專(zhuān)利名稱(chēng)：一種樹(shù)狀聚合物靶向納米粒子及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種納米醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種樹(shù)狀聚合物耙向納 米粒子及其制備和應(yīng)用。
技術(shù)背景樹(shù)狀聚合物(Dendrimer)是一種人工合成、具有精確結(jié)構(gòu)的納米粒子。 其分子量大小可精細(xì)調(diào)控，藥代動(dòng)力學(xué)行為具有可重復(fù)性。在其合成過(guò)程中， 可以人工調(diào)控聚合物的體積、形態(tài)以及末端基團(tuán)的種類(lèi)。樹(shù)狀聚合物具有溶 解性高、粘附性低、高反應(yīng)性以及可與其他物質(zhì)混合等特點(diǎn)，可以作為單分 子納米粒子運(yùn)載藥物或基因。更為重要的是樹(shù)狀聚合物無(wú)免疫原性、無(wú)遺傳 毒性與細(xì)胞毒性，不會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)、不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與細(xì)胞死 亡，是理想的免疫靶向藥物。近年來(lái)，靶向納米藥物的研制成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域中十分活躍的研究方向， 特別是針對(duì)腫瘤治療的納米粒子的研究。通過(guò)控制組成、形狀和尺寸，人們 能夠定制所需要的納米復(fù)合顆粒，從而滿足特定領(lǐng)域的需要。納米尺度效應(yīng)機(jī)理說(shuō)明就藥物傳輸載體而言，納米尺度范圍內(nèi)的顆粒 尺寸變化會(huì)強(qiáng)烈地影響其在血液中的循環(huán)時(shí)間和體內(nèi)的生物分布。通常粒徑 小于IO納米的微粒在人體中通過(guò)溢出作用和新陳代謝作用很快就被除去。正 常組l只血管的內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密，間隙小， 一般小于8納米；而癌變組織中 血管壁1勺間隙要大得多，在100 800納米之間。因此合成10 100納米的表面 包被PEG的樹(shù)狀聚合物納米復(fù)合粒子，能有效躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的吞噬作用， 在主動(dòng)靶向和被動(dòng)靶向的導(dǎo)向下高濃度聚集于肺部。在樹(shù)狀聚合物中使用帶有靶向殘基的PEG修飾部分羧基具有以下優(yōu)勢(shì) (1)納米粒子的表面親脂性越大其對(duì)調(diào)理蛋白的結(jié)合力越強(qiáng)，吞噬細(xì)胞 對(duì)其吞噬也越強(qiáng)。表面PEG的引入可有效增強(qiáng)樹(shù)狀聚合物的親水性，有利于納 米復(fù)合粒子躲避吞噬細(xì)胞識(shí)別的能力，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。同時(shí)親水 性的增強(qiáng)也可提高納米復(fù)合粒子在靜脈血液中的穩(wěn)定性。(2)聚酰胺一胺類(lèi)樹(shù)狀聚合物G10代的粒徑約10納米左右，PEG為親水 性大分子，它的引入不僅可以為構(gòu)筑10 100納米的不同尺度粒子做貢獻(xiàn)，還 可以防止聚合物在循環(huán)過(guò)程中被分解，從而提高該納米復(fù)合粒子體系的生物 利用度。本發(fā)明制備出了具有靶向性的樹(shù)狀納米復(fù)合粒子。作為靶向藥物的一種， 該納米復(fù)合粒子通過(guò)靜脈注射，在主動(dòng)靶向和被動(dòng)靶向作用下，選擇性進(jìn)入 肺癌腫瘤組織后并高濃度聚集于此。本發(fā)明樹(shù)狀納米復(fù)合粒子可用于制備造 影劑，以提高造影對(duì)比度而達(dá)到敏感性顯像，使影像更加清晰，在癌癥影像 學(xué)中具有重要應(yīng)用價(jià)值。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種生物相容性好、水溶性好，對(duì)肺癌細(xì)胞具有靶 向性的樹(shù)狀納米復(fù)合粒子。本發(fā)明又一 目的在于提供一種對(duì)肺癌細(xì)胞具有靶向性的納米樹(shù)狀聚合物 藥物載體系統(tǒng)的制備方法和用途。一種樹(shù)狀聚合物耙向納米粒子，其通式為PAMAM—PEG—X 其中PAMAM為樹(shù)狀不同代數(shù)的聚合物；PEG為分子量為1000 10000Da 的聚乙二醇；X為葉酸，半乳糖、多肽、脂質(zhì)體、抗體等靶向基團(tuán)； PAMAM (以肺癌耙向樹(shù)狀聚合物為例)結(jié)構(gòu)式如下AF-HN-GEP-HNOCQHsOCHNC^HNOC氣AF-HN"GEP-HNOCC4H80CHNC2H4HNOCC2E]、. AF揚(yáng)GEP-HNOCCjH80C跳2H^HNOCC2H4 ^ 卞CCONHCsH^NHCOCftCONH-PEG-NH-FA■>、 、 C^CONHC^NHCOqHgCONH-ffiG-NH-FA^ \>1 C^CONHC^NHCOCACONH-PEG-NH-FAAF-HN^GEP-HNOCdHgOCHNC^HNOCC^ / \ C^CONHC^NHCOQHj^ONH-PEG-NH-FAAF-HN^GEP-HNOCQftOCHNCjHjHNOCC^ / '^^^ C2H4CCNHC2HiNHCOCftCONH-PEG-NH-FA 《 IfCT 《A。G %AF-H^GEP-HNOCQHsOCHN&HaHNOCC^ 凌 % Cy^CONH&HiNHCOqHgCONH-PEG-WWAAF-賜鵬腦0:4 1^ 、CACWHC^NHCOQH8C調(diào)孤脂APEG (以聚乙二醇二胺為例)結(jié)構(gòu)式為:<formula>formula see original document page 6</formula>X (以葉酸FA為例)結(jié)構(gòu)式為:樹(shù)狀聚合物靶向納米粒子的制備方法，包括以下步驟(1) 耙向基團(tuán)與聚乙二醇二胺的合成a. 將X (葉酸FA)溶于二甲基亞砜(DMSO)溶劑中，加入PEG (聚乙 二醇二胺)，加入l-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽催化劑，在避光、 氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，反應(yīng)生成聚乙二醇/葉酸；b. 向聚乙二醇/葉酸混合物中加入蒸餾水，降溫至室溫，轉(zhuǎn)移至透析袋中， 在pH^9.5的碳酸氫鈉緩沖液中透析三天；再在水中透析兩天，濃縮凍干、得 聚酰胺-胺，避光保存；(2) 聚酰胺-胺的羧基化a. 將聚酰胺-胺溶于二甲基亞砜(DMSO)溶劑中，加入丁二酸酐，加入 4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化劑，反應(yīng)溫度30°C-50°C，生成羧基樹(shù)狀大分 子；b. 將反應(yīng)混合物用蒸餾水稀釋后轉(zhuǎn)移至透析袋中，置于水中透析三天， 過(guò)濾后濃縮凍干，干燥保存；(3) 耙向納米粒子的制備a. 將(1)產(chǎn)物聚乙二醇/葉酸和(2)產(chǎn)物羧基樹(shù)狀大分子在二甲基亞砜 (DMSO)溶劑中反應(yīng)，加入EDC/N-羥基琥珀酰胺催化劑得聚合物納米粒子；b. 將上述所得的聚合物納米粒子，放置水中透析三天，濃縮凍干得到樹(shù) 狀聚合物靶向納米粒子。本發(fā)明樹(shù)狀聚合物靶向納米粒子，用于制備造影劑，在癌癥影像學(xué)中應(yīng)用。本發(fā)明提供的基于樹(shù)形聚合物靶向納米粒子系統(tǒng)由三個(gè)功能部分組成: (1)處于最外端的靶向基團(tuán)殘基；(2)作為連接臂的親水性聚乙二醇鏈；(3) 位于中心核的樹(shù)狀聚合物PAMAM。 通式為PAMAM~~PEG~~X其中X為葉酸，半乳糖、多肽、脂質(zhì)體、抗體等靶向基團(tuán)；PEG為分子 量為1000 10000Da的聚乙二醇；PAMAM為樹(shù)狀不同代數(shù)的聚合物。為得到靶向納米復(fù)合粒子，本發(fā)明采用一種連接臂將靶向基團(tuán)和樹(shù)狀聚 合物聚酰胺-胺連接起來(lái)。先將連接臂一端與靶向基團(tuán)反應(yīng)，再將另一端與聚 酰胺-胺反應(yīng)，從而得到納米復(fù)合粒子。各步合成方法如下(1) 靶向基團(tuán)與連接臂聚乙二醇二胺的合成第一步以l-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)為催化劑，將靶向基團(tuán)的羧基與聚乙二醇二胺的氨基反應(yīng)生成酰胺鍵，通過(guò)控制投料比、 加料順序、溶劑量等得到一端取代的聚乙二醇/葉酸。該化學(xué)反應(yīng)過(guò)程采取避 光、氮?dú)獗Ｗo(hù)。反應(yīng)使用的溶劑為二甲基亞砜(DMSO)，使用前需提純。以下描述中除 非特別提及， 一般溶劑均為提純處理后使用。第二步反應(yīng)物的純化，向聚乙二醇/葉酸混合物反復(fù)加入三次蒸餾水使反應(yīng)停止，待溫度降至室溫后轉(zhuǎn)移至透析袋中于pH-9.5的碳酸氫鈉緩沖液中 透析三天除掉二甲基亞砜(DMSO)，再放置水中透析兩天除鹽，濃縮凍干、 避光保存。(2) 聚酰胺-胺的羧基化第一步將聚酰胺-胺溶解在二甲基亞砜(DMSO)溶劑中，加入過(guò)量的 丁二酸酐，利用端胺基開(kāi)丁二酸酐，生成端基為羧基的樹(shù)狀大分子，反應(yīng)溫 度控制在5(TC以下。該步反應(yīng)催化劑以4-二甲氨基吡啶(DMAP)為最佳， 反應(yīng)溫度在3(TC-5(TC之間時(shí)，化學(xué)反應(yīng)速度快。第二步將上述反應(yīng)混合物用蒸餾水稀釋后轉(zhuǎn)移至透析袋中，放置水中 透析三天，過(guò)濾后濃縮凍干，干燥保存。 (3)耙向納米粒子的制備第一步利用(1)產(chǎn)物的聚乙二醇/葉酸另一端胺基與(2)產(chǎn)物的羧基 在二甲基亞砜(DMSO)溶劑中進(jìn)行反應(yīng)，得到聚合物納米粒子。第二步上述所得的納米粒子水中透析三天純化產(chǎn)物，濃縮凍干得到樹(shù)狀納米粒子。該步驟中催化劑為EDC/N-羥基琥珀酰胺。利用(1)中和(2)中的第一步和第二步，或其他化學(xué)方法，可合成不同尺寸的納米粒子。本發(fā)明提供了 一種樹(shù)狀聚合物靶向納米粒子；同時(shí)提供了制備該樹(shù)狀聚 合物靶向納米粒子的新方法，即將靶向基團(tuán)和樹(shù)狀聚合物之間通過(guò)親水性的 聚乙二醇相連，形成尺寸可控的耙向復(fù)合納米結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)可以為過(guò)渡金屬 提供充足的配體，在人類(lèi)各種癌癥的影像診斷中具有重要意義。作為靶向藥 物的一種，本納米復(fù)合粒子通過(guò)靜脈注射，在主動(dòng)靶向和被動(dòng)靶向作用下， 選擇性進(jìn)入肺癌腫瘤組織后并高濃度聚集于此?？捎糜谥苽湓煊皠?，以提高 造影的對(duì)比度而達(dá)到敏感性顯像，使影像更加清晰，在癌癥影像學(xué)中具有重 要應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明提供了一種新的樹(shù)狀聚合物靶向納米粒子的結(jié)構(gòu)，具有新穎性和 創(chuàng)造性；本發(fā)明提出了該樹(shù)狀聚合物靶向納米粒子的制備方法，具有實(shí)質(zhì)性 技術(shù)內(nèi)容；同時(shí)本發(fā)明提供了樹(shù)狀聚合物靶向納米粒子在癌癥影像學(xué)中的應(yīng) 用方法和重要價(jià)值，因此本發(fā)明具有實(shí)用性。癌癥是人類(lèi)生存的大敵，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的重要課題。本發(fā)明利用生物 納米技術(shù)，解決人類(lèi)渴望解決的癌癥早期準(zhǔn)確診斷，對(duì)促進(jìn)人類(lèi)早日攻克癌 癥這一難題具有重要意義。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)具有極高的生物兼容性，無(wú)免疫原性和細(xì)胞 毒性；(2)核心結(jié)構(gòu)大小精細(xì)可調(diào)，表面羧基數(shù)量可控；(3)主動(dòng)靶向和被 動(dòng)靶向相結(jié)合對(duì)肺癌細(xì)胞具有高靶向性能；(4)親水高分子表面修飾能夠延 長(zhǎng)納米復(fù)合粒子的血液循環(huán)時(shí)間。


圖1為FA-PEG紅外譜圖。圖2為FA-PEG-PAMAM紅外譜圖。圖3為本發(fā)明納米粒子在稀溶液中的動(dòng)態(tài)光散射表征，包括粒徑和Zeta 電位的表征，可以看出單分散性很好。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述 實(shí)施例1:1. PEG-FA的合成將O.l摩爾的FA溶于二甲基亞砜(DMSO)溶劑中攪拌通氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入 EDC/NHS (l-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰胺)活化 兩小時(shí)，然后投入等摩爾比的聚乙二醇二胺(分子量2000)，室溫避光攪拌反 應(yīng)24小時(shí)，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到截留分子量為1000的透析袋中透析72小時(shí)后濃縮 凍干，使用過(guò)硅膠柱將雙取代產(chǎn)物FA-PEG-FA與單取代NH2—PEG-FA分離 提純，得到PEG-FA的合成產(chǎn)物，避光低溫保存。2. PAMAM-COOH的合成取O.lmmol的PAMAM (4.0代)溶于無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)溶劑中， 氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入O.Olmmol的4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化劑和6.4mmo1 的丁二酸酐，溫度4(TC，攪拌反應(yīng)48小時(shí)，將溶劑二甲基亞砜透析除去，過(guò) 濾掉不溶物后冷凍干燥。3. FA-PEG-PAMAM的合成取0.05mmo1的PAMAM-COOH溶于無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)溶劑中， 加入催化劑量的EDC/NHS活化羧基，反應(yīng)兩小時(shí)后投入0.32mmo1的單取代 的NH2-PEG-FA，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)72小時(shí)；透析除掉溶劑和未反應(yīng) 物，得PAMAM-COOH的合成產(chǎn)物，濃縮凍干，用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)FA-PEG-PAMAM 的粒徑和Zeta電位，用凝膠滲透色譜測(cè)定其分散性后保存。實(shí)施例2:1. PEG-FA的合成將0.1摩爾的FA溶于無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)溶劑中，攪拌通氮?dú)獗Ｗo(hù)， 加入EDC/NHS活化兩小時(shí)，然后投入等摩爾比的聚乙二醇二胺，室溫避光攪拌反應(yīng)24小時(shí)，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到截留分子量為1000的透析袋中透析72小 時(shí)后濃縮凍干，用過(guò)硅膠柱將雙取代產(chǎn)物FA-PEG-FA與單取代NH2~"PEG-FA 分離提純，得PEG-FA的合成產(chǎn)物，避光、低溫保存。2. COOH-PEG-FA的合成取lOmmol的NH2~~PEG~FA溶于無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)中，氮?dú)?保護(hù)，加入0.01mmol的4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化劑和20mmo1的丁二 酸酑，溫度40'C，攪拌反應(yīng)48小時(shí)，將溶劑二甲基亞砜(DMSO)透析除去， 過(guò)濾不溶物后冷凍干燥。3. FA-PEG-PAMAM的合成取lOmmol的COOH-PEG-FA溶于二甲基亞砜(DMSO)中，加入催化劑 量的EDC/NHS活化羧基，反應(yīng)兩小時(shí)后投入0.32mmol PAMAM (端基為胺 基)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)72小時(shí)。然后透析除掉溶劑和未反應(yīng)物，所 得反應(yīng)產(chǎn)物濃縮凍干。用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)FA- PEG-PAMAM的粒徑和Zeta電位， 用凝膠滲透色譜測(cè)定其分散性后保存。實(shí)施例3:1. PEG-FA的合成將0.1摩爾的FA溶于二甲基亞砜(DMSO)中，攪拌通氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入 EDC/NHS活化兩小時(shí)，然后投入等摩爾比的聚乙二醇二胺，在室溫避光下攪 拌反應(yīng)24小時(shí)，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到截留分子量為1000的透析袋中透析72小 時(shí)后濃縮凍干，過(guò)硅膠柱將雙取代產(chǎn)物FA-PEG-FA與單取代NH2^PEG-FA 分離提純，得PEG-FA的合成產(chǎn)物，避光低溫保存。2. PAMAM-COOH的合成取O.lmmol端基為酯基的PAMAM溶于三次蒸餾水中，加入lmol/L的 NaOH溶液，溫度50。C，攪拌反應(yīng)24小時(shí)，酯基水解生成端羧基，將生成的甲 醇和水旋蒸除去，得到PAMAM-COOH的合成產(chǎn)物，冷凍干燥。3. FA-PEG-PAMAM的合成取0.05mmo1的PAMAM-COOH溶于二甲基亞砜(DMSO)中，加入催化 劑量的EDC/NHS活化羧基，反應(yīng)兩小時(shí)后投入0.32mmo1的單取代的 NH2-PEG-FA，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)72小時(shí)。然后透析除掉溶劑和未反應(yīng)物，產(chǎn)物濃縮凍干。用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)FA-PEG-PAMAM的粒徑和Zeta電位， 用凝膠滲透色譜測(cè)定其分散性。 實(shí)施例4:同實(shí)施例1的試驗(yàn)方法，固定PEG的分子量為2000，改變PAMAM的代 數(shù)，分別合成3.0代、4.0代、5.0代的PAMAM-PEG-FA。實(shí)施例5:同實(shí)例1的試驗(yàn)方法，固定PAMAM的代數(shù)，改變PEG的分子量，分別 采用分子量為1000、 2000、 3400、 5000、 10000合成該樹(shù)形聚合物納米粒子， 發(fā)現(xiàn)納米粒子粒徑隨分子量的增加而明顯增加。在上述實(shí)施例中，制得了粒徑為40 150納米的樹(shù)形聚合物肺癌耙向納 米粒子。上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選例，并不用來(lái)限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的 原則之內(nèi)，所做的任何修改、變化、變通或替換方案，均在本發(fā)明的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種樹(shù)狀聚合物靶向納米粒子，其通式為PAMAM-PEG-X其中PAMAM為樹(shù)狀聚合物；PEG為分子量1000～10000Da的聚乙二醇；X為葉酸，半乳糖、多肽、脂質(zhì)體、抗體等靶向基團(tuán)；PAMAM(以肺癌靶向樹(shù)狀聚合物為例)結(jié)構(gòu)式如下PEG(以聚乙二醇二胺為例)結(jié)構(gòu)式為X(以葉酸為例)結(jié)構(gòu)式為
2. —種樹(shù)狀聚合物靶向納米粒子的制備方法，包括以下步驟 (l)靶向基團(tuán)與聚乙二醇二胺的合成'.a.將X (葉酸)溶于二甲基亞砜(DMSO)溶劑中，加入PEG (聚 乙二醇二胺)，加入l-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽催化劑， 在避光、氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下反應(yīng)得聚乙二醇/葉酸；b.向聚乙二醇/葉酸混合物中加入蒸餾水，降溫至室溫，轉(zhuǎn)移至透析袋中，在pH=9.5的碳酸氫鈉緩沖液中透析三天；再在水中透析 兩天，濃縮凍干、得聚酰胺-胺，避光保存；(2) 聚酰胺-胺的羧基化a. 將聚酰胺-胺溶于二甲基亞砜(DMSO)溶劑中，加入丁二酸 酐，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化劑，反應(yīng)溫度30。C-50。C， 生成羧基樹(shù)狀大分子；b. 將反應(yīng)混合物用蒸餾水稀釋后轉(zhuǎn)移至透析袋中，置于水中透析 三天，過(guò)濾后濃縮凍干，干燥保存；(3) 耙向納米粒子的制備a. 將(1)產(chǎn)物聚乙二醇/葉酸和(2)產(chǎn)物羧基樹(shù)狀大分子在二 甲基亞砜(DMSO)溶劑中反應(yīng)，加入EDC/N-羥基琥珀酰胺催化劑 得聚合物納米粒子；b. 將上述所得的聚合物納米粒子，放置水中透析三天，濃縮凍干 得到樹(shù)狀聚合物靶向納米粒子。
3.—種樹(shù)狀聚合物靶向納米粒子，用于制備造影劑，在癌癥影像 學(xué)中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，一種樹(shù)狀聚合物靶向納米粒子及其制備方法和在癌癥影像學(xué)中的應(yīng)用。通式為PAMAM-PEG-X，其中PAMAM為樹(shù)狀不同代數(shù)的聚合物；PEG為分子量為1000～10000Da的聚乙二醇；X為葉酸，半乳糖、多肽、脂質(zhì)體、抗體等靶向基團(tuán)。本發(fā)明同時(shí)提供了制備該樹(shù)狀聚合物靶向納米粒子的新方法，即將靶向基團(tuán)和樹(shù)狀聚合物之間通過(guò)親水性的聚乙二醇相連，形成尺寸可控的靶向復(fù)合納米結(jié)構(gòu)。本發(fā)明納米粒子具有極高的生物兼容性，無(wú)免疫原性和細(xì)胞毒性；對(duì)肺癌細(xì)胞具有高靶向性能的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明在人類(lèi)各種癌癥的影像診斷中具有重要意義。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101327328SQ200810041129
公開(kāi)日2008年12月24日 申請(qǐng)日期2008年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日
發(fā)明者劉順英, 張偉祿, 娜 李, 羅淑芳 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)