專利名稱：：用于化妝品和醫(yī)學(xué)用途的具有幾種透明質(zhì)酸級(jí)分的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含至少兩種透明質(zhì)酸(HA)級(jí)分(fmction)或其鹽的組合物，所述兩種透明質(zhì)酸級(jí)分為一種具有非常低的平均分子量(MW)的HA級(jí)分和一種低-中MW的HA級(jí)分，所述組合物用于保濕(moisturizing)、化妝或抗皺配制物中以減少深處和表面的皺紋。
背景技術(shù)：
：人體最豐富的雜多糖是糖胺聚糖(glycosaminoglycan)。糖胺聚糖是無支鏈的糖聚合物，由重復(fù)的二糖單元組成(只有硫酸角質(zhì)素在糖的核心區(qū)是分支的)。所述二糖單元通常包含兩種修飾的糖一N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)之一，作為第一糖單元。另一單元通常是糖醛酸，如葡糖醛酸(GlcUA)或艾杜糖酪酸(iduronate)。糖胺聚糖是帶負(fù)電荷的分子，并且在溶液中(insolution)時(shí)具有賦予高粘性的延伸構(gòu)象。糖胺聚糖主^f立于細(xì)胞表面上或胞外基質(zhì)中。糖胺聚糖在溶液中還具有低壓縮性，并因此是理想的生理潤(rùn)滑液體，例如關(guān)節(jié)(joint)。糖胺聚糖的剛性為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)的整體性并且提供細(xì)胞之間允許細(xì)胞遷移的通道。具有最高生理重要性的糖胺聚糖是乙酰透明質(zhì)酸(hyaluronan)、硫酸軟骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素和疏酸角質(zhì)素。大多數(shù)糖胺聚糖通過特定的寡糖結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié)合至蛋白聚糖核心蛋白。乙酰透明質(zhì)酸與某些蛋白聚糖形成大聚集體(largeaggregate),但例外是游離糖鏈與蛋白聚糖形成非共價(jià)復(fù)合體。已鑒定了乙酰透明質(zhì)酸在人體中的許多功能(參見，LaurentT.C.和Fraser5J.R.E.,1992,FASEBJ.6:2397-2404;和TooleB.P.，1991，"Proteoglycansandhyaluronaninmorphogenesisanddifferentiation.，，于CellBiologyoftheExtracellularMatrix,第305-341頁，HayE.D.，編，Plenum,NewYork)。乙酰透明質(zhì)酸存在于透明軟骨、滑膜關(guān)節(jié)液(synovialjointfluid)以及真皮和表皮皮膚組織中。還猜測(cè)乙酰透明質(zhì)酸在許多生理功能，如粘附、發(fā)育、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、癌癥、血管發(fā)生和愈傷中具有作用。由于乙酰透明質(zhì)酸獨(dú)特的物理和生物特性，將其用于眼外科和關(guān)節(jié)外科中，并且正在其它醫(yī)學(xué)方法中對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。術(shù)語"透明質(zhì)酸，，用于文獻(xiàn)中的意思是由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺(D-glucuronicandN-acetyl-D-glucosamineacid)的殘基纟且成的具有不同分子量的酸性多糖，其天然存在于細(xì)胞表面、脊推動(dòng)物結(jié)締組織的基礎(chǔ)胞外物質(zhì)(basicextracellularsubstance)、關(guān)節(jié)的滑月莫'液、目艮3求內(nèi)液(endobulbarfluidoftheeye)、人臍帶組織和雞冠(cocks，comb)中。術(shù)語"透明質(zhì)酸，，實(shí)際上通常用于指具有不同分子量的帶有交替D-葡糖酪酸和N-乙酰-D-葡糖胺殘基的全系列多糖，或甚至其降解的級(jí)分，并且因此看上去使用復(fù)數(shù)術(shù)語"透明質(zhì)酸，，會(huì)更加恰當(dāng)。然而該單數(shù)術(shù)語將仍然用在本說明書中；另外，縮寫"HA(hyaluronicacid;透明質(zhì)酸)"將頻繁地使用以代替此集合術(shù)語。HA在生物體中起著重要的作用，作為許多組織(如皮膚、腱、肌肉和軟骨)的細(xì)胞的機(jī)械支持，它是胞間基質(zhì)的主要成分。HA在生物過程中也起著其它重要的作用，如組織的濕潤(rùn)，和潤(rùn)滑作用。HA可從上述天然組織中提取，然而現(xiàn)今優(yōu)選的是通過微生物方法制備HA以使轉(zhuǎn)移傳染劑的潛在風(fēng)險(xiǎn)最小化，并且提高產(chǎn)品的均勻性、質(zhì)量和可用性(WO03/0175902,Novozymes)。已將HA和它不同分子大小的級(jí)分和它們各自的鹽用作藥物，特別在治療關(guān)節(jié)病(arthropathy)方面；作為天然器官和組織的輔助和/或替代物，特別在眼科學(xué)和整容手術(shù)(cosmeticsurgery)方面；以及作為化妝品制品中的作用劑(agent)。也已開發(fā)了乙酰透明質(zhì)酸的產(chǎn)品用于整形外科學(xué)(orthopaedics)、風(fēng)濕病學(xué)(rheumatology)和皮膚病學(xué)(dermatology)。公知將具有約1至約1.5MDa平均分子量的高分子量HA級(jí)分用在化妝品組合物(例如露(lotions)和霜?jiǎng)?creams))中來提供出色的保濕性質(zhì)。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了非常低分子量的HA級(jí)分顯示抗皺性質(zhì)，據(jù)稱是因?yàn)檫@些級(jí)分穿過皮膚屏障的能力。在許多應(yīng)用中保濕和抗皺性質(zhì)兩者都是高度期待的，呈現(xiàn)這兩種性質(zhì)的單一組合物將會(huì)具有巨大的商業(yè)意義。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的發(fā)明人近期配制了幾種HA組合物，其包含兩種獨(dú)立的(separate)HA級(jí)分，一種具有非常低的平均分子量，另一種級(jí)分具有低-中平均分子量，并且他們?cè)u(píng)估了這些級(jí)分的保濕和抗皺效果。令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)這些組合物顯示保濕以及抗皺兩種效果。因此，在本發(fā)明的第一方面中涉及保濕、化妝或抗皺產(chǎn)品，其包含至少兩種透明質(zhì)酸級(jí)分或其鹽，其中一種級(jí)分具有8,000-100,000Da，優(yōu)選10-90kDa，或優(yōu)選20-80kDa，或30-70kDa，甚至更優(yōu)選40-60kDa，或最優(yōu)選約50kDa的平均分子量；并且另一種級(jí)分具有100，000-500,000Da，或優(yōu)選150-450kDa，更有選200-400kDa，甚至更優(yōu)選地250-350kDa或最優(yōu)選約300kDa的平均分子量。在第二方面，本發(fā)明涉及組合物，其包含如第一方面中限定的產(chǎn)品，和活性成分，優(yōu)選所述活性成分是藥理活性劑。本發(fā)明的第三方面涉及藥物組合物，其包含有效量的如第一方面中限定的產(chǎn)品，以及可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑。第四方面涉及藥物組合物，其包含有效量的如第一方面中限定的產(chǎn)品作為運(yùn)載體，以及藥理活性劑。第五方面涉及化妝品，其包含有效量的如第一方面中限定的產(chǎn)品作為活性成分。在第六方面中，本發(fā)明涉及衛(wèi)生、醫(yī)療或外科物品，其包含如第一方面中限定的產(chǎn)品，優(yōu)選所述物品是外科海綿、愈傷海綿，或包含在急救繃帶(bandaid)或其它創(chuàng)傷敷裹材料中的部分。重要的方面涉及藥物膠嚢或微膠嚢，其包含如第一方面中限定的產(chǎn)品。本發(fā)明最后的方面涉及在眼科學(xué)中、在骨關(guān)節(jié)炎或癌癥的治療中執(zhí)行程序的方法；處理創(chuàng)傷的方法；進(jìn)行藥理活性劑的皮膚施用或透皮施用，或化妝品的皮膚施用的方法的改進(jìn)，所述改進(jìn)包括使用如第一方面中限定的產(chǎn)品，或者如第二、第三或第四方面中任一項(xiàng)限定的組合物。多個(gè)方面涉及如第一方面中限定的產(chǎn)品，或者如前述方面中任一項(xiàng)限定的組合物的用途，用于制備治療骨關(guān)節(jié)炎、癌癥的藥物，制備用于眼科治療的藥物，制備用于處理創(chuàng)傷的藥物，制備用于血管發(fā)生的藥物，或制備保濕劑(moisturizer)。附圖簡(jiǎn)述在一些附圖中，柱狀圖標(biāo)有一個(gè)星號(hào)，表示與，O時(shí)的值相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異值；pS0.05。標(biāo)有兩個(gè)星號(hào)的柱狀圖是與t=0時(shí)的值相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高度顯著差異的值；pSO.Ol。圖1:對(duì)相對(duì)長(zhǎng)時(shí)間皮膚水合作用(relativelongtermskinhydration)的比較評(píng)估。在4周和8周的處理之后，用3種分子量的HA級(jí)分獲得水合作用的顯著提高。圖2:顯示用皮膚彈性測(cè)量?jī)x(cutometer)測(cè)量的多種皮膚彈性參數(shù)，如下文詳述中所述。圖3:顯示在4周和8周的施用之后，相對(duì)的測(cè)量的總體皮膚彈性(relativemeasuredoverallskinelasticities)R2。用全部活性霜?jiǎng)┚宄赜^察到了總體彈性(R2)的顯著提高。在不同分子量的HA級(jí)分之間未觀察到顯著差異。圖4:相對(duì)平均4且并造度觀'J量(relativemeanroughnessmeasurement)在下文描述，結(jié)果示于圖4。在4周和8周的施用之后，平均粗糙度值顯著降低。優(yōu)先積累在皮膚表面的300,000DaMW級(jí)分的效果更加顯著。圖5:相對(duì)最大粗凈造度觀'j量(relativemaxroughnessmeasurement)在下文描述，結(jié)果示于圖5;在4周和8周的施用之后，這些值也顯著降低，但是僅就兩種最低分子量的級(jí)分而言。能夠穿過皮膚的非常低分子量的50kDaHA級(jí)分的這種效果明顯是更顯著的。圖6:顯示在如下文實(shí)施例中所述的4周和8周施用之后的相對(duì)粘彈性比例R6。就低MWHA級(jí)分觀察到了非常顯著的增加。發(fā)明詳述"透明質(zhì)酸"在本文定義為未硫酸化的糖胺聚糖，由N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重復(fù)二糖單位組成，其通過交替的(3-1,4和卩-1,3糖苷鍵聯(lián)接到一起。透明質(zhì)酸也稱作乙酰透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸鹽或HA。8術(shù)語乙酰透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸在本文可以互換使用。本發(fā)明的第一方面涉及保濕、化妝或抗皺產(chǎn)品，其包含至少兩種透明質(zhì)酸級(jí)分或其鹽，其中一種級(jí)分具有范圍在8,000-IOO，OOODa，優(yōu)選10-90kDa，或優(yōu)選20-80kDa,或30-70kDa,甚至更優(yōu)選范圍在40-60kDa，或最優(yōu)選約50kDa的平均分子量；并且另一種級(jí)分具有范圍在100,000-500,000Da，或優(yōu)選150-450kDa,更優(yōu)選200-400kDa，甚至更優(yōu)選范圍在250-350kDa,或最優(yōu)選約300kDa的平均分子量。雞冠是乙酰透明質(zhì)酸重要的商業(yè)來源。微生物是可供選擇的來源。美國(guó)專利No.4,801,539公開了用于制備透明質(zhì)酸的發(fā)酵方法，其包括獸瘟鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)菌林，報(bào)道的產(chǎn)率是約3.6g透明質(zhì)酸每升。歐洲專利No.EP0694616公開了使用改進(jìn)的獸瘟鏈球菌菌抹的發(fā)酵方法，報(bào)導(dǎo)的產(chǎn)率是約3.5g透明質(zhì)酸每升。如WO03/054163(Novozymes)(該文件完整并入本文)中所公開的，可以重組產(chǎn)生透明質(zhì)酸或其鹽，例如在革蘭氏陽性芽孢桿菌屬宿主中重組產(chǎn)生。已描述乙酰透明質(zhì)酸合酶來自于脊推動(dòng)物、細(xì)菌病原體和藻病毒(DeAngelis,RL"1999,Cell.Mol.LifeSci.56:670-682)。WO99/23227公開了來自似馬4連J求菌(Streptococcusequisimilis)的I組透明質(zhì)酸鹽合酶(hyaluronatesynthase)。WO99/51265和WO00/27437描述了來自多殺巴斯德氏菌(Pasturellamultocida)的II組透明質(zhì)酸鹽合酶。Ferretti等公開了釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的乙酰透明質(zhì)酸合酶操縱子，其由三個(gè)基因hasA、hasB和hasC組成，其分別編碼透明質(zhì)酸鹽合酶、UDP葡糖脫氫酶和UDP-葡糖焦磷酸化酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98，4658-4663,2001)。WO99/51265描述了具有似馬鏈球菌乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼區(qū)的核酸區(qū)段。由于重組芽孢桿菌屬細(xì)胞的乙酰透明質(zhì)酸直接表達(dá)至培養(yǎng)基，可以使用簡(jiǎn)單的方法從該培養(yǎng)基中分離乙酰透明質(zhì)酸。首先，將芽孢桿菌屬細(xì)胞和細(xì)胞碎片從培養(yǎng)基中物理去除。如果期望，首先可將培養(yǎng)基稀釋，以降低培養(yǎng)基的粘性。用于從培養(yǎng)基去除細(xì)胞的許多方法對(duì)于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員是已知的，如離心和微濾(microfiltration)。如果期望，然后可將剩余的上清液過濾，如通過超濾，以從乙酰透明質(zhì)酸濃縮和去除小分子污染物。去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片之后，通過已知機(jī)制從培養(yǎng)基簡(jiǎn)單沉淀乙酰透明質(zhì)酸。鹽、醇或鹽和醇的組合可用于/人濾液沉淀乙酰透明質(zhì)酸。一旦變?yōu)?reduceto)沉淀物，能夠通過物理方法容易地將乙酰透明質(zhì)酸從溶液中分離。可使用本領(lǐng)域已知的蒸發(fā)技術(shù)(如凍干或噴霧干燥)，從濾液溶液干燥或濃縮乙酰透明質(zhì)酸。宿主細(xì)月包優(yōu)選實(shí)施方案涉及第一方面的產(chǎn)品，其中所述透明質(zhì)酸或其鹽是重組產(chǎn)生的，優(yōu)選通過革蘭氏-陽性細(xì)菌或宿主細(xì)胞，更優(yōu)選通過芽孢桿菌屬(genusSac/〃w力的細(xì)菌重組產(chǎn)生。宿主細(xì)胞可以是適合用于重組產(chǎn)生透明質(zhì)酸的任何芽孢桿菌屬細(xì)胞。芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞可以是野生型芽孢桿菌屬細(xì)胞或其突變體。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的芽孢桿菌屬細(xì)胞包括但不限于Sac/〃w、嗜堿芽孢桿菌C/ac/〃wsa儀a/o;/H7w力、角罕淀粉芽孑包桿菌C6ac/〃m1amy/o/^wej^c/em^短芽孢桿菌(^7c/〃z^6rev^)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bac/〃M"Vrw/a似)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孑包桿菌(5(3c/〃MscoagM/ww)、堅(jiān)強(qiáng)芽孑包桿菌(5"。'7/",mm力、杣爛芽孢桿菌(Sa"'〃^/a^M力、遲緩芽孢桿菌C6a"7/w/e"fw》、地衣芽孑包桿菌C6ac/〃z^//c/zem/omn'力、巨大芽孢桿菌C8ac/〃wmega&n'wm)、短小芽孑包桿菌(5ac/〃船/7Mm//w>sO、嗜熱月旨肪芽孑包桿菌(5fl"7/wWeara^zermo;/H7w》、枯草芽孢桿菌(5a"'〃ww6"to)和蘇云金芽孑包桿菌CSac/〃t^^zMr/"g7'em7、)纟田胞。特別適于重組表達(dá)的突變枯草芽孢桿菌細(xì)胞在WO98/22598有所描述。無包嚢(non-encapsulating)的芽孢桿菌屬細(xì)胞在本發(fā)明中是特別有用的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在其它更優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞。在其它更優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌細(xì)胞。在其它更優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在其它更優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌A164A5(參見美國(guó)專利No.5,891/701)或枯草芽孢桿菌168A4。用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞可以，例如，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如Chang和Cohen,1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)，通過使用感受態(tài)纟田胞(參見，例如Young和Spizizen,1961，JournalofBacteriology81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journalo丄'MolecularBiology56:209-221)，通過電穿孑L(參見，例如Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-75l)或通過接合(參見，例如Koehler和Thome,1987,JournalofBacteriology169:5271-5278)來進(jìn)行。分子量可以根據(jù)改良的?？ㄟ蚍?Bitter和Muir,1962,AnalBiochem.4:330-334)測(cè)定透明質(zhì)酸的水平。此外，透明質(zhì)酸的平均分子量可以使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，如由Ueno等，1988,C7zem.尸/畫.城36,4971-4975;Wyatt,1993,C//附.272:1-40;和WyattTechnologies,1999，"LightScatteringUniversityDAWNCourseManual"和"DAWNEOSManual"WyattTechnologyCorporation,SantaBarbara,California所描述的那些。鹽和交聯(lián)的HA優(yōu)選實(shí)施方案涉及第一方面的產(chǎn)品，其包含透明質(zhì)酸的無機(jī)鹽，優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸銨、透明質(zhì)酸釣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅或透明質(zhì)酸鈷。已發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸鈉與聚乳酸單酰氯或二酰氯(polylacticacidmono-ordi-acylchloride)的反應(yīng)產(chǎn)生了相聯(lián)的或交聯(lián)的HA-PLA或HA-PLA-HA產(chǎn)物，當(dāng)與未處理的HA或PLA的標(biāo)準(zhǔn)光譜比較時(shí)，所述產(chǎn)物在IR光譜上顯示在1736cm-1的強(qiáng)峰，其對(duì)應(yīng)于在相聯(lián)的HA-PLA產(chǎn)物中新形成的聚乳酸酯的存在。因此，優(yōu)選的實(shí)施方式涉及第一方面的產(chǎn)物，其中透明質(zhì)酸或其鹽包含聚合a-羥酸的酯，優(yōu)選是聚乳酸或乙醇酸的酯。也已發(fā)現(xiàn)用硼酸處理透明質(zhì)酸鈉溶液產(chǎn)生了交聯(lián)的HA-硼酸水凝膠，當(dāng)與未處理的Na-HA的標(biāo)準(zhǔn)光譜比較時(shí)，所述交聯(lián)的HA-硼酸水凝膠在FT-IR光譜上顯示在1200和945cm-1的新的峰，其對(duì)應(yīng)于交聯(lián)HA-硼酸水凝膠中新形成的硼酸酯(borateester)的存在。因此，優(yōu)選的實(shí)施方案涉及第一方面的產(chǎn)品，其中透明質(zhì)酸或其鹽包含硼酸酯。在第一方面產(chǎn)品的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸或其鹽全部或部分地與二乙烯砜(divinylsulfone;DVS)交聯(lián)。ii保濕和抗皺作用如下文的實(shí)施例中所示，第一方面的產(chǎn)品具有皮膚保濕作用，表現(xiàn)為增加皮膚水合值(hydrationvalue)的能力，在優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)如下文在實(shí)施例中所限定的進(jìn)行測(cè)量時(shí)，使皮膚水合值經(jīng)過8周(over8weeks)增加至少3%,優(yōu)選至少5%，最優(yōu)選至少7%。另外，第一方面的產(chǎn)品能夠增加皮膚總體彈性R2，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)如下文在實(shí)施例中所限定的進(jìn)行測(cè)量時(shí)，使皮膚總體彈性R2經(jīng)過8周增加至少4%,優(yōu)選至少8%，最優(yōu)選至少12%。同樣，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)如本文所述測(cè)量時(shí)，第一方面的產(chǎn)品能夠使皮膚的平均粗糙度值經(jīng)過8周降低至少5%,優(yōu)選至少10%,并且最優(yōu)選至少15%。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)如本文所限定的進(jìn)行測(cè)量時(shí)，第一方面的產(chǎn)品能夠使皮膚的最大粗糙度值經(jīng)過8周降低至少3%，優(yōu)選至少5%，并且最優(yōu)選至少10%。當(dāng)如本申請(qǐng)所限定的進(jìn)行測(cè)量時(shí)，第一方面產(chǎn)品的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案能夠使皮膚的粘彈性比例R6經(jīng)過8周增加至少10%,優(yōu)選至少15%、20%、25%,并且最優(yōu)選至少30%。其它成分在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)品還可以包含其它成分，優(yōu)選一種或多種活性成分，優(yōu)選一種或多種藥理學(xué)活性物質(zhì)，并且還優(yōu)選水溶性賦形劑，如乳糖。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)品還可以包含一種或多種酶，優(yōu)選連接酶、轉(zhuǎn)移酶、氧化還原酶、水解酶、裂合酶和/或異構(gòu)酶；更優(yōu)選淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素水解酶(cellulyticenzyme)、氧化還原酶或植物細(xì)胞壁降解酶，并且更優(yōu)選具有選自下組的活性的酶氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖芬酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextringlycosyltransfemse)、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、P-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卣過氧化物酶(haloperoxidase)、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖香酶、氧化酶、果膠酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。可以在本發(fā)明中使用的活性成分或藥理活性物質(zhì)的非限定性實(shí)例包括蛋白質(zhì)和/或肽藥物，如，人生長(zhǎng)激素、牛生長(zhǎng)激素、豬生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)激素釋放激素/肽、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、紅細(xì)胞生成素、骨形態(tài)形成性蛋白質(zhì)(bonemorphogenicprotein)、干擾素或其衍生物、胰島素或其衍生物、心房肽III(atriopeptin-III)、單克隆抗體、腫瘤壞死因子、巨噬細(xì)胞活化因子、白細(xì)胞介素、腫瘤退化因子(tumordegeneratingfactor)、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、組織纖溶酶原;敫活物(tissueplasminigenactivator)、因子VII、因子VIII禾口尿;敫酶。可包括水溶性賦形劑用于穩(wěn)定活性成分，這種賦形劑可包括蛋白質(zhì)，例如，白蛋白或明膠；氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和它們的鹽；糖如葡萄糖、乳糖、木糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、右旋糖苷(dextran)、甘露醇、山梨醇、海藻糖和硫酸軟骨素；無機(jī)鹽如磷酸鹽；表面活性劑如TWEEN⑧(ICI)、聚乙二醇，和它們的混合物。賦形劑或穩(wěn)定劑可以以產(chǎn)品重量的0.001至99%的量使用。本發(fā)明的幾個(gè)方面涉及各種組合物和藥物，除了其它成分外，其包含有效量的如第一方面所限定的產(chǎn)品，和活性成分，優(yōu)選所述活性成分是藥理活性劑；可藥用的載體(pharmaceuticallyacceptablecarrier)、賦形劑或稀釋劑，優(yōu)選水溶性賦形劑，并且最優(yōu)選乳糖。此外，本發(fā)明的多個(gè)方面涉及包含如第一方面所限定的產(chǎn)品或如上多個(gè)方面和實(shí)施方案中所限定的組合物的物品，例如，化妝品、衛(wèi)生物品、醫(yī)療或外科物品。在本發(fā)明的最后方面涉及藥物膠嚢或微膠嚢，其包含如第一方面所限定的產(chǎn)品或如本發(fā)明其它方面和實(shí)施方案中所限定的組合物。使用產(chǎn)品或組合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的不同方面涉及，例如在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域使用第一方面的產(chǎn)品或使用本發(fā)明的組合物執(zhí)行處理程序的方法。一個(gè)方面涉及在眼科學(xué)中執(zhí)行程序的方法，其包括使用如第一方面所限定的產(chǎn)品或本發(fā)明的組合物。說另一個(gè)方面涉及在骨關(guān)節(jié)炎治療中執(zhí)行程序的方法，其包括使用如第一方面所限定的產(chǎn)品或本發(fā)明的組合物。另一個(gè)方面涉及在癌癥治療中執(zhí)行程序的方法，其包括使用如第一方面所限定的產(chǎn)品或本發(fā)明的組合物。一個(gè)方面涉及進(jìn)行藥理活性劑的透皮或皮膚施用的方法，其包括使用如第一方面所限定的產(chǎn)品或本發(fā)明的組合物。另一個(gè)方面涉及進(jìn)行化妝品的皮膚施用的方法，其包括使用如第一方面所限定的產(chǎn)品或本發(fā)明的組合物。實(shí)施例實(shí)施例1使用了多種具有不同分子量的透明質(zhì)酸鈉(HA)級(jí)分。表1總結(jié)了重量平均分子量(Mw)、數(shù)量平均分子量(Mn)和多分散性(I=Mw/Mn)。表l.所用不同透明質(zhì)酸鈉的分子特性透明質(zhì)酸鈉MW(Da)Mn(Da)I=Mw/MnHA5053000370001.4HA130130000830001.6HA3003200002100001.5使用以下配方(表2)進(jìn)行明確限定分子量的HA在化妝品配方中的功效測(cè)試。安慰霜?jiǎng)?placebocream)由相同的成分構(gòu)成但不含HA。表2.稱為活性霜?jiǎng)┑幕瘖y品配方的組成成分%w/w水(aqua)72.25HA0.10氬化聚姿烯(Hydrogenatedpolydecene)20.00硬脂基聚氧乙烯(2)醚(Steareth-2)3.00硬脂基聚氧乙烯(21)醚(Steareth-21)1.00十六/十八醇(Cetearylalcohol)1.50苯氧乙醇，對(duì)羥基苯曱酸曱S旨(Methylparaben),對(duì)羥基苯曱酸丁酯(Butylparaben),對(duì)羥基苯曱酸乙酯(Ethylparaben),對(duì)羥基苯甲酸丙酯(Propylparaben)，對(duì)羥基苯曱酸異丁酯0.80W-(羥曱基)-iV-(l，3-雙羥曱基-2,5-二氧-4-咪唑烷基)-N，-(羥曱基)脲(DiazolidinylUrea)0.25EDTA二鈉(Disodi飄EDTA)0.1014本研究的目的是評(píng)估在長(zhǎng)期使用(l個(gè)月和2個(gè)月)后化妝產(chǎn)品的抗皺功效并將其與安慰霜?jiǎng)┍容^。12名受試者在家中涂敷了活性霜?jiǎng)┖桶参克獎(jiǎng)?，一天兩次，持續(xù)2個(gè)月。在研究開始時(shí)，處理一個(gè)月之后，以及研究結(jié)束時(shí)，在眼周區(qū)域?qū)ζつw水合作用和彈性進(jìn)行儀器測(cè)量。在相同的區(qū)域制作皮膚表面的塑性復(fù)制品(plasticreplica)，并且以所述復(fù)制品的圖像分析來評(píng)估皮膚角質(zhì)層的微起伏(micro-rdief)。此外，為研究的區(qū)域拍攝數(shù)碼照片。評(píng)價(jià)方法在生物氣候室(bioclimaticroom)(24。C;50%相對(duì)濕度)中進(jìn)行研究。要求志愿者們不要洗臉，并且在進(jìn)行測(cè)量之前至少3個(gè)小時(shí)不要在測(cè)試所涉及的區(qū)域上涂敷產(chǎn)品。在研究開始時(shí)(To),在左眼周和右眼周區(qū)域?qū)ζつw水合作用、彈性和粗糙度進(jìn)行儀器評(píng)估，須以可重復(fù)的方式進(jìn)行。對(duì)相同的區(qū)域還拍攝了數(shù)碼照片。評(píng)估在臉上進(jìn)行，其中用活性霜?jiǎng)┨幚砟樀囊粋?cè)，而用安慰霜?jiǎng)┨幚砹硗獍脒吥樧鳛閷?duì)照。在臉上涂敷這兩種霜?jiǎng)?活性霜?jiǎng)┖桶参克獎(jiǎng)?的兩側(cè)(左側(cè)和右側(cè))是隨機(jī)的。受試者在他們的臉上每天涂敷這兩種產(chǎn)品兩次，持續(xù)兩個(gè)月。處理1個(gè)月之后(T3o天)和測(cè)試結(jié)束時(shí)(處理2個(gè)月之后，T6o天)，受試者回到實(shí)驗(yàn)室重復(fù)儀器測(cè)量并拍攝新的數(shù)碼圖像。然后分析獲得的數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。長(zhǎng)期水合作用使用皮膚角質(zhì)層水分測(cè)量法(Corneometry)進(jìn)行皮膚表面水合作用的評(píng)估。皮膚角質(zhì)層水分測(cè)量法測(cè)定角質(zhì)層(SC)的電容(capacitance)，并由此反映出相對(duì)SC含水量。測(cè)量使用皮膚角質(zhì)層水分測(cè)量?jī)x(Comeometer):CombiCM825(Courage&Khazaka)進(jìn)行。結(jié)果示于圖l;在4周和8周處理之后，用每種分子量HA均明顯地獲得了水合作用的顯著增加。彈性使用皮膚彈性測(cè)量?jī)x(Cutometer)SEM575(Courage&Khazaka)測(cè)量皮15膚彈性。皮膚彈性測(cè)量?jī)x測(cè)量皮膚被吸入測(cè)量探針的開口時(shí)的垂直形變。這種方法通過以下參數(shù)提供與皮膚彈性有關(guān)的形變參數(shù)，如圖2所示UA/UF-皮膚總體彈性(R2參數(shù))UV/UE=粘彈性比例(R6^lt)UA=應(yīng)力消除期結(jié)束時(shí)的總形變恢復(fù)(totaldeformationrecoveryattheendofthestress-offperiod)UF=皮膚的總延展性(totalextensibility)uv=彈性形變之后發(fā)生的粘彈性蠕變(viscoelasticcreepoccurringaftertheelasticdeformation)UE=因應(yīng)力施加產(chǎn)生的皮膚彈性形變(elasticdeformationoftheskinduetotheapplicationofstress)。在涂敷8周之后測(cè)量的總體彈性R2示于圖3。用全部活性霜?jiǎng)┚宄赜^察到了總體彈性(R2)的顯著增加。在不同分子量的HA級(jí)分之間未觀察到顯著差異。抗皺通過皮膚表面復(fù)制品和圖像分析來評(píng)估皮膚表面的形貌(topography)。測(cè)試的原理是通過應(yīng)用快速硬化合成聚合物(SILFLC^-FlexicoLtd.UK.)來獲得皮膚表面的陰印片(negativeimprint)。然后通過圖像數(shù)字化來分析這種復(fù)制品。從這種圖像計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)的粗糙度參數(shù)Ra(平均粗糙度)和Rz(深紋的最大粗糙度)。平均粗糙度結(jié)果示于圖4。在4周和8周的涂敷之后平均粗糙度值顯著降低。在皮膚表面優(yōu)先積累的300,000DaMW級(jí)分的效果更加明顯。最大粗糙度結(jié)果示于圖5;這些值在4周和8周的涂敷之后也顯著下降，但是僅就兩種最低分子量的級(jí)分而言。能夠穿過皮膚的非常低分子量的50kDaHA級(jí)分的這種效果明顯地更加顯著。1權(quán)利要求1.保濕、化妝或抗皺產(chǎn)品，其包含至少兩種透明質(zhì)酸級(jí)分或其鹽，其中一種級(jí)分具有8,000-100,000Da的平均分子量，另一種級(jí)分具有100,000-500,000Da的平均分子量。2.根據(jù)權(quán)利要求1的產(chǎn)品，其中所述透明質(zhì)酸或其鹽是重組產(chǎn)生的，優(yōu)選通過革蘭氏陽性細(xì)菌，更優(yōu)選通過芽孢桿菌屬的細(xì)菌重組產(chǎn)生。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的產(chǎn)品，其包含透明質(zhì)酸的無機(jī)鹽，優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸銨、透明質(zhì)酸4丐、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅或透明質(zhì)酸鈷。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的產(chǎn)品，當(dāng)如本文所限定的進(jìn)行測(cè)量時(shí)，其能夠使皮膚水合值經(jīng)過8周增加至少3%,優(yōu)選至少5%,最優(yōu)選至少7%。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的產(chǎn)品，當(dāng)如本文所限定的進(jìn)行測(cè)量時(shí)，其能夠使皮膚總體彈性R2經(jīng)過8周增加至少4%，優(yōu)選至少8%，更優(yōu)選至少12%。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的產(chǎn)品，當(dāng)如本文所限定的進(jìn)行測(cè)量時(shí)，其能夠?qū)⑵つw的平均粗糙度值經(jīng)過8周減少至少5%,優(yōu)選至少10%,并且最優(yōu)選至少15%。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的產(chǎn)品，當(dāng)如本文所限定的進(jìn)行測(cè)量時(shí)，其能夠?qū)⑵つw的最大粗糙度值經(jīng)過8周減少至少3%,優(yōu)選至少5%，并且最優(yōu)選至少10%。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的產(chǎn)品，當(dāng)如本文所限定的進(jìn)行測(cè)量時(shí)，其能夠使皮膚的粘彈性比例R6經(jīng)過8周增加至少10%，優(yōu)選至少15%、20°/0、25%，并且最優(yōu)選至少30%。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的產(chǎn)品，其中所述透明質(zhì)酸或其鹽包含硼酸和/或聚合a-羥酸的酯，優(yōu)選是聚乳酸或乙醇酸的酯。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的產(chǎn)品，其中所述透明質(zhì)酸或其鹽全部或部分地與二乙烯砜(DVS)交聯(lián)。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的產(chǎn)品，其還包含活性成分，優(yōu)選藥理活性物質(zhì)。12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的產(chǎn)品，其還包含水溶性賦形劑，優(yōu)選乳糖。13.組合物，其包含如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)限定的產(chǎn)品，和活性成分，優(yōu)選所述活性成分是藥理活性劑。14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其還包含水溶性賦形劑，優(yōu)選乳糖。15.藥物組合物，其包含有效量的如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)限定的產(chǎn)品，以及可藥用載體、賦形劑或稀釋劑。16.藥物組合物，其包含有效量的如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)限定的產(chǎn)品作為運(yùn)載體，以及藥理活性劑。17.化妝品，其包含作為活性成分的有效量的如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)限定的產(chǎn)品。18.衛(wèi)生、醫(yī)療或外科物品，其包含如^L利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品；優(yōu)選所述物品是外科海綿、愈傷海綿，或包含于急救繃帶或其它創(chuàng)傷敷裹材料中的部分。19.藥物膠嚢或微膠嚢，其包含如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品。20.在眼科學(xué)中執(zhí)行程序的方法中的改進(jìn)，其包括使用如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物。21.在骨關(guān)節(jié)炎治療中執(zhí)行程序的方法中的改進(jìn)，其包括使用如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中^f壬一項(xiàng)所限定的組合物。22.在癌癥治療中執(zhí)行程序的方法中的改進(jìn)，其包括使用如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物。23.在進(jìn)行透皮施用藥理活性劑的方法中的改進(jìn)，其包括使用如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物。24.在進(jìn)行皮膚施用藥理活性劑的方法中的改進(jìn)，其包括使用如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物。25.在進(jìn)行皮膚施用化妝品的方法中的改進(jìn)，其包括使用如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物。26.使用如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物的眼科學(xué)方法。27.治療骨關(guān)節(jié)炎的方法，其包括向哺乳動(dòng)物施用有效量的如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物，優(yōu)選所述施用是皮膚施用、透皮施用、口服施用或通過注射施用。28.處理創(chuàng)傷的方法，其包括向哺乳動(dòng)物施用有效量的如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物。29.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物用于制備治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物的用途。30.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物用于制備眼科學(xué)治療的藥物的用途。31.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物用于制備治療癌癥的藥物的用途。32.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物用于制備處理創(chuàng)傷的藥物的用途。33.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物用于制備用于血管發(fā)生的藥物的用途。34.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的產(chǎn)品或如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所限定的組合物用于制備保濕劑、化妝品或霜?jiǎng)┑挠猛?。全文摘要本發(fā)明提供保濕、化妝或抗皺產(chǎn)品，其包含至少兩種透明質(zhì)酸級(jí)分或其鹽，其中一種級(jí)分具有8,000-100,000Da的平均分子量，另一種級(jí)分具有100,000-500,000Da的平均分子量。文檔編號(hào)A61K31/728GK101500535SQ200780029995公開日2009年8月5日申請(qǐng)日期2007年6月26日優(yōu)先權(quán)日2006年6月28日發(fā)明者伯吉特·M·馬勒,卡迪加·施瓦克-阿布德勞伊申請(qǐng)人:諾維信生物聚合物公司