一種用斑馬魚對(duì)藥物功效的評(píng)價(jià)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種為斑馬魚應(yīng)用于中藥安全性評(píng)價(jià)和魚類生理學(xué)的研究提供基礎(chǔ)資料的藥物功效評(píng)價(jià)方法，包括如下步驟，1)、試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備：a）、藥品，b）、實(shí)驗(yàn)儀器，c）、實(shí)驗(yàn)魚馴養(yǎng)；2)、試驗(yàn)方法：a）、設(shè)置濃度梯度，b）、排除消化過(guò)程差異，c）、藥物處理，d）、實(shí)驗(yàn)魚恢復(fù)平靜，e）、記錄窒息時(shí)間的準(zhǔn)備，f）、記錄窒息時(shí)間，g）、實(shí)驗(yàn)魚的乳酸的測(cè)定，h）、計(jì)算實(shí)驗(yàn)魚體內(nèi)乳酸的含量，i）、實(shí)驗(yàn)魚的乳酸脫氫酶的測(cè)定，j）、統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)本發(fā)明，證明斑馬魚應(yīng)用于中藥藥物篩選安全性評(píng)價(jià)是可行的，本研究可為斑馬魚應(yīng)用于中藥安全性評(píng)價(jià)和魚類生理學(xué)的研究提供基礎(chǔ)資料。
【專利說(shuō)明】一種用斑馬魚對(duì)藥物功效的評(píng)價(jià)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種藥物功效的評(píng)價(jià)方法，特別是涉及一種用斑馬魚對(duì)藥物功效的評(píng)價(jià)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]紅景天系薔薇目景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhod1la L.),多年生草本或亞灌木野生植物，因花、根、莖之浸液均成紅色而得名。主要生長(zhǎng)于高寒、缺氧、狂風(fēng)、紫外線照射強(qiáng)、晝夜溫差大、海拔2000?5000m的巖石縫隙和高山礫石中，惡劣的生存環(huán)境使紅景天從遺傳上具備了特殊的適應(yīng)性物質(zhì)，是一種珍稀的藥用植物。
[0003]在藥物的開發(fā)過(guò)程中，臨床應(yīng)用之前的藥物藥效篩選和安全性評(píng)價(jià)是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。目前藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)研究主要包括體內(nèi)(動(dòng)物)實(shí)驗(yàn)和體外(細(xì)胞、分子)實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)毒性試驗(yàn)周期長(zhǎng)，藥物用量大，操作難度大，不利于少量藥物的快速毒性篩選。而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不能精確地模擬藥物在體內(nèi)的真實(shí)過(guò)程，實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往難以在體內(nèi)得到重現(xiàn)。要解決新藥開發(fā)過(guò)程中的瓶頸問(wèn)題，就要建立經(jīng)濟(jì)、快速、有效的毒性評(píng)價(jià)動(dòng)物模型，進(jìn)行體外大規(guī)模篩選，建立哺乳動(dòng)物鑒定之前的中間驗(yàn)證體系。
[0004]斑馬魚由于其自身的特點(diǎn)，可克服體外細(xì)胞和化學(xué)篩選模型的局限性，在短期內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模藥物篩選，觀察藥物對(duì)多種復(fù)雜生理過(guò)程的效果,從整體上直觀地評(píng)估藥物的治療效果、不良反應(yīng)及毒副作用；能夠更便捷地獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，明顯縮短研發(fā)周期，降低研發(fā)成本，加快新藥開發(fā)過(guò)程。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種為斑馬魚應(yīng)用于中藥安全性評(píng)價(jià)和魚類生理學(xué)的研究提供基礎(chǔ)資料的藥物功效評(píng)價(jià)方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用斑馬魚對(duì)藥物功效的評(píng)價(jià)方法，其包括如下步驟:
1)、試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備:
a)、藥品:由三普藥業(yè)股份有限公司銷售三普紅景天膠囊。由南京建成生物工程研究所銷售的乳酸測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒；
b)、實(shí)驗(yàn)儀器:可見光分光光度計(jì)，酶標(biāo)儀；
C)、實(shí)驗(yàn)用魚馴養(yǎng):以購(gòu)自廣東的斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)魚，首先進(jìn)行為期4周的馴養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，以小型顆粒飼料為餌料，培養(yǎng)在水溫25°C，溶氧大于6.5mg/L，光制為12:12的環(huán)境中；
2)、試驗(yàn)方法:
a)、設(shè)置濃度梯度，設(shè)置6個(gè)處理實(shí)驗(yàn)的紅景天濃度梯度各為Omg/L、0.01mg/L、
0.02mg/L、0.04mg/L、0.08mg/L和0.16mg/L，各處理實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)魚數(shù)量為20條；
b)、排除消化過(guò)程差異，實(shí)驗(yàn)前，斑馬魚禁食24h以排除消化過(guò)程差異，然后隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)魚分配到各處理組； C)、藥物處理，紅景天水溶液置于IL玻璃燒杯中，然后于恒溫25°C水浴控制溫度，采用小型氣泵充氧，往水體中放入實(shí)驗(yàn)魚后立即以塑料篩網(wǎng)罩住燒杯杯口 ；
d)、實(shí)驗(yàn)魚恢復(fù)平靜，藥物處理結(jié)束后，小心移出斑馬魚，移出后的斑馬魚逐個(gè)放入預(yù)先注入恒溫養(yǎng)殖水的25mL小口玻璃瓶中，充滿水后，用塑料篩網(wǎng)罩住玻璃瓶口，放入恒溫水浴，適應(yīng)lOmin，使實(shí)驗(yàn)魚恢復(fù)平靜；
e)、記錄窒息時(shí)間的準(zhǔn)備，用小塑料管向玻璃瓶?jī)?nèi)注入飽和溶氧養(yǎng)殖用水，1s內(nèi)使瓶?jī)?nèi)的水全部被換出后，蓋緊橡膠塞，并以秒表開始計(jì)時(shí)；
f)、記錄窒息時(shí)間，直至實(shí)驗(yàn)魚身體失去平衡發(fā)生側(cè)翻時(shí)，記錄時(shí)間，為窒息時(shí)間；為消除個(gè)體大小對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，對(duì)體重差異進(jìn)行了以下校正:ts=ti*(m/0.2)0.75*25/(25-m),其中ts為校正后時(shí)間，ti為校正前時(shí)間為體重；將各濃度梯度試驗(yàn)校正后的時(shí)間ts與對(duì)應(yīng)濃度關(guān)系制作成標(biāo)準(zhǔn)曲線；
g)、實(shí)驗(yàn)魚的乳酸的測(cè)定，把用于測(cè)定缺氧窒息的實(shí)驗(yàn)魚在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在低于4攝氏度的環(huán)境中制成生理鹽水勻漿液，再將此生理鹽水勻漿液稀釋10倍后離心取上清液，再將此上清液稀釋5倍，再用乳酸測(cè)試盒按步驟加樣，最后在530nm波長(zhǎng)時(shí)用可見光分光光度計(jì)測(cè)其吸光值，并制作計(jì)算乳酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
h)、計(jì)算實(shí)驗(yàn)魚體內(nèi)乳酸的含量，采用以下方法計(jì)算實(shí)驗(yàn)魚體內(nèi)乳酸的含量:
組織中乳酸的含量=c*50/1000
其中，c為通過(guò)乳酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的勻漿稀釋液乳酸濃度，計(jì)算后繪制出各濃度試驗(yàn)的乳酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0007]i)、實(shí)驗(yàn)魚的乳酸脫氫酶的測(cè)定，上步操作制得的斑馬魚生理鹽水勻漿液，離心取上清液，稀釋20倍，用乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒按步驟加樣，反應(yīng)15min，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)時(shí)測(cè)其吸光度；并通過(guò)換算出每個(gè)濃度試驗(yàn)中乳酸脫氫酶的濃度，制作各個(gè)濃度試驗(yàn)中乳酸脫氫酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0008]j)、統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析及多重比較分析不同濃度處理造成的差異。
[0009]優(yōu)選的，所述的實(shí)驗(yàn)魚平均體重在0.2g左右。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:通過(guò)本發(fā)明，證明斑馬魚應(yīng)用于中藥藥物篩選安全性評(píng)價(jià)是可行的，本研究可為斑馬魚應(yīng)用于中藥安全性評(píng)價(jià)和魚類生理學(xué)的研究提供基礎(chǔ)資料。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為本發(fā)明一一種用斑馬魚對(duì)藥物功效的評(píng)價(jià)方法的不同濃度紅景天溶液處理5天對(duì)斑馬魚窒息時(shí)間的影響曲線圖。
[0012]圖2為本發(fā)明一一種用斑馬魚對(duì)藥物功效的評(píng)價(jià)方法的不同濃度紅景天溶液處理5天對(duì)斑馬魚缺氧窒息后體內(nèi)乳酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0013]圖3為本發(fā)明一一種用斑馬魚對(duì)藥物功效的評(píng)價(jià)方法的不同濃度紅景天溶液處理5天對(duì)斑馬魚缺氧窒息后體內(nèi)乳酸含量的影響曲線圖。
[0014]圖4為本發(fā)明一一種用斑馬魚對(duì)藥物功效的評(píng)價(jià)方法的不同濃度紅景天溶液處理5天對(duì)斑馬魚缺氧窒息后體內(nèi)乳酸脫氫酶活性的影響曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明:
一種用斑馬魚對(duì)藥物功效的評(píng)價(jià)方法，包括如下步驟:
一、試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備:
1、藥品:由三普藥業(yè)股份有限公司銷售三普紅景天膠囊。由南京建成生物工程研究所銷售的乳酸測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒。
[0016]2、實(shí)驗(yàn)儀器:可見光分光光度計(jì),酶標(biāo)儀。
[0017]3、實(shí)驗(yàn)用魚:以購(gòu)自廣東的斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)魚，首先進(jìn)行為期4周的馴養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，以江門市蓬江區(qū)海豚水族有限公司生產(chǎn)的海豚熱帶魚糧微顆粒為餌料，培養(yǎng)在水溫25°C，溶氧大于6.5mg/L,光制為12:12的環(huán)境中。
[0018]二、試驗(yàn)方法:
1、設(shè)置6個(gè)處理實(shí)驗(yàn)的紅景天濃度梯度各為Omg/L、0.01mg/L、0.02mg/L、0.04mg/L、
0.08mg/L和0.16mg/L，各處理實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)魚數(shù)量為20條；
2、實(shí)驗(yàn)前，斑馬魚禁食24h以排除消化過(guò)程差異，然后隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)魚(平均體重0.2g左右)分配到各處理組；
3、紅景天水溶液置于IL玻璃燒杯中，然后于恒溫25°C水浴控制溫度，采用小型氣泵充氧，往水體中放入實(shí)驗(yàn)魚后立即以塑料篩網(wǎng)罩住燒杯杯口 ；
4、藥物處理結(jié)束后，小心移出斑馬魚，移出后的斑馬魚逐個(gè)放入預(yù)先注入恒溫養(yǎng)殖水的25mL小口玻璃瓶中，充滿水后，用塑料篩網(wǎng)罩住玻璃瓶口，放入恒溫水浴，適應(yīng)lOmin，使實(shí)驗(yàn)魚恢復(fù)平靜；
5、用小塑料管向玻璃瓶?jī)?nèi)注入飽和溶氧養(yǎng)殖用水，1s內(nèi)使瓶?jī)?nèi)的水全部被換出后,蓋緊橡膠塞，并以秒表開始計(jì)時(shí)；
6、直至實(shí)驗(yàn)魚身體失去平衡發(fā)生側(cè)翻時(shí)，記錄時(shí)間，為窒息時(shí)間；為消除個(gè)體大小對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，對(duì)體重差異進(jìn)行了以下校正:ts=ti*(m/0.2)0.75*25/(25-m)，其中ts為校正后時(shí)間(min)，ti為校正前時(shí)間(min)，m為體重(g);將各濃度梯度試驗(yàn)校正后的時(shí)間ts與對(duì)應(yīng)濃度關(guān)系制作成標(biāo)準(zhǔn)曲線——圖1。
[0019]7、斑馬魚的乳酸和乳酸脫氫酶的測(cè)定，把用于測(cè)定缺氧窒息的實(shí)驗(yàn)魚在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在低于4攝氏度的環(huán)境中制成生理鹽水勻漿液，再將此生理鹽水勻漿液稀釋10倍后離心取上清液，再將此上清液稀釋5倍，再用乳酸測(cè)試盒按步驟加樣(具體步驟按照南京建成生物工程研究所的乳酸測(cè)試盒使用說(shuō)明書)，最后在530nm波長(zhǎng)時(shí)用可見光分光光度計(jì)測(cè)其吸光值，并制作計(jì)算乳酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線——圖2。
[0020]8、計(jì)算斑馬魚體內(nèi)乳酸的含量:
采用以下方法計(jì)算斑馬魚體內(nèi)乳酸的含量:
組織中乳酸的含量=c*50/1000
其中，c為通過(guò)圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的勻漿稀釋液乳酸濃度(mmol/L)，50為稀釋倍數(shù)(稀釋為體重的50倍，單位為g);并繪制出各濃度試驗(yàn)的乳酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖——圖3。
[0021]9、上步操作制得的斑馬魚生理鹽水勻漿液，離心取上清液，稀釋20倍，用乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒按步驟加樣，反應(yīng)15min，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)時(shí)測(cè)其吸光度；并通過(guò)換算出每個(gè)濃度試驗(yàn)中乳酸脫氫酶(LDH)的濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線——圖4。具體的換算方法需參考查閱南京建成生物工程研究所的A020乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒說(shuō)明書中的分析方法。
[0022]10、統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行運(yùn)算，同時(shí)采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析及多重比較(LSD)分析不同濃度處理造成的差異。
[0023]結(jié)果:
統(tǒng)計(jì)分析紅景天藥物處理5天，藥物濃度與斑馬魚窒息所用時(shí)間的關(guān)系，
由圖1可知，紅景天藥液處理5天之后，斑馬魚的窒息時(shí)間隨濃度增高呈現(xiàn)明顯的先增后降的趨勢(shì)，當(dāng)處理濃度為0.02mg/L時(shí)達(dá)到最大值，與對(duì)照組差異性顯著。當(dāng)處理濃度為0.04mg/L時(shí),窒息時(shí)間最短,但與對(duì)照組差異不顯著。當(dāng)處理濃度為0.08mg/L、0.16mg/L時(shí)，窒息時(shí)間與對(duì)照組也沒有明顯差異。
[0024]測(cè)定了缺氧窒息實(shí)驗(yàn)后的斑馬魚體內(nèi)乳酸的含量和乳酸脫氫酶(LDH)的活性，分析紅景天藥物處理濃度與斑馬魚體內(nèi)乳酸的積累量、乳酸脫氫酶(LDH)活性的關(guān)系，得到圖
3、圖4所示的結(jié)果:
由圖3可知，用不同濃度的紅景天藥液處理5天，缺氧窒息后，隨著藥物處理濃度的增大，斑馬魚體內(nèi)乳酸含量呈現(xiàn)先增高，后降低，再增高的變化趨勢(shì)。在處理濃度為0.01mg/L、
0.08mg/L時(shí)明顯地高于對(duì)照組，在處理濃度為0.04mg/L時(shí)低于對(duì)照組，乳酸含量的變化出現(xiàn)了兩個(gè)峰值，而其它濃度的處理組較對(duì)照組乳酸含量的變化不顯著。
[0025]由圖4可知，用不同濃度的紅景天藥液處理5天，缺氧窒息后，隨著藥物處理濃度的增大，斑馬魚體內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)的活性呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，各藥物處理組之間差異不顯著，當(dāng)藥物濃度大于0.02mg/L時(shí)，斑馬魚體內(nèi)乳酸脫氫酶活性顯著低于對(duì)照組。
[0026]結(jié)論:
本發(fā)明中，隨藥物處理濃度增高，斑馬魚耐低氧能力先迅速增高，然后降低，二者關(guān)系呈鐘形曲線。低濃度處理后，斑馬魚耐低氧能力增強(qiáng)，提示紅景天對(duì)魚類有抗缺氧的效果，采用斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)應(yīng)當(dāng)可行。
[0027]本發(fā)明研究了缺氧窒息后斑馬魚體內(nèi)乳酸含量和乳酸脫氫酶(LDH)的活性，當(dāng)濃度為0.04mg/L時(shí)，乳酸含量顯著低于對(duì)照組，這說(shuō)明紅景天在此濃度時(shí)起到了降低乳酸含量的作用。本實(shí)驗(yàn)中LDH活性隨著濃度的增大而降低，說(shuō)明紅景天可能通過(guò)降低LDH活力從而減少乳酸的生成，發(fā)揮抗疲勞的作用。
[0028]中藥藥物抗疲勞、抗缺氧藥性研究和安全性評(píng)價(jià)目前所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般是小鼠，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究，說(shuō)明斑馬魚應(yīng)用于中藥藥物篩選安全性評(píng)價(jià)是可行的，本方法可為斑馬魚應(yīng)用于中藥安全性評(píng)價(jià)和魚類生理學(xué)的研究提供基礎(chǔ)資料。
[0029]南京建成生物工程研究所的A020乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒說(shuō)明書中的分析方法:速率A ;主波長(zhǎng):340nm ;副波長(zhǎng):405nm ;樣品量:8.0ul ；R-1:320ul, R-2:80ul ;校準(zhǔn)方式:K因子；反應(yīng)方向:上升；測(cè)定溫度:37°C。
[0030]樣品與R-1混勻后反應(yīng)5分鐘，加入R-2混合后延遲53秒，測(cè)定104秒。
[0031]計(jì)算:

Δ ABS/minXVtX1000
LDH(U/L)=-

6.22XVsXd Δ ABS/min =每分鐘平均吸光度變化； Vt =總反應(yīng)體積(ml)；
1000 = U/ml到U/L的轉(zhuǎn)換系數(shù)；
6.22 = NADH的毫摩爾吸光系數(shù)；
Vs =標(biāo)本體積(ml)； d =比色杯光徑(cm)。
[0032]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本【技術(shù)領(lǐng)域】中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用斑馬魚對(duì)藥物功效的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)、試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備: a)、藥品:由三普藥業(yè)股份有限公司銷售三普紅景天膠囊；由南京建成生物工程研究所銷售的乳酸測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒； b)、實(shí)驗(yàn)儀器:可見光分光光度計(jì)，酶標(biāo)儀； C)、實(shí)驗(yàn)用魚馴養(yǎng):以購(gòu)自廣東的斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)魚，首先進(jìn)行為期4周的馴養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，以小型顆粒飼料為餌料，培養(yǎng)在水溫25°C，溶氧大于6.5mg/L，光制為12:12的環(huán)境中； 2)、試驗(yàn)方法: a)、設(shè)置濃度梯度，設(shè)置6個(gè)處理實(shí)驗(yàn)的紅景天濃度梯度各為Omg/L、0.0lmg/L、0.02mg/L、0.04mg/L、0.08mg/L和0.16mg/L，各處理實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)魚數(shù)量為20條； b)、排除消化過(guò)程差異，實(shí)驗(yàn)前，斑馬魚禁食24h以排除消化過(guò)程差異，然后隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)魚分配到各處理組； C)、藥物處理，紅景天水溶液置于IL玻璃燒杯中，然后于恒溫25°C水浴控制溫度，采用小型氣泵充氧，往水體中放入實(shí)驗(yàn)魚后立即以塑料篩網(wǎng)罩住燒杯杯口 ； d)、實(shí)驗(yàn)魚恢復(fù)平靜，藥物處理結(jié)束后，小心移出斑馬魚，移出后的斑馬魚逐個(gè)放入預(yù)先注入恒溫養(yǎng)殖水的25mL小口玻璃瓶中，充滿水后，用塑料篩網(wǎng)罩住玻璃瓶口，放入恒溫水浴，適應(yīng)lOmin，使實(shí)驗(yàn)魚恢復(fù)平靜； e)、記錄窒息時(shí)間的準(zhǔn)備，用小塑料管向玻璃瓶?jī)?nèi)注入飽和溶氧養(yǎng)殖用水，1s內(nèi)使瓶?jī)?nèi)的水全部被換出后，蓋緊橡膠塞，并以秒表開始計(jì)時(shí)； f)、記錄窒息時(shí)間，直至實(shí)驗(yàn)魚身體失去平衡發(fā)生側(cè)翻時(shí)，記錄時(shí)間，為窒息時(shí)間；為消除個(gè)體大小對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，對(duì)體重差異進(jìn)行了以下校正:ts=ti*(m/0.2)0.75*25/(25-m),其中ts為校正后時(shí)間，ti為校正前時(shí)間為體重；將各濃度梯度試驗(yàn)校正后的時(shí)間ts與對(duì)應(yīng)濃度關(guān)系制作成標(biāo)準(zhǔn)曲線； g)、實(shí)驗(yàn)魚的乳酸的測(cè)定，把用于測(cè)定缺氧窒息的實(shí)驗(yàn)魚在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在低于4攝氏度的環(huán)境中制成生理鹽水勻漿液，再將此生理鹽水勻漿液稀釋10倍后離心取上清液，再將此上清液稀釋5倍，再用乳酸測(cè)試盒按步驟加樣，最后在530nm波長(zhǎng)時(shí)用可見光分光光度計(jì)測(cè)其吸光值，并制作計(jì)算乳酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線； h)、計(jì)算實(shí)驗(yàn)魚體內(nèi)乳酸的含量，采用以下方法計(jì)算實(shí)驗(yàn)魚體內(nèi)乳酸的含量: 組織中乳酸的含量=c*50/1000 其中，c為通過(guò)乳酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的勻漿稀釋液乳酸濃度，計(jì)算后繪制出各濃度試驗(yàn)的乳酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； i)、實(shí)驗(yàn)魚的乳酸脫氫酶的測(cè)定，上步操作制得的斑馬魚生理鹽水勻漿液，離心取上清液，稀釋20倍，用乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒按步驟加樣，反應(yīng)15min，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)時(shí)測(cè)其吸光度；并通過(guò)換算出每個(gè)濃度試驗(yàn)中乳酸脫氫酶的濃度，制作各個(gè)濃度試驗(yàn)中乳酸脫氫酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線； j)、統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析及多重比較分析不同濃度處理造成的差異。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用斑馬魚對(duì)藥物功效的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，所述的實(shí)驗(yàn)魚平均體重在0.2g左右。
【文檔編號(hào)】G01N33/15GK104165975SQ201410300100
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】范能全, 羅毅平, 彭蘭, 林艷華 申請(qǐng)人:重慶市食品藥品檢驗(yàn)所