黃原蛋白多克隆抗體對斑馬魚卵黃原蛋白的檢測結(jié)果。【具體實施方式】:
[0021]制備檢測斑馬魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒分為以下步驟:
[0022](I)斑馬魚卵黃原蛋白的誘導(dǎo)與分離純化
[0023]斑馬魚卵黃原蛋白純品的制備:采用水體暴露17 β -雌二醇的方式誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生卵黃原蛋白，將斑馬魚置于2L的玻璃缸中，每缸放入10尾斑馬魚，17 β -雌二醇的暴露濃度為200 μ g/L,每天全部換水，并重新加入相應(yīng)的17 β -雌二醇，早晚投喂飼料，水溫26°C;7天后將斑馬魚放入50%的酒精中，待斑馬魚麻醉后，取出稱重，并加入3倍體積4°C預(yù)冷的PBS緩沖液(內(nèi)含ImM PMSF，pH 7.5)，在冰浴條件下用玻璃勻漿器勻漿，4°C、8000g離心10分鐘，收集上清液；將收集的所有上清液用于離子交換層析(DEAE-Sepharose Fast Flow)，用分別含0.07Μ、0.1Μ、0.2Μ和1.0M NaCl的25mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)進(jìn)行不連續(xù)洗脫，收集0.2M洗脫組分，裝入截留分子量為10kDa的Millipore超濾離心管，4°C、3000g離心30分鐘，加入Iml PBS，收集截留在超濾離心管膜上的蛋白；取Iml收集液加入SephadexG-200層析柱，用25mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)洗脫，收集第一個主洗脫峰，即為斑馬魚卵黃原蛋白。
[0024](2)斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備
[0025]取600 μ g純化的斑馬魚卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后對新西蘭大白兔進(jìn)行背部皮下多點注射，每點注射0.1ml，兩周后再次加強免疫，免疫劑量為600 μ g/只，用弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行背部皮下注射，此后，每隔10天按以上方法進(jìn)行加強免疫；第5次注射后于第5天從心臟取血，6000r/min離心20分鐘，收集上清，獲得了兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗血清；抗體的純化分為以下幾步，上樣前向多克隆抗血清中加入1/3的對照陰性樣品(雄魚勻漿液)，低溫振蕩2h，4°C過夜，次日離心取上清；向上清中加入等體積的PBS緩沖液；在冰浴條件下加入等體積飽和硫酸銨，0°C震蕩2h后，低溫離心(8000rpm，15min)，棄上清，沉淀用1ml PBS緩沖液溶解；用0.45微米孔徑的濾膜過濾后，上Hitrap Protein G柱，以PBS緩沖液洗脫10個柱體積后，用0.1M甘氨酸(ρΗ2.7)洗脫，即獲得兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體。
[0026](3)將制備的斑馬魚卵黃原蛋白純品I支、兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體I支、空白96孔酶標(biāo)板一塊，以及包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗I支裝入盒體內(nèi)，構(gòu)成本發(fā)明的試劑盒。其具體組成如下:
[0027]I) PVDF膜2張；
[0028]2)斑馬魚卵黃原蛋白純品I支，使用前用PBS稀釋至I μ g/ml ；
[0029]3)兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體I支，使用前用封閉液按1:1000的體積比稀釋；
[0030]4)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗I支，使用前用封閉液按I: 1500的體積比稀釋；
[0031]5)封閉液、洗滌液、顯色液各I支，所述的洗滌液為TBST(10mM Tris-HCl、150mMNaCl、0.05% Tween-20, pH7.5);封閉液為含5 %脫脂奶粉的TBST ;顯色液為含0.06%3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)的1mM Tris-HCl，使用前向顯色液中加入0.05% (v/v)雙氧水。
[0032]本發(fā)明的試劑盒可用于斑馬魚卵黃原蛋白的定性檢測。
[0033]利用本發(fā)明的試劑盒檢測斑馬魚卵黃原蛋白的方法，具體包括以下步驟:
[0034]I)將試劑盒中的斑馬魚卵黃原蛋白純品和待測的樣品稀釋后進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，所述的待測的樣品包括斑馬魚血漿、整體勻漿液、肝臟組織及肝細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0035]2)把電流凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜；
[0036]3)用封閉液封閉PVDF膜的非特異性結(jié)合位點，4°C孵育過夜，棄去封閉液；
[0037]4)加入用封閉液稀釋的兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體(1:1000)，室溫下震蕩孵育，棄去溶液，用洗滌液洗滌PVDF膜3次；
[0038]5)加入用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1: 1500)，室溫下震蕩孵育，棄去溶液，用洗滌液洗滌PVDF膜3次；
[0039]6)加入顯色液，待蛋白質(zhì)條帶清晰后，棄去顯色液，用蒸餾水終止顯色反應(yīng)，PVDF膜拍照后于避光處保存；
[0040]7)在雄性斑馬魚樣品中發(fā)現(xiàn)有顯色條帶，表明該魚體內(nèi)產(chǎn)生了卵黃原蛋白，其生活的水環(huán)境受到了環(huán)境雌激素類物質(zhì)的污染。
【主權(quán)項】
1.一種檢測斑馬魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒，包括一個盒體，該盒體內(nèi)裝有:1)PVDF膜2張；2)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗I支；3)封閉液、洗滌液、顯色液各I支，所述的洗滌液為TBST ;封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST ;顯色液為含0.06% (m/V)3’ - 二氨基聯(lián)苯胺的1mM Tris-HCl ;其特征在于該盒體還裝有:斑馬魚卵黃原蛋白純品I支，兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體I支。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的斑馬魚卵黃原蛋白純品為100 μ g/ml的斑馬魚卵黃原蛋白溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測斑馬魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒，其特征在于所述的斑馬魚卵黃原蛋白純品的制備方法如下: 采用水體暴露17β-雌二醇的方式誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生卵黃原蛋白，將斑馬魚置于2L的玻璃缸中，每缸放入10尾斑馬魚，17 β -雌二醇的暴露濃度為200 μ g/L,每天全部換水，并重新加入相應(yīng)的17 β -雌二醇，早晚投喂飼料，水溫26°C ;7天后將斑馬魚放入50%的酒精中，待斑馬魚麻醉后，取出稱重，并加入3倍體積4°C預(yù)冷的PBS緩沖液(內(nèi)含ImM PMSF,PH 7.5)，在冰浴條件下用玻璃勻漿器勻漿，4°C、8000g離心10分鐘，收集上清液；將收集的所有上清液用于離子交換層析(DEAE-Sepharose Fast Flow)，用分別含0.07M、0.1M、0.2M和1.0M NaCl的25mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)進(jìn)行不連續(xù)洗脫，收集0.2M洗脫組分，裝入截留分子量為10kDa的Millipore超濾離心管，4°C、3000g離心30分鐘，加入Iml PBS,收集截留在超濾離心管膜上的蛋白；取Iml收集液加入Sephadex G-200層析柱，用25mMTris-HCl緩沖液(pH 7.5)洗脫，收集第一個主洗脫峰，即為斑馬魚卵黃原蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測斑馬魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒，其特征在于所述的兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備方法如下: 取600 μ g純化的斑馬魚卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后對新西蘭大白兔進(jìn)行背部皮下多點注射，每點注射0.1ml，兩周后再次加強免疫，免疫劑量為600 μ g/只，用弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行背部皮下注射，此后，每隔10天按以上方法進(jìn)行加強免疫；第5次注射后于第5天從心臟取血，6000r/min離心20分鐘，收集上清，獲得了兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗血清；抗體的純化分為以下幾步，上樣前向多克隆抗血清中加入1/3的對照陰性樣品(雄魚勻漿液)，低溫振蕩2h，4°C過夜，次日離心取上清；向上清中加入等體積的PBS緩沖液；在冰浴條件下加入等體積飽和硫酸銨，0°C震蕩2h后，低溫離心(8000rpm，15min)，棄上清，沉淀用1ml PBS緩沖液溶解；用0.45微米孔徑的濾膜過濾后，上Hitrap Protein G柱，以PBS緩沖液洗脫10個柱體積后，用0.1M甘氨酸(ρΗ2.7)洗脫，即獲得兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體。
5.權(quán)利要求1所述的檢測斑馬魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒，在環(huán)境雌激素類物質(zhì)篩選與內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)檢測中的應(yīng)用。
6.利用上述試劑盒檢測斑馬魚卵黃原蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將試劑盒中的斑馬魚卵黃原蛋白純品和待測的樣品稀釋后進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，所述的待測的樣品包括斑馬魚血漿、整體勻漿液、肝臟組織及肝細(xì)胞培養(yǎng)液； 2)把電流凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜； 3)用封閉液封閉PVDF膜的非特異性結(jié)合位點，4°C孵育過夜，棄去封閉液； 4)加入用封閉液稀釋的兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體(1:1000)，室溫下震蕩孵育，棄去溶液，用洗滌液洗滌PVDF膜3次； 5)加入用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1:1500)，室溫下震蕩孵育，棄去溶液，用洗滌液洗滌PVDF膜3次； 6)加入顯色液，待蛋白質(zhì)條帶清晰后，棄去顯色液，用蒸餾水終止顯色反應(yīng)，PVDF膜拍照后于避光處保存； 7)在雄性斑馬魚樣品中發(fā)現(xiàn)有顯色條帶，表明該魚體內(nèi)產(chǎn)生了卵黃原蛋白，其生活的水環(huán)境受到了環(huán)境雌激素類物質(zhì)的污染。
【專利摘要】斑馬魚卵黃原蛋白免疫印跡試劑盒及其檢測方法與應(yīng)用。該試劑盒含有斑馬魚卵黃原蛋白純品與兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體。制備時，首先利用17β-雌二醇誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生卵黃原蛋白，通過兩步層析與超濾相結(jié)合的方法純化出卵黃原蛋白，然后免疫新西蘭大白兔制備兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗血清，并利用硫酸銨沉淀與Hitrap？Protein？G層析純化獲得兔抗斑馬魚卵黃原蛋白多克隆抗體。本試劑盒可以用于環(huán)境雌激素類物質(zhì)的篩選，能夠靈敏、方便的定性檢測斑馬魚血液、整體勻漿液、肝臟組織及肝細(xì)胞培養(yǎng)液中的卵黃原蛋白，最低檢測限為60ng？mL-1，為斑馬魚在內(nèi)分泌干擾物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用提供了重要工具。
【IPC分類】G01N33-531, G01N33-558
【公開號】CN104569384
【申請?zhí)枴緾N201410748506
【發(fā)明人】汝少國, 王軍, 王蔚, 田華
【申請人】中國海洋大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月9日...