一種納米粒子組合物及其在抗腫瘤血管生成中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物制備技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)，涉及到一種納米粒子組合物及其在抗 腫瘤血管生成中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤(癌癥)是人類的重大疾病，加強(qiáng)新型抗腫瘤藥物的研究和開發(fā)具有十分 重要的意義。全球現(xiàn)有惡性腫瘤患者超過(guò)2200萬(wàn)人，每年新診患者達(dá)1010萬(wàn)人，每年死于腫 瘤超過(guò)620萬(wàn)例。我國(guó)現(xiàn)有惡性腫瘤患者至少300至400萬(wàn)人，每年新診患者超過(guò)160萬(wàn)人，年 死亡人數(shù)超過(guò)130萬(wàn)。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的快速發(fā)展、平均壽命的延長(zhǎng)、飲食結(jié)構(gòu)和環(huán)境 因素的改變，腫瘤發(fā)病率和死亡率呈迅速上升趨勢(shì)，疾病譜也發(fā)生了重大變化，目前在農(nóng)村 地區(qū)人口腫瘤居死因第三位（107.1/10萬(wàn)人），而在城市人口死因中已位居第一（126.0/10 萬(wàn)人）。手術(shù)、放療和化療是腫瘤的常規(guī)治療手段。手術(shù)、放療只適合于局部發(fā)生的腫瘤;對(duì) 已發(fā)生轉(zhuǎn)移的中晚期腫瘤，細(xì)胞毒性化療藥物仍是一線治療方案;然而，長(zhǎng)期以來(lái)，常規(guī)化 療藥物一直存在毒副作用大，病人耐受性差，長(zhǎng)期使用引起賴藥性等等問題;而對(duì)一些對(duì)化 療藥物不敏感的腫瘤類型，患者還處于無(wú)藥可治的狀態(tài)。因此，開發(fā)低毒、高效及腫瘤靶向 性特性的抗癌治療技術(shù)，成為當(dāng)前研究及治療的重點(diǎn)。
[0003] 腫瘤的基因治療是當(dāng)前腫瘤生物治療研究的熱點(diǎn)之一。它是利用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)遺傳物 質(zhì)(DNA，RNA)到機(jī)體細(xì)胞，通過(guò)表達(dá)治療基因或者調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，特異性的干 涉腫瘤組織的生長(zhǎng)、發(fā)育而達(dá)到抑制或者清除腫瘤的目的。除了具有靶點(diǎn)明確，低毒、病人 易耐受的生物藥物的優(yōu)點(diǎn)之外，基因藥物與蛋白藥物相比還擁有以下優(yōu)點(diǎn)：1、轉(zhuǎn)導(dǎo)基因進(jìn) 入人體細(xì)胞后，完全利用細(xì)胞自身的蛋白轉(zhuǎn)錄及修飾系統(tǒng)產(chǎn)生治療蛋白與生理蛋白功能更 接近;2、可通過(guò)對(duì)編碼基因開放讀碼框架中轉(zhuǎn)錄元件的分子生物學(xué)改造，實(shí)現(xiàn)持續(xù)、高效及 組織細(xì)胞特異性的治療蛋白表達(dá);3、針對(duì)腫瘤患者的個(gè)體化差異，設(shè)計(jì)治療基因，制作工藝 簡(jiǎn)單，可以實(shí)現(xiàn)快速有針對(duì)性的患者個(gè)體化治療。自1990年第一個(gè)基因治療藥物被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)進(jìn)行臨床測(cè)試以來(lái)，在歐美國(guó)家已經(jīng)有超過(guò)1000個(gè)基因治療方案在進(jìn)行臨床測(cè)試，其 中60%是用于治療腫瘤。多個(gè)治療基因在臨床測(cè)試中顯示了明確的抗腫瘤功效;或者聯(lián)合 化療、放療使用，減少化其毒副作用，提高病人的可耐受性。已經(jīng)被臨床測(cè)試的基因包括:抑 癌基因、腫瘤免疫治療基因、在抗腫瘤血管生成中的基因、致死基因等等。然而，迄今為止， 沒有一個(gè)基因藥物被歐美國(guó)家批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)。缺乏高效、安全的基因藥物傳遞技術(shù)是限制 基因治療臨床應(yīng)用的一個(gè)主要問題。
[0004] 病毒載體是當(dāng)前基因治療使用的主流載體?；谂c生倶來(lái)、結(jié)構(gòu)精巧的基因轉(zhuǎn)導(dǎo) 系統(tǒng)，這些人工重組病毒顯示了高的基因轉(zhuǎn)染效率、優(yōu)秀的生物相容性。然而，1999年逆錄 病毒基因治療導(dǎo)致兩個(gè)兒童患者產(chǎn)生細(xì)胞惡變的事件，使人們對(duì)基因組整合性病毒載體的 生物安全性問題產(chǎn)生了質(zhì)疑!非病毒基因傳遞技術(shù)是近年發(fā)展的新興基因傳遞技術(shù)。它主 要是使用正電子聚合物（polymer)通過(guò)靜電相互作用，包裹和濃縮長(zhǎng)鏈的基因（DNA或者 RNA)藥物形成粒子，以避免基因藥物的降解及促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。與病毒載體相比較，非病毒 載體具有生物安全性好、制作簡(jiǎn)單、成本低、免疫原性小，而且容易進(jìn)行化學(xué)修飾等優(yōu)點(diǎn)?；?于這些優(yōu)勢(shì)，非病毒載體得到基因治療學(xué)家愈來(lái)愈多的關(guān)注。近十年來(lái)，眾多的化學(xué)生物學(xué) 家合成了大量的非病毒載體，包括:多種脂質(zhì)體及其衍生物;多種多聚亞胺(PEI)、多聚賴氨 酸(PLL)，Dentrimers,殼聚糖(Chitosan)及其衍生物等等。然而，商業(yè)提供的基因轉(zhuǎn)染試劑 還存在毒性大、只適合瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、缺乏腫瘤靶向性等等，遠(yuǎn)不能適應(yīng)臨床基因治療應(yīng)用需 求。
[0005] 腫瘤靶向性納米基因藥物傳遞技術(shù)主要是通過(guò)納米載體材料及工程技術(shù)，將治療 基因制作成納米級(jí)（1-100納米)的藥物粒子，通過(guò)對(duì)納米顆粒大小及形態(tài)的控制，表面的修 飾及腫瘤靶向性配體的嫁接，而實(shí)現(xiàn)基因藥物腫瘤靶向性傳遞的技術(shù)方法。納米粒子腫瘤 靶向性的生理基礎(chǔ)是腫瘤血管的結(jié)構(gòu)特征。腫瘤是高度異質(zhì)性的組織，其血管內(nèi)皮細(xì)胞之 間的間隙常大于100納米，且基底膜不健全、缺少血管外周組織，有利于100納米左右的納米 粒子通過(guò)和滲透;而正常的組織血管內(nèi)皮間隙為5-10nm，可阻止粒徑較大的粒子滲透和通 過(guò)，減少正常細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的吸收，降低其毒副反應(yīng);其次，腫瘤組織淋巴回流系統(tǒng)發(fā)育 不完善，有的甚至缺乏淋巴組織，導(dǎo)致滲透到腫瘤組織的納米粒子不容易被排泄，這被稱為 腫瘤的延長(zhǎng)稽留效應(yīng)(ER)。要順利到達(dá)腫瘤組織，納米粒子還需克服機(jī)體的幾個(gè)生理限制， 包括：網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬、清除，脾竇、肝竇的血液過(guò)濾作用等。納米粒徑大小及表面修 飾是克服這些生理障礙的關(guān)鍵因素。常規(guī)來(lái)說(shuō)，粒徑小于5nm容易從腎臟排出，微米級(jí)粒子 會(huì)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，大于200nm粒子常常不能透過(guò)肝竇或者脾竇。除了粒徑以外，納米 粒子表面親水性修飾及電荷特性也影響網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)納米粒子的識(shí)別和清除。常規(guī)來(lái) 說(shuō)，經(jīng)親水性阻滯劑修飾，或者表面電荷低的納米粒子，能避開體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的識(shí)別及 清除，延長(zhǎng)藥物粒子體內(nèi)的血液循環(huán)半衰期，增加腫瘤組織的靶向聚集。在納米粒子聚集到 腫瘤以后，增加腫瘤細(xì)胞的吸收也是提高藥效的關(guān)鍵。通過(guò)連接腫瘤細(xì)胞特異性配體到納 米粒子，使其通過(guò)受體配體調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物 的吸收。
[0006] 在抗腫瘤血管生成中的是廣泛使用的抗實(shí)體瘤生物治療方案。常規(guī)來(lái)說(shuō)，當(dāng)腫瘤 體積較小時(shí)，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)滲透作用獲取其生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)。當(dāng)腫瘤直徑超過(guò)滲透限 制時(shí)（1-2_)，腫瘤血管生成將會(huì)發(fā)生。此后，其將促進(jìn)或加快實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，并為腫瘤的轉(zhuǎn) 移提供通道。自上世紀(jì)70年代Folkman等人開啟抗腫瘤血管研究以來(lái)，大量的血管生成抑制 物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，它們可以被歸納為外源性和內(nèi)源性在抗腫瘤血管生成中的抑制劑兩 類。外源性在抗腫瘤血管生成中的抑制劑主要是一些具有蛋白酶抑制功能的小分子化合 物，其在抗腫瘤血管生成中的作用明顯，同時(shí)毒副作用也很大。而內(nèi)源性在抗腫瘤血管生成 中的因子毒副作用較小，但是，要達(dá)到治療效果，通常需要持續(xù)反復(fù)的給藥。一些在抗腫瘤 血管生成中的的靶點(diǎn)藥物已經(jīng)被多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)開展臨床實(shí)驗(yàn)，但是療效不如預(yù)期。最近的 研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)一個(gè)血管生成通路被抑制后，腫瘤細(xì)胞可以建立其它的通路，誘導(dǎo)新的血管生 成;抑制腫瘤血管生成導(dǎo)致腫瘤缺氧，可誘發(fā)腫瘤干細(xì)胞的活化，從而引起腫瘤復(fù)發(fā)。這些 可能是在抗腫瘤血管生成中的抑制劑臨床療效欠佳的主要原因。
[0007] Endostatin是一種膠原XVIII來(lái)源的內(nèi)源性在抗腫瘤血管生成中的因子，它通過(guò) 干涉FGF2，VEGF，TN調(diào)控的分子信號(hào)通路，封閉integrin受體，抑制金屬基質(zhì)蛋白酶的活性 等機(jī)制，發(fā)揮廣譜的在抗腫瘤血管生成中的作用，抑制腫瘤的生長(zhǎng)與侵襲。在我國(guó)，以血管 內(nèi)皮抑素Endostatin為母體的在抗腫瘤血管生成中的多肽藥物(恩度)已獲批準(zhǔn)臨床應(yīng)用。 但是，這種多肽要達(dá)到有效治療濃度需要多次反復(fù)給藥，導(dǎo)致治療費(fèi)用較高。使用基因療 法，轉(zhuǎn)導(dǎo)Endostatin治療基因到組織，利用患者細(xì)胞自身來(lái)表達(dá)和釋放治療基因，可有效 克服這一問題。近年來(lái)，以病毒為載體的Endostatin基因療法也在多個(gè)國(guó)家開展臨床試驗(yàn)， 但至今未有相關(guān)藥物獲批上市。其主要的原因是，常規(guī)病毒載體具有較高的免疫原性，易被 機(jī)體清除，而且也缺乏腫瘤靶向性。最近，研究發(fā)現(xiàn)，腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人類肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 的三環(huán)片段（thekringleldomainofhumanHGFα-chain，HGFKl)通過(guò)干擾EGFR，VEGFR2 和bFGFR信號(hào)通路，而發(fā)揮抗肝癌作用。但是，這些病毒載體的基因治療方案，仍然存在由基 因組整合引起的生物安全和機(jī)體對(duì)病毒載體的免疫反應(yīng)等問題。而，多肽類藥物要達(dá)到治 療效果需要持續(xù)高劑量重復(fù)給藥，這將嚴(yán)重影響治療的效果，增加治療成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種安全、高效、長(zhǎng)效的納米粒子組合物及其 在抗腫瘤血管生成中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明所述的一種納米粒子組合物，所述納米粒子組合物為聚合物載體和表達(dá)治 療基因的質(zhì)粒自組裝而成的納米粒子;所述聚合物載體為環(huán)糊精-聚乙烯亞胺-聚乙二醇-葉酸四元組裝式聚陽(yáng)離子載體;所述表達(dá)治療基因的質(zhì)粒為包含編碼肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的三 環(huán)片段蛋白DNA序列和編碼