專利名稱：：螺環(huán)生物堿化合物及含其的藥物組合物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于藥物
技術領域：
，涉及一類含有醛基的吡咯環(huán)與核糖類似物形成的螺環(huán)生物堿衍生物，以其為有效成分的藥物組合物，其制備方法及其在制備糖尿病性腎病或慢性腎病藥物或食品中的應用。
背景技術：
：糖尿病性腎病(diabeticn印hropathy，DN)是由于糖尿病引起的微血管病變所致的腎小球硬化癥，是腎小球的一種閉塞性病變，其發(fā)生主要和胰島素作用不足所致糖尿病性代謝失調及活性氧過剩有關，臨床表現(xiàn)為蛋白尿、水腫、高血壓和腎功能進行性損害。最新研究表明糖尿病性腎病是引起腎衰、尿毒癥的主要因素，但目前世界上尚缺乏有效的治療藥物，臨床治療以控制癥狀為主。DN的發(fā)病機制多數(shù)學者認為與持續(xù)性高血糖相關。糖蛋白含量增加，可相繼出現(xiàn)腎微血管基底膜增厚、紅細胞變形能力減低和糖化血紅蛋白值的升高。三者均使腎組織供氧減少而受損傷。高血糖狀態(tài)下多元醇代謝處于亢進狀態(tài)，在醛糖還原酶作用下，葡萄糖轉變?yōu)樯嚼娲?，后者在山梨醇脫氫酶作用下又可轉變?yōu)楣?。山梨醇和果糖等多元醇系高滲性物質，蓄積于細胞內可引起細胞內水腫和細胞機能的減低。除高血糖外，腎血流動力學異常、管球反饋調節(jié)失常、非酶促糖基化、多元醇代謝異常、前列腺素分泌增多、氧自由基形成、細胞外基質(ECM)代謝異常及多種細胞生長因子(如白細胞介素)分泌增多等在DN的發(fā)病中亦起著重要作用。在腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞，高糖誘導細胞內產(chǎn)生過多的活性氧簇，激活活性氧自由基和膜攻擊補體成分，上調轉化生長因子_131及ECM基因和蛋白的表達，造成細胞膜的損傷，導致腎小球結構和功能損害及ECM分布異常。高濃度葡萄糖也能直接作用于腎小球系膜細胞和血管平滑肌細胞，通過氧自由基等作用使細胞骨架破壞，并使血管對縮血管活性物質的反應性降低，腎小球入球小動脈擴張，引起腎小球高血壓。另一方面，機體抗氧化能力如超氧化物歧化酶(S0D)、谷光苷肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶等活性下降，細胞NADPH量不足，血槳抗氧化劑等水平降低，使ROS在體內過多積聚，對多種正常蛋白質、脂質核酸等造成損害導致糖尿病性腎病，已經(jīng)形成共識。Nam等(NamSM，LeeMY，KohJHetal.EffectsofNADPHoxidaseinhibitorondiabeticn印hropathyin0LETFrats:theroleofreducingoxidativestressinitsprotectiveproperty.DiabetesResearchandClinicalPractice2009;83:176-82)在研究NADK1氧化酶抑制劑對DN大鼠的作用時，發(fā)現(xiàn)夾竹桃麻素可以減少氧化產(chǎn)物MDA的分泌，改善氧化應激保護DN大鼠；Liu等(LiuHR，TangXY，DaiDZetal.EthanolextractsofRehma皿iacomplex(DiHuang)containingnoCornifructusimproveearlydiabeticnephropathybycombiningsuppressionontheET—R0Saxiswithmodulatehypoglycemiceffectinrats.JournalofEthnopharmacology2008;118:466-72)研究還證明，誘導型一氧化氮合酶(iN0S)產(chǎn)生的NO與R0S共同作用，形成對組織和機體有毒性的過氧亞硝酸鹽0N00-，激活絲裂原活化蛋白激酶MAPK信號通路，促使ETA受體上調，進一步增加了氧化應激產(chǎn)物。這也表明活化的內皮素-1通路(ET-1)和過多的ROS都與DN有關。ECM及細胞因子參與了DN的發(fā)生，目前報道比較多的是腎小球系膜細胞分泌的細胞因子，如IL-6、單核細胞趨化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-l，MCP-1)、核因子ka卯a(chǎn)B(皿clearfactor-kB，NF-kB)等。在DN的發(fā)生過程中，它們通過自分泌和/或旁分泌作用，作用于系膜細胞。腎臟系膜ECM包括多種成分，如IV型膠原(CIV)、層粘蛋白(LN)、III型前膠原(PIII)、透明質酸(HA)等。這些成分不僅是腎臟系膜的主要組分，同時也是腎基底膜的重要成分。DN發(fā)生時腎小球系膜細胞出現(xiàn)持續(xù)住分泌ECM、系膜增生、腎小球肥大，最終致腎小球硬化，因此ECM反映了腎小球基底膜的代謝狀態(tài)。IL-6主要來源于活化的單核或巨噬細胞，是一種多基因多效應的細胞因子，可誘導超敏反應蛋白(hs-CRP)、纖維蛋白原等表達，剌激系膜細胞增生，膠原合成明顯，導致ECM的增多。研究證實，人類和大鼠系膜細胞均可分泌IL-6和表達IL-6mRNA，體外培養(yǎng)系膜細胞的上清液中加入IL-6可以增加氚標記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)的摻入率，提示IL-6與系膜細胞增殖和ECM分泌增多有關。單核細胞趨化蛋白-l(MCP-l)是由單核細胞、內皮細胞和腎組織細胞等分泌的一種同型半胱氨酸，是炎癥趨化因子家族的一員，對單核/巨噬細胞有趨化、激活雙重作用的趨化因子。以往在炎癥性腎臟疾病中研究較多，近來在DN中也被認為是巨噬細胞滲入到腎小球，引起腎小球損傷的炎癥性疾病(KanamoriH，MatsubaraT，MimaAetal.InhibitionofMCP-1/CCR2pathwayamelioratesthedevelopmentofdiabeticnephropathy.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications2007;360:772-777)，因此MCP-1在DN發(fā)生中的作用越來越引起重視。Kanamori等報道DN模型大鼠MCP-1水平明顯增加并與腎功能損害程度相一致，阻斷MCP-1及其受體CCR2介導的通路，可有效減少IV型膠原和TGF-P的表達改善腎小球硬化。Tam等(TamFW，RiserBL，MeeranKetal.Urinarymonocytechemoattractantprotein-l(MCP-l)andco皿ectivetissuegrowthfactor(CCN2)asprognosticmarkersforprogressionofdiabeticn印hropathy.Cytokine2009;47:37-42)也報道MCP-1基因敲除小鼠對鏈脲霉素誘導的糖尿病腎病模型有保護作用。綜上，近年的研究進展表明糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的病理機制是與細胞內活性氧族過度產(chǎn)生，細胞因子如IL-6，MCP-1等以及細胞外基質如IV型膠原(CIV)的過度分泌密切相關。觀察藥物對高糖誘導的腎系膜細胞R0S及細胞因子的影響，已經(jīng)成為目前研究糖尿病腎病藥物的通用方法。藥用植物是開發(fā)新藥的重要來源，特別是在抗生素及抗癌藥物領域，據(jù)統(tǒng)計有近60_80%的藥物來自天然產(chǎn)物或其衍生物。因此從自然界尤其具有人用歷史的中醫(yī)藥中尋找有效治療藥物是可能的。石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott.)系天南星科(Araceae)菖蒲屬多年生草本植物，主產(chǎn)于四川、浙江、江蘇等地，以干燥根莖入藥。石菖蒲始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，味辛性溫，具芳香之氣，行散之力強，為宣氣通窮之佳品。中醫(yī)學認為石菖蒲的功能主治是開竅豁痰、醒神益智、聰耳明目、化濕開胃和散寒除痹。如本品配生姜搗服，治痰迷心竅；配遠志為"不忘散"(《證治準繩》)，治迷惑健忘；配黃連等為"菖蒲丸"(《普濟方》)，能寧心安神，治失眠健忘；配烏頭為"菖蒲散"(《圣濟總錄》)，治冷痹身痛；配遠志、茯苓、人參為"開心散"(《千金方》)，治郁悶失志等。臨床廣泛用于治療癲癇、痰厥、熱病神昏、健忘、老年癡呆等疑難病?？梢钥闯觯牌呀o人印象最深的功效是治療腦病的良藥。近代雖然也有將含有石菖蒲的中藥復方用于骨科和糖尿病腎病的治療，但藥效物質基礎研究尚不深入，有效成分還遠未能揭示。AcortatarinA，是從中藥石菖蒲(A.tatarinowiiSchott.)中發(fā)現(xiàn)的一類具有顯著抑制腎系膜細胞活性氧、炎癥因子(如IL_6、MCP-l、CollagenI、CollagenIV)過度產(chǎn)生的具有重要藥效官能團的螺環(huán)生物堿化合物，目前尚未見其結構式報道，因此是新物質，其抑制腎系細胞活性氧和多種炎癥因子的藥理作用也未見過報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供新的具有藥用價值的化合物AcortatarinA及其衍生物；從石菖蒲(A.tatarinowiiSchott.)中提取、分離該類化合物的方法；以該類化合物為有效成分的藥物組合物；該發(fā)明化合物在制備抗糖尿病性腎病或/和慢性腎病的藥物中的應用。本發(fā)明的上述目的是由下述的技術方案得以實現(xiàn)的具有下述結構式的化合物AcortatarinsA(I)禾PB(II)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>制備AcortatarinsA(I)和B(II)的方法，取干燥粉碎的石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott.)根莖，用水煎煮提取二次，過濾，合并濾液；殘渣用95%乙醇回流提取一次，過濾，濾液與水液合并，減壓濃縮得提取物，提取物混懸于水中，依次用乙酸乙酯、正丁醇充分萃取，等體積各萃取三次，正丁醇萃取物經(jīng)硅膠柱層析200-300目硅膠，氯仿-甲醇-水梯度洗脫9:i，8:2，8:2:o.2，7:3:o.i，7:3:o.5;每個梯度洗脫體積為4L;每份接收1000mL，薄層層析，10X硫酸乙醇顯色，根據(jù)斑點相同進行合并，得到八個組份，其中組份IV經(jīng)MCIgelCHP20P柱層析；甲醇-水梯度洗脫，10%，20%，30%，35%，40%;每個梯度洗脫溶劑量為2倍柱體積，每個梯度收集2份，共得到四個組份A-D，其中第四個柱體積洗脫時收集的組份B經(jīng)S印hadexLH-20甲醇洗脫，得到含有化合物I和II的組份，上述顯色劑呈現(xiàn)黃色斑點，該組份進一步經(jīng)半制備高效液相色譜Agilent1100HPLCsystem,ZorbaxSB_C_18，Agilent,9.4mmX25cm，甲醇-水20:80純化得化合物I和II。藥物組合物，其中含有治療有效量的AcortatarinsA(I)和B(II)化合物和藥學上可接受的載體。預防和治療糖尿病性腎病的藥物，其中含有治療有效量的AcortatarinsA(I)和B(II)化合物和藥學上可接受的載體。AcortatarinsA(I)和B(II)化合物在制備抗糖尿病性腎病的藥物中的應用。AcortatarinsA(I)禾PB(II)化合物在制備抗慢性腎病的藥物中的應用。AcortatarinsA(I)和B(II)化合物在制備保健食品中的應用。本發(fā)明從石菖蒲根莖中發(fā)現(xiàn)的新穎化合物AcortatarinsA和B，在糖尿病腎病或慢性腎病中具有重要的藥用價值。本發(fā)明化合物可以單獨直接應用，可以相互組合應用，也可以與其它藥物包括植物提取物組成復方的形式使用，可以使用不同的藥用輔料，制成多種固體制劑和液體制劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物可經(jīng)口服和注射兩種形式給藥。使用量可根據(jù)給藥途徑、患者的年齡、體重、所治療疾病的類型和嚴重程度等變化進行一次或多次使用。對成人來說，給藥量每天l-100mg比較合適。圖1AcortatarinsA和B抑制高糖誘導的系膜細胞R0S產(chǎn)生；A&B，系膜細胞與不同濃度的AcortatarinA和B，或c-S0D預孵育1小時，再以高糖剌激3小時；C，系膜細胞與10iiMAcortatarinA或100u/mL的c-S0D預孵育1小時，然后以正常濃度5.6mM(NG)或高濃度25mM(HG)D_葡萄糖剌激1到24小時。以DCFH染色，流式細胞儀測定ROS的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)以3次獨立實驗的均數(shù)±標準差表示。AN0VA，p<0.001，在圖A，B，和C;*p<0.05vsNG;#p<0.05vsHG;圖2腎系膜細胞株炎癥因子測定實驗采用美國ADL公司ELISA試劑盒檢測大鼠系膜細胞培養(yǎng)上清IL-6，MCP-1，CollagenI，CollagenIV表達。圖2A為IL-6表達；圖2B為MCP-1表達；圖2C為CollagenI表達；圖2D為CollagenIV表達。具體實施例方式下面用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此來限定本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的實質對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明的范圍。實施例1:AcortatarinsA和B的制備及結構鑒定取干燥粉碎的石菖蒲根莖50kg，首先用水煎煮提取二次(100LX2)，過濾，合并濾液；殘渣用95%乙醇回流提取一次(100LX1)，過濾，濾液與水液合并，減壓濃縮得提取物4.7kg。提取物混懸于6L水中，依次用乙酸乙酯、正丁醇充分萃取(等體積各萃取三次)。正丁醇萃取物315g經(jīng)硅膠柱層析(200-300目硅膠2kg，氯仿-甲醇-水梯度洗脫9:1，8:2，8:2:o.2，7:3:o.1，7:3:o.5;每個梯度洗脫體積為4L;每份接收1000mL)，薄層層析，10X硫酸乙醇顯色，根據(jù)斑點相同進行合并，得到八個組份，其中組份IV(10L-14L)(9.3g)經(jīng)MCIgelCHP20P柱層析(柱床規(guī)格5.5X30cm;甲醇-水梯度洗脫，10%，20%，30%，35%，40%;每個梯度洗脫溶劑量為2倍柱體積，每個梯度收集2份)，共得到四個組份(A-D)，其中組份B(第四個柱體積洗脫時收集的組份)(1.6g)經(jīng)S印hadexLH-20(柱規(guī)格3.0X70cm;甲醇洗脫)得到含有化合物I和II的組份，其特征為上述顯色劑呈現(xiàn)黃色斑點，且為主斑點，該組份進一步經(jīng)半制備高效液相色譜(Agilent1100HPLCsystem,ZorbaxSB_C_18，Agilent,9.4mmX25cm，甲醇-水20:80)純化得化合物1(7.3mg)禾P11(3.4mg)。AcortatarinsA和B的結構鑒定數(shù)據(jù)JASCODIP-370型數(shù)字式旋光儀；Bio-RadFTS-135型紅外光譜儀(KBr壓片)；UV210A型紫外可見光分度計；VGAUTOSpec-3000及FinniganMAT90質譜儀；BrukerDRX-500核磁共振儀，TMS作為內標，S為卯m，J為Hz;熔點用X_4數(shù)字顯微熔點儀(未經(jīng)校正)測定。硅膠為青島海洋化工廠生產(chǎn)；MCI-gelCHP-20P，S印hadexLH-20為通用公司產(chǎn)品；顯色劑為10%H2S04乙醇溶液。AcortatarinA結構式如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>AcortatarinA:無色晶體，熔點164-166°C;[a]27D+253.1(c0.10，MeOH)UV(Me0H)Amax(loge):296(4.25)，254(3.75)nm;IR(KBr)vmax:3426，2928，2855，1734，11713，1641，1462，1185cm—1,Hand13C醒R數(shù)據(jù)，見表I;FABMS:m/z254[M+H]+(100)，206(9);HRESIMSm/z276.0843(calcdfor[M+Na]+276.0847)。AcortatarinB結構式如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>AcortatarinB:白色無定形固體，熔點151_153°C;[a]27D_92.73(c0.10，MeOH);UV(Me0H)入max(loge):295(4.05)，255(3.63)nm;IR(KBr)vmax:3427,2923,2852，1640，1033cm—1,Hand13CNMR數(shù)據(jù)，見表1;FABMS:m/z270[M+H]+(81)，255(23)，225(100)，207(31)，193(10)，179(6)，163(33)，115(35)，74(22);HRESIMSm/z292.0803(calcdfor[M+Na]+292.0797).表I.'H(500MHz)and13CNMR(125MHz)DataofIandII1II《c24.03(ddd,4.9，4.9,89.3(d)3.87(ddd，7.7,7.1，84.0(d)3.7)3.3)34.24(ddd，8.5，4.9，72.3(d)4.06(t,7.7)75.9(d)2.4)4a2.10(dd，14.0，2.4)45.8(t)3.91(d,7.7)肌9(d)4b2.29(dd,14.0,8.5)5104.5100.5(s)(s)4.80(d,15.9)58.7(t)4.88(d,15.4)58.5(t)7b4.96(d,15.9)5.13(d，15.4)8137.6137.3(s)(s)10a4.17(d，14.0)52.0(t)4.30(d,13.7)50.7(t)10b4.55(d，14.0)4.50(d，13.7)116.08(d，4.3)106.16.08(d,4.4)106.2(d)(d)126.98(d，4.3)125.97.03(d，4.4)126.1(d)(d)13132.4132.6(s)(s)149.32(s)180.29.37(s)180.3(d)(d)15a3.57(dd,12.2,4.9)63.0(t)3.61(dd,12.1,7.1)64.7(t)15b3.65(dd，12.2，3.7)3.72(dd，12.1,3.3)實施例2:按實施例1的方法制得AcortatarinsA或B，按常規(guī)法加注射用水，精濾，灌封滅菌后可制成注射液。實施例3:按實施例1的方法制得AcortatarinsA或B，將其溶于無菌注射用水中，用無菌漏斗過濾，分裝，低溫冷凍干燥后無菌熔封即得粉針劑。實施例4:按實施例1的方法制得AcortatarinsA或B，按常規(guī)法配以各種藥用輔料可制成片劑AcortatarinsA或B組合藥物劑型_片劑使用AcortatarinsA或B作為藥物活性成分，使用幾種賦形劑作為制備組合藥物片劑的輔料成分，按照一定比例配比制成每片含有AcortatarinsA或B藥物成分560mg的片劑樣品，表2給出普通片劑的配方比例。表2AcortatarinsA或B組合藥物片劑的原料藥和輔料配方<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將一定數(shù)量AcortatarinsA或B原料與賦形劑輔料制備成不同劑量片劑制劑的方法是將幾種賦形劑輔料與原料藥均勻混合，加入1%羥甲基纖維素鈉溶液適量制成軟料，過篩制粒，濕粒烘干并過篩整粒，加入硬脂酸鎂和滑石粉混合均勻后壓片即得。實施例5:按實施例1的方法制得AcortatarinsA或B，按常規(guī)法配以各種藥用輔料可制成膠囊劑AcortatarinsA或B組合藥物劑型_膠囊的制備含有AcortatarinsA或B作為有效成分的藥物組合膠囊制劑的制備，使用AcortatarinsA或B作為藥物活性成分、使用幾種賦形劑作為制備組合藥物膠囊劑的輔料成分，按照一定比例配比制成每粒膠囊中含有AcortatarinsA或B藥物成分550mg的膠囊制劑，表3給出普通膠囊制劑的配方比例表3AcortatarinsA或B組合藥物膠囊制劑的原料藥和輔料配方<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>將一定數(shù)量的AcortatarinsA或B與賦形劑輔料制備成膠囊制劑的方法是將幾種賦形劑輔料與AcortatarinsA或B原料藥混合均勻，加入1%羥甲基纖維素鈉溶液適量，制成濕粒烘干過篩整粒，加入硬脂酸鎂混合均勻，插入膠囊制得；或不使用制粒步驟，而直接將AcortatarinsA或B原料藥與幾種賦形劑輔料混合均勻，過篩后，直接裝入膠囊制得。實施例6:本發(fā)明化合物AcortatarinsA或B及其與藥用輔料組成的藥物組合物的抗糖尿病腎病或慢性腎病的藥理作用?？鼓I系膜細胞活性氧實驗參照文獻方法(WeiXF，ZhouQG，HouFFetal.AdvancedoxidationproteinproductsinducemesangialcellperturbationthroughPKC—d印endentactivationofNADPHoxidase.AmJPhysiolRenalPhysiol2009;296:F427_F437)，大鼠系膜細胞株(HBZY-l，Life-ScienceAcademyofWuhanUniversity,Wuhan，China)在37。C條件下，培養(yǎng)在pH值為7.4的DMEM(Invitrogen，Carlsbad,CA)培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad,CA)，2mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素禾口100iig/ml鏈霉素。細胞融合達到80%時，采用含有0.5%胎牛血清的培養(yǎng)液饑餓24小時，使細胞同步化于GO期，用于后續(xù)實驗。為了檢測結構I和II的作用，系膜細胞首先與不同濃度的結構I，II或胞漿型Cu/Zn過氧化物歧化酶(c-S0D，anintracellularsuperoxidescavenger,SigmaChemicalCo.，St.Louis，M0)預孵育1小時，然后以5.6mM(normalglucose,NG)或25mM(highglucose，HG)的D_葡萄糖(XiaL，WangH，M皿kSetal.Reactiveoxygenspecies,PKC_P1，andPKC_4mediatehigh_glucose_inducedvascularendothelialgrowthfactorexpressioninmesangialcells.AmJPhysiolEndocrinolMetab2007;293:E1280-E1288)剌激不同時間，觀察各項指標。[OO55]細胞活力測定采用臺盼藍排斥實驗檢測細胞活力。參照文獻(FrankS，ZacharowskiK，WrayGMetal.Identificationofcopper/zincsuperoxidedismutaseasanovelnitricoxide—regulatedgeneinratglomerularmesangialcellsandkidneysofendotoxemicrats.FASEBJ1999;13:869-882)，胰蛋白酶消化搜集細胞，系膜細胞懸液與0.4X臺盼藍(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)以l:1體積混合，室溫反應3分鐘，以細胞計數(shù)器計數(shù)細胞。臺盼藍拒染細胞為活細胞，臺盼藍染色的細胞為死細胞。細胞內活性氧(reactiveoxygenspecies,R0S)含量測定細胞內ROS含量采用熒光探針carboxymethyl-H2-dichlorofluoresceindiacetate(CM-H2-DCF-DA，SigmaChemicalCo.，St.Louis，M0)染色，流式細胞儀檢測(XiaL，WangH，GoldbergHJetal.MesangialcellNADPHoxidaseupregulationinhighglucoseisproteinkinaseCdependentandrequiredforcollagenIVexpression.AmJPhysiolRenalPhysio12006;290:F345_F356)。消化搜集細胞，與CM-H2-DCF-DA(1iiM)孵育30分鐘。以流式細胞儀(BDFACSCalibursystem,FranklinLakes，NJ)測定熒光強度(激發(fā)波長A二488nm，發(fā)射波長A=515nm)。每組R0S含量用各組細胞熒光強度與正常糖濃度培養(yǎng)的細胞熒光強度的比值表示，結果以細胞總蛋白含量進行校正(RygielTP，MertensAE，StrumaneKetal.TheRacactivatorTiamlpreventskeratinocyteapoptosisbycontrollingR0S_mediatedERKphosphorylation.JCellSci2008;121:1183-1192)。統(tǒng)計學分析所有實驗重復三次。連續(xù)變量表示為均數(shù)±標準差，采用單因素方差分析進行比較，SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析。方差齊時采用Student-Newman-Keuls法進行比較，方差不齊時采用Dimnett'sT3法進行比較。雙尾檢驗P值小于0.05認為具有統(tǒng)計學差異。結果AcortatarinsA和B抑制了高糖誘導的系膜細胞R0S生成。本實驗結果顯示，高糖誘導了系膜細胞ROS生成，這與先前的報道(XiaL，WangH，MunkSetal.Reactiveoxygenspecies,PKC_P1，andPKC_mediatehigh_glucose_inducedvascularendothelialgrowthfactorexpressioninmesangialcells.AmJPhysiolEndocrinolMetab2007;293:E1280_E1288。XiaL，WangH，GoldbergHJetal.MesangialcellNADPHoxidaseupregulationinhighglucoseisproteinkinaseCdependentandrequiredforcollagenIVexpression.AmJPhysiolRenalPhysiol2006;290:F345_F356。HaH，YuMR，ChoiYJetal.Roleofhighglucose—inducednuclearfactor—kBactivationinmonocytechemoattractantprotein_lexpressionbymesangialcells.JAmSocNephrol2002;13:894-902)—致。為了檢測AcortatarinsA和B能否抑制高糖誘導系膜細胞R0S的過量產(chǎn)生，系膜細胞首先與不同濃度的AcortatarinsA和B或c-SOD(陽性對照)預先孵育，然后以高糖剌激3小時。如圖Figure1A&B所示，高糖誘導的系膜細胞R0S的產(chǎn)生明顯被AcortatarinA抑制，AcortatarinB也表現(xiàn)出輕度的抑制效應。AcortatarinsA和B的抗氧化活性呈劑量依賴性，并且分別在10iiM(AcortatarinA)和50yM(AcortatarinB)達到最大抑制效應。為了進一步證明AcortatarinA在系膜細胞的抗氧化效應，系膜細胞與10yM的AcortatarinA或100u/ml的c-S0D預先孵育1小時，然后以5.6或25mM的D_葡萄糖孵育l到24小時。如圖Figure1C所示，高糖以時間依賴方式誘導系膜細胞R0S產(chǎn)生。而通過檢測不同時間點的R0S結果顯示，AcortatarinA幾乎減少了一半R0S的產(chǎn)生量。為了排除AcortatarinsA和B對于細胞的毒性影響，每次實驗結束均采用臺盼藍排斥實驗檢測細胞活力。結果顯示各組間沒有統(tǒng)計學差異(數(shù)據(jù)未顯示)。此項結果顯示AcortatarinsA和B對于高糖培養(yǎng)的系膜細胞具有抗氧化效應。AcortatarinsA和B抑制高糖誘導的系膜細胞R0S產(chǎn)生(見圖1所示)A&B，系膜細胞與不同濃度的AcortatarinA和B，或c_S0D預孵育1小時，再以高糖剌激3小時；C，系膜細胞與10iiMAcortatarinA或100u/mL的c-SOD預孵育1小時，然后以正常濃度5.6mM(NG)或高濃度25mM(HG)D_葡萄糖剌激1到24小時。以DCFH染色，流式細胞儀測定ROS的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)以3次獨立實驗的均數(shù)±標準差表示。ANOVA，p<0.001，在圖A，B，和C;*p<0.05vsNG;#p<0.05vsHG.腎系膜細胞株炎癥因子測定實驗(見圖2所示)采用美國ADL公司ELISA試劑盒檢測大鼠系膜細胞培養(yǎng)上清IL_6，MCP-l，CollagenI，CollagenIV表達。圖2A為IL-6表達；圖2B為MCP-1表達；圖2C為CollagenI表達；圖2D為CollagenIV表達。實驗原理采用雙抗體夾心法測定標本中大鼠系膜細胞培養(yǎng)上清MCP-1(IL-6、CollagenIV、CollagenI)水平。用純化的抗-MCP-1(IL-6、CollagenIV、CollagenI)抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被單抗的微孔中依次加入大鼠MCP-1(IL-6、CollagenIV、Collagenl)，再與HRP標記的MCP-1(IL-6、CollagenIV、CollagenI)抗體結合，形成抗體_抗原_酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MCP-l、IL-6、CollagenIV、CollagenI呈正相關。用酶標儀450nm波長下測定吸光度(0D值)，通過標準曲線計算樣品中大鼠MCP-1、IL-6、CollagenIV、Collagenl濃度。樣本處理1)細胞培養(yǎng)上清無菌管收集，2，000rpm/min，離心20min。仔細收集上清。分裝凍存于-80。C。2)刮取底壁細胞，總蛋白裂解液裂解，12，000rpm/min，4t:離心10min，收集上清，Bradford法測量總蛋白含量。ELISA檢測，操作按試劑盒說明進行1)標準品的稀釋與加樣酶標包被板設標準品孔，倍比稀釋(稀釋后各孔加樣量都為50ii1)加入標準品MCP-1(IL-6、CollagenIV、CollagenI)。2)加樣分別設空白孔(空白對照孔不加樣品和酶標試劑，其余各驟操作相同)、待測樣品孔(樣品稀釋度為5倍)。輕輕晃動混勻。3)溫育37。C，30min。4)洗滌5)加酶6)溫育7)洗滌8)顯色9)終止棄去板中液體，甩干，洗液洗5次，30秒/次。吸水紙拍干。每孔加入50ii1酶標記液，空白孔除外。37。C，30min。棄去板中液體，甩干，洗液洗5次，30秒/次。吸水紙拍干。每孔加入底物A、B液各50iU/孔。37°C，15min。避光。每孔加入終止液各50ii1/孔。10)測定以空白孔調零，酶標儀450nm讀吸光度(0D值)。11)實驗重復3次。結果計算CurveE鄧ertl.3擬合曲線分析計算樣品濃度并以細胞總蛋白含量校正(MCP-l&IL_6:pg/mgcellprotein;CollagenIV&CollagenI:ng/mgcellprotein)。結果如圖所示。其中AcortatarinA對應圖中SCP_88。以上結果說明AcortatarinA(I)對高糖誘導的腎系膜細胞株炎癥因子IL_6，MCP-l，CollagenI和CollagenIV有明顯的抑制作用，而這些細胞因子在糖尿病腎病病理發(fā)展過程中起著重要作用，因此上述藥理實驗顯示本發(fā)明的化合物對糖尿病腎病的防治價值。本發(fā)明化合物從結構上講比較新穎，并且結構中含有藥物化學領域公認的重要的藥效官能團，整個化合物結構具有成藥性。采取針對性的篩選糖尿病腎病公認的高糖誘導腎系膜細胞株模型，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物能顯著抑制活性氧和幾種炎癥因子(IL-6，MCP-l，Collagenl、CollagenIV)，因此表明該發(fā)明化合物在糖尿病腎病及慢性腎病防治中具有重要價值，可用于糖尿病腎病和慢性腎病的防治。權利要求具有下述結構式的螺環(huán)生物堿化合物AcortatarinsA(I)和B(II)，F(xiàn)SA00000022928100011.tif2.制備權利要求1螺環(huán)生物堿AcortatarinsA(I)和B(II)的方法，取干燥粉碎的石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott.)根莖，用水煎煮提取二次，過濾，合并濾液；殘渣用95%乙醇回流提取一次，過濾，濾液與水液合并，減壓濃縮得提取物，提取物混懸于水中，依次用乙酸乙酯、正丁醇充分萃取，等體積各萃取三次，正丁醇萃取物經(jīng)硅膠柱層析200-300目硅膠，氯仿-甲醇-水梯度洗脫9:i，8:2，8:2:o.2，7:3:o.i，7:3:o.5;每個梯度洗脫體積為4L;每份接收lOOOmL，薄層層析，10%硫酸乙醇顯色，根據(jù)斑點相同進行合并，得到八個組份，其中組份IV經(jīng)MCIgelCHP20P柱層析；甲醇-水梯度洗脫，10%，20%，30%，35%，40%;每個梯度洗脫溶劑量為2倍柱體積，每個梯度收集2份，共得到四個組份A-D，其中第四個柱體積洗脫時收集的組份B經(jīng)S印hadexLH-20甲醇洗脫，得到含有化合物I和II的組份，上述顯色劑呈現(xiàn)黃色斑點，該組份進一步經(jīng)半制備高效液相色譜Agilent1100HPLCsystem,ZorbaxSB-C_18，Agilent,9.4mmX25cm，甲醇-水20:80純化得化合物I和II。3.藥物組合物，其中含有治療有效量的權利要求l的化合物和藥學上可接受的載體。4.預防和治療糖尿病性腎病的藥物，其中含有治療有效量的權利要求1的化合物和藥學上可接受的載體。5.權利要求1中化合物在制備抗糖尿病腎病的藥物中的應用。6.權利要求1中化合物在制備抗慢性腎病的藥物中的應用。7.權利要求1中化合物在制備保健食品中的應用。全文摘要具有下述結構式的化合物AcortatarinsA(I)和B(II)，是一類來自著名中藥石菖蒲中的螺環(huán)生物堿，具有天然罕見且藥物化學中被認為是重要藥效團的嗎啉環(huán)結構，此類化合物的制備方法及其在制備抗糖尿病性腎病和慢性腎病藥物或食品中的應用。文檔編號A61P3/10GK101775026SQ20101010501公開日2010年7月14日申請日期2010年2月3日優(yōu)先權日2010年2月3日發(fā)明者仝曉剛,侯凡凡,呂青,周麗麗,梁敏,程永現(xiàn)申請人:中國科學院昆明植物研究所;南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院