專利名稱：具雌激素活性的紅車軸草提取物的制備方法及其提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，更具體地說是涉及一種從豆科車軸草屬植物紅車軸草中提取的有效部位，以及該提取物制備方法的改進技術(shù)。
背景技術(shù)：
紅車軸草(Trifolium pratense L.)為豆科車軸草屬多年生草本植物，又名紅三葉、紅花苜蓿和三葉草等，為優(yōu)良的飼料和牧草，廣泛分布于世界各地，我國新疆、吉林、云貴高原、湖北鄂西山地都有野生，江淮流域、華南、西南等地均有栽培，是我國長江流域以南地區(qū)優(yōu)良的豆科牧草。民間主要用作治療更年期綜合癥、骨質(zhì)疏松癥、抗腫瘤(乳腺癌、子宮癌、前列腺癌等)，國外已有多種紅車軸草制劑產(chǎn)品上市，是國際上公認的治療更年期綜合癥療效確切的植物藥，其銷量在美國多年以來一直名列植物藥的前十位，非常受歡迎，我國每年均有其大量提取物出口。中國專利CN1566108A和CN1439367A也公開了二種紅車軸草提取物的制備工藝。為充分挖掘和利用我國這一寶貴植物資源，很有必要對這一植物進行深入研究，特別是以動物藥效學(xué)結(jié)果為導(dǎo)向，制訂完全符合工業(yè)化生產(chǎn)的有效部位制備工藝。
現(xiàn)代化學(xué)研究表明，紅車軸草中主要含有(異)黃酮類、香豆素類及酚羧酸類成分，均屬于植物雌激素范疇，顯然，紅車軸草雌激素活性有效部位應(yīng)是上述三類成分的總和，而非單一的異黃酮類成分，雌激素有效部位的篩選依據(jù)應(yīng)是動物藥效學(xué)實驗結(jié)果，并非單純提高異黃酮的含量。
植物雌激素(phytoestrogens PE)是指某些能結(jié)合并激活哺乳類動物及人類的雌激素受體，從而具有雌激素活性的植物成分，主要存在于豆類植物和齒狀植物中。植物雌激素為雜環(huán)多酚類化合物，依據(jù)分子結(jié)構(gòu)的不同主要包括以下三類成分異黃酮類(isoflavones)、香豆素類(coumestans)、木脂素類(lignans)，上述三類成分其結(jié)構(gòu)與哺乳類動物雌激素17β-雌二醇相似，在植物中廣泛存在。自Bennetts HW1946年首次報道植物雌激素活性以來，由于植物雌激素對人類有明顯的保健作用，而無明顯的毒副作用，且資源豐富，因而受到世界上許多科學(xué)家的重視，上世紀(jì)90年代歐美國家政府紛紛主動撥款以資助該項研究。
現(xiàn)代科學(xué)研究的成果證實植物雌激素對與雌激素水平相關(guān)的許多疾病有很好的保健和治療作用，主要體現(xiàn)在骨質(zhì)疏松、更年期綜合癥、癌癥及心血管病癥方面。植物雌激素可看成是對傳統(tǒng)激素替代療法(hormonereplacement therapy，HRT)的潛在替代治療物，主要是因為如果長期服用化學(xué)激素類藥物可產(chǎn)生明顯的副作用，如易促發(fā)子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、陰道出血等。有調(diào)查表明，由于女性擔(dān)心化學(xué)激素類藥物改變了其自然的生理過程，出于對副作用的恐懼，僅有35-49％的女性接受傳統(tǒng)的激素替代療法，其中仍有一部分不能長期堅持應(yīng)用，根據(jù)一些非專業(yè)的報告，許多女性擅自使用一些中草藥治療更年期綜合癥，常有明顯的效果，其中起作用的成分是植物雌激素。
植物雌激素較化學(xué)類雌激素藥物的一大明顯優(yōu)勢是其可長期服用，而無明顯副作用，其原因是天然植物雌激素具有選擇性雌激素受體(estrogenreceptor，ER)調(diào)節(jié)劑的作用，1997年Kuiper發(fā)現(xiàn)了一種新雌激素受體，與以前已知的ER(現(xiàn)在稱為ERα)不同，稱為ERβ，植物雌激素分別可與ERα和ERβ受體結(jié)合，但與二者的親合力不同，資料顯示，植物雌激素對ERβ的親合力高于ERα，而內(nèi)源性的甾醇雌激素則沒有這種差異，其植物雌激素作用可能由ERβ介導(dǎo)，由于ERα和ERβ在不同組織和細胞的表達不同，因而植物雌激素與內(nèi)源性雌激素雌二醇有著不同的組織特異性而發(fā)揮不同的作用。同時植物雌激素也可與雌二醇競爭性地結(jié)合ER產(chǎn)生雌激素拮抗作用，當(dāng)體內(nèi)雌激素水平過高時，植物雌激素則可與ERα結(jié)合發(fā)揮拮抗作用，故具有雙向性，可以有效地避免由于體內(nèi)雌激素水平過高所產(chǎn)生的副作用。一般低劑量時，與內(nèi)源雌激素競爭結(jié)合ER，主要表現(xiàn)為抗雌激素活性；中劑量時，它可以產(chǎn)生一定的雌激素活性；高劑量時，它可以活化因雌激素水平限制未能活化的ER，產(chǎn)生雌激素強效應(yīng)，所以，植物雌激素可通過與不同受體的結(jié)合實現(xiàn)對人體內(nèi)雌激素水平的自控平衡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備具雌激素活性的紅車軸草提取物的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種具有較好雌激素樣作用的紅車軸草提取物。
本發(fā)明的解決方案是從干燥紅車軸草中提取具雌激素活性的紅車軸草提取物，所述提取物的制備方法，包括以下主要步驟(1)紅車軸草地上部分，粉碎，用含水的乙醇溶液提取。所說的紅車軸草地上部分，是指干燥藥材；用于提取紅車軸草的含水乙醇溶液，其乙醇濃度為50-95％；用量為藥材重量的5-15倍；加熱回流提取2-3次，每次2-3小時為較佳。
(2)過濾提取液，濃縮濾液并回收乙醇，濾液濃縮至10-30％醇濃度。當(dāng)提取用乙醇濃度較高時，為防止?jié)饪s后期的焦糊現(xiàn)象，可向濾液中加入適量的蒸餾水。
(3)濃縮液加入濃度為10-30％的乙醇溶液和澄清劑，攪拌混勻后放置沉淀。10-30％的乙醇溶液的加入量為藥材重量的5-15倍，最終藥液量為藥材重量的8-12倍為佳，加入量太小，溶液濃度太大，沉降效果不好，加入量太大，則增加勞動強度。澄清劑的加入量為藥材重量的0.05-0.5％，加入量太小，沉降效果不好，加入量太大，則造成不必要的浪費。為提高提取物得率，沉淀部分可用適量10-30％的乙醇溶液洗滌2次，上清液合并后也通過大孔吸附樹脂柱。所說的澄清劑選自甲殼素類、101果汁類及ZTCl+1類澄清劑，加入時應(yīng)按照每類澄清劑的使用說明，配成溶液使用，邊加邊攪，混合均勻。
(4)取上清液通過苯乙烯型大孔吸附樹脂柱，水洗后用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液。所說的苯乙烯型大孔吸咐樹脂柱，是指已用酸、堿、有機溶媒、蒸餾水等處理好的苯乙烯型大孔吸附樹脂柱，為保證有效成分在柱上的充分吸附，濾液通過柱的流速不宜過快，以三氯化鐵試劑檢查流出液為陰性反應(yīng)為宜，濾液全部通過柱后，用蒸餾水洗柱去除雜質(zhì)，柱流速可適當(dāng)快些，蒸餾水洗至流出液顏色較淺后，采用50-95％的乙醇溶液將柱上吸附的成分洗下，此時可看到柱上有明顯的棕紅色的色帶隨著洗脫的進行逐漸向下移動，待該色帶接近柱底端或出現(xiàn)三氯化鐵陽性反應(yīng)時，開始收集洗脫液，收集至洗脫液三氯化鐵陰性反應(yīng)。
(5)蒸出洗脫液中的部分乙醇，濃縮液再加入蒸餾水稀釋，控制溶液中乙醇含量至10-20％。其目的是為了大孔吸附樹脂乙醇洗脫液中的成分能夠全溶，10-20％的乙醇濃度不會影響異黃酮、香豆素類成分在聚酰胺柱上的吸附。為保證有效成分在聚酰胺層析柱上的吸附效果，10-20％乙醇溶液的量應(yīng)為藥材重量的10-20倍，濃度太大，有效成分在聚酰胺層析柱上的吸附效果不好，必要時，在上聚酰胺層析柱前，用10-20％的乙醇稀釋。
(6)將稀釋后的溶液通過聚酰胺層析柱，用蒸餾水洗柱后，以乙醇溶液洗脫，收集洗脫液。該聚酰胺柱使用前亦是已用酸、堿、有機溶媒、蒸餾水等處理好，為保證有效成分在柱上的充分吸附，濾液通過柱的流速不宜過快，以三氯化鐵試劑檢查流出液為陰性反應(yīng)為宜，濾液全部通過柱后，用蒸餾水洗柱去除雜質(zhì)，柱流速可適當(dāng)快些，蒸餾水洗至流出液顏色較淺后，采用50-95％的乙醇溶液將柱上吸附的成分洗下，此時可看到柱上有明顯的棕紅色的色帶隨著洗脫的進行逐漸向下移動，待該色帶接近柱底端或出現(xiàn)三氯化鐵陽性反應(yīng)時，開始收集洗脫液，收集至洗脫液三氯化鐵陰性反應(yīng)。
(7)濃縮洗脫液，并回收乙醇，得到的稠膏經(jīng)真空干燥后，微粉化成300目以下的微粉，以提高該提取物的生物利用度。
按照本發(fā)明所述的紅車軸草提取物的制備方法所制得的紅車軸草提取物顯示以下特性(1)土黃色粉末，微粉粒徑為300-400目；(2)該粉末主要成分為異黃酮、香豆素類；(3)紫外分光光度光譜特征吸收峰(nm)260，206；(4)紅外光譜特征吸收峰(cm-1)3520，3080，2920，1720，1680，1610，1280，1050，960；
(5)顯色化學(xué)反應(yīng)如下A三氯化鐵反應(yīng)顯墨綠色，陽性。說明含有酚羥基類化合物，異黃酮及香豆素類成分結(jié)構(gòu)中一般也含有酚羥基。
B濃硫酸反應(yīng)顯黃色-漿紅色，說明含有異黃酮類成分。濃硫酸是強氧化劑，幾乎對所有的成分均可產(chǎn)生反應(yīng)，但對每類成分的顯色不同。
C鈉汞齊反應(yīng)顯黃色-紅紫色，說明含有異黃酮類成分。
D異羥腭酸-鐵反應(yīng)顯紅色，說明含香豆素類成分。
(6)本發(fā)明與原發(fā)明提取物的雌激素作用(子宮系數(shù))比較，小、中、大三個劑量組的小鼠子宮系數(shù)均有明顯提高，是由于在本發(fā)明的提取物中含有香豆素類等其它雌激素活性成分的緣故。
本發(fā)明制備方法與CN1566108A及CN1439367A工藝的關(guān)鍵差別在于采用了澄清劑及大孔吸附樹脂和聚酰胺柱的組合對提取液進行純化處理；按本發(fā)明方法制得的紅車軸草提取物既含有異黃酮類成分，也含有香豆素類成分；該提取物具有雌激素樣作用。
本發(fā)明的一個重要特點是在對紅車軸草提取液進行純化處理時，加入了一種澄清劑。
我們對紅車軸草的乙醇提取液濃縮并加水稀釋后發(fā)現(xiàn)，上清液仍較渾濁，沉降效果不好，這樣無疑會使得過濾困難，且濾液很容易“毒化”樹脂柱，影響純化效果且縮短樹脂柱壽命，所以我們采用了澄清劑以助沉。澄清劑是近些年來發(fā)展起來的一種適合于中藥工業(yè)化生產(chǎn)的有效方法，它是通過吸附、架橋、絮凝等作用使提取液中的較大分子雜質(zhì)沉降下來，達到純化有效成分的目的。在該工藝中，向加水稀釋后的濃縮液加入適量的澄清劑后，可使上清液澄清透明，使得有效成分與大分子雜質(zhì)充分分離。
本發(fā)明的另一個重要特點是采用了澄清劑及大孔吸咐樹脂和聚酰胺柱的工藝組合對提取取液進行純化處理。
在澄清劑處理過的溶液中，還含有較多的小分子或中等大小分子的其它雜質(zhì)，需要進一步處理，一般可有兩種處理方案，一是采用乙酸乙酯萃取，二是進行大孔樹脂柱層析。若采用乙酸乙酯萃取處理，盡管乙酸乙酯萃取部分中的異黃酮及香豆素類成分含量有明顯提高，但母液中異黃酮及香豆素類成分的殘留量也較大，大大降低提取物最終的得率，且萃取過程極易產(chǎn)生乳化，勞動強度又大，又考慮到環(huán)保、安全及生產(chǎn)成本等因素，所以采用大孔樹脂柱層析更為合理，事實上，目前藥廠實際生產(chǎn)中也基本采用此法。大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)人工合成的聚合物吸附劑，具有交聯(lián)立體結(jié)構(gòu)，因而物理、化學(xué)性能穩(wěn)定，機械強度好，經(jīng)簡單處理后可反復(fù)循環(huán)使用。隨著近些年來大孔樹脂的不斷推廣應(yīng)用，適合于吸附分離各類成分的不同規(guī)格型號的大孔樹脂應(yīng)運而生，根據(jù)所分離成分的類別不同可分別采用不同規(guī)格型號的樹脂，樹脂的選擇原則應(yīng)對有效成分針對性強，選擇性高，分離效果好，如DM130、D101、D201、HPD100、HPD600、AB-8、NKA-9適用于吸附分離黃酮(苷)、蒽醌(苷)、香豆素類成分；D301、HPD300、NKA-9適用于吸附分離皂苷、生物堿類成分；D301、HPD600、NKA-9適用于吸附分離環(huán)烯醚萜苷類成分；JKS-30適合于潔霉素及其它抗菌素類成分的吸附分離等。
在大孔樹脂的乙醇洗脫液中仍還有如異黃酮及香豆素分子大小，結(jié)構(gòu)中不含酚羥基的其它雜質(zhì)，為進一步純化，需采用針對異黃酮及香豆素類成分更強的分離手段，在已有文獻中采用了有機溶媒分級或萃取處理法，但該法消耗的有機溶媒體積較大，勞動強度及生產(chǎn)成本較高，在本發(fā)明的制備方法中我們考慮到異黃酮及香豆素分子中一般均含有酚羥基結(jié)構(gòu)，所以采用了對酚羥基結(jié)構(gòu)類成分有特異性吸附作用的聚酰胺柱層析，它是利用酚羥基可與聚酰胺中的酰胺鍵產(chǎn)生締合這一性質(zhì)，將異黃酮及香豆素類化合物吸附在聚酰胺柱上，該法較有機溶媒分級處理法勞動強度及生產(chǎn)成本低，有機溶媒用量小，利于環(huán)保。
本發(fā)明的再一個重要特點是采用動物藥效學(xué)結(jié)果作為追蹤有效部位的指標(biāo)。
眾所周知，植物中的成分類別眾多且復(fù)雜，不同類別的成分與成分之間對某一病癥可產(chǎn)生協(xié)同作用，某一植物對某一病癥有效是該植物中的所有有效成分共同作用的結(jié)果；由于目前的科技水平所限，絕大多數(shù)植物中的成分還知之甚少，已知成分中的藥理活性成分相對于植物中的所有成分來講，更是鳳毛麟角，所以采用動物藥效學(xué)結(jié)果作為追蹤有效部位的指標(biāo)更加科學(xué)合理，本發(fā)明即是如此?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明，紅車軸草中主要含有(異)黃酮類、香豆素類及酚羧酸類成分，均屬于植物雌激素范疇，顯然，紅車軸草雌激素活性有效部位應(yīng)是上述三類成分的總和，而非單一的異黃酮類成分，雌激素有效部位的篩選依據(jù)應(yīng)是動物藥效學(xué)實驗結(jié)果，并非單純提高異黃酮的含量，本發(fā)明即是遵照這一原則，在制備方法的研究中，以動物藥效學(xué)的實驗結(jié)果作為導(dǎo)向和基礎(chǔ)，再結(jié)合工廠生產(chǎn)的成本低、污染小等具體要求，而不是單純地側(cè)重如何提高異黃酮類成分的純度和得率，與開發(fā)新藥的結(jié)合更加密切。
(1)由本發(fā)明制備方法制得的紅車軸草提取物與現(xiàn)有技術(shù)制備的提取物的比較見表1表1

本發(fā)明與原發(fā)明比較提取物得率增加了13.85％，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。
(2)由本發(fā)明制備方法制得的紅車軸草提取物與原發(fā)明制備的提取物的雌激素作用(子宮系數(shù))比較實驗方法按原發(fā)明對未成熟雌性小鼠子宮發(fā)育的影響項下進行選取健康雌性小鼠40只，體重11-13g，分為空白對照組和給藥組。三個小、中、大劑量給藥量分別為250、500、750mg/kg(以異黃酮、香豆素計)，空白對照組給予相同體積的蒸餾水，一次/日，連續(xù)七天，末次給藥后第二天，小鼠稱重，頸椎脫臼處死動物，解剖取子宮，精密稱重，計算子宮系數(shù)，并與原發(fā)明有關(guān)數(shù)據(jù)比較，見表2
表2

子宮增重作用與對照組比較差異顯著(P＜0.01)。
本發(fā)明與原發(fā)明提取物的雌激素作用(子宮系數(shù))比較，小、中、大三個劑量組的小鼠子宮系數(shù)均有明顯提高，是由于在本發(fā)明的提取物中含有少量香豆素類等其它雌激素活性成分的緣故。
總之，本發(fā)明的優(yōu)點是很明顯的，本發(fā)明制備方法與上述制備工藝的關(guān)鍵差別在于采用了加澄清劑及大孔吸附樹脂和聚酰胺柱的組合對提取液進行純化處理，按本發(fā)明方法制得的紅車軸草提取物既含有異黃酮類成分，也有香豆素類成分，總含量超過50％，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較提取物得率增加了13.85％，主要原因是以聚酰胺柱層析代替了有機溶劑的分級或萃取處理，降低了有效成分的損耗，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義；本發(fā)明制備的提取物的雌激素作用(子宮系數(shù))與現(xiàn)有技術(shù)比較，小、中、大三個劑量組的小鼠子宮系數(shù)均有明顯提高，動物實驗證實，由本發(fā)明制得紅車軸草提取物具有較好的雌激素樣作用。本發(fā)明制備方法成本低廉、操作簡單、沒有采用一、二類有機溶媒，綠色環(huán)保，完全適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。
具體實施例方式
實施例1取紅車軸草地上部分1kg，粉碎，用藥材重量10倍的50％乙醇回流提取3次，每次3小時，合并乙醇提取液，蒸餾回收乙醇至10％醇度，加入10％乙醇溶液稀釋藥液，攪勻后，加入2gZTCl+1 II型澄清劑B組分配成的1％醋酸溶液200ml，攪拌混勻，0.5小時后再加入1gZTCl+1 II型澄清劑A組分配成的1％醋酸溶液100ml，攪拌混勻，放置6小時自然沉淀，吸取上清液，沉淀部分分別用4倍藥材重量的10％乙醇溶液洗滌沉淀2次，上清液合并，將下部沉淀過濾，濾液與上清液合并后通過已處理好的DM130大孔吸附樹脂柱(12×120cm；流速15ml/min)，蒸餾水洗柱(流速40ml/min)至流出液顏色不再變淺，用70％乙醇洗柱(流速20ml/min)，可看到明顯的棕紅色色帶向下移動，當(dāng)色帶移至層析柱的底端，流出液顏色開始加深且三氯化鐵試劑反應(yīng)陽性時，開始收集洗脫液，至流出液顏色較淺且三氯化鐵試劑檢測陰性，合并乙醇洗脫液，蒸餾回收乙醇至1/3體積，冷至室溫，加入適量的蒸餾水(控制藥液乙醇含量10％)，攪拌混勻，通過已處理好的聚酰胺柱(80-100目；12×120cm；流速15ml/min)，蒸餾水洗柱(流速40ml/min)至流出液顏色不再變淺，用70％乙醇洗柱(流速20ml/min)，收集洗脫液至三氯化鐵試劑檢測陰性，合并乙醇液，蒸餾回收乙醇并濃縮成流浸膏，真空干燥(90℃)，粉碎并微粉化，得土黃色粉末，重7.8g，紫外分光光度法在260nm處測定，異黃酮、香豆素類成分的含量為57％。
實施例2取紅車軸草地上部分1kg，粉碎，用藥材重量15倍的95％乙醇回流提取2次，每次2小時，合并乙醇提取液，蒸餾回收乙醇約2/3體積時，加入與剩余藥液等體積的蒸餾水，繼續(xù)濃縮至20％醇度，加入20％乙醇溶液稀釋藥液，攪勻后，加入3g甲殼素澄清劑配成的1％醋酸溶液300ml，攪拌混勻，放置8小時自然沉淀，吸取上清液，沉淀部分分別用4倍藥材重量的20％乙醇溶液洗滌沉淀2次，上清液合并，將下部沉淀過濾，濾液與上清液合并后通過已處理好的AB-8型大孔吸附樹脂柱(12×120cm；流速15ml/min)，蒸餾水洗柱(流速40ml/min)至流出液顏色不再變淺，用95％乙醇洗柱(流速20ml/min)，可看到明顯的棕紅色色帶向下移動，當(dāng)色帶移至層析柱的底端，流出液顏色開始加深且三氯化鐵試劑反應(yīng)陽性時，開始收集洗脫液，至流出液顏色較淺且三氯化鐵試劑檢測陰性，合并乙醇洗脫液，蒸餾回收乙醇至1/3體積，冷至室溫，加入適量的蒸餾水(控制藥液乙醇含量15％)，攪拌混勻，通過已處理好的聚酰胺柱(80-100目；12×120cm；流速15ml/min)，蒸餾水洗柱(流速40ml/min)至流出液顏色不再變淺，用95％乙醇洗柱(流速20ml/min)，收集洗脫液至三氯化鐵試劑檢測陰性，合并乙醇液，蒸餾回收乙醇并濃縮成流浸膏，真空干燥(90℃)，粉碎并微粉化，得土黃色粉末，重9.1g，紫外分光光度法在260nm處測定，異黃酮、香豆素類成分的含量為65％。
實施例3取紅車軸草地上部分1kg，粉碎，用藥材重量10倍的70％乙醇回流提取3次，每次3小時，合并乙醇提取液，蒸餾回收乙醇至30％醇度，加入30％乙醇溶液稀釋藥液，攪勻后，加入5g101果汁澄清劑配成的水溶液100ml，攪拌混勻，放置8小時自然沉淀，吸取上清液，沉淀部分分別用4倍藥材重量的30％乙醇溶液洗滌沉淀2次，上清液合并，將下部沉淀過濾，濾液與上清液合并后通過已處理好的HPD100型大孔吸附樹脂柱(12×120cm；流速15ml/min)，蒸餾水洗柱(流速40ml/min)至流出液顏色不再變淺，用70％乙醇洗柱(流速20ml/min)，可看到明顯的棕紅色色帶向下移動，當(dāng)色帶移至層析柱的底端，流出液顏色開始加深且三氯化鐵試劑反應(yīng)陽性時，開始收集洗脫液，至流出液顏色較淺且三氯化鐵試劑檢測陰性，合并乙醇洗脫液，蒸餾回收乙醇至1/3體積，冷至室溫，加入適量的蒸餾水(控制藥液乙醇含量20％)，攪拌混勻，通過已處理好的聚酰胺柱(80-100目；12×120cm；流速15ml/min)，蒸餾水洗柱(流速40ml/min)至流出液顏色不再變淺，用70％乙醇洗柱(流速20ml/min)，收集洗脫液至三氯化鐵試劑檢測陰性，合并乙醇液，蒸餾回收乙醇并濃縮成流浸膏，真空干燥(90℃)，粉碎并微粉化，得土黃色粉末，重8.8g，紫外分光光度法在260nm處測定，異黃酮、香豆素類成分的含量為71％。
權(quán)利要求
1.一種具雌激素活性的紅車軸草提取物的制備方法，其特征在于包括以下主要步驟(1)取紅車軸草地上部分，粉碎，用含水的乙醇溶液提??；(2)過濾提取液，濃縮濾液并回收乙醇，濾液濃縮至10-30％醇濃度；(3)向濃縮液中加入濃度為10-30％的乙醇溶液和澄清劑，攪拌混勻后放置沉淀；(4)取上清液通過苯乙烯型大孔吸附樹脂柱，水洗后用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；(5)蒸出洗脫液中的部分乙醇，濃縮液再加入蒸餾水稀釋，控制溶液中乙醇含量至10-20％；(6)將稀釋后的溶液通過聚酰胺層析柱，用蒸餾水洗柱后，以乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；(7)濃縮洗脫液，并回收乙醇，得到的稠膏經(jīng)真空干燥后，微粉化成300目以下的微粉。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于操作步驟(1)中用于提取紅車軸草的含水乙醇溶液，其乙醇濃度為50-95％；用量為藥材重量的5-15倍。
3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于操作步驟(3)中10-30％乙醇溶液的加入量為藥材重量的5-15倍，澄清劑的加入量為藥材重量的0.05-0.5％，所說的澄清劑選自甲殼素類、101果汁類及ZTC1+1類澄清劑。
4.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于操作步驟(4)和(6)中用于洗脫的乙醇溶液的濃度為50-95％。
5.按照權(quán)利要求1所述的制備方法制得的紅車軸草提取物，該提取物顯示以下特性(1)呈土黃色粉末，微粉粒徑為300-400目；(2)該粉末主要成分為異黃酮、香豆素類；(3)紫外分光光度光譜特征吸收峰(nm)260，206；(4)紅外光譜特征吸收峰(cm-1)3520，3080，2920，1720，1680，1610，1280，1050，960；(5)顯色化學(xué)反應(yīng)如下A三氯化鐵反應(yīng)顯墨綠色，陽性，判定有酚羥基類化合物存在；B濃硫酸反應(yīng)顯黃色-漿紅色，判定有異黃酮類成分存在；C鈉汞齊反應(yīng)顯黃色-紅紫色，判定有異黃酮類成分存在；D異羥肟酸-鐵反應(yīng)顯紅色，判定有香豆素類成分存在；(6)本發(fā)明與原發(fā)明提取物的雌激素作用(子宮系數(shù))比較，小、中、大三個劑量組的小鼠子宮系數(shù)均有明顯提高，顯示本發(fā)明的提取物中含有香豆素類及其它雌激素活性成分。
全文摘要
一種具雌激素活性的紅車軸草提取物的制備方法及其提取物。其制備工藝，是以動物模型雌激素藥效學(xué)實驗的結(jié)果為導(dǎo)向。該工藝包括下列步驟(1)用含水乙醇提取紅車軸草地上部分，過濾提取液蒸餾濃縮濾液至10－30％醇濃度；(2)向濃縮液中加入濃度為10－30％的乙醇溶液及澄清劑，攪拌混勻，放置沉淀；(3)取上清液通過苯乙烯型大孔吸附樹脂柱，水洗柱后，用含水乙醇洗脫；(4)部分回收洗脫液中的乙醇后，加入蒸餾水對該濃縮液稀釋至含醇量10－20％，該溶液通過聚酰胺層析柱，水洗柱后，用含水乙醇洗脫，濃縮洗脫液并真空干燥，粉碎得土黃色粉末。該粉末主要成分為異黃酮、香豆素類，以紫外分光光度法測定在260nm處有最大吸收的成分含量超過50％。該提取物具有雌激素活性。
文檔編號A61P15/12GK1876010SQ20061004383
公開日2006年12月13日 申請日期2006年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月20日
發(fā)明者楊尚軍, 姚慶強, 王元書, 解硯英, 李 杰 申請人:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所