttcaatattt agattttttt aaaccctcca tgttttcaaa tatttgtcca tgctaacaac 360
[0016]ccatgcaatg gaaatcattg attagatgga aatccatcta atcaatggat tatgtataaa 420
[0017]gaaataaggt ggtttagtat tggggtgaat taaacattta tcgtcatttt tatcacagtt 480
[0018]atactaacat atacttactc ccatgaccat ttaataaaaa tattatctta taatgatgaa 540
[0019]taaacaagca ttctttaaac tccactgtaa aaaaactcac aaagctaaag ttatttacat 600
[0020]ttaaacacgt tttacatctt tcagcacatc ctagtttaga tttcctattt gaaatcacat 660
[0021]gccatcattt tttaaatcgc tgcgtgtcta tatttgattg tatatgacat tgactggatg 720
[0022]tgtttacaaa ctcatcattt ctgcctttta tttcctgaac tatttcacat gcatgcctca 780
[0023]ttattttagc ctatgcatgt ttacccagtt gtctggattt ctagcttgaa tgaatttcct 840
[0024]cttctaatga cctcgtggca aacatcttaa ggacaaagaa aattgcagct gcacatctgg 900
[0025]ccgaacacag caaaggtaaa cctttattta tatgatcaaa aatgtcagtt ttgtgacatt 960
[0026]tcagtgcagg aacaacaaca aaaagagaca ttttttgaaa aaagtgaatg aataaataat 1020
[0027]aaaagcagaa tgttttacta tggaacactg tggcctttgt ttgctggcca tacttgcatc 1080
[0028]acaaacaact gtcaattgtt tgacaaaagg cagcaaaaaa cagcacacta aagccaacaa 1140
[0029]cgtttttacc ctcgacagag acagatttgt ccatgtgttc ataacgtttt ctctgaaaag 1200
[0030]aaccatgctg agtatcacac acagcagttg gttaatgaat tgcaaagtca ctggaaatta 1260
[0031]atttgcagat atttcaagac ttggagcgaa cagagcaagc ggggcgaatg cagattgcaa 1320
[0032]cgtttatctg ggatacaaat tacagcacct acttcaagaa atcaatccaa gaactcgttc 1380
[0033]ggcatctcaa ggccaaaatt tatcaatgaa ataaacaaag gcgtgtagcg taacatcatc 1440
[0034]aacgtctcga tcatcttgcg tgatgaatga aacatggagt ggtttgtctg cagatgacaa 1500
[0035]tttcaaactc ttacatgttt gcaatgcacc atatgtgatc cctcaacgta aactatttgt 1560
[0036]ataatgaaca tgagtcacca caacaatggt ttgattgtgc caaagccgtt cttcgatgtg 1620
[0037]ctctgcttct ttctcataga caggccttgt tgttctgggc tcaagtcggg gcagatgtgg 1680
[0038]actagaacaa tagcagctcc ttttatcaga gagcagggta gtgacaccct ccgcgggcac 1740
[0039]acagggctcg aaagaatgcc tggcaccagc ccagtatcac tgacgctatt gcaggcccac 1800
[0040]ctcatctcct gtgatgccat gcaacggagg ggacgacacc ttcaaaggcc agcccttcgt 1860
[0041]gcttagaagc gccgaagact atcgagaagg tttgcagaan sdarcgtctc cagagcggac 1920
[0042]tttggattga gcggagaagg acatac(SEQ ID N0.1)1946
[0043]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方法，能夠有效制備獲得可特異性清除髓鞘組織、引起髓鞘脫失的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(mbp:nfSB::EGFP)。此外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述制備獲得的可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，在甲硝唑的作用下，幼魚的少突膠質(zhì)細(xì)胞可以被特異性清除，使其出現(xiàn)髓鞘脫失的病理改變，并伴有運(yùn)動功能下降，進(jìn)而，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg (mbp:nfsB::EGFP)能夠?yàn)榛铙w研究髓鞘損傷與再生的調(diào)控機(jī)制，以及相關(guān)藥物篩選提供有力的動物模型。
[0044]另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的制備可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法還可以具有如下附加的技術(shù)特征:
[0045]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP是通過如下步驟構(gòu)建獲得的:通過BamHI和NcoI酶切、T4連接酶連接，將SEQ ID N0.1所示的mbp基因啟動子克隆到已知質(zhì)粒pgrna-nfsB-EGFP中。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括:從pCS2FA-轉(zhuǎn)座酶通過mMESSAGE mMACHINE系統(tǒng)制備Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA。
[0047]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP與Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA共同導(dǎo)入野生型斑馬魚中，包括:將2μ l、25ng/y I的重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP和2μ l、35ng/y I的Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA共同導(dǎo)入野生型斑馬魚胚胎中。由此，能夠有效提高轉(zhuǎn)基因效率，以及H)陽性個體的比率。
[0048]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過以下步驟培養(yǎng)獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系:利用熒光顯微鏡對經(jīng)過轉(zhuǎn)化的斑馬魚進(jìn)行篩選，以便確定H)陽性個體，其中，所述經(jīng)過轉(zhuǎn)化的斑馬魚中在脊髓兩側(cè)有呈線狀分布、表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞的個體即為H)陽性個體；常規(guī)養(yǎng)殖所述H)陽性個體至具備繁殖能力，并將具備繁殖能力的H)陽性個體與野生型斑馬魚進(jìn)行交配，以便 獲得Fl代斑馬魚；利用熒光顯微鏡對所述Fl代斑馬魚進(jìn)行篩選，以便確定Fl陽性個體，其中，所述Fl代斑馬魚中在脊髓兩側(cè)有呈線狀分布、表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞的個體即為Fl陽性個體；將所述Fl陽性個體與野生型斑馬魚個體進(jìn)行交配，以便得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系。
[0049]具體地，根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，本發(fā)明的制備可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法，還可以包括以下步驟:
[0050](I)克隆mbp基因啟動子，制備重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP，通過PCR方法擴(kuò)增斑馬魚髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,mbp)基因啟動子,其長度為1.9kb,包含第一個外顯子，序列為SEQ ID N0.1，擴(kuò)增引物序列為SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5，用BamH1、NcoI和T4連接酶將mbp啟動子替換到pgrna-nfsB-EGFP質(zhì)粒上；
[0051](2)制備Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA，從pCS2FA_轉(zhuǎn)座酶通過mMESSAGE mMACHINE系統(tǒng)制備To12轉(zhuǎn)座酶mRNA ；
[0052](3)胚胎轉(zhuǎn)化與篩選，將2μ I質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP和2μ I Το12轉(zhuǎn)座酶mRNA在I~4細(xì)胞期共注射到野生型(AB系)斑馬魚胚胎中。具體步驟如下:配制10 μ I工作液，包括mbp-nfsB-EGFP2 μ 1，Το12 轉(zhuǎn)座酶mRNA2 μ I，酚紅(Phenol Red)2.5μ l，DEP(^jC3.5y I。表達(dá)載體mbp-nfsB-EGFP和To 12轉(zhuǎn)座酶mRNA工作濃度分別為25ng/ μ I和35ng/ μ I。其中，酚紅僅用于指示顏色，以確定是否注射成功。將工作液放入顯微注射針內(nèi)(由玻璃毛細(xì)管拉制而成)，利用顯微注射儀，在I~4細(xì)胞期將工作液注射到野生型(AB系)斑馬魚胚胎中，注射的位置在卵黃囊內(nèi)靠近細(xì)胞極處，注射體積為Iml/胚胎。在96hpf，利用熒光顯微鏡篩選H)，沿脊柱兩側(cè)分布有串珠樣綠色熒光蛋白陽性信號分布的個體被認(rèn)定為H)陽性個體。常規(guī)養(yǎng)殖H)陽性個體至具備繁殖能力，與野生型(AB系)交配，以便獲得Fl代斑馬魚，然后用同樣方法篩選Fl代斑馬魚，以確定Fl陽性個體，。Fl陽性個體再與野生型(AB系)個體交配，以便得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg(mbp:nfsb::EGFP)。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，進(jìn)一步包括:利用原位雜交技術(shù)對所述H)陽性個體和所述Fl陽性個體進(jìn)行假陽性檢測。由此，能夠避免發(fā)育過程中的色素沉著產(chǎn)生假陽性熒光信號影響最終結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，利用原位雜交技術(shù)對所述H)陽性個體和所述Fl陽性個體進(jìn)行假陽性檢測進(jìn)一步包括:在E3孵化液中加入0.003%的1-苯基-2-硫脲(l-phenyl-2-thiourea,PTU,Sigma)至6dpf (授精的天數(shù))，收集幼魚，以4%多聚甲醒固定，以mbp mRNA標(biāo)記少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞，然后，按照原位雜交標(biāo)準(zhǔn)化流程進(jìn)行幼魚整體原位雜交，確定陽性轉(zhuǎn)基因個體。其中，陽性信號的定位與GFP陽性信號一致時，表明GFP標(biāo)記的細(xì)胞為少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞，即陽性轉(zhuǎn)基因個體。
[0054]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括:使用甲硝唑?qū)λ龇€(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系進(jìn)行處理，以便獲得少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或施旺氏細(xì)胞被特異性清除的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。
[0055]其中，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，使用甲硝唑?qū)λ龇€(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系進(jìn)行處理，進(jìn)一步包括:利用細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)所述穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，其中每孔加入5ml5mM甲硝唑DMS0-E3孵化液，于28.5°C下避光培養(yǎng)5天，以便獲得經(jīng)過處理的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系；將所述經(jīng)過處理的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系以DMS0-E3孵化液清洗3次、每次5min，其中，所述甲硝唑DMS0-E3孵化液的配制方法為將甲硝唑溶于所述DMS0-E3孵化液，所述甲硝唑的工作濃度是5mM，所述DMS0-E3孵化液為添加了 0.2體積％DMS0的E3孵化液。其中，本發(fā)明所采用的與斑馬魚養(yǎng)殖等相關(guān)表達(dá)方式例如“E3孵化液”等均為本領(lǐng)域常規(guī)術(shù)語，其具體含義或組成等可參見下文提供的標(biāo)準(zhǔn)化方案:WeSterfield，M.Thezebrafish book:a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydaniorerio) 1993, Eugene, 0R:M.Westerfield,通過參照將其全文并入本文。例如，本發(fā)明所述的的E3孵化液為60 μ g/ml海鹽。
[0056]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚是通過前面所述的方法制備獲得的。
[0057]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，在甲硝唑的作用下，幼魚的少突膠質(zhì)細(xì)胞可以被特異性清除，從而出現(xiàn)髓鞘脫失的病理改變。進(jìn)而，發(fā)明人又對上述出現(xiàn)髓鞘脫失病理改變的轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行了行為學(xué)評價:于IOdpf (受精的天數(shù))時期收集清洗后的甲硝唑處理組和對照組(未經(jīng)甲硝唑處理的可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚)幼魚,放入含Iml/孔E3孵化液的48孔板(每孔一條幼魚)，每次每組八條，重復(fù)三次；開始實(shí)驗(yàn)前幼魚首先適應(yīng)環(huán)境15min，再讓幼魚在孔板中自由運(yùn)動，以孔板上方架設(shè)的攝像機(jī)記錄視頻IOmin,以Ethovision XT軟件分析視頻,繪出運(yùn)動軌跡圖，并通過總運(yùn)動距離、平均運(yùn)動速度兩個指標(biāo)進(jìn)行定量統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲硝唑處理組的總運(yùn)動距離和平均運(yùn)動速度顯著低于對照組，即與對照組相比，髓鞘損傷造成斑馬魚運(yùn)動能力下降。進(jìn)一步驗(yàn)證了斑馬魚髓鞘損傷造成斑馬魚運(yùn)動能力下降。
[0058]換言之，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，能夠穩(wěn)定遺傳，不僅能夠特異性地標(biāo)記髓鞘組織，還能在甲硝唑的作用下特異性造成髓鞘的損傷，并伴有運(yùn)動能力下降，其在一定程度上能夠模擬人類髓鞘脫失的病理改變和功能變化，進(jìn)而，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚能夠用作活體研究髓鞘損傷與再生的調(diào)控機(jī)制，以及相關(guān)藥物篩選的動物模型。
[0059]這是因?yàn)椋琈bp基因特異性表達(dá)在少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞，即中樞神經(jīng)系統(tǒng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的施旺氏細(xì)胞，本發(fā)明的可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(即Tg (mbpmfsB::EGFP))轉(zhuǎn)基因斑馬魚以綠色熒光蛋白(EGFP)驅(qū)動mbp啟動子，同時攜帶了 nfsB細(xì)胞毒性基因(其編碼硝基還原酶(Nitroreductase，NTR)),因此這個模型具有兩個優(yōu)勢:第一，通過上述方法制備得到的該轉(zhuǎn)基因斑馬魚可以穩(wěn)定遺傳，由于斑馬魚個體小，產(chǎn)卵量大，因此容易獲得大量遺傳背景和表型一致的實(shí)驗(yàn)動物個體，這就為篩選新的藥物或治療方法打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；第二，髓鞘細(xì)胞不僅被綠色熒光蛋白特異性標(biāo)記，而且可以經(jīng)甲硝唑的處理被特異性、可逆性、可控性清除，不僅適合于有關(guān)髓鞘形成的研究，還可以誘導(dǎo)髓鞘細(xì)胞的損傷進(jìn)而恢復(fù)，從而深入研究髓鞘損傷和再生的機(jī)制。
[0060]由此，根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了前面所述的可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚在髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或再生機(jī)制研究，以及篩選用于治療髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或用于髓鞘再生的藥物中的應(yīng)用。即該可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，在甲硝唑的作用下，幼魚的少突膠質(zhì)細(xì)胞可以被特異性清除，使其出現(xiàn)髓鞘脫失的病理改變，并伴有運(yùn)動功能下降，進(jìn)而，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚能夠用作活體研究髓鞘損傷與再生的調(diào)控機(jī)制，以及相關(guān)藥物篩選的動物模型。
[0061]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了一種篩選用于治療髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或用于髓鞘再生的藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:根據(jù)權(quán)利要求前面所述的方法，制備獲 得可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚；使用甲硝唑?qū)λ隹商禺愋郧宄枨式M織的轉(zhuǎn)基 因斑馬魚進(jìn)行處理，以便獲得少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或施旺氏細(xì)胞被特異性清除的轉(zhuǎn)基因斑馬魚；以及在存在所述藥物的條件下，對所述少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或施旺氏細(xì)胞被特異性清除的轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行培養(yǎng)，并基于培養(yǎng)前后所述少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或施旺氏細(xì)胞被特異性清除的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的運(yùn)動能力的變化情況對所述藥物進(jìn)行篩選，其中，所述少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或施旺氏細(xì)胞被特異性清除的轉(zhuǎn)基因斑馬魚培養(yǎng)后相對于培養(yǎng)前運(yùn)動能力提高，為所述藥物能夠用于治療髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或用于髓鞘再生的指示。由此，利用該方法能夠有效地篩選治療髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或用于髓鞘再生的藥物。其中，需要說明的是，可以以總運(yùn)動距離和平均運(yùn)動速度作為指標(biāo)衡量斑馬魚的運(yùn)動能力。
[0062]其中，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，使用甲硝唑?qū)λ龇€(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系進(jìn)行處理，進(jìn)一步包括:利用細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)所述穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，其中每孔加入5ml5mM甲硝唑DMS0-E3孵化液，于28.5°C下避光培養(yǎng)5天，以便獲得經(jīng)過處理的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系；將所述經(jīng)過處理的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系以DMS0-E3孵化液清洗3次、每次5min，其中，所述甲硝唑DMS0-E3孵化液的配制方法為將甲硝唑溶于所述DMS0-E3孵化液，所述甲硝唑的工作濃度是5mM，所述DMS0-E3孵化液為添加了 0.2體積％DMS0的E3孵化液。
[0063]此外，需要說明的是，本發(fā)明將重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP與Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA經(jīng)顯微注射至斑馬魚胚胎中，篩選并鑒定得到能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚后，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚中的待清除細(xì)胞被熒光蛋白特異性標(biāo)記，并攜帶NTR，進(jìn)而將轉(zhuǎn)基因斑馬魚暴露在一定濃度的甲硝唑(metronidazole,Mtz)中，因Mtz僅對NTR表達(dá)陽性產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，而導(dǎo)致該種細(xì)胞的特異性清除。本發(fā)明的可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚作為動物模型的有點(diǎn)在于:1.甲硝唑容易通過水進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)，在5dpf以后的斑馬魚中即可應(yīng)用，通常使用濃度為l_5mM，即使在IOmM下對成體魚的存活和正常生活沒有明顯影響];2.清除作用快速，在甲硝唑作用后12-72小時實(shí)現(xiàn)細(xì)胞清除，通過熒光蛋白觀察或免疫組化等方法容易觀察清除效果；3.清除過程可逆，脫離甲硝唑后，24小時后細(xì)胞開始復(fù)原，但不同細(xì)胞復(fù)原時間各異。從而，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因斑馬魚能夠被精準(zhǔn)地特異性清除少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或施旺氏細(xì)胞，從而引起髓鞘組織特異性缺失，進(jìn)而能夠有效用作髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或再生相關(guān)研究的動物模型。
[0064]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0065]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0066]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的mbp-nfsB-EGFP重組質(zhì)粒的示意圖；
[0067]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例，轉(zhuǎn)基因后斑馬魚脊椎周圍表達(dá)綠色熒光蛋白的情況；
[0068]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例，利用mbp原位雜交檢測熒光蛋白的表達(dá)部位結(jié)果圖； [0069]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例，甲硝唑處理前后對少突膠質(zhì)細(xì)胞的影響的檢測結(jié)果圖；以及
[0070]圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例，表示髓鞘損傷對斑馬魚運(yùn)動能力的影響的檢測結(jié)果圖。
[0071]需要說明的是，本發(fā)明所述的重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP的結(jié)構(gòu)均如圖1所示?！揪唧w實(shí)施方式】
[0072]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0073]實(shí)施例1
[0074]一、實(shí)驗(yàn)材料和方法
[0075]1、實(shí)驗(yàn)動物
[0076]按標(biāo)準(zhǔn)化方案(可參照:Westerfield,M.The zebraf ish book: a guide for thelaboratory use of zebrafish(Brachydanio rerio) 1993, Eugene, 0R:M.ffesterfield,通過參照將其全文并入本文)養(yǎng)殖野生型斑馬魚(AB品系)，水溫28.5°C，光照/黑暗周期為14h/10h，成體斑馬魚產(chǎn)卵后收集胚胎，養(yǎng)殖于E3孵化液，以受精的小時數(shù)(hourspost-fertilization, hpf )或受精的天數(shù)(days post-fertilization, dpf )表不胚胎和幼魚的發(fā)育階段。
[0077]2、轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制備[0078]通過Tol2系統(tǒng)制備轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg (mbp:nfsB::EGFP)。
[0079]2.1 構(gòu)建 mbp-nfsB-EGFP 重組質(zhì)粒
[0080]通過PCR方法擴(kuò)增斑馬魚髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, mbp)基因啟動子，一個啟動子長度為1.9kb，序列見SEQ ID N0.1，包含第一個外顯子，其引物序列為:正向引物:5’ -CGCCGGGATCCATAATAACAATCCCAACTC-3’ (SEQ ID N0.4)，反向引物:5’-CG CCGCCATGGGTATGTCCTTCTCCGCTCA-3’ (SEQ ID N0.5);另一個啟動子長度為 2.2kb，序列見SEQ ID N0.2，包含第一個外顯子，其引物序列為:正向引物:5’ -CGCCGGGATCCTGCTGAGATGTGACTACTG-3’(SEQ ID N0.6),反向引物:5’ -CGCCGCCATGGGCTCTGTGCCTATAAACTGC-3’ (SEQ ID N0.7);第三個啟動子長度為 1.9kb，序列見 SEQ ID N0.3,不包含第一個外顯子，其引物序列為:正向引物:5’ -CGCCGGGATCCCGATCCGTCTACGACTCTA-3’ (SEQ ID N0.8)，反向引物:5，-CGCCGCCATGGCCATGGGGTGTTGATCTGT-3，(S EQ IDN0.9)。
[0081]PCR反應(yīng)條件為:
【權(quán)利要求】
1.一種制備可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法，其特征在于，包括如下步驟: 將重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP與Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA共同導(dǎo)入野生型斑馬魚中；以及 培養(yǎng)獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，所述穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系即為可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚， 其中，所述重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP中攜帶的mbp基因啟動子的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP是通過如下步驟構(gòu)建獲得的:通過BamHI和NcoI酶切、T4連接酶連接，將SEQ ID N0.1所示的mbp基因啟動子克隆到已知質(zhì)粒pgrna-nfsB-EGFP中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括:從PCS2FA-轉(zhuǎn)座酶通過mMESSAGE mMACHINE 系統(tǒng)制備 Tol2 轉(zhuǎn)座酶 mRNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP與Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA共同導(dǎo)入野生型斑馬魚中，包括:將2μ l、25ng/y I的重組質(zhì)粒mbp-nfsB-EGFP和2μ l、35ng/y I的Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA共同導(dǎo)入野生型斑馬魚胚胎中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過以下步驟培養(yǎng)獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系: 利用熒光顯微鏡對經(jīng)過轉(zhuǎn)化的斑馬魚進(jìn)行篩選，以便確定H)陽性個體，其中，所述經(jīng)過轉(zhuǎn)化的斑馬魚中在脊髓兩側(cè)有呈線狀分布、表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞的個體即為H)陽性個體； 常規(guī)養(yǎng)殖所述H)陽性個體至具備繁殖能力，并將具備繁殖能力的H)陽性個體與野生型斑馬魚進(jìn)行交配，以便獲得Fl代斑馬魚； 利用熒光顯微鏡對所述Fl代斑馬魚進(jìn)行篩選，以便確定Fl陽性個體，其中，所述Fl代斑馬魚中在脊髓兩側(cè)有呈線狀分布、表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞的個體即為Fl陽性個體； 將所述Fl陽性個體與野生型斑馬魚個體進(jìn)行交配，以便得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括:利用原位雜交技術(shù)對所述H)陽性個體和所述Fl陽性個體進(jìn)行假陽性檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括:使用甲硝唑?qū)λ龇€(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系進(jìn)行處理，以便獲得少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或施旺氏細(xì)胞被特異性清除的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，使用甲硝唑?qū)λ龇€(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系進(jìn)行處理，進(jìn)一步包括: 利用細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)所述穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，其中每孔加入5ml5mM甲硝唑DMS0-E3孵化液，于28.5°C下避光培養(yǎng)5天，以便獲得經(jīng)過處理的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系； 將所述經(jīng)過處理的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系以DMS0-E3孵化液清洗3次、每次5min， 其中，所述甲硝唑DMS0-E3孵化液的配制方法為將甲硝唑溶于所述DMS0-E3孵化液，所述甲硝唑的工作濃度是5mM，所述DMS0-E3孵化液為添加了 0.2體積％DMS0的E3孵化液。
9.一種可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，其是通過權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法制備獲得的。
10.權(quán)利要求9所述的可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚在髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或再生機(jī)制研究，以及篩選用于治療髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或用于髓鞘再生的藥物中的應(yīng)用。
11.一種篩選用于治療髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或用于髓鞘再生的藥物的方法，其特征在于，包括: 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，制備獲得可特異性清除髓鞘組織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚； 使用甲硝唑?qū)λ隹商禺愋郧宄枨式M織的轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行處理，以便獲得少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或施旺氏細(xì)胞被特異性清除的轉(zhuǎn)基因斑馬魚；以及 在存在所述藥物的條件下，對所述少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或施旺氏細(xì)胞被特異性清除的轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行培養(yǎng)，并基于培養(yǎng)前后所述少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或施旺氏細(xì)胞被特異性清除的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的運(yùn)動能力的變化情況對所述藥物進(jìn)行篩選，其中，所述少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或施旺氏細(xì)胞被特異性清除的轉(zhuǎn)基因斑馬魚培養(yǎng)后相對于培養(yǎng)前運(yùn)動能力提高，為所述藥物能夠用于治療髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或用于髓鞘再生的指示。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，使用甲硝唑?qū)λ龇€(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系進(jìn)行處理，進(jìn)一步包括: 利用細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)所 述穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，其中每孔加入5ml5mM甲硝唑DMSO-E3孵化液，于28.5°C下避光培養(yǎng)5天，以便獲得經(jīng)過處理的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系；將所述經(jīng)過處理的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系以DMSO-E3孵化液清洗3次、每次5min， 其中，所述甲硝唑DMSO-E3孵化液的配制方法為將甲硝唑溶于所述DMSO-E3孵化液，所述甲硝唑的工作濃度是5mM，所述DMSO-E3孵化液為添加了 0.2體積％DMSO的E3孵化液。
【文檔編號】A01K67/027GK103966261SQ201410109257
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】魏世輝, 李玉皓, 方楊武 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院, 南開大學(xué)