專利名稱：：三葉草提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及三葉草提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
：肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，是我國位居第二的癌癥"殺手"，常見于中年男性。因其惡性度高、病情進展快，病人早期一般沒有什么不適，但一旦出現癥狀就診，就已經屬于中晚期。故肝癌的治療難度大，一般患者發(fā)病后生存時間僅為6個月，人稱"癌中之王"。根據調查結果表明，目前男性前三位的新發(fā)癌癥分別是肺癌、結腸癌和鼻咽癌，女性則是乳癌、結腸癌及肺癌，充分說明了肺癌和結腸癌在新發(fā)癌癥群中的危害性。從植物中尋找高效低毒的抗癌藥物，成為國內外抗癌藥物研究的重點。有效的抗癌化合物和中草藥有效部位的抗癌復方制劑都具有重要的臨床價值。三葉草(7^'/bh'鵬prate/^eL.)，《中國植物志》中又稱為紅車軸草、紅三葉，為豆科植物車軸草屬，原產于歐洲中部，引種到世界各國，我國南北各省區(qū)均有種植，并見逸生于林緣、路邊、草地等濕潤處?！吨袊幹矆D鑒》記載鎮(zhèn)痙，止咳，上喘。全草制成軟膏，治局部潰瘍。三葉草在制備抗腫瘤藥物中的應用未見有報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供三葉草提取物的一種新用途。本發(fā)明所提供的三葉草提取物的用途是三葉草提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用；所述三葉草提取物按照如下方法制備用水和/或有機溶劑作為提取劑，從三葉草中提取得到三葉草提取物。其中，所述有機溶劑具體可為甲醇、乙醇、石油醚、氯仿、二氯甲垸、乙酸乙酯、正丁醇、苯或甲苯。所述提取劑具體可為體積百分含量為95%的乙醇水溶液。所述提取可為回流提取。所述提取中，提取的溫度可為60-10(TC。所述提取至少提取一次，每次提取的時間為1-4小時。在如上任一所述中，所述腫瘤具體可為肝癌、結腸癌或肺癌。根據如上方法所制備的預防和/或治療腫瘤藥物可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法導入機體如肌肉、皮內、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質混合或包裹后導入機體。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。如上制備的預防和/或治療腫瘤藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備。上述預防和/或治療腫瘤藥物的用量一般為200-800mg三葉草提取物/kg體重/天，療程為10至15天。本發(fā)明制備三葉草提取物的方法簡單.、成本低廉。實驗證明，本發(fā)明的三葉草提取物能夠有效的抑制人腫瘤細胞的生長，如人肝癌、結腸癌或肺癌細胞。因此本發(fā)明所提供的三葉草提取物對制備抗腫瘤藥物，尤其是抗肝癌、肺癌、結腸癌藥物具有重要的意義。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例l、三葉草提取物的制備取三葉草(寧波德康生物制品有限公司)200g，將其以1:3(三葉草95%乙醇)的重量份數比與95。/。乙醇(乙醇水=95:5，體積比)混合，在6(TC條件下回流提取3h，抽濾，收集第一次回流提取液1和濾渣h將得到的所有濾渣l與95%乙醇混合，95%乙醇的量與第一次相同，在60。C條件下提取3h，收集第二次回流提取液2和濾渣2，并將提取液2與提取液1合并；將得到的所有濾渣2與95%乙醇混合，95%乙醇的量與第一次相同，6(TC回流提取3h，抽濾，收集第三次回流提取液3;將提取液l、提取液2和提取液3合并，將所得的提取液進行真空減壓濃縮、真空干燥(去除乙醇和水)至恒重，得到1.15g三葉草提取物。實施例2、三葉草提取物在抑制腫瘤細胞生長中的應用將對數生長的腫瘤細胞(人肝癌細胞BEL-7402、人結腸癌細胞HCT-8、人肺癌細胞A-549)用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用含10%(體積百分含量)胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基懸浮細胞，制成細胞懸液，并分別將各腫瘤細胞稀釋至1.0xl()S個/mL，再將其接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔200uL，各腫瘤細胞分別接種6個孔(包括實驗組3個和對照組3個)，于37。C，5。/。CG)2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h;然后傾去各孔培養(yǎng)液。將實施例1制得的三葉草提取物溶解于DMSO中，然后用DMEM完全培養(yǎng)基進行稀釋，得到三葉草提取物的溶液，三葉草提取物的終濃度為50ug/mL，其中，DMSO的濃度為10%(體積百分含量)。同時設實驗組、對照組進行實驗實驗組將三葉草提取物溶液依次分別加入上述腫瘤細胞BEL-7402、HCT-8、A-549的培養(yǎng)孔內，各自接種3個孔，每孔加入200ul;對照組向上述各腫瘤細胞的培養(yǎng)孔內加入含10%(體積百分含量)DMSO的DMEM完全培養(yǎng)基，各自接種3個孔，每孔加入200ul;將以上各組的培養(yǎng)板同時置于37t:、5%(:02的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2天。2天后向每孔加入20ul新鮮配制的5mg/ml四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液，并在37。C、5。/。C02的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h;小心棄上清，每孔加入200uLDMSO，室溫放置15-20min,每5min振蕩一次；在酶標儀上測定各孔在波長490nm處的光密度值(OD值)，按公式計算腫瘤細胞生長抑制率。抑制率(％)=(OD，,OD實驗)/OD對照x濯％。實驗設三次重復，結果取平均數。三葉草提取物對人不同腫瘤細胞BEL-7402、HCT-8、A-549的抑制作用的結果如表l所示。表1、三葉草提取物對人不同腫瘤細胞的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>三葉草提取物對腫瘤細胞的抑制作用實驗結果表明(表l)，三葉草提取物在濃度為50ug/mL時對人肝癌細胞BEL-7402、結腸癌細胞HCT-8和肺癌細胞A-549均有一定程度的抑制作用。因此，三葉草提取物可以用于制備抗肝癌、結腸癌、肺癌的藥物。權利要求1、三葉草提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用；所述三葉草提取物按照如下方法制備用水和/或有機溶劑作為提取劑，從三葉草中提取得到三葉草提取物。2、根據權利要求l所述的應用，其特征在于所述有機溶劑為甲醇、乙醇、石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、苯或甲苯。3、根據權利要求l所述的應用，其特征在于所述提取劑為體積百分含量為95%的乙醇水溶液。4、根據權利要求l-3中任一所述的應用，其特征在于所述提取為回流提取。5、根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述提取的溫度為60-10(TC。6、根據權利要求4或5所述的應用，其特征在于所述提取中，至少提取一次，每次提取的時間為l-4小時。7、根據權利要求1至6中任一所述的應用，其特征在于所述腫瘤為肝癌、結腸癌或肺癌。全文摘要本發(fā)明公開了三葉草提取物的新用途。該新用途是三葉草提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述提取物是按照如下方法制備的以三葉草為原料，用水和/或有機溶劑提取得到的。本發(fā)明所提供的三葉草提取物對制備抗腫瘤藥物，尤其是抗肝癌、肺癌、結腸癌藥物具有重要的意義。文檔編號A61K36/48GK101347493SQ200810119398公開日2009年1月21日申請日期2008年9月5日優(yōu)先權日2008年9月5日發(fā)明者巖劉,向俊鋒,唐亞林,瑋戴,莉譚申請人:中國科學院化學研究所