專利名稱：用于治療自身免疫病的方法和組合物的制作方法
背景技術(shù)：
當(dāng)宿主的免疫應(yīng)答未能辨別外源抗原和自身分子(自身抗原)而由此引起異常的免疫應(yīng)答時產(chǎn)生自身免疫病。自身免疫病中針對自身分子的免疫應(yīng)答導(dǎo)致偏離自身耐受的正常狀態(tài)，其包括能對自身抗原應(yīng)答的T細(xì)胞和B細(xì)胞的破壞，其已通過在生命早期免疫系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)生的事件預(yù)防。通過其結(jié)合和呈遞加工的肽至T細(xì)胞的能力而在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起著重要作用的細(xì)胞表面蛋白為主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子(Rothbard等.(1991)Annu.Rev.ImmunoL 9527)。
某些人類白細(xì)胞抗原(HLA)等位基因在患有特定疾病的個體中比在普通群體中以更高的頻率出現(xiàn)。HLA基因座編碼人的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)基因。MHC分子以兩種形成存在，I類和II類，都編碼于單基因復(fù)合物內(nèi)。MHC基因為高度多態(tài)性的人群體中一些基因座具有上至數(shù)百個等位基因(Hansen等.1993 In“FundamentalImmunology”Ed.Paul，W.E.，Raven Press，New York，NY，p.577)。
I類MHC分子為45 kD的跨膜糖蛋白，與另一種糖蛋白，12 kDβ-2微球蛋白非共價聯(lián)合。后者并不插入細(xì)胞膜中，并且在基因組的MHC區(qū)域外側(cè)編碼。人I類分子有三種不同的同種型，稱為HLA-A、-B和-C，在分開的基因座編碼。I類分子的組織表達為遍在的和共顯性的。已解析了數(shù)個人和鼠的I類分子的三維結(jié)構(gòu)(Bjorkman等.(1987)Nature 329506；Garrett等.(1989)Nature 342692；Madden等.(1991)Nature 353321；Fremont等.(1992)Science 257919)。取決于結(jié)合位點內(nèi)多態(tài)性的殘基，三種I類同種型以及其等位形式，具有不同的肽結(jié)合特異性(Falk等.(1991)Nature 351290；Falk等.(1992)Eur.J.jmmunol，22277)。
II類MHC分子為兩種跨膜糖蛋白，35 kD鏈和28kDβ鏈的非共價結(jié)合的異二聚體。在人中，II類分子以三種不同的同種型存在，稱為HLA-DP、-DQ和-DR。最少有六種α和八種β基因，其以不同的簇排列。DR中的多態(tài)性限于β鏈，而DP和DQ同種型中兩條鏈都是多態(tài)性的。II類基因產(chǎn)物中的結(jié)構(gòu)變體與免疫識別的功能特征有關(guān)，導(dǎo)致組織相容性、免疫識別和疾病易感性的個體差異。細(xì)胞表面上兩種類型的二聚物由與DRβ1、DRβ2、DRβ3或DRβ4多肽結(jié)合的DRα多肽組成。兩種類型的結(jié)構(gòu)變化包括差異多至35％的初級氨基酸序列。II類多肽鏈具有結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域為含有辨別II類α基因和II類β基因的可變序列的特定結(jié)構(gòu)亞基。等位基因變化部位形成抗原結(jié)合裂口，其代表免疫識別的個體結(jié)構(gòu)差異。與I類相反，II類分子共顯性地表達，呈現(xiàn)有限的組織分布其僅存在于免疫系統(tǒng)細(xì)胞的表面。所述細(xì)胞包括抗原-呈遞細(xì)胞，例如，巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和郎格罕氏細(xì)胞；與免疫系統(tǒng)相互作用的上皮組織細(xì)胞，包括胸腺上皮細(xì)胞；B淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞；以及受誘導(dǎo)的T細(xì)胞。
已確定了II類MHC的三種不同DR分子和DQ分子的三維結(jié)構(gòu)(Brown等.(1993)，Nature 36433；Stern等.(1994)Nature 388215；Ghosh等.(1995)Nature 378457；Dessen等.(1997)Immunity，7473；Lee等.(2001)Nature Immunol.2(6)501-507)。總的說來，其結(jié)構(gòu)非常類似于I類分子。肽結(jié)合位點包括α和β鏈的第一個結(jié)構(gòu)域，其與I類相反，在兩側(cè)都是開放的，允許更長的(12-24殘基長的)肽的結(jié)合(Chicz等.(1992)Nature，764)。與CD4分子相互作用的α和β鏈的第二個結(jié)構(gòu)域上另外的結(jié)合位點選擇性地表達在輔助T(Th)細(xì)胞上。該分子具有對T輔助(Th)細(xì)胞的共-受體功能，類似于CD8對細(xì)胞毒性的T(Tc)細(xì)胞的功能。
結(jié)合II類MHC分子的肽通過以活化特定的T細(xì)胞的方式呈遞。通常有兩種類型的T細(xì)胞T輔助1(Th1)和T輔助2(Th2)。Th1細(xì)胞參與提供細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，其通常為前-炎性的。當(dāng)活化時，Th1細(xì)胞產(chǎn)生前-炎性的細(xì)胞因子如干擾素(IFN)-γ和白介素(IL)-2。Th2細(xì)胞參與提供體液免疫，其通常為非炎性的。當(dāng)活化時，Th2細(xì)胞產(chǎn)生非炎性的細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-10以及IL-13。活化的T細(xì)胞還可受誘導(dǎo)而增殖或經(jīng)受凋亡。因此，取決于肽的特性，結(jié)合MHC分子并且由其呈遞的肽可活化Th1或Th2，轉(zhuǎn)變前-炎性和非炎性應(yīng)答的平衡。
大量證據(jù)表明對許多疾病的易感性，尤其是自身免疫病，與特定的主要組織相容性復(fù)合體等位基因非常相關(guān)(Tiwari和Terasaki(1985)中綜述的，“HLA and disease association，”New York；Springer Verlag)。自身免疫病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化(MS)、人I型或胰島素-依賴的糖尿病(IDDM)、自身免疫葡萄膜炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)和脂瀉病。雖然存在一些I類-有關(guān)的疾病，大多數(shù)自身免疫病情認(rèn)為與II類等位基因有關(guān)。MHC II類分子在CD4+T淋巴細(xì)胞的選擇和活化中極為重要，其調(diào)節(jié)對蛋白質(zhì)抗原的免疫應(yīng)答。基因組分析已鑒定了與Hodgkin’s疾病、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、尋常天皰瘡、胰島素依賴型糖尿病(IDDM，I型糖尿病)和脂瀉病有關(guān)的HLA特定的單個等位基因變體(Thomson(1995)Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.32183-219；Nepom和Erlich(1991)Annu.Rev.Immunol.9493-525；Tiwari，如上)。
1型糖尿病(即，胰島素-依賴型糖尿病，(IDDM))占所有人類的糖尿病的20％，并且為該病的最嚴(yán)重形式，具有最高發(fā)病率和死亡率。估計在美國有800,000人患有IDDM，每年診斷的新病例為約30,000例。在美國和一些歐洲國家，尤其在芬蘭和英國的某些地區(qū)，IDDM的發(fā)病率在過去幾十年中持續(xù)上升。來自長期糖尿病的一些并發(fā)癥為血管病、微血管病、眼并發(fā)癥、糖尿病性腎病、糖尿病性神經(jīng)病變、糖尿病性足病和皮膚以及粘膜病。
IDDM為進行性的自身免疫病，其中胰腺的產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞被身體的自身免疫系統(tǒng)緩慢破壞。某些蛋白質(zhì)，如谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島素以及胰島細(xì)胞抗原，用作自身抗原，成為免疫系統(tǒng)自身攻擊的靶標(biāo)。這些自身抗原中，已提示GAD為該病發(fā)病機理的主要自身抗原。什么引發(fā)異常免疫事件的級聯(lián)反應(yīng)還未知，但在人中，IDDM易感性和抗性與某些HLA-DQB1和DQA1基因座的等位基因編碼的HLA-DQ分子有關(guān)。所述HLA-DQ分子為特定HLA-DQB1和DQA1等位基因的聯(lián)合蛋白質(zhì)產(chǎn)物，稱為DQB1*0201、DQB1*0302、DQB1*0304、DQB1*0401、DQB1*0501、DQB1*0502；以及DQA1*0301、DQA1*0302、DQA1*0303、DQA1*0501。這些等位基因可能編碼于一個單倍型上(“cis”等位基因)如DQB1*0201-DQA1*0501-DRB1*0301和DQB1*0302-DQA1*0301-DRB1*0401。另外，等位基因可能編碼于不同的單倍型上(“trans”等位基因)?！皌rans”等位基因的例子為DQB1*0201-DQA1*0501-DRB1*0301上的DQB1*0201或DQB1*0301-DQA1*0301-DRB1*0404上的DQA1*0301的組合。攜帶DQB1*0201-DQA1*0501和DQB1*0302-DQA1*03單倍型的個體具有發(fā)展IDDM的最高風(fēng)險(Yu等.(2000)Eur.J.Immunol.302497-2506)。另外，患有IDDM的95％的白種人攜帶等位基因DRB1*0301或DRB1*0401，或兩者。在糖尿病的小鼠模型系統(tǒng)中，利用表達Aβ/HLA-DQ8和HLA-DR3的轉(zhuǎn)基因動物，源自GAD的天然加工的肽在脾臟和淋巴結(jié)中結(jié)合至HLA-DQ8和/或HLA-DR3。這些小鼠自發(fā)發(fā)展胰島炎和GAD自身反應(yīng)。
目前，IDDM的治療需要長期給藥胰島素以控制高血糖癥。不受控制的高血糖癥可進一步損傷產(chǎn)生胰島素的胰腺β細(xì)胞，并且從遠(yuǎn)來看，引起更大的胰島素缺乏。目前，在美國對于IDDM的治療，口服磺酰脲類和胰島素注射劑為唯一的兩種有效治療劑。兩種制劑具有作為副作用的誘導(dǎo)低血糖癥，降低血糖濃度至危險程度的可能性。沒有維持IDDM中葡萄糖水平基本正常波動的普遍合適的和一貫有效的方法。理想的治療將最小化低血糖癥的風(fēng)險而維持葡萄糖水平低于目標(biāo)值。藥物方案與糖類飲食攝入量的調(diào)控一起維持葡萄糖水平在控制之下。然而，迄今為止，IDDM沒有治愈的。
脂瀉病，亦稱口炎性腹瀉或谷蛋白-敏感的腸道病，是因為對谷類谷粒儲存蛋白質(zhì)過敏的胃腸吸收缺陷引起的疾病，儲存蛋白質(zhì)包括谷蛋白其產(chǎn)物麥膠蛋白和麥谷蛋白，存在于小麥、大麥、燕麥和黑麥中。該疾病由識別作為飲食抗原的麥膠蛋白的CD4 T細(xì)胞引起并且這些細(xì)胞誘導(dǎo)Th1-介導(dǎo)的慢性炎性應(yīng)答，其損害絨毛，引起包括腹瀉、失重和脂肪痢、絨毛狀萎縮以及吸收不良的病征。此外，脂瀉病患者可能遭受吸收不良和營養(yǎng)不良結(jié)果的病情。其還可能與皰疹樣皮炎、泡狀皮疹、應(yīng)激性、抑郁、肌肉痙攣、關(guān)節(jié)疼痛、疲勞和月經(jīng)不調(diào)有關(guān)。脂瀉病被認(rèn)為是歐洲最常見的遺傳疾病，雖然研究顯示多至每250個美國人中1個可能具有該病的某些形式，估計4,700個美國人中有一個診斷患有該病。脂瀉病與和DQA1*0301以及DQA1*0501聯(lián)合的等位基因DQB1*0302和DQB1*0201有關(guān)。95％的患者攜帶DQB1*0201或DQB1*0302(Sollid等.(1993)Gastroenterol.105910)。強的HLA相關(guān)被認(rèn)為應(yīng)歸于由DQB1*0201、DQA1*0501、DQB1*0302和DQA1*0301編碼的DQ分子有效地呈遞源自麥膠蛋白和麥谷蛋白的富含谷氨酰胺的肽的去氨基變體的能力。如在IDDM中一樣，同樣的治療應(yīng)用因此適用于該病。
兩種類型的MHC分子中，因為下列理由II類為免疫抑制干預(yù)的主要靶標(biāo)首先，MHC-II分子活化T輔助(Th)細(xì)胞，Th為免疫調(diào)節(jié)的中心，并且在炎性疾病中決定著大部分免疫病理學(xué)。第二，大多數(shù)自身免疫病在遺傳上與II類等位基因有關(guān)。第三，MHC-II分子選擇性表達于免疫系統(tǒng)細(xì)胞上，而MHC-I存在于大多數(shù)體細(xì)胞上。
靶向II類MHC分子的藥物制劑提供了相比大多數(shù)現(xiàn)有免疫抑制藥物的一些優(yōu)點。首先，其代表基于疾病機理的干預(yù)，預(yù)計其中斷致病級聯(lián)反應(yīng)中的初始事件。第二，它可設(shè)計成選擇性性地針對僅少數(shù)II類同種異型，而不管對病原體具有有效保護應(yīng)答的抗原呈遞系統(tǒng)的其他類型，因此相比大多數(shù)免疫抑制藥物幾乎不引起損害免疫能力的副作用。第三，該方法和化合物可在對引起該疾病的實際自身抗原沒有任何具體認(rèn)識的情況下應(yīng)用。
迄今為止，已經(jīng)描述了靶向HLA-DR亞類分子的方法和組合物，而不是靶向HLA-DQ亞類分子的那些。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于治療自身免疫病和其他不想要的免疫反應(yīng)的方法和組合物，包括給予結(jié)合一種或多種HLA-DQ分子并且調(diào)節(jié)DQ-限制性T細(xì)胞應(yīng)答的共聚物。某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的共聚物結(jié)合HLA-DQA1分子，并且更優(yōu)選結(jié)合在等位基因DQA1*0501-DQB1*0201、DQA1*0301、DQB1*0401和DQA1*0301-DQB1*0302中編碼的一種或多種HLA分子?？衫弥赶蚴茉嚨腄Q的共聚物治療的典型的病癥包括胰島素-依賴型糖尿病(IDDM)；脂瀉病；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；類固醇敏感的腎病綜合征；腎間質(zhì)(mesengial)IgA腎??；發(fā)作性睡?。簧窠?jīng)性多發(fā)性硬化；復(fù)發(fā)性多軟骨炎；皮膚病如皰疹樣皮炎、特異性皮炎、貝切特氏病、天皰瘡、牛皮癬、原發(fā)的Sjogren’s綜合癥；全身血管?。患t皮??；胃腸機能紊亂如克羅恩氏病；呼吸障礙如Sommer型超敏性肺炎和自身免疫甲狀腺疾病(AITD)。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的共聚物結(jié)合某些HLA-DQ分子，其使得所述分子的攜帶者易患IDDM和脂瀉病。所述HLA-DQ分子為特定的HLA-DQB1和DQA1等位基因的聯(lián)合蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其稱為DQB1*0201、DQB1*0302、DQB1*0304、DQB1*0401、DQB1*0501、DQB1*0502；和DQA1*0301、DQA1*0302、DQA1*0303、DQA1*0501。這些等位基因可能編碼于相同的單倍型上(“cis”等位基因)如DRB1*0201-DQA1*0501-DRB1*0301和DQB1*0302DQA1*0301-DRB1*0401。產(chǎn)生包括″cis″等位基因多肽產(chǎn)物的HLA分子此處稱為“cis二聚體”。另外，等位基因可以編碼于不同的單倍型上(“trans”等位基因)。產(chǎn)生包括“trans”等位基因多肽產(chǎn)物的HLA分子此處稱為“trans二聚體”。“trans”等位基因的例子為DQB1*0201-DQA1*0501-DRBi*0301上的DRB1*0201和DQB1*0301-DQA1*0301-DRB1*0404上的DQA1*0301的組合。
共聚物概要本發(fā)明的一個方面為通過各種氨基酸殘基的隨機合成(聚合反應(yīng))而形成的共聚物組合物。所述組合物包括三元共聚物，其為具有至少三個不同氨基酸殘基的隨機序列的共聚物，其中至少有一個氨基酸選自以下組(1)酸性或中性的極性殘基(天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q))；和(2)疏水脂肪族殘基和小的親水羥基殘基(亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T))；(3)小的脂肪族殘基(丙氨酸(A)、甘氨酸(G))。
因此，共聚物為例如，包括以下表1中三個氨基酸殘基組的三元共聚物。
通常，三元共聚物組合物中，合成共聚物以使得分別對于上述第一組、第二組和第三組的相對量，氨基酸組分的摩爾輸入率為約2∶5∶3。另外，分別對于第一組、第二組和第三組的氨基酸相對量，氨基酸組分的摩爾輸入率為約2∶25∶15。另外，分別對于第一組、第二組和第三組的氨基酸相對量，氨基酸組分的摩爾輸入率為約2∶1∶0.6。
在另一實施方案中，該共聚物組合物為四元共聚物，包括四個氨基酸殘基，至少一個氨基酸殘基選自以上三組之一。因此，共聚物為例如，包括以下表2中四個氨基酸殘基的四元共聚物。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案為包括以下氨基酸殘基組一種的隨機序列的共聚物組合物天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸和谷氨酸(DALE)；天冬氨酸、丙氨酸、異亮氨酸和谷氨酸(DAIE)；天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸和谷氨酸(DAVE)；天冬氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和谷氨酸(DATE)；天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸和谷氨酸(DGLE)；天冬氨酸、甘氨酸、異亮氨酸和谷氨酸(DGIE)；天冬氨酸、甘氨酸、纈氨酸和谷氨酸(DGVE)；或天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和谷氨酸(DGTE)。
通常，合成這些組合物以使得如上所示，分別具有約1∶10∶3∶1或1∶15∶3∶1的氨基酸組分的摩爾輸出率。另外，氨基酸組分的摩爾產(chǎn)率分別為約1∶25∶15∶5。另外，氨基酸組分的摩爾輸出率分別為約1∶3∶1.5∶0.2。不同氨基酸之間摩爾產(chǎn)率具有約10％的變化范圍。用于共聚物組合物D∶A∶X∶E或D∶G∶X∶E合成的優(yōu)選的摩爾輸入率為約1∶5∶3∶1，其中X為L、I、V、S或T?；蛘撸@些氨基酸的摩爾輸入率為約1∶25∶15∶5或1∶1∶1.5∶0.2。
在其他的實施方案中，指向受試的DQ的共聚物為具有隨機化的或部分隨機的氨基酸序列的共聚物的混合物，其包含其中至少一個氨基酸選自以下的氨基酸殘基(1)疏水脂肪族殘基(如亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、甲硫氨酸(M))；(2)酸性殘基(如天冬氨酸(D)、谷氨酸(E))；(3)小的親水殘基(如絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、半胱氨酸(C))；和(4)小的脂肪族殘基(如丙氨酸(A)、甘氨酸(G))。
在一實施方案中，共聚物利用氨基酸谷氨酸(E)和/或天冬氨酸(D)、亮氨酸(L)、絲氨酸(S)和丙氨酸(A)衍生出，并且此處稱為“ELSA”共聚物。
在某些其他的實施方案中，指向受試的DQ的共聚物為具有隨機化的或部分隨機的氨基酸序列的混合物，其包含其中至少一個氨基酸選自以下組的五個不同的氨基酸殘基(1)酸性殘基(如天冬氨酸(D)、谷氨酸(E))；(2)疏水脂肪族殘基(如亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、甲硫氨酸(M)(3)龐大的疏水殘基(如酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F))；(4)小的親水殘基(如絲氨酸(S)、半胱氨酸(C)、蘇氨酸(T))；和(5)小的脂肪族殘基(如丙氨酸(A)、甘氨酸(G))。
另一種示例的共聚物利用氨基酸殘基谷氨酸(E)和/或天冬氨酸(D)、亮氨酸(L)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)衍生出，并且此處稱為“DLYV”共聚物。
在另一實施方案中，任何共聚物可進一步包括另外的氨基酸殘基，其中另外的氨基酸殘基發(fā)現(xiàn)在自身免疫病如糖尿病的自身抗原性肽的某些氨基酸序列位置。所述氨基酸影響肽功能性結(jié)合至與自身免疫病有關(guān)的II類MHC蛋白的親和力。在具有II類MHC蛋白的復(fù)合物中所述共聚物具有T細(xì)胞刺激活性。例如，對上任何組合而言另外的氨基酸為賴氨酸殘基(K)。K殘基以充足的摩爾輸出率存在以通過與II類MHC蛋白復(fù)合的共聚物而提高T細(xì)胞的刺激。此外，K殘基以充足的摩爾輸出率存在以提高共聚物的水溶性。在另一實施方案中，共聚物可包含脯氨酸(P)殘基。
可以利用一定比率的待整合入隨機共聚物的氨基酸。本發(fā)明優(yōu)選的隨機共聚物包括氨基酸殘基K、E、A、S、V和P。K∶E∶A∶S∶V優(yōu)選的摩爾輸入率為0.3∶0.7∶9∶0.5∶0.5∶0.3。
在其他的實施方案中，共聚物的氨基酸序列不是完全隨機的，并且具有“錨定”殘基，其在產(chǎn)生的聚合物中以規(guī)則的間距存在。優(yōu)選，共聚物具有通用序列[XXXa1XXXXXXXXa2XX]n，其中Xa1和Xa2為選自谷氨酸和天冬氨酸的酸性氨基酸殘基，X為任何選擇的氨基酸殘基，并且2≤n≤8。
優(yōu)選，共聚物可合成為具有一個通用序列1.[XXEXXXXXXXEXX]42.[XXEXXXXXXXDXX]43.[XXDXXXXXXXDXX]44.[XXDXXXXXXXEXX]45.[XXEXXVXXXXDXX]46.[XXDXXVXXXXDXX]47.[XXDXXVXXXXEXX]48.[XXEXXVXXXXEXX]4其中X為A、S、V、K或P。
在一優(yōu)選的實施方案中，A∶S∶V∶K∶P的摩爾輸入率為5∶1∶1∶1∶0.5。
該共聚物能結(jié)合II類MHC蛋白，例如，人II類MHC蛋白如等位基因DQA1*0501-DQB1*0201編碼的HLA-DQ2或等位基因DQA1*03-DQB1*0302等位基因編碼的HLA-DQ8。此外，共聚物能結(jié)合受試動物如小鼠的II類MHC蛋白，例如IAg7蛋白。優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的共聚物組合物以平均Kd 1μM或更低，且更優(yōu)選小于100nM、10nM或甚至1nM的平均Kd結(jié)合一種或多種DQ同種型。確定優(yōu)選的共聚物的另一種方法基于競爭性結(jié)合測定法，如Sidney等.(2002)J.Immunol.1695098中所述的，其表示為IC50值。本發(fā)明優(yōu)選的共聚物具有小于1μM，更優(yōu)選小于500nM，并且甚至更優(yōu)選小于100nM的IC50。
此處提供的共聚物為至少約30個殘基的長度，至少約40個殘基的長度或該共聚物為至少約50個殘基的長度。此外，該共聚物不大于約90個殘基的長度，不大于約80個殘基的長度或不大于約70個殘基的長度。優(yōu)選，該隨機共聚物為約10至100個氨基酸殘基長，更優(yōu)選20至80個氨基酸殘基長，30至70個氨基酸殘基長，更優(yōu)選40至60個氨基酸殘基長，并且最優(yōu)選約50個氨基酸殘基長。當(dāng)合成后，隨機共聚物的典型制劑為各種長度肽的混合物，其大部分為所需的長度但包含通過現(xiàn)有的合成方法不可避免產(chǎn)生的更短或更長的肽。
在某些優(yōu)選的實施方案中，主題共聚物配制用作藥物以便具有小于25,000，且更優(yōu)選小于10000、5000、1000、500、100、50或小于10的多分散性。
治療方法概要本發(fā)明另一個方面為自身免疫病的治療方法，包括給予功能性結(jié)合到與自身免疫病有關(guān)的HLA-DQ分子并由此活化T細(xì)胞識別的共聚物組合物。某些實施方案中，主題共聚物結(jié)合自身免疫-有關(guān)的HLA-DQ同種型，如DQB1*0201、DQB1*0302、DQB1*0304、DQB1*0401、DQB1*0501、DQB1*0502；和DQA1*0301、DQA1*0302、DQA1*0303、DQA1*0501的一種或多種，具有比與HLA-DR分子和/或其他DQ同種型的共聚物結(jié)合的Kd至少小10倍的Kd。
本發(fā)明另一個方面為治療由HLA-DQ分子介導(dǎo)的不需要的免疫應(yīng)答的方法，包括給予功能性結(jié)合到與所述不需要的免疫應(yīng)答有關(guān)的HLA-DQ分子的共聚物組合物。本發(fā)明又一個方面為治療由HLA-DQ分子介導(dǎo)的過敏和過敏反應(yīng)的方法，包括給予功能性結(jié)合到與過敏癥有關(guān)的HLA-DQ分子的共聚物組合物。本發(fā)明的一個方面還提供可通過給藥功能性結(jié)合到與所述疾病有關(guān)的HLA-DQ分子的共聚物組合物而治療的疾病的治療方法。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供治療受試者中糖尿病的方法，包括給予受試者組合物，其包括具有以隨機序列聚合的氨基酸的共聚物，該氨基酸包括至少一個來自下列組的殘基(1)酸性或中性的極性殘基(天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q))；和(2)疏水的脂肪族殘基和小的親水羥基殘基(亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T))；(3)小的脂肪族殘基(丙氨酸(A)、甘氨酸(G))。
由此治療受試者的糖尿病。通常，共聚物中，酸性殘基為谷氨酸和/或天冬氨酸；中性殘基為丙氨酸和/或甘氨酸；以及疏水脂肪族氨基酸為亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和/或蘇氨酸。
治療的受試者可以是人。或者，受試者為非-人動物，如嚙齒類，包括大鼠、小鼠或倉鼠。例如，受試者為非-肥胖性糖尿病(NOD)小鼠或鏈脲霉素-誘發(fā)的糖尿病小鼠。
在另一實施方案中，治療方法利用發(fā)明的任何共聚物進行，優(yōu)選，包括含有至少一個氨基酸殘基選自下列組的多肽的共聚物(2)酸性殘基(如天冬氨酸(D)、谷氨酸(E))；(4)小的脂肪族殘基(如丙氨酸(A)、甘氨酸(G))；(1)疏水脂肪族殘基(如亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、甲硫氨酸(M))；和(3)小的親水殘基(如絲氨酸(S)、半胱氨酸(C)、蘇氨酸(T))。
此外，共聚物可包括脯氨酸(P)。
某些實施方案中，該方法允許自身免疫病通過持續(xù)-釋放載體如透皮貼片、涂有持續(xù)-釋放制劑的可植入醫(yī)療裝置或適于活性組分持續(xù)-釋放的可植入或可注射藥物制劑而連續(xù)治療。
本發(fā)明的治療方法還提供共聚物與其他藥物的聯(lián)合給藥。主題共聚物可與其他活性組分組合給藥，如抗炎劑、生長因子、細(xì)胞因子、免疫抑制劑或抗-高血壓藥物、治療脂類病癥的藥物或糖尿病患者的抗-肥胖藥物。例如，主題共聚物可與環(huán)加氧酶抑制劑以及TNF-α、IL-1或ICAM-1的抑制劑一起使用。或者，附加的試劑為免疫抑制劑。免疫抑制劑可以是藥物或蛋白質(zhì)。該藥物為以下至少一種，雷帕霉素；皮質(zhì)類固醇；硫唑嘌呤；麥考酚酸嗎啉乙酯；環(huán)胞素；環(huán)磷酰胺；氨甲喋呤；6-巰基嘌呤；FK506；15-脫氧精胍菌素；鞘氨醇-1-磷酸鹽受體激動劑如FTY 720(2-氨基-2-(2-[4-辛基苯基]乙基)-1，3-丙二醇鹽酸鹽)和其他的膦酸酯類似物(Forrest等.(2004)JPET 309758-768)；米托蒽醌；2-氨基-1，3-丙二醇；6-(3-二甲基-氨丙?；?福斯克林；和脫甲基免疫霉素。該蛋白質(zhì)為以下至少一種，hul 124；BTI-322；allotrap-HLA-B270；OKT4A；Enlimomab；ABX-CBL；OKT3；ATGAM；basiliximab；daclizumab；胸腺球蛋白(thymoglobulin)；ISAtx247；Medi-500；Medi-507；Alefacept；efalizumab；infliximab和干擾素。
抗-高血壓藥物的例子包括β-阻斷劑、組織蛋白酶S抑制劑和ACE抑制劑。治療脂類病癥的藥物例子包括HMG-CoA還原酶抑制劑、煙酸、膽汁酸螯合劑和纖維酸衍生物?？?肥胖藥物的例子包括P-3激動劑、CB-1拮抗劑、食欲抑制劑如例如西布曲明(Meridia)和脂肪酶抑制劑如例如奧利司他(Xenical)。
在治療IDDM的情況下，本發(fā)明的共聚物還可與糖尿病治療的其他已知療法結(jié)合而給予，已知療法包括PPAR激動劑、磺酰脲藥物、非-磺酰脲促分泌劑、α-葡糖苷酶抑制劑、胰島素敏化劑、胰島素促分泌劑、降低肝葡萄糖排出量的化合物和胰島素。在所述聯(lián)合治療中，治療劑的量小于將共聚物給予同樣的受試者之前的量。
所述治療可在本發(fā)明化合物的給藥之前、同時或之后給予。胰島素包括兩種長的和短的作用的形式以及胰島素的制劑。PPAR激動劑可包括任何PPAR亞基或其組合的激動劑。例如，PPAR激動劑可包括PPAR-α、PPAR-γ、PPAR-67，或PPAR的任何兩個或三個亞基的組合的激動劑。PPAR激動劑包括，例如羅格列酮和吡格列酮?；酋ｋ逅幬锇?，例如格列本脲、格列美脲、氯磺丙脲和格列吡嗪。當(dāng)與本發(fā)明的共聚物一起給予時對治療糖尿病有效的α-葡糖苷酶抑制劑包括阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖。當(dāng)與主題共聚物一起給予時對治療糖尿病有效的胰島素敏化劑包括噻唑烷二酮和非-噻唑烷二酮?？赡苡行У慕档透纹咸烟桥懦隽康幕衔锇ǘ纂p胍，如Glucophage和Glucophage XR。當(dāng)與本發(fā)明的共聚物一起給予時對治療糖尿病有效的胰島素促分泌劑包括磺酰脲和非-磺酰脲藥物GLP-1、GIP、PAC/VPAC受體激動劑、分泌素、那格列奈、美格列奈、瑞格列奈、格列本脲、格列美脲、氯磺丙脲、格列吡嗪。GLP-1包括具有比天然GLP-1更長半衰期的GLP-1衍生物，如例如脂肪酸衍生的GLP-1和exendin。
在本發(fā)明的另一實施方案中，該方法提供觀察糖尿病的發(fā)作頻率或糖尿病發(fā)作的嚴(yán)重程度以精確計量治療的有效性。在相關(guān)的實施方案中，該治療方法提供觀察給予共聚物后糖尿病的生理參數(shù)。例如，通過測量參數(shù)如游離血糖的降低、血液胰島素的提高、胰腺胰島素的提高、胰腺質(zhì)量的增加或β胰島細(xì)胞的數(shù)目增加而監(jiān)測有效的治療。
在某些實施方案中，共聚物通過注射，如靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射或通過靜脈內(nèi)輸液(或點滴)而給予患者?；蛘?，共聚物通過口服、透皮、肺或腹膜內(nèi)給藥而給予。
本發(fā)明還提供方法以預(yù)防性地治療處于發(fā)展自身免疫病、不需要的免疫應(yīng)答、過敏或通過給予共聚物組合物，包括給予該共聚物能治療的任何疾病風(fēng)險中的受試者，以便預(yù)防或延緩所述疾病或病情的發(fā)作。
本發(fā)明的另一個實施方案提供用于治療糖尿病患者的試劑盒，包括具有根據(jù)此處任何氨基酸共聚物組合物的氨基酸隨機序列的共聚物和容器。該試劑盒可進一步包括使用說明書。該試劑盒可以單位劑量提供共聚物。
藥物組合物概要本發(fā)明的另一個方面提供包括本發(fā)明共聚物的藥物組合物。有些實施方案中的組合物進一步包括藥學(xué)可接受載體和/或賦形劑。某些實施方案中，該藥物組合物包括結(jié)合HLA-DQ分子的一種或多種治療有效的共聚物和藥學(xué)可接受載體。該藥物組合物可配制用于各種的給藥途徑，包括口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、透皮、肺或腹膜內(nèi)給藥。在另一實施方案中，該藥物組合物適于活性組分的持續(xù)釋放，該組合物包括允許治療活性的共聚物緩釋的生物學(xué)相容的聚合物或基質(zhì)。所述持續(xù)釋放制劑可以是例如透皮片、植入物或栓劑的形式。
在某些實施方案中，該藥物組合物進一步包括其他的藥學(xué)活性組分，用于另外的藥物或制劑和上述共聚物結(jié)合的共同給藥。另外的制劑可以是其他共聚物，如引起HLA-DR介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的共聚物。典型的DR-指向的共聚物包括Copaxone(glatiramer乙酸鹽，如美國專利3,849,550和6,214,791中所述的)、YFAK和PCT公開WO03/029276中所述的其他共聚物以及PCT公開WO00/05250中所述的三元共聚物。
本發(fā)明的另一個實施方案提供用于自身免疫病如糖尿病或脂瀉病；不需要的免疫應(yīng)答；過敏癥或任何通過給予本發(fā)明的共聚物能治療的疾病的治療藥物的制造方法，包括配制此處所述的任何共聚物用于給予需要所述治療的患者。
該組合物可以以自身免疫病、不需要的免疫應(yīng)答、過敏癥或通過給予本發(fā)明的共聚物能治療的任何疾病的治療有效單位劑量而提供。自身免疫應(yīng)答可以是脂瀉病或糖尿病，其可以是前-糖尿??；胰島素-依賴型糖尿病(IDDM，I型糖尿病)或II型糖尿病。受試者可以是人。或者，受試者為非-人動物，如嚙齒類，如大鼠、小鼠或倉鼠。例如，受試者為非-糖尿病性肥胖(NOD)小鼠或鏈脲霉素-誘發(fā)的糖尿病小鼠。單位劑量為適于受試者體格大小的量。
篩選方法概要本發(fā)明的另一個方面提供篩選和鑒定結(jié)合HLA-DQ分子以及預(yù)防自身免疫應(yīng)答的共聚物的方法。所述方法允許鑒定對治療自身免疫病有效的共聚物。
某些實施方案中，受試的DQ-指向的共聚物用便于共聚物檢測的部分修飾或標(biāo)記。在優(yōu)選的實施方案中，該共聚物為生物素化的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該共聚物用FITC修飾。示例的共聚物為上述用生物素或FITC修飾的隨機共聚物。在其他實施方案中，具有在產(chǎn)生的聚合物中以規(guī)則間距存在的“錨定”殘基的共聚物用生物素或FITC修飾。優(yōu)選，可合成經(jīng)修飾的共聚物以具有一種通式9.生物素-間隔物-[XXEXXXXXXXEXX]n10.生物素-間隔物-[XXEXXXXXXXDXX]n11.生物素-間隔物-[XXDXXXXXXXDXX]n12.生物素-間隔物-[XXDXXXXXXXEXX]n13.生物素-間隔物-[XXEXXVXXXXDXX]n14.生物素-間隔物-[XXDXXVXXXXDXX]n15.生物素-間隔物-[XXDXXVXXXXEXX]n16.生物素-間隔物-[XXEXXVXXXXEXX]n其中A、S、V、K或P，其摩爾輸入率為5∶1∶1∶1∶0.5，2≤n≤8，并且間隔物包括2至6個氨基酸殘基，優(yōu)選具有氨基酸序列SGSG。在一優(yōu)選的實施方案中，n＝4。
這些修飾的共聚物用于測定和診斷，例如用于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)中。標(biāo)記的共聚物還可以用于確定結(jié)合HLA分子的共聚物當(dāng)中最好的序列或優(yōu)選的序列。另外，標(biāo)記的共聚物可用于篩選與HLA-DQ分子結(jié)合或和HLA-DQ分子相關(guān)的本發(fā)明的共聚物無關(guān)的其他化合物。
在非-人動物如嚙齒類，如大鼠、小鼠或倉鼠中，篩選方法可用于體內(nèi)測定。
附圖簡述

圖1顯示來自與RSP-006(生物素化的RSP-003)競爭性結(jié)合HLA-DQ8的半隨機共聚物RSP-001、RSP-002和RSP-003的競爭作用測定結(jié)果，具有呈現(xiàn)于縱座標(biāo)上的作為來自所觀察復(fù)合物量的競爭作用程度而計算的數(shù)據(jù)，呈現(xiàn)于橫坐標(biāo)上的作為提高的競爭劑的函數(shù)的更低背景的陰性對照。縱座標(biāo)上所示Afu指任意熒光單位。
圖2顯示與RSP-006競爭性結(jié)合HLA-DQ8的隨機共聚物RSP-008(DAVE)、RSP-009(DATE)和RSP-010(DALE)的競爭作用測定的結(jié)果。
圖3顯示與RSP-006競爭性結(jié)合HLA-DQ8的隨機共聚物CO-14(YFAK)的競爭作用測定結(jié)果。
圖4顯示生物素化的隨機共聚物RSP-004、RSP-005和RSP-006與HLA-DQ8的直接結(jié)合測定的結(jié)果。
圖5顯示生物素化的隨機共聚物RSP-004、RSP-005和RSP-006與HLA-DR2的直接結(jié)合測定的結(jié)果。
圖6顯示與生物素化的CLIP(II類-相關(guān)的恒定鏈肽)競爭性結(jié)合HLA-DR2的RSP-008(DAVE)、RSP-009(DATE)和RSP-010(DALE)的競爭作用測定結(jié)果。
圖7顯示如通過免疫后T細(xì)胞對共聚物的應(yīng)答證實的RSP-001免疫小鼠的能力。
圖8顯示通過免疫后T細(xì)胞對共聚物的應(yīng)答證實的RSP-002免疫小鼠的能力。
圖9顯示通過免疫后T細(xì)胞對共聚物的應(yīng)答證實的RSP-003免疫小鼠的能力。
圖10顯示通過免疫后T細(xì)胞對共聚物的應(yīng)答證實的RSP-010(DALE)免疫小鼠。
發(fā)明詳述I.概述一些自身免疫病呈現(xiàn)與人類白細(xì)胞抗原(HLA)的某些等位基因的強相關(guān)性。尤其，某些疾病單獨與該等位基因的HLA-DQ亞類或等位基因的HLA-DQ亞類與HLA-DR亞類的聯(lián)合有關(guān)。這些疾病包括IDDM和脂瀉病?；阼b定帶來易感性的MHC II類等位基因而鑒定處于發(fā)展該疾病風(fēng)險中的個體是可能的。
隨機合成的共聚物可通過與結(jié)合這些蛋白質(zhì)受體分子的候選自身抗原競爭，或通過誘導(dǎo)T細(xì)胞無變應(yīng)性或甚至T細(xì)胞凋亡，或通過T細(xì)胞的抑制，使得隨后T細(xì)胞對自身抗原的應(yīng)答在體內(nèi)受抑制而用于治療與HLA-DQ基因產(chǎn)物有關(guān)的自身免疫病。此外，具有一種或多種另外組分，如以不同量添加入聚合反應(yīng)中的氨基酸類似物或衍生物的合成共聚物可以是各種自身免疫T細(xì)胞應(yīng)答的有效抑制劑。參見Strominger等.的PCT/US02/31399，以及Fridkis-Hareli等.(2002)J.Clin.Invest.1091635-1643，兩者的全部內(nèi)容在此通過引用而引入此處。
自身免疫病治療的主要的目標(biāo)是發(fā)展抗原-特異性免疫調(diào)節(jié)治療的，其干擾自反應(yīng)性T細(xì)胞受體(TCR)與由抗原-呈遞細(xì)胞表面的自身MHC受體呈遞的自身抗原性肽的三分子的相互作用。T細(xì)胞-介導(dǎo)的自身免疫病的這些免疫療法在已知靶抗原的動物模型中是成功的(參見，例如，Weiner(1997)Immunol.Today 18335-343；Nicholson等.(1997)Proc.Natl.Acad Sci.USA 949279-9284)。經(jīng)改變的肽配體(APL)的用途已用于治療EAE(Nicholson等.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA949279-9284；Brocke等.(1996)Nature 379343-346)和最近用于治療MS(Bielekova等.(2000)Nat.Med.101167-1175；Kappos等.(2000)Nat.Med.101176-1182)，具有相矛盾的發(fā)現(xiàn)，。
胰島素-依賴型糖尿病(IDDM)或I型糖尿病是嚴(yán)重的健康問題?？杀O(jiān)測具有某些HLA-DR和HLA-DQ亞類等位基因的遺傳易感性個體對胰島抗原的自身抗體，其指示疾病的發(fā)作。在該疾病發(fā)作時治療所述個體以抑制自身免疫應(yīng)答以及因此抑制對組織的更進一步破壞被預(yù)期是有效的。
另一種潛在的疾病應(yīng)用為脂瀉病的治療，其與由等位基因DQA1*0501-DQB1*0201和-DQA1*03-DQB1*0302編碼的HLA非常相關(guān)。自身免疫應(yīng)答的抑制預(yù)計對減輕脂瀉病的病征是有效的。
T淋巴細(xì)胞能夠通過其T細(xì)胞受體(TCR)識別外源抗原。TCR結(jié)合主要組織相容性蛋白(MHC)，后者為專門的抗原呈遞細(xì)胞細(xì)胞表面上的膜結(jié)合糖蛋白。MHC與短的，源自自身或外源蛋白質(zhì)的胞內(nèi)加工的肽形成復(fù)合物。有兩種主要的MHC蛋白種類，I類和II類。I類分子與所述細(xì)胞內(nèi)部加工的源自自身或外源蛋白的肽復(fù)合，而II類分子與來自細(xì)胞外部的那些蛋白復(fù)合。所述肽在其肽結(jié)合槽處以10-6M范圍內(nèi)的結(jié)合親和力(Kd)非-共價結(jié)合至MHC。II類MHC的肽結(jié)合槽兩端打開并且因此能容納9至75個氨基酸殘基長度的肽。
Glatiramer乙酸鹽，亦稱Copaxone，共聚物-1、Copl、YEAK或GLAT為由酪氨酸(Y)、谷氨酸(E)、丙氨酸(A)和賴氨酸(K)以大約1∶1.5∶5∶3的摩爾比組成的隨機氨基酸共聚物。在溶液中利用N-羧基胺基酸酐合成Glatiramer乙酸鹽(Teitelbaum等.(1971)Eur.J.Immunol.1242-248)。其已成功開發(fā)并且批準(zhǔn)作為多發(fā)性硬化(MS)，尤其MS復(fù)發(fā)形式的治療(Bornstein等.(1987)NewEngl.J.Med.317408-414；Johnson等.(1995)Neurol.451268-1276)，并且目前用途廣泛。最初，glatiramer乙酸鹽和其他相關(guān)的隨機共聚物用于明確免疫應(yīng)答的遺傳基礎(chǔ)，目前稱為II類MHC基因(McDevitt和Sela(1965)J.Exp.Med.122517-532；McDevitt和Sela(1967)J.Exp.Med.126969-978)。發(fā)現(xiàn)Glatiramer乙酸鹽對實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎的抑制是有效的(Teitelbaum等.(1971)Eur.J Immunol.1242-248；Teitelbaum等.(1973)Eur.J.Immunol.3256-262 Aharoni等.(1993)Eur.J.Immunol.2317-25)。
雖然沒有完全了解glatiramer乙酸鹽的作用機理，很可能其生物學(xué)活性的必要條件涉及結(jié)合人MHC II類分子的能力。最常見與MS有關(guān)的MHC等位基因為HLA-DR2(DRB1*1501)，并且已顯示glatiramer乙酸鹽結(jié)合該MHCII類分子并活化個體的顯著比例的T細(xì)胞(通常15-20％)。T細(xì)胞經(jīng)glatiramer乙酸鹽的活化只限于HLA-DR分子，并且通過HLA-DQ分子幾乎不產(chǎn)生應(yīng)答。(Brenner等.(2001)J.Neuroimmunol.115152-160，F(xiàn)ridkis-Hareli等.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914812-4876，表1)。因此，雖然glatiramer乙酸鹽對降低MS復(fù)發(fā)率有效，其并不治療涉及HLA-DQ分子的其他自身免疫病，如糖尿病或脂瀉病。
結(jié)合II類分子的肽需要在錨定位點存在確定的側(cè)鏈，其一起形成特定的結(jié)合基序。這些錨定位點已確定為氨基酸位點1至位點9(或P1至P9)。對于肽產(chǎn)生最佳II類結(jié)合的最重要的接觸點為P1、P4、P7和P9。對于與糖尿病有關(guān)的II類MHC蛋白，與蛋白質(zhì)袋相互作用的肽的最重要的位點為P1和P9。因為這些P1和P9袋是可容納各種不同氨基酸側(cè)鏈的大袋，它們被認(rèn)為是“混雜的”。利用此處提供的組合物，發(fā)現(xiàn)當(dāng)P1和P9被氨基酸殘基谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)占據(jù)時結(jié)合尤其緊密。具有在特定位點具有不同殘基特征的氨基酸殘基的肽以可預(yù)測的親和力結(jié)合MHC分子。然而，利用HLA-DR分子的實驗表明，在非-錨定位點，允許側(cè)鏈變化而不影響結(jié)合(Hammer等.，(1993，1994和1995)，如上)。該結(jié)合機理使得許多不同的肽能夠通過給定的HLA同種異型而呈遞。錨定位點的側(cè)鏈與結(jié)合位點內(nèi)的特定袋互相作用，而在非-錨定位點的那些側(cè)鏈指向外部，并且可用于經(jīng)Th細(xì)胞上T細(xì)胞受體(TCR)的識別。
因此可以理解的是具有與自身抗原性肽相同的結(jié)合基序而在非-錨定位點具有不同殘基的化合物將結(jié)合疾病相關(guān)的MHC分子，由此預(yù)防自身免疫T細(xì)胞的活化，并且因此中斷疾病過程。根據(jù)該模式，具有在關(guān)鍵位點或“錨定”殘基處最緊密適合蛋白質(zhì)中袋的氨基酸殘基類型的共聚物將對改善自身免疫病的病征是最有效的。所述化合物借此發(fā)揮其作用的機理為對抗原-呈遞部位的競爭性拮抗作用。因此期待選擇性結(jié)合到參與特定自身免疫病的II類分子的化合物特異性地干預(yù)那些疾病。結(jié)合MHC分子并且抑制T細(xì)胞活化的另外的肽已在例如國際專利申請WO92/02543、WO93/05011、WO95/07707中公開。
或者，取代自身抗原性肽的化合物可比自身抗原性肽更能活化不同組的T細(xì)胞(Vignali和Strominger(1994)J.Exp.Med.1791945-1956)。在自身免疫應(yīng)答以Th1細(xì)胞介導(dǎo)的不需要的炎性應(yīng)答為特征的情況中，Th2細(xì)胞而不是Th1細(xì)胞的活化以產(chǎn)生或增加免疫抑制細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生可減輕自身免疫反應(yīng)的病征并且導(dǎo)致不想要的免疫應(yīng)答的抑制。很可能II類MHC蛋白復(fù)合物與T細(xì)胞相互作用的重要位點為P2、P4和P5。參見Wucherpfennig等.(1994)J.Exp.Med.179279；也參見Bettelli等.(1998)J.Immunol.1613299；和Aharoni等.(1998)J.Neuroimmunol.91135，showing stimulation of T cells with mouse ClassII MHC protein complexes，以及Duda等.(2000)J.Cell Immunol.105967，with human Class II MHC protein complexes。Arnon等.(2003)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100(24)14157-62，表明用Cop I的治療在小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)特定的Th2細(xì)胞，以及這些Th2細(xì)胞分泌免疫抑制的細(xì)胞因子。
最近已確定了人胰島素肽和由等位基因DQA1*03-DQB1*0302編碼的HLA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。(Lee等.(2001)Nature Immunol.2501-507)基于該結(jié)構(gòu)，此處以下提供的用由等位基因DQA1*03-DQB1*0302編碼的HLA的肽結(jié)合研究(Yu等.(2000)Eur.J.Immunol.302497-2506)和試驗結(jié)果為能結(jié)合某些HLA分子的共聚物。
不受任何具體作用機理的限制，在此當(dāng)引入占據(jù)P1和P9袋的共聚物時選擇第一組氨基酸。第一組氨基酸根據(jù)許多不同標(biāo)準(zhǔn)選擇，例如此處表4中所示數(shù)據(jù)的分析，并且包括天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。選擇第二組氨基酸以當(dāng)占據(jù)P4位點時與TCR相互作用，其也可以是混雜的。參見Herman等(1999)J.Immunol.1636275。第二組氨基酸為纈氨酸(V)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)?？墒褂昧硗獾陌被幔缳嚢彼?K)，其影響共聚物的電荷，而因此推測影響其水溶性，并且此外當(dāng)占據(jù)共聚物中的位點時可能與TCR相互作用而改變T細(xì)胞的應(yīng)答。
II.定義術(shù)語“同種異型”指免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)上存在的等位變體產(chǎn)生的血清蛋白的不同抗原性形式。
術(shù)語“無變應(yīng)性”指受試者免疫系統(tǒng)在細(xì)胞水平或有機體水平對抗原的無應(yīng)答性。
術(shù)語“與...有關(guān)”指”與..共存”或“與..相關(guān)”。該術(shù)語不一定表明因果關(guān)系，雖然所述關(guān)系可能存在。
術(shù)語“自身免疫病情”或“自身免疫病”指由不適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答引起的疾病狀態(tài)，該免疫應(yīng)答指向稱為自身抗原的自身編碼的實體。自身免疫病為一類病癥，其包括橋本甲狀腺炎；特發(fā)性粘液性水腫，嚴(yán)重的甲狀腺機能減退；多發(fā)性硬化，以腦或脊髓中膜片或變硬的組織為標(biāo)志的髓鞘脫失病；重癥肌無力，其為具有肌肉進行性衰弱的疾病，由對神經(jīng)肌肉接點處的乙酰膽堿受體自身免疫攻擊引起；Guillain-Barre綜合癥，多發(fā)性神經(jīng)炎；全身性紅斑狼瘡；葡萄膜炎；自身免疫卵巢炎；慢性免疫血小板減少性紫癜；結(jié)腸炎；糖尿?。还鹊鞍撞荒托缘闹瑸a??；Grave’s疾病，其為甲狀腺機能減退的一種形式；牛皮癬；尋常天皰瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。
術(shù)語“結(jié)合”指兩種分子之間，由于例如，生理條件下共價的、靜電的、疏水的、離子的和/或氫-鍵相互作用，并且包括如鹽橋和水橋的相互作用的直接關(guān)聯(lián)。
術(shù)語“cis”指由相同單倍型上的基因位點編碼的兩種等位基因，而“trans”指兩個不同單倍型上的基因編碼的兩種等位基因。當(dāng)形成HLA蛋白的兩種多肽來自cis等位基因，此處該產(chǎn)物指“cis二聚體”。當(dāng)形成HLA蛋白的兩種多肽來自trans等位基因，此處該產(chǎn)物指“trans二聚體”。
術(shù)語“共聚物”指具有包括多個不同種類氨基酸殘基的隨機氨基酸序列的氨基酸的聚合物。氨基酸殘基可以是天然存在的或合成的類似物。共聚物還包括衍生物，包括化學(xué)修飾的多肽和肽模擬物，并且可包括化學(xué)鍵而不是天然存在的肽鍵。
如此處所用的術(shù)語“糖尿病”指在任何哺乳動物包括實驗動物模型中的任何明顯的糖尿病病征，并且包括人的形式如胰島素-依賴型糖尿病(IDDM，I型糖尿病)，其與等位基因DQA1*0501-DQB1*0201(針對HLA-DQ2的等位基因)或DQA1*03-DQB1*0302(針對DQ8的等位基因)遺傳上相關(guān)聯(lián)，II型糖尿病、早期糖尿病，以及以適度降低的胰島素或適度提高的血糖水平為特征的前-糖尿病。雖然當(dāng)前流行的糖尿病主要是II型或成年發(fā)作的糖尿病并且以胰島素抗性為特征，該疾病可表現(xiàn)為破壞β-細(xì)胞以及胰島素不足?！扒?糖尿病”描述了未正式診斷患有糖尿病，但懷疑患有糖尿病或相關(guān)病情的哺乳動物中的病情，其例如通過根據(jù)胰島素或葡萄糖水平以及由于家族史、遺傳傾向性而具有對糖尿病或有關(guān)病情的易感性，或II型糖尿病情況下的肥胖，或當(dāng)哺乳動物之前患有糖尿病或有關(guān)病情而處于糖尿病復(fù)發(fā)風(fēng)險時而表現(xiàn)出病征。
術(shù)語“單倍型”定義為由于基因組的該特定區(qū)域中低的染色體內(nèi)重組而引起的相同的染色體的一些基因位點上等位基因的非隨機分布得到的基因組DNA連續(xù)區(qū)域。因為MHC基因在染色體上彼此鄰近，MHC內(nèi)很少發(fā)生遺傳重組并且大多數(shù)個體將從每一親本遺傳完整的親本等位基因組；所述連鎖基因組稱為單倍型，MHC基因發(fā)現(xiàn)在一個單倍體基因組中。
術(shù)語“異種細(xì)胞”指用于產(chǎn)生MHC蛋白的細(xì)胞，其與受試者細(xì)胞無關(guān)，例如，異種細(xì)胞不是哺乳動物細(xì)胞。異種細(xì)胞例如可來自冷血動物，例如來自無脊椎動物；異種細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞或微生物細(xì)胞如酵母細(xì)胞。
術(shù)語“HLA分子”指任何II類主要組織相容性復(fù)合體糖蛋白。術(shù)語“HLA-DQ分子”或“HLA-DR分子”各自指HLA-DQ亞型或HLA-DR亞型中的任何一種。
術(shù)語“IC50”指與缺乏用于測試IC50的試劑時相比產(chǎn)生50％效果降低的試劑的濃度。
術(shù)語“摩爾輸入率”指用于制備隨機共聚物的氨基酸的摩爾比。輸入摩爾比確定多少各種氨基酸用于合成隨機共聚物。
術(shù)語“摩爾輸出率”指構(gòu)成隨機共聚物組合物的氨基酸的摩爾比。輸出摩爾比可由隨機共聚物組合物樣品的氨基酸組成分析而確定。通常，更小的氨基酸被更有效地引入多肽中，產(chǎn)生與其他的氨基酸組分相比比輸入摩爾率所示的更高的氨基酸產(chǎn)率。
術(shù)語“MHC活性”指MHC分子例如通過活化T細(xì)胞刺激免疫應(yīng)答的能力。MHC活性抑制劑能抑制該活性，并且因此通過MHC抑制T細(xì)胞的活化。在優(yōu)選的實施方案中，主題抑制劑選擇性地抑制被特定的II類MHC同種型或同種異型的活化。所述抑制劑能夠抑制特定的不需要的MHC活性而不干擾生物體中的所有MHC活性，因此選擇性地治療動物中不需要的免疫應(yīng)答，如哺乳動物，優(yōu)選人，而通常不損害動物的免疫應(yīng)答。
術(shù)語“抗原結(jié)合槽”或“肽結(jié)合槽”指II類MHC蛋白質(zhì)分子表面上的三維的抗原相互作用部位(Stern等.(1994)Nature 368215)，其通過II類MHC蛋白質(zhì)分子的α和β亞基的表面形成。術(shù)語“II類MHC HLA蛋白表面”包括三維構(gòu)型的蛋白質(zhì)分子接觸外界環(huán)境的部分，包括與水溶劑相互作用以及能結(jié)合其他的細(xì)胞組分如核酸、其他的蛋白質(zhì)和肽的那些蛋白質(zhì)特征。
術(shù)語”P1袋”和”P4袋”包括II類MHC蛋白分子的肽結(jié)合表面上的三維多態(tài)性區(qū)域，其容納來自結(jié)合II類MHC蛋白的肽的氨基酸殘基側(cè)鏈(Fridkis-Hareli等.(1998)J.Immunol.1604386-4397；Fridkis-Hareli等.(2000)Human Immunol.61640；Fridkis-Hareli等.(2001)Human Immunol.62753-763)，包括結(jié)合的天然存在的抗原或表位，以及結(jié)合的合成肽或共聚物。
術(shù)語”P-1位點”和”P5位點”指II類MHC蛋白分子肽復(fù)合物上的氨基酸殘基，其直接接觸T細(xì)胞受體(Fridkis-Hareli等.(2000)Human Immunol.61640；Fridkis-Hareli等.(2001)Human Immunol.62753-763)。P-1位點指占據(jù)P1袋肽的氨基酸殘基之前的氨基酸。P5位點指占據(jù)肽或多肽氨基酸序列中P4袋的氨基酸殘基后的氨基酸殘基。P2、P3和P5殘基為TCR接觸殘基。類似地，P9位點指位于超過肽或多肽氨基酸序列的P5位點四個位點的氨基酸殘基。
術(shù)語“患者”指動物，優(yōu)選哺乳動物，包括人以及家畜和其他的獸醫(yī)學(xué)患者。
術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”在此可互換使用。這些術(shù)語指未修飾的氨基酸鏈，并且也包括較小的修飾，如磷酸化、糖基化和脂類修飾。術(shù)語“肽”和“肽模擬物”并不互相排斥而包含實質(zhì)上的重疊部分。
“肽模擬物”包括氨基酸鏈任何修飾的形式，如磷酸化、加帽、脂肪酸修飾，并且包括非天然主鏈和/或側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。如下所述，肽模擬物包括氨基酸鏈和非-肽小分子之間的結(jié)構(gòu)連續(xù)區(qū)。肽模擬物通常保留可認(rèn)識的肽-樣聚合物單元結(jié)構(gòu)。因此，肽模擬物可保留結(jié)合HLA蛋白以形成活化患有自身免疫病的患者中自反應(yīng)性T細(xì)胞的復(fù)合物的功能。
術(shù)語“氨基酸殘基”為本領(lǐng)域已知。通常此處所用用于命名氨基酸和保護性基團的縮寫以IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會的建議為基礎(chǔ)(參見Biochemistry(1972)111726-1732)。在某些實施方案中，用于本發(fā)明應(yīng)用的氨基酸為蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的天然存在的氨基酸，或包含氨基和羧基的所述氨基酸天然存在的合成代謝或分解代謝產(chǎn)物。尤其合適的氨基酸側(cè)鏈包括選自下列氨基酸的側(cè)鏈甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、半胱氨酸(C)、亮氨酸(L)、異亮氨酸、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、甲硫氨酸(M)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、脯氨酸(P)、組氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。大多數(shù)用于本發(fā)明共聚物的氨基酸可以特定的幾何或立體異構(gòu)形式存在。雖然(D)-異構(gòu)體可以包括在共聚物內(nèi)，如在非-錨定位點處或在共聚物的肽模擬物型式情況下，在優(yōu)選的實施方案中，用于形成主題共聚物的氨基酸為(L)-異構(gòu)體。如此處所用的，“氨基酸”可包括其為如此處定義的氨基酸衍生物和/或氨基酸類似物的一種或多種組分。例如，具有“酪氨酸”殘基的共聚物中，一種或多種那些殘基的一部分可用同型酪氨酸替代。
術(shù)語“氨基酸殘基”進一步包括任何此處所指具體氨基酸的類似物、衍生物和同源物，以及C末端或N末端保護的氨基酸衍生物。術(shù)語氨基酸的“衍生物”指具有另外的取代基，例如N-羧酸酐基團、γ-苯甲基、ε，N-三氟乙?；?，附著于氨基酸原子的鹵素基團的氨基酸的化學(xué)相關(guān)形式，或該氨基酸可用N末端或C末端保護基團修飾。
術(shù)語“氨基酸類似物”指具有不同構(gòu)型例如，異構(gòu)體或具有氨基酸的近似大小、電荷以及形狀的有機分子的氨基酸的化學(xué)相關(guān)形式。例如，本發(fā)明預(yù)期氨基酸類似物，其中側(cè)鏈經(jīng)延長或縮短而仍提供用于環(huán)化的羧基、氨基或其他的反應(yīng)性前體官能團的用途，以及具有有合適官能團的變體側(cè)鏈的氨基酸類似物的用途。例如，主題化合物可包括氨基酸類似物如，例如氰丙氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸、正亮氨酸、3-磷酸絲氨酸、高絲氨酸、二羥基-苯丙氨酸、5-羥色氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸、二氨基庚二酸、鳥氨酸、或二氨基丁酸。在此具有合適側(cè)鏈的其他天然存在的氨基酸代謝物或前體可為本領(lǐng)域技術(shù)人員識別并且包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通常，“氨基酸”在此包括天然氨基酸的變體，包括在兩個相鄰殘基之間具有一個或多個非-肽或肽模擬物鍵的多肽形式的氨基酸。
術(shù)語“疏水的”氨基酸指脂肪族氨基酸丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)和纈氨酸(V)、括號中的術(shù)語為每種氨基酸的單字母標(biāo)準(zhǔn)碼縮寫，以及芳香族氨基酸色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)。當(dāng)在蛋白質(zhì)或肽內(nèi)發(fā)現(xiàn)作為殘基時，這些氨基酸提供作為脂肪族長度和芳香族側(cè)鏈大小的函數(shù)的疏水性。
術(shù)語“親水羥基”氨基酸指絲氨酸(S)或蘇氨酸(T)。
術(shù)語“帶電荷”氨基酸指氨基酸天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、組氨酸(H)、精氨酸(R)和賴氨酸(K)，其在水溶液中生理學(xué)pH值時在包含這些殘基的肽或蛋白質(zhì)上提供正(H、K和R)或負(fù)(D、E)電荷。組氨酸(H)在pH 7時為疏水的，并且在pH 6時為帶電荷的。
如此處所用的，“預(yù)防”指延緩或阻止例如病癥或病情的一種或多種癥狀的發(fā)作。
術(shù)語“前體藥物”意味著包括在生理條件下轉(zhuǎn)化為本發(fā)明抑制劑的化合物。用于制備前體藥物的常見方法為選擇在生理條件下水解的部分以提供所需生物學(xué)活性的藥物。在其他的實施方案中，前體藥物通過患者或靶病原體的酶活性而轉(zhuǎn)化。
如此處所用的，“治療”指至少減輕例如病癥或病情的一種或多種癥狀的嚴(yán)重程度或改善其結(jié)果。
術(shù)語“ED50”指產(chǎn)生其最大的應(yīng)答或作用的50％的藥物劑量?；蛘?，其可指在50％的試驗受試者或制劑中產(chǎn)生預(yù)定應(yīng)答的劑量。
術(shù)語“LD50”指在50％的試驗受試者中致死的藥物劑量。
術(shù)語“治療指數(shù)”指定義為LD50/ED50的藥物治療指數(shù)。
術(shù)語“構(gòu)效關(guān)系”或“SAR”指其中改變藥物的分子結(jié)構(gòu)從而改變其與受體、酶等等相互作用的方法。
術(shù)語“脂肪族”指線性的、支鏈的、環(huán)烷烴、烯烴或炔。某些實施方案中，本發(fā)明的脂肪族基團為線性的或支鏈的并且具有1至約20個碳原子。
術(shù)語“烷基”指飽和脂肪族基團，包括直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)烷基(脂環(huán)族的)基團、烷基取代的環(huán)烷基基團和環(huán)烷基取代的烷基基團。某些實施方案中，直鏈或支鏈烷基其主鏈具有約30個或更少的碳原子(例如，C1-C30的直鏈，C3-C30的支鏈)，以及或者約20個或更少的碳原子。同樣地，環(huán)烷基其環(huán)狀結(jié)構(gòu)中具有約3至約10個碳原子，并且或者其環(huán)狀結(jié)構(gòu)中具有約5、6或7個碳。
此外，術(shù)語“烷基”(或“低級的烷基”)包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，其后者指烴主鏈的一個或多個碳上具有替換氫的取代基的烷基部分。所述取代基可包括例如，鹵素、羥基、羰基(如羧基、烷氧羰基、甲酰基或?；?、硫代羰基(如硫酯、硫代醋酸鹽或硫代甲酸鹽)、烷氧基、磷?；㈧⑺狨?、亞膦酸酯、氨基、酰氨基、脒、亞胺、氰基、硝基、疊氮基、巰基、烷硫基、硫酸鹽、磺酸酯、氨磺酰、亞磺酰氨基、磺?；?、雜環(huán)基、芳烷基或芳香族的或雜芳香族的部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員可了解，如果合適，烴鏈上取代的部分自身可被取代。例如，取代烷基的取代基可包括氨基、疊氮基、亞氨基、酰氨基、磷?；?包括膦酸酯和亞膦酸酯)、磺酰基(包括硫酸鹽、亞磺酰氨基、氨磺酰和磺酸酯)，和甲硅烷基，以及醚、烷硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸鹽和酯)、-CF3、-CN等等的取代和未取代形式。示例的取代烷基描述如下。環(huán)烷基可進一步用烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、氨烷基、羰基-取代的烷基、-CF3、-CN等等取代。
術(shù)語“雜原子”指非碳或氫的任何元素的原子。示例性的雜原子包括硼、氮、氧、磷、硫和硒，以及或者氧、氮或硫。
術(shù)語“芳基”包括5-、6-和7-元單-環(huán)芳香族基團，其可包括零至四個雜原子，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、惡唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等等。環(huán)狀結(jié)構(gòu)中具有雜原子的那些芳香基團也可稱為“芳香基雜環(huán)”或“雜芳族化合物”。芳香環(huán)可在一個或多個環(huán)位點用上述取代基取代，例如鹵素、疊氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、烷氧基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、酰氨基、膦酸酯、亞膦酸鹽、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺?；?、亞磺酰氨基、酮、醛、酯、雜環(huán)基、芳香族的或雜原子的部分、-CF3、-CN等等。術(shù)語“芳香基”還包括具有兩個或更多環(huán)的多環(huán)系統(tǒng)，其中兩個或更多碳為兩個鄰接環(huán)所共有(該環(huán)為“稠環(huán)”)，其中至少一個環(huán)為芳香族的，例如另一個環(huán)可以是環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳香基和/或雜環(huán)基。
III.示例的實施方案共聚物本發(fā)明提供結(jié)合到T細(xì)胞并且以HLA-DR-介導(dǎo)的方式加上HLA-DQ-介導(dǎo)的方式活化或以取代HLA-DR的HLA-DQ-介導(dǎo)的方式活化T細(xì)胞的化合物。本發(fā)明還提供結(jié)合II類MHC分子并且以HLA-DQ-介導(dǎo)的方式預(yù)防自-抗原性肽活化T細(xì)胞的化合物。
本發(fā)明的一個方面為通過各種氨基酸殘基的隨機合成(聚合作用)形成的共聚物組合物。所述組合物包括三元共聚物，其為具有至少三個不同氨基酸殘基的隨機序列的共聚物，其中至少一個氨基酸選自以下組(1)酸性或中性殘基(天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q))；和(2)疏水的脂肪族殘基和小的親水羥基殘基(亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T))；
(3)小的脂肪族殘基(丙氨酸(A)、甘氨酸(G))。
因此，共聚物為例如，包括選自表1中三個氨基酸殘基組的三個氨基酸殘基的三元共聚物表1.三元共聚物組合物
通常，三元共聚物組合物中，合成共聚物以使第一組、第二組和第三組的氨基酸的相對量分別具有大約2∶5∶3的氨基酸組分摩爾輸入率。另外，分別對于第一組、第二族和第三組的氨基酸相對量，氨基酸組分的摩爾輸入率為約2∶25∶15。另外，分別對于第一組、第二組和第三個組的氨基酸相對量，氨基酸組分的摩爾輸入率為約2∶1∶0.6。
在某些其他的實施方案中，受試的指向DQ的共聚物為四元共聚物或五元共聚物，每種共聚物為隨機化的或部分隨機的氨基酸序列的混合物，其包含其中至少一個氨基酸選自以下各組的四個不同的氨基酸殘基(1)疏水脂肪族殘基(如亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、甲硫氨酸(M))；(2)酸性殘基(如天冬氨酸(D)、谷氨酸(E))；
(3)小的親水殘基(如絲氨酸(S)、半胱氨酸(C)、蘇氨酸(T))；和(4)小的脂肪族殘基(如丙氨酸(A)、甘氨酸(G))。
另外，共聚物可包含脯氨酸(P)殘基?；诤图膊∫赘行杂嘘P(guān)的β57的多態(tài)性，該酸性氨基酸側(cè)鏈用作由等位基因DQA1*03-DQB1*0302編碼的HLAP9袋和由等位基因DQA1*0501-DQB1*0201編碼的HLA P9袋的關(guān)鍵錨定殘基。脂肪族側(cè)鏈用作第二個相關(guān)袋P4的良好錨。剩余的袋非常適合容納小的、中性的或疏水的殘基。因此，在一實施方案中，結(jié)合HLA-DQ分子的共聚物包括選自上述四個組的多個氨基酸殘基。
在一實施方案中，利用氨基酸谷氨酸(E)和/或天冬氨酸(D)、亮氨酸(L)、絲氨酸(S)和丙氨酸(A)衍生出共聚物，并且此處稱為“ELSA”共聚物。
在某些其他的實施方案中，受試的指向DQ的共聚物為具有隨機化的或部分隨機的氨基酸序列的混合物，其包含其中至少一個氨基酸選自以下各組的四個不同的氨基酸殘基(1)疏水的脂肪族殘基(如亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、甲硫氨酸(M))和龐大的疏水的殘基(如酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M))；(2)酸性殘基(如天冬氨酸(D)、谷氨酸(E))；(3)小的親水殘基(如絲氨酸(S)、半胱氨酸(C)、蘇氨酸(T))；和(4)小的脂肪族殘基(如丙氨酸(A)、甘氨酸(G))。
另外，共聚物可包含脯氨酸(P)殘基。一個典型的共聚物利用氨基酸殘基谷氨酸(E)和/或天冬氨酸(D)、亮氨酸(L)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)衍生出，并且此處稱為“DLYV”共聚物。
在一個可選擇的實施方案中，共聚物為包括四個氨基酸殘基組合的四元共聚物，所述組合選自表2中的四個氨基酸殘基組表2四元共聚物組合物
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案為包括一種下列氨基酸殘基組的隨機序列的共聚物組合物天冬氨酸、丙氨酸、異亮氨酸和谷氨酸(DALE)；天冬氨酸、丙氨酸、異亮氨酸和谷氨酸(DAIE)；天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸和谷氨酸(DAVE)；天冬氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和谷氨酸(DATE)；天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸和谷氨酸(DGLE)；天冬氨酸、甘氨酸、異亮氨酸和谷氨酸(DGIE)；天冬氨酸、甘氨酸、纈氨酸和谷氨酸(DGVE)；或天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和谷氨酸(DGTE)。
通常，合成這些組合物以使得如上所示，分別具有約1∶10∶3∶1或1∶15∶3∶1的氨基酸組分的摩爾輸出率。另外，氨基酸組分的摩爾輸出率分別為約1∶25∶15∶5。另外，氨基酸組分的摩爾輸出率分別為約1∶3∶1.5∶0.2。不同氨基酸之間摩爾輸出率具有約10％的變化范圍。
在另一實施方案中，任何共聚物可進一步包括另外的氨基酸殘基，其中與II類MHC蛋白復(fù)合的該共聚物具有T細(xì)胞刺激活性，其中另外的氨基酸殘基發(fā)現(xiàn)在糖尿病的自身抗原性肽中。例如，以上任何組合的另外的氨基酸為賴氨酸殘基(K)。K殘基以充足的摩爾輸出率存在以通過與II類MHC蛋白復(fù)合的共聚物而提高T細(xì)胞的刺激。此外，K殘基以充足的摩爾輸出率存在以提高共聚物的水溶性。
可以利用以一定比率整合入隨機共聚物的氨基酸。本發(fā)明優(yōu)選的隨機共聚物包括氨基酸殘基K、E、A、S、V和P。更優(yōu)選，K∶E∶A∶S∶V的摩爾輸入率為0.3∶0.7∶9∶0.5∶0.5∶0.3。
此外，某些實施方案中，該共聚物可以是在產(chǎn)生的聚合物中具有以固定的間距存在而提供最佳II類結(jié)合的“錨定”或固定殘基的半-隨機的(或半-規(guī)則的)聚合物。
優(yōu)選，共聚物具有通用序列[XXXa1XXXXXXXXa2XX]n，其中2≤n≤8，X為任何氨基酸殘基，并且Xa1和Xa2為選自谷氨酸和天冬氨酸的酸性氨基酸殘基?；蛘?，Xa1和Xa2的一個可以是纈氨酸。
優(yōu)選，可合成共聚物以具有一個通用序列1.[XXEXXXXXXXEXX]n2.[XXEXXXXXXXDXX]n3.[XXDXXXXXXXDXX]n4.[XXDXXXXXXXEXX]n5.[XXEXXVXXXXDXX]n6.[XXDXXVXXXXDXX]n7.[XXDXXVXXXXEXX]n8.[XXEXXVXXXXEXX]n其中X為A、S、V、K或P。
在一優(yōu)選的實施方案中，A∶S∶V∶K∶P的摩爾輸入率為5∶1∶1∶1∶0.5，并且2≤n≤8。在一優(yōu)選的實施方案中，n＝4。
該肽可具有9至25個氨基酸殘基的長度。優(yōu)選，該肽為13個氨基酸-殘基長。9至25個氨基酸的限定序列長度的肽可包含2至20個固定的殘基。本發(fā)明中所述肽的單個固定殘基可結(jié)合在任何P1、P4、P7或P9位點結(jié)合II類MCH分子槽的肽。優(yōu)選，所述肽包含2或3個固定的殘基。在一實施方案中，13個氨基酸的規(guī)定序列長度的肽將包含2個固定的殘基，E或D或任何其組合。優(yōu)選13個氨基酸規(guī)定序列長度的肽包含3個固定殘基。該肽可為規(guī)定序列的多聚體，其中重復(fù)單元的數(shù)目優(yōu)選在2至8的范圍。更優(yōu)選，重復(fù)單元的數(shù)目為3至6。最優(yōu)選，重復(fù)單元的數(shù)目為4。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多聚體包括13個氨基酸規(guī)定序列長度的肽，其包含2個固定的殘基，E或D或其任何組合。
優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的共聚物組合物以1μM或更低的平均Kd，且更優(yōu)選小于100nM、10nM或甚至1nM的平均Kd結(jié)合一種或多種DQ同種型。另一種鑒定優(yōu)選的共聚物的方法以競爭性結(jié)合測定為基礎(chǔ)，如Sidney等.(2002)J.Immunol.1695098中所述的，其可以表示為IC50值，或50％的結(jié)合受抑制的競爭劑的值。本發(fā)明優(yōu)選的共聚物具有小于1μM，更優(yōu)選小于500nM，并且甚至更優(yōu)選小于100nM的IC50。
此處提供的共聚物為至少約30個殘基的長度，至少約40個殘基的長度或該共聚物為至少約50個殘基的長度。此外，該共聚物不大于約90個殘基的長度，不大于約80個殘基的長度或不大于約70個殘基的長度。優(yōu)選，該隨機共聚物為約10至100個氨基酸殘基長，更優(yōu)選20至80個氨基酸殘基長，更優(yōu)選40至60個氨基酸殘基長，并且最優(yōu)選約50個氨基酸殘基長。當(dāng)合成后，隨機共聚物的典型制劑為各種長度肽的混合物，其大部分為所需的長度但包含通過現(xiàn)有的合成方法不可避免產(chǎn)生的更短或更長的肽。優(yōu)選，肽通過固相化學(xué)合成。
在某些優(yōu)選的實施方案中，主題共聚物配制用作藥物以便具有小于25,000，且更優(yōu)選小于10000、5000或甚至1000的多分散性。
降低HLA-DQ介導(dǎo)的自身免疫應(yīng)答的本發(fā)明化合物具有對各種II類MHC-相關(guān)疾病或病癥如胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、脂瀉病、皰疹樣皮炎和自身免疫甲狀腺疾病(AITD)預(yù)防或治療的治療價值。本發(fā)明的化合物可以給予患者用于免疫病癥的治療，例如涉及不需要的或不適當(dāng)?shù)拿庖呋钚?，或可用來制備治療藥物。尤其，有效劑量的本發(fā)明化合物可治療性地用于改善或預(yù)防胰島素-依賴型糖尿病、脂瀉病和其他疾病。用于涉及不需要的或不適當(dāng)?shù)腗HC活性的病癥，如自身免疫病癥治療的有效劑量的本發(fā)明化合物可通過本領(lǐng)域已知考慮日常安全研究、毒性研究、劑量濃度研究和投遞方法例如丸劑、連續(xù)或反復(fù)投遞的標(biāo)準(zhǔn)方法而確定。
化合物的制備本發(fā)明的化合物為上述氨基酸殘基或其類似物的隨機或半隨機共聚物(以至形成肽模擬物)，其可利用很容易得到的技術(shù)和材料合成。為了舉例說明，本發(fā)明的共聚物可利用Fmoc或t-boc起始氨基酸類似物等等合成，其固定在用于進一步聚合(固態(tài)合成)的自動化肽合成裝置中樹脂上。以可調(diào)節(jié)而提供具有最佳結(jié)合特性的共聚物的摩爾比聚合氨基酸。
用于肽合成的所述樹脂支持物的例子包括Merrifield樹脂、與1％DVB交聯(lián)的氯甲基化的聚苯乙烯；Fmoc氨基酸Wang樹脂、4芐氧基芐基醇，樹脂為用氨基酸(例如，F(xiàn)moc-D-trp(boc)-Wang樹脂)預(yù)-裝載的?？傻玫讲煌看笮。?00-200目，以及分離起始氨基酸的高裝載或低裝載密度的樹脂。
合成方法可包括提供溶液，其為所選擇的活化形式氨基酸以每種適當(dāng)衍生的氨基酸前體(衍生以保護某些官能團，如L-賴氨酸的ε氨基，例如前體ε，N-三氟乙?；?L-賴氨酸)的合適摩爾比的混合物，例如，活化作為N-羧基酸酐?；蛘撸铣煞椒砂ㄋx擇的氨基酸衍生前體以優(yōu)選的摩爾比合成過程期間的在線混合。氨基酸的摩爾輸出率不同于摩爾輸入率，即，用于合成混合物的氨基酸的摩爾比不同于合成的隨機共聚物中氨基酸的摩爾比。摩爾輸出率通過共聚物組合物水解后常規(guī)的氨基酸組成分析確定。不同氨基酸之間摩爾輸出率具有約10％的變化范圍。
優(yōu)選如肽合成中常規(guī)保護的，聚合入本發(fā)明組合物的不同的衍生氨基酸的溶液添加至珠子樣品例如，F(xiàn)moc。用于完整的共聚物分子合成、解封閉以及裂解以從樹脂中除去的試劑可從設(shè)備廠商處獲得(Applied Biosystems Peptide Synthesizer，F(xiàn)oster City，CA，或AdvancedChemTech，Louisville，KY)；參見例如，Bodansky，Principles of PeptideSynthesis，2nd Ed.，Springer-Verlag，1991，其內(nèi)容在此通過引用引入。另外的氨基酸或類似物或氨基酸衍生物可添加至所選構(gòu)成共聚物的至少三個氨基酸，以替代小比例的那些氨基酸而提供例如，具有提高的蛋白酶抗性而因此具有增強的藥物學(xué)性質(zhì)如更長的體內(nèi)使用期的共聚物。類似物的例子為同型酪氨酸，或其他取代的酪氨酸衍生物，以及氨基丁酸，每種可作為Fmoc衍生物從Advanced ChemTech獲得。
共聚物合成裝置也可購買獲得，例如，在Chiron Technologies，Clayton，Australia，the Harvard Medical School Biopolymer Laboratory，Boston，MA以及在Advanced ChemTech，Inc.，Louisville，KY。
某些實施方案中，本發(fā)明的化合物包括所述線性共聚物，其通過取代或添加不同的化學(xué)部分而進一步修飾。在一實施方案中，所述修飾在殘基位置并且其量以足以抑制受試者中共聚物蛋白水解降解。例如，氨基酸修飾可在至少一個脯氨酸殘基的序列中出現(xiàn)；該殘基存在于至少一個羧基-和氨基末端中；另外，脯氨酸可存在于至少一個羧基-和氨基-末端的四個殘基內(nèi)。此外，氨基酸修飾可以是D-氨基酸。
某些實施方案中，主題共聚物為肽模擬物。肽模擬物為基于或源自肽和蛋白質(zhì)的化合物。本發(fā)明的共聚物肽模擬物通?？赏ㄟ^一個或多個天然氨基酸殘基例如利用非天然氨基酸、構(gòu)象限制、電子等排替換等等的結(jié)構(gòu)修飾而獲得。主題肽模擬物組成肽和非-肽合成結(jié)構(gòu)之間的結(jié)構(gòu)空間連續(xù)區(qū)。
所述肽模擬物可具有如為非-可水解的(例如，對蛋白酶或降解相應(yīng)肽共聚物的其他生理條件提高的穩(wěn)定性)、提高的特異性和/或效力的所述性質(zhì)。用于示例性的目的，本發(fā)明的肽類似物可利用例如苯二氮(例如，參見Freidinger等.in“PeptidesChemistry and Biology，“G.R.Marshall ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988)、取代的γ內(nèi)酰胺環(huán)(Garvey等.in“PeptidesChemistry and Biology，”G.R.Marshall版本，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988，p123)、C-7模擬物(Huffman等.in“PeptidesChemistry and Biology，”G.R.Marshall ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988，p.105)、酮-亞甲基假肽(Ewenson等.(1986)J.Med.Chem.29295；和Ewenson等.in“PeptidesStructure and Function(Proceedings of the 9th AmericanPeptide Symposium)，”Pierce Chemical Co.Rockland，IL，1985)、β-折疊二肽核(Nagai等.(1985)Tetrahedron Lett.26647；和Sato等.(1986)J.Chern.Soc.Perkin Trans.11231)、β-氨基醇(Gordon等.(1985)Biochem.Biophys.Res.Commun.126419；和Dann等.(1986)Biochent.Bioplays.Res.Commun.13471)、二氨基酮(Natarajan等.(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.124141)和修飾的亞甲基氨基(Roark等.in“PeptidesChemistry and Biology，”G.R.Marshall ed.，ESCOMPublisherLeiden，Netherlands，1988，p134)產(chǎn)生。此外通常參見，Session IIIAnalytic and synthetic methods，in“PeptidesChemistry andBiology，”G.R.Marshall ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988)。
除可進行各種側(cè)鏈替換以產(chǎn)生主題共聚物肽模擬物之外，本發(fā)明具體預(yù)期肽二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象限制模擬物的用途。已開發(fā)了用于肽酰胺鍵的許多替代物。經(jīng)常利用的用于酰胺鍵的替代物包括下列組(i)trans-烯烴，(ii)氟代烯烴，(iii)亞甲基氨基，(iv)膦酰胺和(v)磺酰胺。
酰胺鍵替代物的例子 trans-烯烴氟代烯烴 亞甲基氨基 膦酰胺 磺酰胺另外，可利用基于共聚物主鏈更大量修飾的肽模擬物。落入該種類的肽模擬物包括(i)retro-inverso類似物，和(ii)N-烷基甘氨酸類似物(所謂的類肽)。
二肽類似物的例子 retro-inverso N-烷基甘氨酸此外，組合化學(xué)的方法用來針對肽模擬物共聚物的開發(fā)。例如，所謂“肽變體(peptide morphing)”策略的一個實施方案集中于包括各種各樣肽鍵取代物的肽類似物文庫的隨機生成。
在一個示例的實施方案中，肽模擬物可源自retro-inverso類似物。Retro-inverso類似物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備，如通過Sisto等在美國專利4,522,752所述的。作為常規(guī)指導(dǎo)，對于模擬物轉(zhuǎn)換，通常改變對蛋白質(zhì)水解最敏感的位點，而任選較低敏感性的酰胺鍵。終產(chǎn)物或其中間體可通過HPLC純化。
在另一個示例性的實施方案中，肽模擬物可源自retro-enantio共聚物。象這樣的Retro-enantio類似物可通過商業(yè)上可得到的D-氨基酸(或其類似物)和標(biāo)準(zhǔn)固體-或溶液-相肽-合成技術(shù)合成。
在另一個示例性的實施方案中，可制備trans-烯烴衍生物?？筛鶕?jù)Shue等.(1987)Tetrahedron Lett.283225的方法以及同樣根據(jù)本領(lǐng)域已知的其他方法合成共聚物的trans-烯烴類似物。可以理解的是根據(jù)所用試劑的性質(zhì)在引用的方法中或其他可用的方法中改變可能是必要的。
此外可以將通過上述方法合成的假肽偶聯(lián)至其他假肽而制備具有代替酰胺官能團的一些烯官能團的共聚物。例如，可制備對應(yīng)某些二肽序列的假肽并且隨后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)偶聯(lián)在一起以產(chǎn)生共聚物肽的類似物，其在殘基之間具有交替的烯鍵。
另一類肽模擬物衍生物還包括膦酸酯衍生物。所述膦酸酯衍生物的合成可從已知的合成方案修改得到。參見例如，Loots等.in“PeptidesChemistry and Biology，”(Escom Science Publishers，Leiden，1988，p.118)；Petrillo等.in“PeptidesStructure and Function(Proceedings ofthe 9th American Peptide Symposium)，”Pierce Chemical Co.Rockland，IL，1985)。
其他的實施方案中，修飾可以是糖類或脂類部分的引入。所述修飾還改變共聚物在各種介質(zhì)中的溶解度以使其可方便地制備入合適的藥物組合物中。修飾脂類基團包括金合歡醇基基團或肉豆蔻酰基團。修飾糖類基團包括任何天然存在和合成糖的單糖或低聚糖以及糖醇，例如葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖和其他糖以及其各自的醇。
治療方法本發(fā)明的一個方面提供通過將本發(fā)明的一種或多種共聚物以治療有效量給予受試者而治療患有自身免疫病受試者的方法。本發(fā)明的另一方面提供治療患有不需要的免疫應(yīng)答、過敏癥或任何通過給予此處所述本發(fā)明共聚物而能治療疾病的受試者的方法。通過本發(fā)明提供的治療方法尤其適于治療I型或胰島素-依賴型糖尿病、脂瀉病或HLA-DQ分子介導(dǎo)的任何其他自身免疫病。
通常，本發(fā)明的實施方案為給予治療性共聚物組合物合適的日劑量，其將是產(chǎn)生治療作用，例如減輕癥狀的最低有效劑量。治療性共聚物優(yōu)選以作為合適的最小起始劑量的每個受試者每天至少約2mg、至少約5mg、至少約10mg或至少約20mg的劑量給予。此處所述方法的一個實施方案中，可給予約0.01至約500mg/kg的劑量。通常，本發(fā)明化合物的有效劑量為每千克受試者每天約50至約400微克的化合物。然而，技術(shù)人員可理解本發(fā)明組合物的劑量將隨著受試者以及所用的具體給藥途徑而變化。本領(lǐng)域中通常調(diào)節(jié)劑量以適合單獨的受試者。例如，可給予單丸劑，可隨時間給予一些分開的劑量，或劑量可根據(jù)疾病情況的緊急性而成比例降低或提高。另外，有效量尤其基于化合物的大小、化合物的生物降解性、化合物的生物活性以及化合物的生物利用率。如果化合物不快速降解，為生物可利用的以及高活性的，則較少的量就將是有效的。適于受試者的實際劑量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員以常規(guī)操作很容易地確定，例如醫(yī)師或獸醫(yī)給定的常規(guī)起始點。
由于所述給藥帶來的癥狀改善是顯著的，表現(xiàn)為以糖尿病發(fā)作的復(fù)發(fā)頻率的降低、癥狀嚴(yán)重程度的降低以及起始給藥后一段時間復(fù)發(fā)發(fā)作的消除。治療有效劑量優(yōu)選相對于未治療的受試者減輕癥狀以及，降低至少約20％的復(fù)發(fā)頻率，例如至少約40％、至少約60％和至少約80％或約100％消除一種或多種癥狀，或消除自身免疫病的復(fù)發(fā)。
化合物可以每小時、每天、每周、每月、每年(例如，定時釋放形式)或作為一次投遞而投遞。投遞可以連續(xù)投遞一段時間，例如靜脈內(nèi)投遞。此處所述方法的一個實施方案中，制劑至少每天給予一次。在一個實施方案中，制劑每天給予。在一個實施方案中，制劑每隔一天給予。在一個實施方案中，制劑每6至8天給予。在一個實施方案中，制劑每周給予。治療的時段可以為至少約一個月、至少約六個月或至少約一年。
此處所述方法的一個實施方案中，給藥途徑可以為口服的、腹膜內(nèi)的、透皮的、皮下的、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射、吸入的、局部的、病灶內(nèi)的、輸液；脂質(zhì)體-介導(dǎo)的投遞；局部的、鞘內(nèi)的、齦袋、直腸的、支氣管內(nèi)、鼻的、經(jīng)粘膜的、腸內(nèi)的、眼的或耳的投遞，或本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易理解的本領(lǐng)域已知的任何其他方法。本發(fā)明組合物的另一實施方案結(jié)合用于不同給藥途徑的微粒形式保護層，蛋白酶抑制劑或滲透增強劑，包括腸胃外的、肺的、鼻的和口服途徑。
本發(fā)明方法的一個實施方案為以持續(xù)釋放形式給予本發(fā)明的共聚物。所述方法包括應(yīng)用持續(xù)-釋放透皮貼片或植入持續(xù)-釋放膠囊或包被的可植入醫(yī)療器械以使治療有效量的本發(fā)明共聚物持續(xù)投遞至所述方法的受試者。本發(fā)明的化合物和/或制劑可以通過膠囊投遞，其允許制劑或肽一段時間內(nèi)的持續(xù)-釋放。受控的或持續(xù)-釋放組合物包括親脂性貯存(例如，脂肪酸、蠟、油)的制劑。本發(fā)明還包括用聚合物包被的微粒組合物(例如，poloxamers或poloxamines)，或微囊密封的投遞系統(tǒng)。某些實施方案中，共聚物來源是立體定向提供于自身免疫攻擊區(qū)內(nèi)或鄰近該區(qū)，例如接近胰腺而用于IDDM的治療。
在另一個相關(guān)的實施方案中，該方法進一步包括給予至少一種另外的治療劑。所述制劑可以為結(jié)合不同HLA分子的另一種共聚物如Copaxone，所述不同的HLA分子可以是HLA-DQ分子或HLA-DR分子；抗體或抗體片段，其結(jié)合不需要的炎性分子或細(xì)胞因子如白介素-6、白介素-8、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子或酶抑制劑如蛋白酶抑制劑如α1-抗胰蛋白酶、抑肽酶、激肽釋放酶抑制劑；環(huán)加氧酶抑制劑；抗生素如羥氨芐青霉素、利福平、紅霉素；抗病毒劑如阿昔洛韋；類固醇抗炎藥如糖皮質(zhì)激素；性類固醇如黃體酮；非-類固醇抗炎藥如阿斯匹林、布洛芬或醋氨酚；抗-癌劑如氨甲喋呤或阿霉素；細(xì)胞因子阻斷劑；粘附分子阻斷劑；免疫抑制劑如FK506或環(huán)孢素；或非炎性細(xì)胞因子如白介素-4或白介素-10。其他的細(xì)胞因子和生長因子可以是干擾素-β、腫瘤壞死因子、抗血管生成因子、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、白介素、成熟因子、趨化蛋白和上述保留類似生理學(xué)活性的變體和衍生物。
發(fā)明方法的另一個實施方案進一步包括抗肥胖劑的給予?？?肥胖藥物的例子包括P-3激動劑、CB-1拮抗劑、食欲抑制劑如例如西布曲明(Meridia)和脂肪酶抑制劑如例如奧利司他(Xenical)。
本發(fā)明方法的一個實施方案中，本發(fā)明的共聚物與通常用于治療糖尿病患者中脂類病癥的藥物結(jié)合給予。所述藥物包括但不限于，HMG-CoA還原酶抑制劑、煙酸、膽汁酸螯合劑和纖維酸衍生物。
本發(fā)明方法的又一個實施方案中，本發(fā)明的共聚物與抗-高血壓藥物如β-阻斷劑、組織蛋白酶S抑制劑和ACE抑制劑結(jié)合給予。
本發(fā)明的共聚物可以與一種以上任何上述另外的治療劑一起給予。
另外的藥劑可以作為如下所述藥物組合物的添加部分而給予，或可以作為獨立的組合物當(dāng)另外的藥劑的生理作用與本發(fā)明共聚物的生理作用重疊時共同給藥或在此期間內(nèi)給予。更具體地，另外的制劑可以與共聚物共同給予或在共聚物給藥的一周、數(shù)天、24小時、8小時或立即之前給予?；蛘?，另外的制劑可以與共聚物共同給予或在共聚物給藥后一周、數(shù)天、24小時、8小時或立即給予。
本發(fā)明的另一個實施方案為通過給予本發(fā)明的共聚物而用于預(yù)防性治療處于發(fā)展自身免疫病風(fēng)險中的受試者的方法，以延緩或預(yù)防疾病發(fā)作。處于風(fēng)險中的受試者通過例如，通過檢驗與所述自身免疫病有關(guān)的HLA等位基因而確定對自身免疫病的遺傳易感性，和/或基于家族史或與所述自身免疫病有關(guān)的其他遺傳標(biāo)記而鑒定。所述預(yù)防性治療可另外包括結(jié)合到與所要治療的自身免疫病有關(guān)的第二種HLA分子的第二種共聚物。第二種HLA分子可以是HLA-DQ或HLA-DR分子。優(yōu)選，預(yù)防性治療的自身免疫病為IDDM或脂瀉病。
利用本發(fā)明共聚物組合物的預(yù)防性治療還適于預(yù)防不需要的免疫應(yīng)答，如宿主-移植物疾病或移植物-宿主疾病或器官移植后的移植物排斥。本發(fā)明的共聚物可以在移植之前、期間和之后，單獨或與常規(guī)的免疫抑制劑藥物一起給予受試者。所述給藥可在移植前一周、數(shù)天、24小時、8小時或立即進行，并且可在以治療方案中移植后的另一個60-100天，但至少移植當(dāng)天后的60天持續(xù)給予患者。利用本發(fā)明共聚物組合物的預(yù)防性治療還適于預(yù)防過敏或任何通過本發(fā)明共聚物給藥能治療的疾病。
治療組合物本發(fā)明的另一個方面提供包括藥物有效量的本發(fā)明共聚物組合物以及可接受載體和/或賦形劑的藥物組合物。藥學(xué)可接受載體包括生理學(xué)相容的任何溶劑、分散介質(zhì)或包衣。優(yōu)選，載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、口服、腹膜內(nèi)、透皮、局部或皮下給藥。一種示例的藥學(xué)可接受載體為生理鹽水。其他的藥學(xué)可接受載體和其劑型為熟知的并且通常在例如Remington’s Pharmaceutical Science(18thEd.，ed.Gennaro，MackPublishing Co.，Easton，PA，1990)中描述。各種藥學(xué)可接受賦形劑為本領(lǐng)域熟知的并且可在例如Handbooks of Pharmaceutical Excipients(4thed.，Ed.Rowe等.Pharmaceutical Press，Washington，D.C.)中找到。組合物可配制為溶液、微乳劑、脂質(zhì)體、膠囊、片劑或適于上述治療方法中不同給藥途徑的其他形式。包含共聚物的有效組分可包被在材料中以保護其在到達靶作用部位之前不被環(huán)境失活。
本發(fā)明的另一實施方案中，藥物組合物為持續(xù)釋放制劑。本發(fā)明的共聚物可與控制共聚物進入當(dāng)時環(huán)境的釋放速度的生物學(xué)相容性聚合物或基質(zhì)混合。受控的或持續(xù)釋放的組合物包括親脂性貯存(例如，脂肪酸、蠟、油劑)的制劑、植入物、透皮貼片和微囊密封的投遞系統(tǒng)。本發(fā)明還包括用聚合物包被的微粒組合物(例如，poloxamers或poloxamines)。本發(fā)明組合物的另一實施方案結(jié)合用于不同給藥途徑的微粒形式保護層，蛋白酶抑制劑或滲透增強劑，包括腸胃外的、肺的、鼻的和口服途徑?？山邮艿妮d體包括羧甲基纖維素(CMC)和修飾的CMC。參見例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，Ed.，Marcel Dekker，Inc.，NY，1978。
藥物組合物還可包括另外的治療活性組分。所述另外的組分可以為結(jié)合不同HLA分子的另一種共聚物如Copaxone，抗體或抗體片段，其結(jié)合不需要的炎性分子或細(xì)胞因子如白介素-6、白介素-8、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子-α；酶抑制劑如蛋白酶抑制劑如α1-抗胰蛋白酶、抑肽酶、激肽釋放酶抑制劑；環(huán)加氧酶抑制劑；抗生素如羥氨芐青霉素、利福平、紅霉素；抗病毒劑如阿昔洛韋；類固醇抗炎藥如糖皮質(zhì)激素；性類固醇如黃體酮；非-類固醇抗炎藥如阿斯匹林、布洛芬或醋氨酚；抗癌劑如氨甲喋呤或阿霉素；細(xì)胞因子阻斷劑；粘附分子阻斷劑；免疫抑制劑如FK506或環(huán)孢素；或非炎性細(xì)胞因子如白介素-4或白介素-10。其他的細(xì)胞因子和生長因子如干擾素-β、腫瘤壞死因子、抗血管生成因子、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、白介素、成熟因子、趨化蛋白和其保留類似生理學(xué)活性的變體和衍生物也可用作本發(fā)明組合物的另外的組分。
本發(fā)明治療性組合物的一個實施方案可包括與一種或多種抗肥胖藥結(jié)合的共聚物，如P-3激動劑、CB-1拮抗劑、食欲抑制劑，如例如，西布曲明(Meridia)和脂肪酶抑制劑如例如，奧利司他(Xenical)。
通常用于治療糖尿病患者中脂類病癥的一種或多種藥物可以是本發(fā)明組合物另外的治療性活性組分。所述藥物包括但不限于，HMG-CoA還原酶抑制劑、煙酸、膽汁酸螯合劑和纖維酸衍生物。
抗-高血壓藥物，如例如，β-阻斷劑、組織蛋白酶S抑制劑和ACE抑制劑可以是本發(fā)明組合物另外的治療性活性組分。β-阻斷劑的例子為醋丁洛爾、比索洛爾、艾司洛爾、萘心安、阿替洛爾、拉貝洛爾、卡維地洛和美托洛爾。ACE抑制劑的例子為卡托普利、恩那普利、賴諾普利、貝那普利、福辛普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、群多普利和莫昔普利。組織蛋白酶S特異性抑制劑的例子為具有如下通式(I)所示結(jié)構(gòu)的呋喃酮衍生物和其藥學(xué)可接受鹽
其中R1＝R’、R’C(O)、R’C(S)、R’SO2、R’OC(O)、R’NHC(O)，R’＝ X＝O、S、NH，W、Y、Z＝CH、NR”＝選自以下的單或多環(huán)取代組合H、C1-7-烷基、C3-6-環(huán)烷基、OH、SH、胺、鹵素R2、R4＝H、C1-7-烷基、C3-7-環(huán)烷基；R3＝C1-7-烷基、C3-7-環(huán)烷基、Ar-C1-7-烷基；R5＝C1-7-烷基、鹵素、Ar-C1-7-烷基、C1-3-烷基-CONR″，Riv；RiV＝ 其中n＝1-3，m＝1-3；Rv、Rvi＝H、C1-7-烷基；A＝N、CH；B＝N、O、S、CH；當(dāng)B＝O、S時Rvii＝缺乏的；或當(dāng)B＝N、CH時Rvii＝H、C1-7-烷基；Rviii＝O、C1-7-烷基；R6＝H、Ar-C1-7-烷基、C1-3-烷基-SO2-Rix、C1-3-烷基-C(O)-NHRiX或CH2XAr；其中X和Ar如此處定義。
通式(I)的化合物在公開的PCT申請WO00/69855中公開，其公開內(nèi)容在此全文引入。組織蛋白酶S抑制劑的另一個例子為具有底下通式(II)所示結(jié)構(gòu)的呋喃酮衍生物和其藥學(xué)可接受鹽 其中R1為R’-C(＝O)或R’-S(＝O)2-R’為 X＝O、S、NH，W、Y、Z＝CH、N；R”＝選自下列的單或多環(huán)取代H、C1-7-烷基、C3-6-環(huán)烷基、OH、SH、胺、鹵素；R3＝C1-7-烷基、C2-7-烯基、C3-7-環(huán)烷基、Ar、Ar-C1-7-烷基；R4＝H、C1-7-烷基、C3-7-環(huán)烷基；C2-7-烯基、Ar、Ar-C1-7-烷基；R5＝C1-7-烷基、羥基或鹵-代C1-C7-烷鹵基、Ar-C1-7-烷基，C0-3-烷基-CONR3R4或RivRiV＝ n＝1-3、m＝1-3；Rv、Rvi＝H、C1-7-烷基；A＝N、CH；B＝N、O、S、CH；當(dāng)B＝O、S時Rvii＝缺乏的；或當(dāng)B＝N、CH時Rvii＝H、C1-7-烷基；Rviii＝O，C1-7-烷基；
R6＝H、C1-7-烷基、AR-C1-7-烷基、C1-3-烷基-SO2-Rix、C1-3-烷基-C(O)-NHRix或CH2XAr；Rix為C1-7-烷基、Ar-C1-7-烷基、C3-C6-環(huán)烷基和其藥學(xué)可接受鹽。通式(II)的化合物在公開的PCT申請WO 02/40462中公開，其公開內(nèi)容在此全文引入。其他的組織蛋白酶S抑制劑的例子為1-[3-[4-(6-氯-2，3-二氫-3-甲基-2-氧代-1H-苯并咪唑-1-基)-1-哌啶基]丙基]-4，5，6，7-四氫化-5-(甲磺酰)-3-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-吡唑酮[4，3-c]吡啶(JNJ 10329670)(Thurmond等.(2004)J.Pharmacol.Exp.Ther.308(1)268-76，Epub 2003 Oct 17)；CLIK-60(Katunuma等.FEBS Lett.4586-10)；4-嗎啉脲-Leu-同型Phe-乙烯基砜(Flannery等.(2003)Am.J.Pathol.163(1)175-82)；Paecilopeptin(Shindo等.(2002)Biosci.Biotechnol.Biochem.66(11)2444-8)；二肽腈(Ward等.(2002)J.Med.Chem.45(25)5471-82)；和二肽α-酮-β-醛(Walker等.(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.275(2)401-5)。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選在投遞時為無菌的非熱原性的并且優(yōu)選在制造和貯藏條件下為穩(wěn)定的。
鑒定治療活性共聚物的方法本發(fā)明的另一個方面提供用于鑒定能減輕自身免疫病發(fā)作的嚴(yán)重程度和降低頻率的治療性共聚物的方法。
某些實施方案中，受試的DQ-指向共聚物用易于檢測共聚物的部分修飾或標(biāo)記。在一優(yōu)選的實施方案中，該共聚物為生物素化的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該共聚物用FITC修飾。典型的共聚物為用生物素或FITC修飾的上述的隨機共聚物。在其他實施方案中，具有在產(chǎn)生的聚合物中以規(guī)則間距存在的“錨定”殘基的共聚物用生物素或FITC修飾。
在一優(yōu)選的實施方案中，可合成經(jīng)修飾的共聚物以具有通式9.生物素-間隔物-[XXEXXXXXXXEXX]n10.生物素-間隔物-[XXEXXXXXXXDXX]n11.生物素-間隔物-[XXDXXXXXXXDXX]n12.生物素-間隔物-[XXDXXXXXXXEXX]n13.生物素-間隔物-[XXEXXVXXXXDXX]n14.生物素-間隔物-[XXDXXVXXXXDXX]n15.生物素-間隔物-[XXDXXVXXXXEXX]n16.生物素-間隔物-[XXEXXVXXXXEXX]n其中A、S、V、K或P，其摩爾輸入率為5∶1∶1∶1∶0.5，2≤n≤8，并且間隔物包括2至6個氨基酸殘基，優(yōu)選具有氨基酸序列SGSG。在一優(yōu)選的實施方案中，n＝4。
這些修飾的共聚物用于測定和診斷，例如用于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)中。標(biāo)記的共聚物還可以用于確定結(jié)合HLA分子的共聚物當(dāng)中最好的序列或優(yōu)選的序列。另外，標(biāo)記的共聚物可用于篩選與HLA-DQ分子結(jié)合或和HLA-DQ分子相關(guān)的本發(fā)明的共聚物無關(guān)的其他化合物。
對治療自身免疫病治療有效的共聚物可通過下列方法鑒定(1)如上所述合成本發(fā)明的共聚物；(2)確定所述共聚物與HLA-DQ分子的結(jié)合；(3)將共聚物與HLA-DQ分子的結(jié)合和已知自身抗原性肽與HLA-DQ的結(jié)合相比較；(4)選擇比檢測過的已知自身抗原性肽更強結(jié)合HLA-DQ分子的共聚物；和(5)通過呈遞所選擇共聚物的HLA-DQ分子確定經(jīng)T輔助細(xì)胞介導(dǎo)的活化的抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
自身抗原性肽的例子為包含人胰島素氨基酸殘基9-23的肽；包含人GAD氨基酸殘基206-220的肽；或包含人HSP60氨基酸殘基441-460的肽。經(jīng)檢測針對共聚物的HLA-DQ分子可以是此處所述的任何HLA-DQ分子。
在非-人動物如嚙齒類，如大鼠、小鼠或倉鼠中，篩選方法可用于體內(nèi)測定。嚙齒類可以是針對人類疾病的模型，如針對人糖尿病的NOD小鼠。
實施例1.共聚物結(jié)合HLA-DQ這些新共聚物結(jié)合HLA-DQ分子的能力通過競爭性結(jié)合測定法檢驗，其中共聚物與源自胰島自身抗原的肽競爭結(jié)合可溶重組HLA-DQ8分子，源自胰島自身抗原肽的例子為以上所列的。由等位基因DQA1*03-DQB1*0302編碼的可溶的重組HLA-DQ8在銅-誘導(dǎo)型金屬硫蛋白啟動子控制下在果蠅S2細(xì)胞中表達。HLA-DQ8通過用來自轉(zhuǎn)錄因子Fos和Jun的亮氨酸拉鏈二聚化結(jié)構(gòu)域替換DQα和DQβ的跨膜和胞內(nèi)片段而設(shè)計為可溶的蛋白質(zhì)。參見Hausmann等.(1999)J.Exp.Med.1891723-1734。表達的重組蛋白通過利用單克隆抗體9.3.F10(HB180，American Type Culture Collection)的親和層析和利用Mono Q HR柱(Pharmacia Biotech)的親和層析從濃縮的上清純化。
每種共聚物為如Fridkis-Hareli等.(1999)J.Immunol.1624697-4704中所述的分離和合并的序列。通常，聚合物通過利用Zorbax C18 1.0mm反-相柱的小孔HPLC分離，用0至60％乙腈梯度中0.055％三氟乙酸的梯度洗脫。峰選擇、經(jīng)反相分離和Edman微測序基于Chicz等.(1993)J.Exp.Med.17827-47而設(shè)計。
用生物素化的共聚物進行共聚物結(jié)合測定。在結(jié)合測定法中，溫育共聚物候選者和可溶的HLA-DQ8并且利用單克隆抗體9.3.F10捕獲形成的復(fù)合物，其特異性結(jié)合HLA-DQ8。捕獲的復(fù)合物通過用銪-標(biāo)記的鏈親和素檢測而定量。競爭測定法中，生物素化的共聚物與可溶的HLA-DQ8預(yù)孵育。隨后添加過量的具有源自胰島自身抗原(如胰島素氨基酸殘基9-23、GAD氨基酸殘基206-220或HSP60氨基酸殘基441-460)氨基酸序列的未標(biāo)記的競爭肽以替換共聚物。殘留的共聚物-HLA-DQ8復(fù)合物的級分根據(jù)維持更低非特異性結(jié)合的對照量而計算，測量至72小時以確定所述復(fù)合物的半衰期。
選擇具有比自身抗原性肽更強或相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合親和力的共聚物。優(yōu)選的共聚物與HLA-DQ8形成具有長于12小時的半衰期的復(fù)合物。更優(yōu)選，所選的共聚物與HLA-DQ8形成具有長于24小時、48小時或更優(yōu)選72小時半衰期的復(fù)合物。
用于實驗的共聚物具有下列氨基酸組成并且，如果合適，具有錨定氨基酸RSP-001[XXEXXXXXXXEXX]4RSP-002[XXEXXXXXXXDXX]4RSP-003[XXEXXXXXXXDXX]4其中X為在合成開始時具有5∶1∶1∶1∶0.5摩爾輸入率的A、K、S、V、P的混合物。
RSP-008DAVE的隨機混合物RSP-009DATE的隨機混合物RSP-010DALE的隨機混合物其中合成開始時四個氨基酸的摩爾輸入率為1∶5∶3∶1。
CO-14產(chǎn)生的隨機共聚物組合物中具有四個氨基酸殘基的摩爾輸入率為約1∶1.2∶18∶6的YFAK。
結(jié)合測定法的結(jié)果在圖1-6中顯示。圖1顯示競爭測定法的結(jié)果，其中未-標(biāo)記的隨機共聚物RSP-001、RSP-002和RSP-003與RSP-006，其為生物素化的RSP-003競爭結(jié)合HLA-DQ8。圖2顯示利用競爭測定法獲得的與RSP-006競爭性結(jié)合HLA-DQ8的未-標(biāo)記隨機共聚物RSP-008(DAVE)、RSP-009(DATE)和RSP-010(DALE)的結(jié)果。圖3顯示利用競爭測定法獲得的CO-14(YFAK)的結(jié)果，由于其對HLA-DR分子的親和力而為最初的目的共聚物組合物。該圖表顯示對于非特異性對照正確的結(jié)果，并且顯示替換的隨機共聚物的量。圖4顯示生物素化的隨機共聚物RSP-004(生物素化的RSP-001)、RSP-005(生物素化的RSP-002)和RSP-006(生物素化的RSP-006)直接結(jié)合測定法的結(jié)果。獲自這些實驗的結(jié)果一致表明這些隨機共聚物以類似的親和力結(jié)合HLA-DQ8。
圖5和6為顯示這些隨機共聚物結(jié)合HLA-DR2蛋白的對照實驗。圖5為生物素化的隨機共聚物RSP-004、RSP-005和RSP-006的直接結(jié)合測定法。該結(jié)果表明這些隨機共聚物以約10的因數(shù)特異于HLA-DQ8。圖6顯示與CLIP(II類-相關(guān)的恒定鏈肽；Riberdy等.(1992)Nature 360(6403)474-7)競爭HLA-DR2的RSP-008(DAVE)、RSP-009(DATE)和RSP-010(DALE)的競爭測定法結(jié)果，CLIP以中等親和力結(jié)合不同的II類蛋白。這些結(jié)果表明這三種隨機共聚物中沒有一種可競爭生物素化的CLIP，得出結(jié)論為本發(fā)明的這些隨機共聚物的結(jié)合特異于HLA-DQ8。
對HLA-DQ8的解離常數(shù)Kd和“完整性”基于獲自對觀察到的數(shù)據(jù)模擬的曲線而計算。結(jié)果的概要在下述表3中顯示。“完整性”定義為缺乏競爭劑時RP-006肽的平均熒光和結(jié)合曲線達到實驗飽和的點之間的差異。完整性作為未標(biāo)記肽可競爭掉的生物素-標(biāo)記肽的熒光單位數(shù)而測量。觀察到每“類”隨機共聚物具有一致的“完整性”，提示共聚物的某些亞群可通過專一性結(jié)合那類共聚物，而因此不能被不同類的共聚物競爭掉的方式結(jié)合HLA蛋白。隨機共聚物的“類”包括共享例如相同的錨定殘基或可比較的氨基酸組成的結(jié)構(gòu)特征的共聚物組合物。觀察提示RP-006肽可更完全替代RSP-001、002和003，其為與RP-006同類的共聚物，但無法同樣有效地替代其他的共聚物如RSP-008、009或010。
另外，據(jù)計算隨機共聚物對HLA-DR2的解離常數(shù)為約10-20μg/ml，且因此比對HLA-DQ8的值大約10倍。
表3隨機共聚物結(jié)合HLA-DQ8
為了進一步通過結(jié)合測定法檢驗所選擇的共聚物以HLA-DQ限制性方式活化人T細(xì)胞的能力，共聚物與來自具有由等位基因DQA1*0501-DQB1*0201編碼的HLA-DQ2或由等位基因DQA1*03-DQB 1*0302等位基因編碼的HLA-DQ8的受試者的人PBMC溫育。產(chǎn)生的細(xì)胞系的限制因素可用抗-DR和抗-DQ抗體確定。
實施例2.肽結(jié)合到人II類MHC HLA-DQ8共聚物、肽和抗體。
利用固相技術(shù)(Barany，G，和R.Merrifield.1979.Academic Press，New York，NY)在Applied Biosystems肽合成器上合成肽并且通過反-相HPLC(RP-HPLC)純化。
“人源化”的糖尿病小鼠模型用于此處的研究中，其中該小鼠缺乏內(nèi)源性的II類基因但轉(zhuǎn)基因表達人HLA-DQ8和DR3蛋白。GAD65注射入這些轉(zhuǎn)基因小鼠，其因此用GAD65免疫。出現(xiàn)GAD65抗體后從小鼠脾臟和淋巴結(jié)純化HLA-DR3和DQ8和其來自GAD65的結(jié)合肽片段。分離獲得的合并的肽的并且檢驗從免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的T細(xì)胞對這些肽的應(yīng)答。確定在這些轉(zhuǎn)基因動物中GAD65肽是否通過DR和DQ蛋白呈遞，并且比較與每種蛋白有關(guān)的肽的序列以確定其是否為相同的或重疊的肽。此外，根據(jù)單和雙轉(zhuǎn)基因動物的比較確定是否一種II類MHC蛋白的存在影響與另一種蛋白有關(guān)的肽庫的呈遞。
利用允許微量和快速純化的BioCAD儀器完成這些MHC蛋白的純化。通過HPLC分離合并的肽并且通過利用產(chǎn)生自免疫轉(zhuǎn)基因小鼠脾和淋巴結(jié)的T細(xì)胞雜交瘤的IL-2產(chǎn)生或增殖測定法發(fā)現(xiàn)目的肽峰，隨后鑒定峰中肽。最后，合成鑒定的肽并且用其免疫小鼠以確定其是否為免疫原性的。
蛋白質(zhì)表達和純化。可溶的HLA-DQ分子在果蠅S2細(xì)胞中表達并且如所述進行純化(Kalandadze等.1996.J.Biol.Chem.27120156-20162)。細(xì)胞在26℃在補充有0-5％胎牛血清(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)的ExCell 401培養(yǎng)基的滾瓶中培養(yǎng)(JRH Biosciences，Lenexa，KS)。通過1mM CuSO4誘導(dǎo)后4-5天收集細(xì)胞。來自收集的細(xì)胞的上清依次通過A蛋白、G蛋白和A蛋白-LB3.1柱，隨后用50 mM3-[環(huán)己胺]-1-丙磺酸(CAPS)，pH 11.5洗脫結(jié)合的HLA-DR，并且用200mM磷酸鹽(pH 6.0)中和。蛋白質(zhì)濃縮于Centriprep 10膜上(Amicon，Beverly，MA)。
結(jié)合的共聚物的HPLC分離和微測序。每種結(jié)合的共聚物與未結(jié)合的材料分離并且如之前所述合并測序(Fridkis-Hareli，M.等.(1999)J.Immunol.1624697-4704)。簡要地，分離在帶有1040二極管陣列檢波器的Hewlett-Packard 1090 HPLC上利用ZorbaxC18 1.0mm反-相柱的小孔HPLC進行。用乙腈(0至10分鐘為0％，73分鐘為33％以及105分鐘為60％)中0.055％三氟乙酸(TFA)的梯度以54μl/min的流速洗脫共聚物。用于峰選擇、反相分離和Edman微測序的策略之前已有描述(Chicz，R.M.等.(1993)J.Exp Med.17827-47；Godkin等.(1997)Int.Immunol.9905-11)。合并的級分在惠普公司G1005A(PaloAlto，CA)的蛋白質(zhì)序列測定儀上利用廠商的規(guī)程3.5經(jīng)過自動的Edman降解。
結(jié)合II類MHC蛋白的肽的測定法用于該測定法的溶液為下列除非另作說明，結(jié)合緩沖液為20mM2-[N-嗎啉代]乙磺酸(MES)，140mM NaCl，0.05％NaN3，pH5.0；PBS為150mM氯化鈉，7.5mM Na2HPO4，2.5mM NaH2PO4，pH7.2；TBS為137mM氯化鈉，25mM Tris pH 8.0，2.7mM氯化鉀；TTBS為TBS加0.05％Tween-20。
添加樣品之前，免疫測定平皿(96-孔微量滴定，PRO-BINDTM，F(xiàn)alcon，Lincoln Park，NJ)用PBS中(總計100μl)1μg/孔親和-純化的LB3.1單克隆抗體在4℃包被18小時?？纂S后用TBS/3％牛血清白蛋白(BSA)37℃封閉1 h并且用TTBS洗滌三次。馬上添加樣品之前，添加50μl TBS/1％BSA至每孔。
通過50μl結(jié)合緩沖液中0.13μM終濃度的生物素化肽與未標(biāo)記的抑制劑(隨機共聚物或?qū)φ针?以及HLA-DQ分子在37℃共-孵育40h而進行抑制反應(yīng)。如下，利用鏈親和素-偶聯(lián)的堿性磷酸酶檢測結(jié)合的肽-生物素。平皿用TTBS洗滌三次并且與100μl鏈親和素-偶聯(lián)的堿性磷酸酶(1∶3000，BioRad，Richmond，CA)在37℃溫育1h，隨后添加三乙醇胺緩沖液中的對硝基苯磷酸(BioRad)。通過微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(model MR4000；Dynatech，Chantilly，VA)監(jiān)測410nm的吸光率。
使用技術(shù)用于洗脫自小規(guī)模純化的HLA-DQ8的肽的測序。從1g細(xì)胞分離來自HLA-DQ8蛋白的純化物。該研究中的標(biāo)準(zhǔn)為Priess細(xì)胞(HLA-DR4、HLA-DQ8純合的)。POROS免疫親和柱(BioCAD儀器)用于從20克細(xì)胞分離HLA-DQ8(以及HLA-DR4)。從1/20的該材料(與1g細(xì)胞等量)洗脫肽。
通過LC-MS-MS鑒定了混合物中總共79種肽序列(表3)。其中許多代表嵌套肽組。尤其源自I類MHC蛋白的一種肽以僅在肽N-或C-末端不同的10個不同序列存在。很容易鑒定該組中的核心。此代表了分離自HLA-DQ8蛋白并且鑒定的最大數(shù)目的肽，并且該臨界數(shù)目提供了如蛋白質(zhì)上P1和P9位點的所述部位分析的共有序列(參見表4)。在對HLA-DQ8(1，2)的兩個先前研究中，八個肽的序列報道在一個研究中，并且另一研究僅描述了肽庫測序。隨后使用該分析，以一克Priess細(xì)胞用于分離(1克為可獲自15-20只小鼠的脾臟的量)。該規(guī)模上很容易分離具有內(nèi)源性肽的HLA-DQ8蛋白復(fù)合物，并且很容易鑒定肽(表4)。該方法產(chǎn)生112種肽序列，比之前觀察到的多很多(Chicz等.(1994)Int.Immunol.61639-49；Godkin等.(1997)Int.Immunol.9905)。根據(jù)所述大量序列，有可能發(fā)展通過由等位基因DQA1*0501-DQB1*0201編碼的II類MHC HLA-DQ2或由等位基因DQA1*03-DQB1*0302等位基因編碼的II類MHC HLA-DQ8用于結(jié)合的共有序列。
表4.獲自Priess細(xì)胞制備物的肽序列(20克，1/20在LCMSMS上進行)
表5.獲自Priess細(xì)胞制備物的肽序列(1克制備物)
實施例3.肽序列分析發(fā)現(xiàn)洗脫的肽通常為酸性的，具有天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)令人驚奇的過度呈遞?？拷诵牡聂然┒耍碢9位具有E或D的肽的比對在表6中顯示。該比對中P1位酸性氨基酸的偏愛也很明顯，其超過在小鼠蛋白I-Ag7觀察到的(Suri等.(2002)J.Jmmunol.168(3)1235-43)。一個種類至另一個種類偏愛之間的區(qū)別可能對免疫識別特別重要。
表6.純合的Priess細(xì)胞系中獲自與HLA-DQ8復(fù)合的所選擇肽的序列比對
推測的P1和P9殘基為粗體。對大多數(shù)這些肽顯示可能的多個候選者。
實施例4.結(jié)合到小鼠II類MHC的肽分析利用分離自小鼠脾臟的I-Ag7，進行旨在獲得對小鼠II類MHC的類似分析的實驗。對公開的利用15只小鼠的脾臟的方法的改進得到少量高純度I-Ag7的分離物(Suri等.，(2002)J.Immunol.168(3)1235-43)。如上對人II類MHC蛋白所示進行分離、測序和分析以獲得小鼠的共有序列。如對HLA-DQ8一樣進行對I-Ag7分離和肽純化的顯微技術(shù)。上述實例用HLA-DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠和HLA-DR3/HLA-DQ8雙轉(zhuǎn)基因小鼠進行。還采用其中疾病更快速發(fā)展的BDC2.5 TCR，CD1d-/-小鼠(Shi等.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 986777-6782)。
實施例5.用于糖尿病治療的共聚物Copaxone對照為了開發(fā)可預(yù)防非-肥胖性糖尿病(NOD)小鼠中糖尿病發(fā)展的共聚物，此處表6中觀察到的P1和P9位點的共有序列氨基酸用作選擇氨基酸殘基的基礎(chǔ)，即選擇哪個氨基酸用于獲得具有隨機序列的共聚物。
NOD小鼠獲自Jackson實驗室，Bar Harbor，ME，并且用作實驗系統(tǒng)(Shi等.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 986777-6782)。這些小鼠在大約13-15周開始發(fā)展糖尿病并且約30周后獲得數(shù)據(jù)以獲得資料，如用于治療和未治療小鼠組比較的癥狀頻率。NOD小鼠在此用Copaxone治療，并且未治療動物和用Copaxone治療的動物之間未發(fā)現(xiàn)差異。該實驗中，10μg Copaxone一周三次注射入小鼠(相當(dāng)于體重比基礎(chǔ)上的人劑量)。還采用更高的劑量，33μg Copaxone小鼠一周三次。這些實驗檢驗了Copaxone不起作用的假設(shè)。
設(shè)計、合成并且檢驗基于表6中結(jié)合基序的新的共聚物。這些共聚物的組合物在此處的概要中給出。
實施例6.T細(xì)胞對隨機共聚物的記憶反應(yīng)NOD小鼠為廣泛研究的用于人胰島素-依賴型糖尿病的鼠模型。NOD小鼠中，表達I-Ag7，其為與HLA-DQ8共享結(jié)構(gòu)和肽-結(jié)合相似性，并且在小鼠中賦予對IDDM易感性的II類MHC分子。進行實驗以確定是否給予包含錨定殘基的半-隨機共聚物可致敏NOD小鼠以使該小鼠產(chǎn)生可通過體外T細(xì)胞測定法測量的T細(xì)胞應(yīng)答。
NOD/Ltj小鼠在第1天用50或250μg的RSP-001、RSP-002、RSP-003或RSP-010，單獨或與完全弗氏佐劑(CFA)一起通過在肩之間的皮下注射免疫。對于RSP-001、002和003，在第3、5、8、10和12天作為激發(fā)免疫重復(fù)相同的皮下注射。對于RSP-010，在第8天重復(fù)相同的注射。對照組動物用磷酸鈉緩沖液注射。在第15天，處死小鼠并且收集脾臟。用不同濃度的用來免疫的相同共聚物在體外再刺激脾細(xì)胞。對于再刺激的每個試驗組進行至少3份重復(fù)。在培養(yǎng)的第2天，添加氚化胸腺嘧啶至一式三份的孔，并且在第3天收集細(xì)胞以測量放射性的摻入，其顯示對抗原應(yīng)答的最初T細(xì)胞的增殖。
該實驗的結(jié)果在圖7-10中顯示。每個附圖顯示通過用RSP-001、002、003和010免疫的小鼠脾的脾細(xì)胞通過曾用于免疫小鼠的共聚物的3H胸苷摻入。這些實驗半-隨機共聚物RSP-001、RSP-002和RSP-003和隨機共聚物RSP-010(DALE)是免疫原性的，因為它們在來自先前暴露的小鼠T細(xì)胞中引起應(yīng)答。
實施例7.GAD65肽分析待獲得的資料涉及對于GAD肽通過與肽復(fù)合的DR3和DQ8蛋白呈遞到T細(xì)胞的了解，并且提供關(guān)于來自肽序列庫的DQ8結(jié)合基序的另外的信息。通過給予共聚物和/或自身抗原性肽而誘導(dǎo)對自身免疫病的耐受性是具有重大實際及理論意義的主題。鑒定源自GAD65并且通過DR和DQ蛋白呈遞的肽將允許設(shè)計基于氨基酸的人療法。
在此資料描述了分離的天然加工的肽，其結(jié)合HLA-DQ8。下一步工作將分析獲自Aβ/DQ3，DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟和淋巴結(jié)中HLA-DQ8和HLA-DR3蛋白的肽，該小鼠發(fā)展胰島炎并且用GAD65免疫或自發(fā)呈現(xiàn)GAD65自身反應(yīng)性。
免疫系統(tǒng)能辨別外源分子和內(nèi)源性的或“自身”細(xì)胞組分如蛋白質(zhì)。一旦識別外源分子，免疫系統(tǒng)招募各種細(xì)胞(例如B和T細(xì)胞)和分子的參與以產(chǎn)生合適的應(yīng)答而除去它們。當(dāng)對自身組分產(chǎn)生免疫應(yīng)答時出現(xiàn)自身免疫。通過T細(xì)胞識別的蛋白質(zhì)被裂解，例如蛋白酶解為小的片段(肽)，其隨后聯(lián)合主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子并且轉(zhuǎn)運至細(xì)胞表面。MHC分子的例子為HLA-DR4、DR3、由DQA1*0501-DQB1*0201等位基因編碼的HLA-DQ2或由DQA1*03-DQB1*0302等位基因編碼的HLA-DQ8，其中某些等位基因已證明與胰島素-依賴型糖尿病(IDDM)的更大風(fēng)險有關(guān)。IDDM被認(rèn)為是T細(xì)胞-介導(dǎo)的自身免疫病，其中T細(xì)胞破壞Langerhans胰島的胰島素-分泌β細(xì)胞。源自谷氨酸脫羧酶(GAD65)的肽，其為主要限于腦和胰島中發(fā)現(xiàn)的β細(xì)胞的酶，涉及該疾病的發(fā)病機理。
在此利用糖尿病的人源化小鼠模型，其中該小鼠缺乏內(nèi)源性的II類基因但轉(zhuǎn)基因表達人HLA-DQ8和DR3蛋白。GAD65注射入這些轉(zhuǎn)基因小鼠，其隨后被GAD65免疫。
利用以上用人B細(xì)胞系WT20和Priess細(xì)胞優(yōu)化的純化方法，微量純化的DR3和DQ8蛋白將用于獲得這些蛋白質(zhì)。應(yīng)用來自轉(zhuǎn)基因小鼠的材料而利用該方法。分離肽庫并且分析肽序列。從免疫轉(zhuǎn)基因小鼠的脾和淋巴結(jié)產(chǎn)生T細(xì)胞雜交瘤并且檢驗它們對這些肽的應(yīng)答。該材料很可能包含不同的肽。利用待獲自每個庫中一些肽的序列，從氨基酸序列數(shù)據(jù)鑒定GAD65肽。最后，合成鑒定的肽并且用以免疫小鼠以確定其是否為免疫原性的。
通過比較來自庫的肽氨基酸序列，GAD65肽通過DR3和DQ8蛋白呈遞至T細(xì)胞提供了有關(guān)DQ8結(jié)合基序的另外的信息。所獲的數(shù)據(jù)在此用于設(shè)計共聚物。源自GAD65并且通過DR和DQ蛋白呈遞的肽的最后鑒定可因此對人療法具有重要的實際影響。
IV.等價物上述共聚物、亞單位和其他組合物涉及的等價物以下所述材料，其以其他方式對應(yīng)于上述材料，并且具有與其相同的總體性質(zhì)(例如，生物相容的、抗腫瘤的)，其中取代基的一種或多種簡單改變并不負(fù)面地影響所述分子實現(xiàn)其預(yù)想目的的效力。通常，可通過例如下述常規(guī)反應(yīng)流程中舉例說明的方法，或通過其改進，利用很容易得到的起始材料、試劑和常規(guī)合成方法制備本發(fā)明的化合物。這些反應(yīng)中，也可以利用本身已知但未在此處提及的變體。
上述所有引用的參考文獻在此通過引用以其全文引入。
權(quán)利要求
1.共聚物組合物，包含具有至少兩個被7個氨基酸殘基分開的固定錨定殘基的半-隨機序列共聚物，其中(1)錨定殘基選自天冬氨酸殘基(D)和谷氨酸殘基(E)；(2)共聚物的剩余部分具有包含至少兩個氨基酸殘基的隨機序列，一個氨基酸選自以下各氨基酸殘基組(a)丙氨酸(A)或甘氨酸(G)；和(b)亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、甲硫氨酸(M)、蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)和半胱氨酸(C)；任選還包含脯氨酸(P)。
2.包含隨機-序列共聚物的共聚物組合物，其氨基酸組成包含至少四個不同的氨基酸殘基，其中至少一個氨基酸殘基選自以下各組(1)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；(2)亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和甲硫氨酸(M)；(3)蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)和半胱氨酸(C)；和(4)丙氨酸(A)和甘氨酸(G)；任選還包含脯氨酸(P)。
3.權(quán)利要求2的共聚物組合物，其中該共聚物為具有選自以下的氨基酸組成的四元共聚物(1)天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸(DALE)；(2)天冬氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、谷氨酸(DAIE)；(3)天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸、谷氨酸(DAVE)；(4)天冬氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、谷氨酸(DATE)；和(5)天冬氨酸、丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸(DASE)。
4.權(quán)利要求2的共聚物組合物，其中該共聚物為具有選自以下氨基酸組成的四元共聚物(1)天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、谷氨酸(DGLE)；(2)天冬氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、谷氨酸(DGIE)；(3)天冬氨酸、甘氨酸、纈氨酸、谷氨酸(DGVE)；(4)天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、谷氨酸(DGTE)；和(5)天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、谷氨酸(DGSE)。
5.隨機序列中包含以下氨基酸殘基的共聚物組合物(1)天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸和谷氨酸(DALE)；(2)天冬氨酸、丙氨酸、異亮氨酸和谷氨酸(DAIE)；(3)天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸和谷氨酸(DAVE)；或(4)天冬氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和谷氨酸(DATE)。
6.隨機序列中包含以下氨基酸殘基的共聚物組合物(1)天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸和谷氨酸(DGLE)；(2)天冬氨酸、甘氨酸、異亮氨酸和谷氨酸(DGIE)；(3)天冬氨酸、甘氨酸、纈氨酸和谷氨酸(DGVE)；或(4)天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和谷氨酸(DGTE)。
7.權(quán)利要求3或4的共聚物組合物，其中氨基酸殘基D∶A∶X∶E或D∶G∶X∶E的摩爾輸出率為約(1)1∶10∶3∶1；(2)1∶15∶3∶1；(3)1∶25∶15∶5；或(4)1∶3∶1.5∶0.2；其中X為L、I、V、S或T；其中摩爾輸出率的變化包括不同氨基酸之間約10％的范圍。
8.權(quán)利要求5或6的共聚物組合物，其中氨基酸殘基D∶A∶X∶E或D∶G∶X∶E的摩爾輸出率為約(1)1∶10∶3∶1；(2)1∶15∶3∶1；(3)1∶25∶15∶5；或(4)1∶3∶1.5∶0.2；其中X為L、I、V或T；其中摩爾輸出率的變化包括不同氨基酸之間約10％的范圍。
9.權(quán)利要求3或4的共聚物組合物，其中氨基酸殘基D∶A∶X∶E或D∶G∶X∶E的摩爾輸入率為約(1)1∶5∶3∶1；(2)1∶25∶15∶5；或(3)1∶1∶1.5∶0.2其中X為L、I、V、S或T。
10.權(quán)利要求5或6的共聚物組合物，其中氨基酸殘基D∶A∶X∶E或D∶G∶X∶E的摩爾輸入率為約(1)1∶5∶3∶1；(2)1∶25∶15∶5；或(3)1∶1∶1.5∶0.2其中X為L、I、V或T。
11.權(quán)利要求3或4的共聚物組合物，其中該共聚物還包括另外的氨基酸殘基，該殘基在對HLA-DQ蛋白特異性的自身身抗原性肽中發(fā)現(xiàn)。
12.權(quán)利要求11的共聚物組合物，其中該另外的氨基酸殘基為賴氨酸殘基(K)。
13.權(quán)利要求1至12之一的共聚物組合物，其中該共聚物功能性地結(jié)合MHC蛋白HLA-DQ。
14.權(quán)利要求1至13之一的共聚物組合物，其中該共聚物包括30至70個氨基酸殘基。
15.權(quán)利要求14的共聚物組合物，其中該共聚物包括約50個氨基酸殘基。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15之一的共聚物組合物，其中該共聚物通過固相化學(xué)合成。
17.共聚物組合物，包含具有至少三個不同氨基酸殘基的隨機-或半-隨機序列共聚物，其中至少一個氨基酸殘基為天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基，其中該共聚物功能性地結(jié)合II類MHC蛋白HLA-DQ。
18.權(quán)利要求13的共聚物組合物，其中該HLA-DQ與自身身免疫病有關(guān)。
19.權(quán)利要求18的共聚物組合物，其中該自身身免疫病為胰島素-依賴型糖尿病或脂瀉病。
20.權(quán)利要求13的共聚物組合物，其中HLA-DQ與不需要的免疫應(yīng)答有關(guān)。
21.權(quán)利要求13的共聚物組合物，其中HLA-DQ與過敏癥有關(guān)。
22.權(quán)利要求13的共聚物組合物，其中HLA-DQ與能通過給予該共聚物組合物而治療的疾病有關(guān)。
23.權(quán)利要求13的共聚物組合物，其中HLA-DQ為HLA-DQ2(等位基因DQA1*0501-DQB1*0201的組合)或HLA-DQ8(等位基因DQA1*03-DQB1*0302的組合)。
24.用于自身免疫疾病治療自身免疫病的藥物組合物，包含藥學(xué)有效量的共聚物組合物，該共聚物組合物包含功能性地結(jié)合與自身免疫病有關(guān)的HLA-DQ分子的共聚物，以及藥學(xué)可接受載體和/或賦形劑。
25.權(quán)利要求24的藥物組合物，其中該共聚物組合物為權(quán)利要求18的共聚物組合物。
26.權(quán)利要求25的藥物組合物，進一步包含另外的治療活性劑。
27.權(quán)利要求26的藥物組合物，其中該另外的治療活性劑為與自身免疫病有關(guān)的第二種HLA分子結(jié)合的第二種共聚物組合物。
28.權(quán)利要求27的藥物組合物，其中第二種HLA分子為HLA-DQ分子。
29.權(quán)利要求27的藥物組合物，其中第二種HLA分子為HLA-DR分子。
30.權(quán)利要求24至29之一的藥物組合物，其中該自身免疫病為糖尿病或脂瀉病。
31.權(quán)利要求26的藥物組合物，其中該另外的治療活性劑為胰島素。
32.權(quán)利要求26的藥物組合物，其中該另外的治療活性劑為一種或多種免疫抑制劑。
33.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中該免疫抑制劑為(1)藥物，選自雷帕霉素；皮質(zhì)類固醇；硫唑嘌呤；麥考酚酸嗎啉乙酯；環(huán)孢素；環(huán)磷酰胺；氨甲喋呤；6-巰基嘌呤；FK506；15-脫氧精胍菌素；鞘氨醇-1-磷酸鹽(S1P)激動劑；FTY720(2-氨基-1，3-丙二醇；2-氨基-2[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1，3-二醇鹽酸鹽)；米托蒽醌；6-(3-二甲基-氨丙酰基)福斯克林；和脫甲基免疫霉素；或(2)蛋白質(zhì)，選自hul 124；BTI-322；allotrap-HLA-B270；OKT4A；Enlimomab；ABX-CBL；OKT3；ATGAM；basiliximab；daclizumab；胸腺球蛋白；ISAtx247；Medi-500；Medi-507；Alefacept；efalizumab；infliximab；和干擾素。
34.用于治療不需要的免疫應(yīng)答的藥物組合物，包含藥學(xué)有效量的共聚物組合物，所述共聚物組合物包含功能性地結(jié)合與不需要的免疫應(yīng)答有關(guān)的HLA-DQ分子的共聚物，以及藥學(xué)可接受載體和/或賦形劑。
35.權(quán)利要求34的藥物組合物，其中該共聚物組合物為權(quán)利要求20的共聚物組合物。
36.用于治療過敏癥的藥物組合物，包含藥學(xué)有效量的共聚物組合物，所述共聚物組合物包含功能性地結(jié)合與過敏癥有關(guān)的HLA-DQ分子的共聚物，以及藥學(xué)可接受載體和/或賦形劑。
37.權(quán)利要求36的藥物組合物，其中該共聚物組合物為權(quán)利要求21的共聚物組合物。
38.藥物組合物，用于治療通過給予共聚物組合物能治療的疾病，包含藥學(xué)有效量的共聚物組合物，所述共聚物組合物包含功能性地結(jié)合與通過給予該共聚物組合物能治療的疾病有關(guān)的HLA-DQ分子的共聚物，以及藥學(xué)可接受載體和/或賦形劑。
39.權(quán)利要求37的藥物組合物，其中該共聚物組合物為權(quán)利要求22的共聚物組合物。
40.用于治療自身免疫病的方法，包括給予患有自身免疫病的受試者治療有效量的共聚物組合物，所述共聚物組合物包含結(jié)合與自身免疫病有關(guān)的HLA-DQ分子的一種或多種隨機序列共聚物。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述共聚物組合物為權(quán)利要求18的共聚物組合物。
42.權(quán)利要求41的方法，進一步包括給予第二種治療活性劑。
43.權(quán)利要求42的方法，其中第二種治療活性劑是結(jié)合到與所述自身免疫病有關(guān)的第二種HLA分子的第二種共聚物組合物。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述的第二種HLA分子為HLA-DQ分子。
45.權(quán)利要求43的方法，其中所述的第二種HLA分子為HLA-DR分子。
46.權(quán)利要求40至45之一的方法，其中所述自身免疫病選自糖尿病和脂瀉病。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中該糖尿病選自前-糖尿病、胰島素-依賴型糖尿病(I型)和II型糖尿病。
48.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中該糖尿病為胰島素-依賴型糖尿病(I型)。
49.根據(jù)權(quán)利要求40至48之一的方法，其中給予共聚物是通過注射提供共聚物。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中注射位點選自靜脈內(nèi)(i.v.)、皮下(s.c.)、肌內(nèi)(i.m.)和腹膜內(nèi)(i.p.)。
51.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中給予共聚物是提供靜脈內(nèi)輸液。
52.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，進一步包括，給予共聚物后，觀察糖尿病或脂瀉病的生理參數(shù)。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中參數(shù)為降低的游離血糖、提高的血液胰島素、提高的胰腺胰島素、增加的胰腺質(zhì)量和增加的β胰島細(xì)胞數(shù)目。
54.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，進一步包括給予共聚物后，觀察糖尿病發(fā)作頻率的降低或糖尿病發(fā)作嚴(yán)重程度的降低。
55.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中該藥劑為胰島素。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所給胰島素的量小于給予共聚物之前給予受試者的量。
57.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中該藥劑為免疫抑制劑。
58.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中該藥劑為(1)藥物，選自雷帕霉素；皮質(zhì)類固醇；硫唑嘌呤；麥考酚酸嗎啉乙酯；環(huán)孢素；環(huán)磷酰胺；氨甲喋呤；6-巰基嘌呤；FK506；15-脫氧精胍菌素；鞘氨醇-1-磷酸鹽(S1P)激動劑；FTY720(2-氨基-1，3-丙二醇；2-氨基-2[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1，3-二醇鹽酸鹽)；米托蒽醌；2-氨基-1，3-丙二醇；6-(3-二甲基-氨丙酰基)福斯克林；和脫甲基免疫霉素；或(2)蛋白質(zhì)，選自hul 124；BTI-322；allotrap-HLA-B270；OKT4A；Enlimomab；ABX-CBL；OKT3；ATGAM；basiliximab；daclizumab；胸腺球蛋白；ISAtx247；Medi-500；Medi-507；Alefacept；efalizumab；infliximab；和干擾素。
59.權(quán)利要求40至58之一的方法，其中受試者為人。
60.權(quán)利要求40至58之一的方法，其中受試者為嚙齒類。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中受試者為非-肥胖性糖尿病(NOD)小鼠或鏈脲霉素-誘發(fā)的糖尿病小鼠。
62.用于治療不需要的免疫應(yīng)答的方法，包括給予患有不需要的免疫應(yīng)答的受試者治療有效量的共聚物組合物，所述共聚物組合物包含結(jié)合與不需要的免疫應(yīng)答有關(guān)的HLA-DQ分子的一種或多種隨機序列共聚物。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述共聚物組合物為權(quán)利要求20的共聚物組合物。
64.用于治療過敏癥的方法，包括給予患有過敏癥癥狀的受試者治療有效量的共聚物組合物，所述共聚物組合物包含結(jié)合與過敏癥有關(guān)的HLA-DQ分子的一種或多種隨機序列共聚物。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述共聚物組合物為權(quán)利要求21的共聚物組合物。
66.用于治療通過給予共聚物組合物能治療的疾病的方法，包括給予患有該疾病的受試者治療有效量的共聚物組合物，所述共聚物組合物包含結(jié)合與該疾病有關(guān)的HLA-DQ分子的一種或多種隨機序列共聚物。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述共聚物組合物為權(quán)利要求22的共聚物組合物。
68.用于預(yù)防性治療處于發(fā)展自身免疫病風(fēng)險中的受試者的方法，包括給予權(quán)利要求18的共聚物，其中自身免疫病的發(fā)作被延緩或阻止自身免疫疾病。
69.權(quán)利要求68的方法，進一步包括結(jié)合與所述自身免疫病有關(guān)的第二種HLA分子的第二種共聚物。
70.權(quán)利要求69的方法，其中所述的第二種HLA分子為HLA-DQ分子。
71.權(quán)利要求69的方法，其中所述的第二種HLA分子為HLA-DR分子。
72.權(quán)利要求68至71之一的方法，其中所述自身免疫病選自I型糖尿病和脂瀉病。
73.預(yù)防患有前-糖尿病的受試者中糖尿病發(fā)展的方法，該方法包括給予受試者權(quán)利要求1-18之一和25-33之一的組合物，由此預(yù)防糖尿病的發(fā)展。
74.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中受試者或受試者家屬相比不患有該病情的對照受試者，具有高血糖或高自身抗體水平。
75.治療胰島移植的受試者受體的方法，該方法包括給予受試者根據(jù)權(quán)利要求1-18之一和25-33之一的組合物。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中在胰島移植之前給予該組合物。
77.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中在胰島移植之后給予該組合物。
78.根據(jù)權(quán)利要求73至77之一的方法，進一步包括觀察受試者的生理參數(shù)。
79.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中參數(shù)選自游離血糖、血液胰島素、胰腺胰島素、胰腺質(zhì)量和β胰島細(xì)胞數(shù)目。
80.用于預(yù)防性治療處于發(fā)展不需要的免疫應(yīng)答風(fēng)險中的受試者的方法，包括給予權(quán)利要求19的共聚物，其中不需要的免疫應(yīng)答的發(fā)作被延緩或阻止。
81.用于預(yù)防性治療處于發(fā)展過敏癥風(fēng)險中的受試者的方法，包括給予權(quán)利要求21的共聚物，其中過敏反應(yīng)的發(fā)作被延緩或阻止。
82.用于通過給予權(quán)利要求22的共聚物而預(yù)防性治療處于發(fā)展通過給予權(quán)利要求22共聚物能治療的疾病風(fēng)險中的受試者的方法，其中不需要的免疫應(yīng)答的發(fā)作被延緩或阻止。
83.用于鑒定對治療HLA-DQ介導(dǎo)的自身免疫病治療有效的共聚物的方法，包括(a)合成選自以下的氨基酸的隨機共聚物(1)疏水的，脂肪族殘基(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸)(2)酸性殘基(天冬氨酸、谷氨酸)(3)小的親水殘基(絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸)(4)小的脂肪族殘基(丙氨酸、甘氨酸)和(5)脯氨酸(b)測定所述共聚物與HLA-DQ分子的結(jié)合；(c)將所述共聚物與所述HLA-DQ分子的結(jié)合和已知的自身抗原性肽與所述HLA-DQ的結(jié)合相比較；(d)選擇基本上比所述已知的自身抗原性肽更強烈結(jié)合所述HLA-DQ分子的所述共聚物；和(e)測定由呈遞所述共聚物的所述HLA-DQ分子調(diào)節(jié)的T-輔助細(xì)胞的活化。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述自身抗原性肽選自(1)包含人胰島素氨基酸殘基9-23的肽；(2)包含人GAD氨基酸殘基206-220的肽；和(3)包含人HSP60氨基酸殘基441-460的肽。
85.權(quán)利要求84的方法，其中所述HLA-DQ分子選自DQA1*03-DQB*0302、DQA1*0501-DQB*0201、HLA-DQA1*0501-DQB1*0201和HLA-DQA1*03-DQB 1*0302之間的反式二聚體、DQA1*03/B1*0302、DQB1*0201/DQA1*0501、DQB1*0201和DQA1*03。
86.權(quán)利要求83至85之一的方法，其中該共聚物為生物素化的。
87.權(quán)利要求83至85之一的方法，其中該共聚物為用FITC標(biāo)記的。
88.權(quán)利要求83至87之一的方法，其中該共聚物能結(jié)合II類MHC小鼠蛋白IAg7。
89.用于制造自身免疫疾病治療自身免疫病的藥物的方法，包括配制用于給予患有自身免疫病受試者的權(quán)利要求1至23之一的共聚物組合物。
90.用于制造治療胰島素-依賴型糖尿病(IDDM)或脂瀉病的藥物的方法，包括配制用于給予患有IDDM或脂瀉病受試者的權(quán)利要求權(quán)利要求19的共聚物組合物。
91.用于制造治療不需要的免疫應(yīng)答的藥物的方法，包括配制用于給予患有不需要的免疫應(yīng)答受試者的權(quán)利要求20的共聚物組合物。
92.用于制造治療過敏癥的藥物的方法，包括配制用于給予患有過敏癥受試者的權(quán)利要求21的共聚物組合物。
93.用于制造治療通過給予權(quán)利要求22的共聚物組合物治療的疾病的藥物的方法，包括配制用于給予患有該疾病的受試者的共聚物組合物。
94.用于治療糖尿病受試者的試劑盒，包含具有根據(jù)權(quán)利要求5、6、8、10或19之一的氨基酸隨機序列的共聚物和容器。
95.權(quán)利要求94的試劑盒，進一步包括使用說明書。
96.權(quán)利要求94的試劑盒，其為單位劑量的。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療自身免疫病和其他不需要的免疫反應(yīng)的方法和組合物，包括給予結(jié)合一種或多種HLA－DQ分子并且調(diào)節(jié)DQ－限制性T細(xì)胞應(yīng)答的共聚物。該共聚物為氨基酸的隨機共聚物和包含錨定殘基而易于結(jié)合DQ結(jié)合袋的共聚物。
文檔編號A61K38/02GK101014355SQ200580014016
公開日2007年8月8日 申請日期2005年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月1日
發(fā)明者凱·W·武赫爾芬尼希, 詹姆斯·拉斯穆森, 于北, 埃里克·扎內(nèi)利, 杰克·L·施特羅明格 申請人:肽免疫公司, 哈佛學(xué)院主席及同事