含有利多卡因的抗腫瘤藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物，具體而言是一種用于治療膀胱癌的含有利多卡因的 抗腫瘤藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在美國為第四位常見腫瘤，在我國則 排名第八位。90%的膀胱癌是移行細(xì)胞癌，其中70%是淺表性膀胱癌，即腫瘤局限于膀胱粘 膜固有層。膀胱癌復(fù)發(fā)率較高。單純手術(shù)治療者約有40%_70%在兩年內(nèi)復(fù)發(fā)，其中淺表性 膀胱癌五年的復(fù)發(fā)率可達(dá)90%，約有10%可進(jìn)展為浸潤性膀胱癌。根據(jù)膀胱癌易復(fù)發(fā)的特 點(diǎn)，實(shí)行術(shù)后藥物膀胱灌注可以達(dá)到清除殘余瘤體，預(yù)防復(fù)發(fā)和延緩進(jìn)展的目的。
[0003] 卡介苗（BacilleCalmette-Guerin,BCG)是最早用于膀胱腔內(nèi)灌注預(yù)防與治 療膀胱腫瘤的，其療效也得到了公認(rèn)。國外的研究報(bào)道術(shù)后膀胱內(nèi)灌注BCG的療效為 30°/『90%不等，是膀胱灌注治療中效果最為理想的藥物。但由于BCG具有較強(qiáng)的抗原性、致 敏性及殘余毒性，其帶來的并發(fā)癥也較多，主要表現(xiàn)為膀胱炎、發(fā)熱及結(jié)核感染，這些不良 反應(yīng)使BCG在臨床上難以推廣使用。而且目前在我國未有一家生物制品研究所的BCG獲 得膀胱灌注治療腫瘤的制藥許可證。
[0004] 由于BCG的毒副反應(yīng)較大，人們開始試用抗癌藥物膀胱腔內(nèi)灌注降低術(shù)后的復(fù)發(fā) 率。1955年Battmem報(bào)導(dǎo)了噻替派局部化療對(duì)惡性腫瘤有效，Johnts等也報(bào)導(dǎo)了膀胱內(nèi) 灌注噻替派可以治愈殘留移行細(xì)胞癌并明顯降低腫瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)。但長期隨訪研究資料表 明，目前的治療仍不能降低遠(yuǎn)期的腫瘤復(fù)發(fā)率，這也成為膀胱腫瘤治療中需要解決的關(guān)鍵 問題之一。國內(nèi)許多學(xué)者也在提高膀胱灌注化療效果方面作了研究報(bào)道。灌注藥物多為臨 床常用的抗腫瘤藥。如：塞替派（TSPA)、阿霉素（ADM)、絲裂霉素（MMC)、順鉑（DDP)、吡柔比 星（THP)、羥基喜樹堿（0ΤΡ)等。膀胱腔內(nèi)灌注化療藥對(duì)淺表性膀胱癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率有明 顯的降低作用，報(bào)道為15°/p60%不等。臨床實(shí)踐中我們發(fā)現(xiàn)使用膀胱灌注化療藥物均會(huì)有 程度不同毒副反應(yīng)的發(fā)生，比如骨髓抑制，化學(xué)性膀胱炎，接觸性皮炎，膀胱短暫性痙攣，膀 胱刺激不適感以及發(fā)熱，全身不適等癥狀。同時(shí)在臨床上還會(huì)遇到對(duì)多種抗腫瘤藥均不敏 感的病例，給治療工作造成了困難。
[0005] 利多卡因（lidocaine)又名賽羅卡因（xylocaine)，利多卡因分子式：C14H22N20,鹽 酸利多卡因分子式：(：14!123(：1隊(duì)0，性狀 ：白色結(jié)晶粉末，化學(xué)名以-二乙氨基乙酰-2,6-二甲 基苯胺。是目前應(yīng)用最多的局麻藥。相同濃度下與普魯卡因相比，利多卡因具有起效快、作 用強(qiáng)而持久、穿透力強(qiáng)及安全范圍較大等特點(diǎn)，同時(shí)無擴(kuò)張血管作用及對(duì)組織幾乎沒有刺 激性?？捎糜诙喾N形式的局部麻醉，有全能麻醉藥之稱，主要用于傳導(dǎo)麻醉和硬膜外麻醉。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種在正常體溫狀態(tài)下，提高腫瘤治療效果并在 腫瘤的局部用藥治療時(shí)降低局部疼痛的含有利多卡因的抗膀胱癌藥物。
[0007] 為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種含有利多卡因的抗腫瘤藥 物，是將利多卡因溶于醫(yī)學(xué)上可接受的溶劑中制成溶液，利多卡因濃度為1. 25mg/ml-5mg/ ml〇
[0008] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的溶液中含有抗膀胱癌的灌注藥物，與利多卡因組合 成灌注液，抗膀胱癌灌注藥物在溶液中的含量是醫(yī)學(xué)上可以接受的通常劑量。所述的抗膀 胱癌的灌注藥物優(yōu)選自絲裂霉素、吡柔比星、蘇復(fù)寧洗液和羥喜樹堿中的任意一種。
[0009] 作為另一種優(yōu)選的方案，所述的醫(yī)學(xué)上可接受的溶劑是生理鹽水和水。
[0010] 使用方法是將上述藥液配制好后立即使用，用導(dǎo)尿管將藥液灌注入膀胱腔內(nèi)，并 使藥液在膀胱腔內(nèi)保留60-90分鐘后，自行排出即可。
[0011] 本發(fā)明同時(shí)還要求保護(hù)利多卡因在制備抗膀胱癌藥物中的應(yīng)用。
[0012] 利多卡因作為一種麻醉劑應(yīng)用多年，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，利多卡因?qū)δ[瘤細(xì) 胞也具有一定的抑制作用。利多卡因在一定濃度下能夠直接抑制腫瘤細(xì)胞，且抑制效果隨 著藥物濃度的升高而增強(qiáng)。在與抗腫瘤藥物組合應(yīng)用時(shí)，利多卡因能夠增強(qiáng)抗腫瘤藥物的 抑瘤作用，提高化療藥物的抗腫瘤作用，這一發(fā)現(xiàn)可以擴(kuò)大利多卡因在腫瘤的治療中的作 用，特別是在腫瘤的局部用藥治療時(shí)降低化療藥物對(duì)機(jī)體的刺激性及毒性作用，降低局部 疼痛，提高腫瘤治療效果的作用。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 實(shí)施例1 利多卡因單用或與絲裂霉素組合對(duì)人膀胱癌細(xì)胞BIU-87抑制作用的影響。
[0014] 以人膀胱癌細(xì)胞株BIU-87為靶細(xì)胞，采用MTT比色法檢測(cè)利多卡因、絲裂霉素單 用和組合應(yīng)用對(duì)靶細(xì)胞的抑制作用。
[0015] 1材料 1.1細(xì)胞株人膀胱癌細(xì)胞株BIU-87,山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科楊曉峰主 任惠贈(zèng)。
[0016] 1.2藥物鹽酸利多卡因注射液，規(guī)格：10ml:0. 2g，批號(hào)：20141118,有效期至 2017. 10;注射用絲裂霉素，規(guī)格：2mg，批號(hào)：130803,有效期至2016. 07,浙江海正藥業(yè)股份 有限公司。
[0017] 1.3試劑及耗材RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四 季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶購自上海生工生物工程有限公司，四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)，購自Solarbio公司，二甲基亞砜（DMS0)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司。96孔 細(xì)胞培養(yǎng)板，購自加拿大BBI公司。
[0018] 1.4儀器生物安全柜，青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；C02培養(yǎng)箱，美國 NuAire公司NU-5500E;倒置顯微鏡，德國Leica090-135. 001 ;光學(xué)顯微鏡，日本Olympus CX21FS1;精密電子天平，日本島津制作所AEG-220 ;SunRise酶標(biāo)儀，奧地利Tecan公司。
[0019] 2實(shí)驗(yàn)方法 2. 1細(xì)胞培養(yǎng)BIU-87細(xì)胞培養(yǎng)于含0· 05g/L鏈霉素、0· 05g/L青霉素、0· 8g/LNaHC03、 3. 6g/LHEPES、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37°C、5%C02及飽和濕度的恒溫孵育箱 中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以〇. 25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0020] 2.2實(shí)驗(yàn)分組陰性對(duì)照組，絲裂霉素單獨(dú)作用組（0.66mg/ml)，利多卡因不同濃 度單獨(dú)作用組（5mg/ml、2. 5mg/ml、l. 25mg/ml)，絲裂霉素與利多卡因聯(lián)合用藥組。
[0021] 2. 2MTT法檢測(cè)BIU-87細(xì)胞抑制率 BIU-87細(xì)胞以5X103個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔加入培養(yǎng)基100ul，置于37°C、5%C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)24h，棄去原培養(yǎng)基，按上述分組方法加入含有不同濃度藥 物的培養(yǎng)基200ul，陰性對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)基，并設(shè)立無細(xì)胞的培養(yǎng)基為調(diào)零組，每組 設(shè)5個(gè)復(fù)孔。加藥2h后向每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去孔內(nèi) 培養(yǎng)液，每孔加入150ulDMS0,置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀測(cè)定在 570nm波長下的吸光值（0D值)。計(jì)算各組對(duì)BIU-87細(xì)胞的抑制率。
[0022] 細(xì)胞抑制率（％) = (1-實(shí)驗(yàn)組平均0D值/對(duì)照組平均0D值）X100% 2. 3統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采 用檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用71·?檢驗(yàn)。代0. 05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0023] 3 結(jié)果 利多卡因單藥（1. 25、2. 5、5mg/ml)的細(xì)胞抑制率分別為45. 91%、62. 16%、80. 00% (K0. 05)，絲裂霉素單藥（0. 66mg/ml)的細(xì)胞抑制率為90. 45% (K0. 05)，不同濃度的 利多卡因與絲裂霉素聯(lián)合用藥均對(duì)靶細(xì)胞的抑制作用較絲裂霉素單藥明顯增強(qiáng)，分別為 94. 77%、96. 14%和97. 95% (K0. 05)。利多卡因單用對(duì)人膀胱癌細(xì)胞BIU-87有明顯的抑制 作用；利多卡因與絲裂霉素聯(lián)合用藥對(duì)人膀胱癌細(xì)胞BIU-87的抑制有增效作用。（表1)。
[0024] 表1利多卡因與絲裂霉素單用以及兩藥組合對(duì)BIU-87細(xì)胞的抑制率
注：*與對(duì)照組比較代0. 05,A與絲裂霉素比較代0. 05 實(shí)施例2 利多卡因單用或與吡柔比星組合殺傷BIU-87細(xì)胞的影響。
[0025] 以人膀胱癌細(xì)胞株BIU-87為靶細(xì)胞，采用MTT比色法檢測(cè)吡柔比星單用和組合應(yīng) 用利多卡因?qū)Π屑?xì)胞的抑制作用。
[0026] 1材料 1.1細(xì)胞株人膀胱癌細(xì)胞株BIU-87,山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科楊曉峰主 任惠贈(zèng)。
[0027] 1.2藥物鹽酸利多卡因注射液，規(guī)格：10ml:0. 2g，批號(hào)：20141118,有效期至 2017. 10 ;注射用鹽酸吡柔比星，規(guī)格：10mg，批號(hào)：1410C15,有效期至2016. 09,深圳萬樂藥 業(yè)有限公司。
[0028] 1.3試劑及耗材RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四 季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶購自上海生工生物工程有限公司，四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)，購自Solarbio公司，二甲基亞砜（DMSO)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司。96孔 細(xì)胞培養(yǎng)板，購自加拿大BBI公司。
[0029] 1.4儀器生物安全柜，青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；C02培養(yǎng)箱，美國 NuAire公司NU-5500E;倒置顯微鏡，德國Leica090-135. 001 ;光學(xué)顯微鏡，日本Olympus CX21FS1 ;精密電子天平，日本島津制作所AEG-220;SunRise酶標(biāo)儀，奧地利Tecan公司。
[0030] 2實(shí)驗(yàn)方法 2. 1細(xì)胞培養(yǎng)BIU-87細(xì)胞培養(yǎng)于含0· 05g/L鏈霉素、0· 05g/L青霉素、0· 8g/LNaHC03、 3. 6g/LHEPES、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37°C、5%C02及飽和濕度的恒溫孵育箱 中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以〇. 25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0031] 2.2實(shí)驗(yàn)分組陰性對(duì)照組，吡柔比星單獨(dú)作用組（0.75mg/ml)，利多卡因不同濃 度單獨(dú)作用組（5mg/ml、2. 5mg/ml、1. 25mg/ml)，吡柔比星與利多卡因聯(lián)合用藥組。
[0032] 2. 2MTT法檢測(cè)BIU-87細(xì)胞抑制率 BIU-87細(xì)胞以1. 3X104個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔加入培養(yǎng)基100ul，置于37°C、 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，按上述分組方法加入含有不同濃度藥物的 培養(yǎng)基200ul，陰性對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)基，并設(shè)立無細(xì)胞的培養(yǎng)基為調(diào)零組，每組設(shè)