專利名稱：自身免疫的增強方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過給予特殊活性成分的增強自身免疫的新方法、該活性成分的制造方法、以及配合有該活性成分的化妝材料，其中所述的特殊活性成分是由江籬屬紅藻類(Gracilaria sp.)為原料得到的，其不會由于熱處理而導(dǎo)致其糖結(jié)合性消失，顯示出良好的識別糖鏈的選擇性和激活細胞性免疫能力等的自身免疫增強活性。
背景技術(shù)：
由于紅細胞凝集素對各種動物的紅細胞顯示出特異的行為，因而被廣泛用作醫(yī)療、制藥、生物化學(xué)等領(lǐng)域的檢查用試劑或分離用材料。該紅細胞凝集素可大致區(qū)分為來源于動物和植物的紅細胞凝集素，但從可大量獲得、處理方便等方面考慮，來源于植物的紅細胞凝集素在實際應(yīng)用上正日益受到關(guān)注。
迄今為止，作為這些來源于植物的紅細胞凝集素，已知有作為陸生植物來源的馬蠶豆的刀豆球蛋白A(Con A)和小麥來源的小麥胚芽植物凝血素(WGA)等(參閱J.Bacteriol，1936年，第32卷，第227～237頁)，作為海洋植物來源的來自龍須菜(Gracilaria verrucosa)的GAVI、來自日本沙菜(Hypneajaponica)的Hypnin A、B、C和D(參閱Bul.Jap.Soc.Sci.Fishe.，1981年，第47卷，第1079～1084頁)等。
但是，盡管來源于陸生植物的紅細胞凝集素能夠容易地得到凝集活性較高的樣品，但是其紅細胞凝集的活性由于也受到諸如單糖類或二糖類之類的單純的糖的抑制，因而存在識別糖鏈的選擇性低的缺點。而盡管來源于海洋植物的紅細胞凝集活性不會受到單糖類或二糖類的抑制，但是其受到像胎球蛋白、脫唾液胎球蛋白之類的糖蛋白質(zhì)的抑制，因而雖然可以認為具有較高的識別糖鏈的選擇性，但是卻存在難以得到凝集活性高的樣品的缺點。兩者還都存在不能通過離子濃度的變化來控制凝集活性的缺點。
通常存在由于對紅細胞凝集素在100℃進行熱處理，而導(dǎo)致其糖結(jié)合能力喪失的缺點。
在紅細胞凝集素相對于細胞的生物活性中，可以列舉具有劃時代意義的與淋巴細胞的反應(yīng)。如果將淋巴細胞與非常低濃度的紅細胞凝集素一起培養(yǎng)，可以使淋巴細胞增殖、分裂。像這樣在靜止期內(nèi)引起淋巴細胞發(fā)生成長·增殖狀態(tài)的觸發(fā)效果被稱為促分裂原刺激，它是一種對異物(抗原)的生物體免疫反應(yīng)的關(guān)鍵性重要現(xiàn)象。促分裂原刺激功能是激活細胞性免疫能力功能中的一種，并且是紅細胞凝集素的自然免疫活性增強的指標。
主要可被用作促分裂原的紅細胞凝集素為刀豆球蛋白A(Con A)、菜豆凝集素P(PHA-P)、菜豆凝集素L(PHA-L)、美洲商陸凝集素(PWM)等，將它們與淋巴細胞一起培養(yǎng)48～72小時，通過測定在DNA中所吸收的標識胸苷的增加率進行檢定。
由于具有促分裂原能力的紅細胞凝集素與細胞的抗原特異性并無關(guān)系，并且能夠活化幾乎所有能夠被活化的淋巴細胞，因而可以容易的跟蹤、研究由細胞增殖所產(chǎn)生的變化。此外，已知紅細胞凝集素還能夠使T淋巴細胞誘導(dǎo)細胞傷害活性。由于被誘導(dǎo)的T細胞的細胞傷害活性是抗原非特異性的，因而可以對各種正常細胞和惡化細胞發(fā)揮作用。
這樣，由于紅細胞凝集素所產(chǎn)生的促分裂原活化的使用簡單、容易，因而常被用作判斷患有包含AIDS等各種疾病的患者免疫能力的方法。并且也常被用于研究各種免疫抑制效果和免疫療法的效果的目的。最近，在癌癥新療法LAK療法中的淋巴細胞分裂促進劑正日益引起人們的注意。
紅細胞凝集素(由蛋白質(zhì)形成的紅細胞凝集素通常被稱為凝集素)具有對糖鏈的特異性的識別、結(jié)合能力。這種性質(zhì)，在作為促分裂原向生物體內(nèi)直接給藥或者向皮膚經(jīng)皮給藥時，能夠識別細胞表層糖鏈，因而和不具有糖鏈結(jié)合能力的促分裂原(例如脂多糖等)相比，被認為能夠通過與細胞表層的糖鏈結(jié)合接近細胞表層，從而更有效地發(fā)揮促分裂原的功能。
但是，由于具有這些促分裂原能力的紅細胞凝集素的主要成分為蛋白質(zhì)，如果在高溫(約100℃)下熱處理或者在40～50℃溫度下長時間放置，就會喪失糖結(jié)合能力，因而在向生物體內(nèi)給藥時與其它藥劑的合并、以及在用于皮膚涂布的乳劑或軟膏時與其它成分的合并難免受到限制。因此，需要能夠在熱處理之后能夠保持糖鏈結(jié)合能力的具有促分裂原能力的紅細胞凝集素，本發(fā)明者首先提出了一種從江蘺屬紅藻類提取高活性紅細胞凝集素的方法(日本專利申請?zhí)亻_平7-278004號公報)。但是，其高活性紅細胞凝集素具有像增強自身免疫能力這樣的生理活性，迄今為止都是未知的。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述情況，本發(fā)明的目的在于，提供一種通過給予特殊活性成分增強自身免疫的新方法，所述的特殊活性成分具有不會由于加熱而導(dǎo)致其糖結(jié)合性消失，顯示出良好的識別糖鏈的選擇性以及激活細胞性免疫能力等的自身免疫增強活性。
本發(fā)明者針對來源于植物的，特別是來源于海洋植物的紅細胞凝集素反復(fù)進行了各種研究，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在特定條件下從江蘺屬紅藻類(Gracilariasp.)中提取的紅細胞凝集素，除了凝集活性高并且識別糖鏈的選擇性高，而且還可以通過改變離子濃度控制凝集活性，不會由于加熱而導(dǎo)致其糖結(jié)合性消失，顯示出良好的識別糖鏈的選擇性以及激活細胞性免疫能力等的自身免疫增強活性，基于上述發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供了一種通過給予以使用鹽類水溶液從江蘺屬紅藻類(Gracilaria sp.)提取的液態(tài)提取物為有效成分的活性成分增強自身免疫活性的新方法、自身免疫增強成分的制備方法以及配合該自身免疫增強成分的化妝品，其中制備方法的特征在于，向使用鹽類水溶液從江蘺屬紅藻類(Gracilaria sp.)提取的提取液中，通過加入硫酸銨使最終濃度達到20～40％飽和濃度進行第一階段的鹽析，除去所沉淀的雜質(zhì)，然后通過進一步加入硫酸銨使最終濃度達到60～80％飽和濃度進行第二階段的鹽析，分離沉淀形式的粗活性級分，通過使用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙獬恋淼玫揭后w粗活性級分，進一步根據(jù)需要，通過在100℃進行1～10分鐘的熱處理除去雜質(zhì)蛋白質(zhì)，接著通過凝膠過濾色譜分離得到分子量為100,000或100,000以上的級分，然后通過色譜分離、純化該成分，收集顯示激活細胞免疫能力的活性的級分。
上述硫酸銨的飽和濃度為基于Green，A.A.& Hughes，W.L.著(1955年)《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology)，第1卷，第67～90頁所述的“結(jié)晶硫酸銨的添加量與濃度(％飽和)的關(guān)系表”所規(guī)定的濃度。
作為本發(fā)明所使用的增強自身免疫的成分是通過下述過程得到的液體，其中所述過程為例如在使用鹽類水溶液從江蘺屬紅藻類(Gracilaria sp.)提取的提取液中，加入硫酸銨使最終濃度達到20～40％飽和濃度以進行第一階段的鹽析，除去所沉淀的雜質(zhì)，然后通過進一步加入硫酸銨使最終濃度達到60～80％飽和濃度以進行第二階段的鹽析，回收沉淀形式的粗活性級分，通過使用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙獬恋淼玫揭后w粗活性級分，進一步根據(jù)需要，通過在100℃進行1～10分鐘的熱處理除去雜質(zhì)蛋白質(zhì)，接著通過凝膠過濾色譜分離分子量為100,000或100,000以上的級分，進一步通過色譜進行分離、純化，收集顯示激活細胞性免疫能力的活性的級分。
作為此時使用的鹽類水溶液，是例如生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、Tris鹽酸緩沖液或者在其中添加了選自氯化鈉、氯化鉀、硫酸鋅、氯化鋅、2-巰基乙醇和二硫代蘇糖醇中的至少一種的液體等，特別優(yōu)選磷酸緩沖液、Tris鹽酸緩沖液或者其中添加了選自氯化鈉、氯化鉀、硫酸鋅以及2-巰基乙醇的至少一種的液體。
上述得到的液體包含以糖為主成分的紅細胞凝集素。作為這種糖，構(gòu)成糖的單糖中的半乳糖的比例為70～100％，優(yōu)選90～100％。當(dāng)在本發(fā)明的自身免疫增強方法中使用上述液體時，除糖之外，還可以含有相對于糖質(zhì)量，蛋白質(zhì)質(zhì)量為0.4或0.4以下的蛋白質(zhì)。
并且，可以使用半乳糖作為標準品，通過苯酚硫酸法進行糖的定量；可以使用牛血清白蛋白作為標準品，通過Lowry法進行蛋白質(zhì)的定量。
作為這時的原料，可以使用江蘺屬紅藻類，優(yōu)選龍須菜(Gracilariaverrucosa)、繩龍須菜(Gracilaria chorda)、它們的亞種。本發(fā)明中的江蘺屬紅藻類(Gracilaria sp.)包括被分類為(1)江蘺屬紅藻類(Gracilaria sp.)的海藻，或者(2)被分類為Gracilariopsis sp.的海藻、或者(3)過去被分類為Gracilariopsis sp.的海藻。
例如，在日本產(chǎn)海藻中，江蘺屬紅藻類(Gracilaria sp.)包含非專利文獻《新日本海藻志日本產(chǎn)海藻類總覽》，吉田忠生著，內(nèi)田老鶴圃發(fā)行，1998年版中的被分類為江蘺目(Gracilariales)江蘺科(Gracilariaceae)的海藻。
這些紅藻類在寒水海洋也有分布，但是特別是在暖水海洋中分布較多，在日本，幾乎全部的海岸地帶都有分布，通常被用作瓊脂的補充物或在食品中應(yīng)用等。
為了適當(dāng)?shù)刂圃毂景l(fā)明所使用的自身免疫增強成分，依次在上述紅藻類原料中實施(1)提取水溶性級分的步驟、(2)分離粗活性級分的步驟、以及根據(jù)需要(3)純化凝集素的步驟。
如果對上述各個步驟進行進一步的詳細說明，包括首先在步驟(1)中，在紅藻類的原料中加入含有鹽類水溶液，例如生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、Tris鹽酸緩沖液或者在其中添加了選自氯化鈉、氯化鉀、硫酸鋅、氯化鋅、2-巰基乙醇和二硫代蘇糖醇中的至少一種的液體，優(yōu)選磷酸鹽緩沖液、Tris鹽酸緩沖液或者其中添加了選自氯化鈉、氯化鉀、硫酸鋅以及2-巰基乙醇中的至少一種的液體勻漿化后，進行離心分離，得到作為上清液的粗提取液。
其次在步驟(2)中，在步驟(1)所得到的提取液中，首先通過加入硫酸銨使最終濃度達到20～40％飽和濃度以進行第一階段的鹽析，通過離心分離處理除去所生成的沉淀。通過這一操作，除去作為沉淀級分的色素等雜質(zhì)。其次，通過在離心分離處理得到的上清液中加入硫酸銨使最終濃度達到60～80％飽和濃度以進行第二階段的鹽析，通過離心分離處理分離所生成的沉淀，然后使用含有氯化鈉的磷酸緩沖液等緩沖液再溶解該沉淀級分，并根據(jù)需要，通過相對于含有氯化鈉的磷酸緩沖液等緩沖液的透析進行純化得到粗活性級分。該粗活性級分可直接用于本發(fā)明的自身免疫增強方法。
可以根據(jù)需要，對該粗活性級分進一步進行步驟(3)。在步驟(3)中，通過對上述步驟(2)中所得到的粗活性級分在100℃進行1～10分鐘的熱處理以除去沉淀的雜質(zhì)蛋白質(zhì)，然后通過凝膠過濾色譜分離得到分子量為10萬或10萬以上的級分，進而通過色譜分離該成分，得到純化紅細胞凝集素。這時，作為在最后階段所使用的色譜，使用離子交換色譜、凝膠過濾色譜、疏水性相互作用色譜、或它們的組合是有利的。
其中所謂的分子量10萬或10萬以上的級分，是指在凝膠過濾色譜中，使用球形蛋白質(zhì)作為標準分子量物質(zhì)，計算出洗脫級分的分子量的結(jié)果為相當(dāng)于10萬或10萬以上分子量的級分。
為了適當(dāng)?shù)刂圃毂景l(fā)明所使用的自身免疫增強成分，將0.1ml具有促分裂原能力的紅細胞凝集素純化樣品加入到TSK凝膠G3000 PWXL柱中，在凝膠過濾色譜過程中，從凝膠過濾色譜柱按照每次0.1ml收集洗脫級分。這時，作為標準分子量物質(zhì)，使用甲狀腺球蛋白(分子量669000)、鐵蛋白(分子量440000)、牛血清白蛋白(分子量67000)、卵白蛋白(分子量43000)。由其結(jié)果可知，具有顯示下述級分的凝集活性的峰的頂點相當(dāng)于分子量5.64×105，其中所述級分是具有促分裂原能力的紅細胞凝集素的洗脫級分(紅細胞凝集活性的級分)。
通過這樣得到的本發(fā)明所使用的自身免疫增強成分進一步具有下述各項的特征(1)具有使用鏈霉蛋白酶處理的羊紅細胞凝集的性質(zhì)，且該凝集活性不受單糖類或二糖類的抑制，但受到胎球蛋白、脫唾液胎球蛋白的抑制，(2)對兔紅細胞的凝集活性隨離子濃度的變化而變化，(3)在使用球形蛋白質(zhì)作為標準分子量物質(zhì)時的凝集過濾色譜中，洗脫為相當(dāng)于分子量100,000或100,000以上的級分，(4)具有激活細胞免疫能力的活性，(5)在100℃經(jīng)過10分鐘的熱處理后也具有糖鏈結(jié)合活性，(6)具有使人淋巴細胞幼稚化的活性，(7)促進氚標記的胸苷向細胞核中的吞噬(取り込み)。
本發(fā)明所使用的自身免疫增強成分是來源于紅藻類的新成分，并可通過離子濃度控制凝集活性，具有優(yōu)良的識別糖鏈的選擇性，具有激活細胞性免疫能力等自身免疫增強活性，且在100℃溫度下進行熱處理10分鐘之后仍然具有糖結(jié)合活性的優(yōu)點。
實施本發(fā)明的最佳方式下面，通過實施例對用于實施本發(fā)明的最佳方式進行說明，但是本發(fā)明并不限于這些實例。
實施例1(1)水溶性級分的提取步驟使用0.15M的氯化鈉水溶液將繩龍須菜(ツルシラモ)(日本德島縣吉野川河口域產(chǎn))洗滌干凈后，以陽光干燥得到干燥物。在100g該干燥物中加入700ml含有0.15M氯化鈉的100mM的磷酸緩沖溶液(pH6.9)進行勻化，然后將該勻化液在4℃溫度下放置6小時，通過離心分離得到上清液的粗提取液。
(2)粗活性成分的分離步驟接著，在該粗提取液中加入硫酸銨使最終濃度達到35％飽和濃度以進行第一階段的鹽析。在硫酸銨的添加結(jié)束后，在4℃溫度下放置1小時，通過離心分離除去生成的沉淀。在該操作中，色素等雜質(zhì)作為沉淀級分被除去。接著，在離心分離得到的上清液中，加入硫酸銨使最終的濃度達到70％的飽和濃度，添加結(jié)束后，在4℃溫度下放置1晚。通過離心分離將所生成的沉淀分離。將所得到的沉淀級分再次用包含0.15M氯化鈉的100mM的磷酸緩沖液(pH 6.9)溶解，得到粗活性級分。所得到的粗活性級分相對于兔紅細胞的紅細胞凝集活性為256單位，比活性為3372.9單位/mg蛋白質(zhì)，活性回收率為62.4％。其中，凝集活性的單位定義為能夠檢測出凝集活性的樣品的最大稀釋率的倒數(shù)。其結(jié)果如表5所示。
(3)凝集素的純化步驟然后，對這樣得到的粗活性級分在100℃溫度下熱處理10分鐘，通過離心分離除去不溶性的雜質(zhì)蛋白質(zhì)后，使用凝膠過濾色譜分離分子量為10萬或10萬以上的級分，使用TSK gel DEAE-5 PW的離子交換色譜進行分離，得到純化樣品。相對于兔紅細胞顯示出紅細胞凝集活性的所得純化樣品的最小蛋白質(zhì)濃度為0.8763μg/ml。由上述結(jié)果可知，通過本發(fā)明的自身免疫增強方法，可以有效地得到保持其活性的來源于紅藻類的紅細胞凝集素。
針對純化標準品，進行相對于兔紅細胞的凝集活性的離子濃度依存性試驗，在0.15M氯化鈉濃度下的凝集活性為2048單位，另一方面，在0.4M氯化鈉的濃度下的凝集活性為8單位。其結(jié)果如表6所示。
純化標準品進行100℃、10分鐘的熱處理后的凝集活性為2048單位，確認不會由于熱處理導(dǎo)致其凝集活性消失。由于紅細胞凝集素的凝集活性是紅細胞凝集素的糖結(jié)合活性指標之一，因而由上述結(jié)果可知，本發(fā)明所使用的自身免疫增強成分向紅細胞凝集素上的糖結(jié)合活性對熱是穩(wěn)定的。
為了研究純化樣品的促分裂原活性，進行人淋巴細胞幼稚化試驗。人淋巴細胞幼稚化試驗用于測定、比較患者和正常健康人的末梢血淋巴細胞的DNA合成能力。該反應(yīng)被認為顯示一般的細胞性免疫反應(yīng)能力。作為測定方法，雖然有在固定染色標準品上統(tǒng)計染色體出現(xiàn)的細胞數(shù)的方法，進行形態(tài)學(xué)觀察的方法等，但在本實施例中，采用了向細胞核中吞噬3H-胸苷的測定方法。使用取自3名健康正常人的淋巴細胞進行實驗。
相對于100ml純水，以1.05g RPMI 1640、0.2g NaHCO3、10000單位的青霉素、10mg鏈霉素、10ml胎牛血清的比例溶解的水溶液作為培養(yǎng)液，在使用過濾器過濾滅菌后，按照使用量放入小瓶，在-20℃溫度下密封保存。
將菜豆凝集素溶于培養(yǎng)液中并將其濃度調(diào)整到10～50μg/ml作為比較用促分裂原。將其分裝于滅菌小試管中，密封后在-20℃溫度下保存。
按照如下方法進行淋巴細胞的分離。即，使用Ficoll-Conray法從添加肝素血液中分離淋巴細胞，用CMF-PBS(pH7.0)洗凈3次。將分離的淋巴細胞懸浮于1ml的培養(yǎng)液中，計算淋巴細胞數(shù)。接著用培養(yǎng)液將濃度調(diào)整為5×105個/ml，得到淋巴細胞懸浮液。
按照下述方法進行淋巴細胞的培養(yǎng)。即，在微量培養(yǎng)板的各個孔中分別注入200μl的淋巴細胞懸浮液。接著在各個孔中分別注入20μl作為促分裂原溶液的純化樣品、作為陽性對照組的比較用促分裂原、作為陰性對照組的磷酸緩沖液(PES)。接著在CO2的濃度為5％、37℃的空氣中，在濕潤狀態(tài)下培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束前8小時在各個孔中分別注入3H-胸苷并使其在培養(yǎng)液中的最終濃度達到1μCi/ml。
按照如下方法進行活性測定。即，應(yīng)用Labo-MASH以食鹽水收集孔內(nèi)，同時在玻璃纖維過濾器上收集細胞，通過對其連續(xù)抽吸洗凈過濾器上的細胞(約20秒，生理食鹽水約1.5ml)。然后，剝離玻璃過濾器上的細胞粘著部分，放入計數(shù)瓶中。在充分干燥后，使用分配器在各個小瓶中注入5ml的甲苯閃爍物(POPO 0.1g+PPO 5g/升甲苯)作為液體閃爍物，通過閃光計數(shù)器進行測量。將對每個試樣平均測定3次的平均值作為結(jié)果示于表1。
表1

從該表可知，本發(fā)明所使用的自身免疫增強成分，較現(xiàn)有的來源于陸生植物的紅細胞凝集素具有更高的促分裂原活性。
實施例2(1)水溶性級分的提取步驟使用0.15M的氯化鈉水溶液將濕重500g的繩龍須菜(日本德島縣吉野川河口域產(chǎn))洗凈，在-30℃溫度下凍結(jié)。使用包含30mM氯化鉀和3μM硫酸鋅、5mM 2-巰基乙醇的0.5M三(羥基甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH 8.2)作為提取用緩沖液，向細粉碎的凍結(jié)海藻(相當(dāng)于濕重500g的繩龍須菜)中加入800ml提取用緩沖液進行勻化，然后將該勻化的液體在4℃溫度下放置6小時后，通過離心分離得到上清液的粗提取液。
(2)粗活性成分的分離步驟接著，在該粗提取液中加入硫酸銨使最終濃度達到35％飽和濃度以進行第一階段的鹽析。在硫酸銨的添加結(jié)束后，在4℃溫度下放置1小時后，通過離心分離除去生成的沉淀。在該操作中，色素等雜質(zhì)作為沉淀級分被除去。接著，在離心分離得到的上清液中，加入硫酸銨使最終濃度達到70％的飽和濃度，添加結(jié)束后，在4℃溫度下放置1晚，通過離心分離將所生成的沉淀分離。將分離得到的沉淀級分再次用包含0.15M氯化鈉的100mM的磷酸緩沖液(pH6.9)溶解，接著相對于包含0.15M氯化鈉的100mM的磷酸緩沖液(pH6.9)進行透析，得到粗活性級分。所得到的粗活性級分相對于兔紅細胞的紅細胞凝集活性為256單位。其中，凝集活性的單位被定義為能夠檢測出凝集活性的樣品的最大稀釋率的倒數(shù)。
(3)凝集素的純化步驟接著，對這樣得到的粗活性級分在100℃溫度下熱處理1分鐘，通過離心分離除去不溶性的雜質(zhì)蛋白質(zhì)，使用凝膠過濾色譜分離分子量為10萬或10萬以上的級分，使用TSK gel DEAE-5 PW的離子交換色譜進行分離，得到純化樣品。這樣得到的純化樣品相對于兔紅細胞的紅細胞凝集活性為2048單位。由上述結(jié)果可知，本發(fā)明的自身免疫增強成分，可以以保持其活性的狀態(tài)得到。
針對純化標準品，進行相對于兔紅細胞的凝集活性的離子濃度依存性試驗，相對于在0.15M氯化鈉濃度下的凝集活性為2048單位，在0.4M氯化鈉的濃度下的凝集活性為8單位。
此外確認了，對純化標準品進行100℃、10分鐘的熱處理后的凝集活性為2048單位，并且不會由于熱處理導(dǎo)致其凝集活性消失。
對于粗活性級分和純化標準品，測定了促分裂原活性。進行了人淋巴細胞幼稚化的試驗。
接著，通過3H-胸苷的吞噬進行淋巴細胞幼稚化試驗，測定粗活性級分和純化樣品的促分裂原活性。這時，全部的細胞培養(yǎng)中所需要的材料，例如微量培養(yǎng)板、細胞收集器、玻璃纖維過濾器、計數(shù)瓶、3H-胸苷、甲苯閃爍物(POPO 0.1g+PPO 5g/升甲苯)、液體閃爍計數(shù)器的準備以及使用它們所進行的操作都是在無菌條件下進行的。
接著，相對于100ml純水，以1.05g RPMI 1640、0.2g NaHCO3、10000單位的青霉素、10mg鏈霉素、10ml胎牛血清的比例溶解的水溶液作為培養(yǎng)液，在使用過濾器過濾滅菌后，按照使用量放入小瓶中，在-20℃溫度下密封保存。在該狀態(tài)下保存2個月為能夠使用的保存期限。使用時按照使用后即作廢的方式，避免進行反復(fù)的凍結(jié)溶解。
使用Ficoll-Conray法從添加肝素血液中分離淋巴細胞。然后用CMF-PBS(pH7.0)洗凈3次后，懸浮于1ml的培養(yǎng)液中，計算淋巴細胞數(shù)。接著用培養(yǎng)液調(diào)整為5×105個/ml。
在微量培養(yǎng)板的各個孔中分別平均注入200μl的淋巴細胞懸浮液進行淋巴細胞的培養(yǎng)。
接著，將加入了淋巴細胞的微量培養(yǎng)板放入清潔臺內(nèi)。通過3個實驗區(qū)進行實驗。以放置在未經(jīng)紫外照射30分鐘清潔臺內(nèi)的對照實驗區(qū)作為實驗區(qū)A。以從上方對微量培養(yǎng)板內(nèi)的淋巴細胞紫外照射了30分鐘的實驗區(qū)作為實驗區(qū)B。以從上方對微量培養(yǎng)板內(nèi)的淋巴細胞紫外照射了16小時的實驗區(qū)作為實驗區(qū)C。如下所述進行紫外照射。將微量培養(yǎng)板放入彩色便攜式(クロマトビユ一ポ一タブル)暗箱(フナコシ株式會社制造)中，通過暗箱上部安裝的6瓦·輕便型UV燈UVL-56型黑光燈(フナコシ株式會社制造)，進行長波長(365nm)的紫外線照射。這時的365nm的紫外線強度是通過將MODEL UVX-36傳感器(フナコシ株式會社制造)連接到數(shù)字式UVXRADIOMETER紫外線強度計上進行測定的。在微量培養(yǎng)板部位的紫外線強度為0.63mW/cm2。
接著，對于各個實驗區(qū)，作為促分裂原溶液，在各個孔中分別平均注入20μl粗活性級分、純化樣品、磷酸緩沖液(PES)。粗活性級分是通過制備成經(jīng)緩沖液稀釋后的稀釋液(稀釋10倍～320倍)后用于實驗的。粗活性級分中的3H-胸苷吞噬量(cpm)是將稀釋液中的測定值乘以稀釋倍數(shù)再換算成原溶液的值而求得的。純化樣品是通過制備成經(jīng)緩沖液稀釋后的稀釋液(稀釋10倍～320倍)，將稀釋液用于實驗的。純化樣品中的3H-胸苷吞噬量(cpm)是將稀釋液中的測定值乘以稀釋倍數(shù)再換算成原溶液的值而求得的。
接著在含有5％CO2的空氣中、37℃的濕潤狀態(tài)下，培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束前8小時在各個孔中分別注入3H-胸苷并使其在培養(yǎng)液中的最終濃度達到1μCi/ml。
按照如下方法進行活性測定。使用Labo-MASH等通過食鹽水收集孔內(nèi)，同時在玻璃纖維過濾器上收集細胞，通過對其連續(xù)抽吸洗凈過濾器上的細胞(約20秒，生理食鹽水約1.5ml)。然后，剝離玻璃過濾器上的細胞粘著部分，放入計數(shù)瓶中。在充分干燥后，使用分配器在各個小瓶中分別注入5ml的液體閃爍物，通過閃光計數(shù)器進行測量。使用取自與實施例1中所用的3個人不同的其它3人的試樣(以下稱為試樣a、試樣b、試樣c)的淋巴細胞進行實驗。在同一實驗條件下的實驗次數(shù)為3次(表中記為1、2、3)，且平均為3次測量的平均值。其中試樣a的結(jié)果如表2所示、試樣b的結(jié)果如表3所示、試樣c的結(jié)果如表4所示。
表2

表3

表4

如表2～4的實驗區(qū)A所示，在實施例2中得到的包含粗活性級分及純化樣品的本發(fā)明中所使用的自身免疫增強成分，和陰性對照組相比，3H-胸苷的吞噬量分別為其600倍或600倍以上和3400倍或3400倍以上，明顯高于對照組，因而可知其顯示出優(yōu)良的促分裂原活性。
此外，如表2～4的陰性對照組的平均值所示，如果進行紫外線照射，3H-胸苷的吞噬量，即免疫力被降低；而如實驗區(qū)B和實驗區(qū)C的結(jié)果所示，通過添加本發(fā)明所使用的自身免疫增強成分，即使進行紫外線照射，3H-胸苷的吞噬也得到促進。
由以上結(jié)果可知，通過對由于紫外線照射處理導(dǎo)致DNA合成能力(3H-胸苷的吞噬等)等免疫力降低的人淋巴細胞添加自身免疫增強成分的粗活性級分·純化標準品，能夠增強該淋巴細胞的DNA合成能力等免疫力。此外，如果紫外照射時間在30分鐘以內(nèi)，能夠提高到與在未經(jīng)紫外照射的人淋巴細胞中添加自身免疫增強成分時相同的DNA合成能力；并且，即使進行紫外照射16小時，也能夠提高到在未經(jīng)紫外照射的人淋巴細胞中添加自身免疫增強成分時50％或50％以上的DNA合成能力；其3H-胸苷的吞噬量遠多于未經(jīng)紫外線照射的陰性對照組。
比較例1在實施例1-(2)粗活性級分的分離步驟中，除了使用50質(zhì)量％乙醇進行分離處理以代替添加硫酸銨的2階段鹽析的分離處理(參閱Phytochemistry，第27卷，第2063～2067頁(1988年))之外，按照與實施例1相同的方法得到粗活性級分。該粗活性級分的相對于兔紅細胞的紅細胞凝集活性為4單位，比活性為53.4單位/mg蛋白質(zhì)，活性回收率為5.0％。其結(jié)果如表5所示。
比較例2按照常用的方法(Comp.Biochem.Phisiol.，第102B卷，第445～449頁(1992年)所述的方法)得到來源于紅藻類的紅細胞。所得到的粗活性級分的紅細胞凝集活性為16單位，比活性為149.5單位/mg蛋白質(zhì)，活性回收率為19.5％。其結(jié)果如表5所示。此外，對于兔紅細胞顯示出紅細胞凝集活性的純化樣品的最小蛋白質(zhì)濃度為32.6μg/ml，相當(dāng)于實施例1的比活性的約1/40。
表5

注1)凝集活性是通過連續(xù)稀釋粗活性級分，由顯示出凝集活性的最大稀釋率計算出來的。
注2)活性回收率是以粗提取液總量的凝集活性為100％計算得到的。
比較例3針對按照常用方法(Comp.Biochem.Phisiol.，第102B卷，第445～449頁(1992年)所述的方法)從紅藻類純化的分子量為50,000的凝集素，研究其相對于兔紅細胞的凝集活性的離子濃度依存性。在0.15M氯化鈉和0.4M氯化鈉濃度下的凝集活性均為1024單位，未發(fā)現(xiàn)凝集活性的離子濃度依存性。其結(jié)果如表6所示。
比較例4將25mg ConA(和光純藥(株)制)溶于100ml的磷酸緩沖液，研究其兔紅細胞的凝集活性的離子濃度依存性。在0.15M氯化鈉和0.4M氯化鈉濃度下的凝集活性均為64單位，未發(fā)現(xiàn)凝集活性的離子濃度依存性。其結(jié)果如表6所示。
表6

注1)凝集活性是通過連續(xù)稀釋純化凝集素，由顯示凝集活性的最大稀釋率計算出來的。
對Con A進行100℃、10分鐘的熱處理后未檢出其凝集活性，確認由于熱處理導(dǎo)致其凝集活性消失。
如表5所示，實施例1所得到的包含粗活性級分的本發(fā)明所使用的自身免疫增強成分，和比較例1和2的相比，凝集活性、比活性、活性回收率都要高，活性回收率為比較例1的約12倍，比較例2的約3倍，比活性是比較例1的約63倍，比較例2的約23倍。此外，從表6可知，實施例1的純化凝集素活性與比較例3和4的不同，可以通過離子濃度控制相對于兔紅細胞的凝集活性。
工業(yè)實用性本發(fā)明的自身免疫增強方法中所使用的活性成分作為臨床領(lǐng)域、醫(yī)療領(lǐng)域、生物化學(xué)工業(yè)領(lǐng)域的治療用、檢查用材料等，以及化妝品領(lǐng)域的添加劑是有用的。
權(quán)利要求
1.一種自身免疫增強方法，其特征在于，使用由江蘺屬紅藻類(Gracilariasp.)的鹽類水溶液得到液態(tài)提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的自身免疫增強方法，其中，江蘺屬紅藻類為龍須菜(Gracilaria verrucosa)、繩龍須菜(Gracilaria chorda)或者它們的亞種。
3.如權(quán)利要求1或2所述的自身免疫增強方法，其特征在于，液體提取物具有使經(jīng)過鏈霉蛋白酶處理的羊紅細胞凝集的活性，并且該凝集活性不受單糖類或二糖類的抑制，但受到胎球蛋白或脫唾液胎球蛋白的抑制。
4.如權(quán)利要求1～3任一項所述的自身免疫增強方法，其特征在于，液體提取物相對于兔紅細胞的凝集活性因離子濃度的不同而不同。
5.如權(quán)利要求1～4任一項所述的自身免疫增強方法，其特征在于，液體提取物是在使用球形蛋白質(zhì)作為標準分子量物質(zhì)的凝膠過濾色譜中，洗脫為分子量相當(dāng)于100,000或100,000以上的級分。
6.如權(quán)利要求1～5任一項所述的自身免疫增強方法，其特征在于，液體提取物具有激活細胞性免疫能力的活性。
7.如權(quán)利要求1～6任一項所述的自身免疫增強方法，其中，液體提取物在經(jīng)過100℃、10分鐘的熱處理后仍具有糖鏈結(jié)合活性。
8.如權(quán)利要求1～7任一項所述的自身免疫增強方法，其特征在于，液體提取物具有將人淋巴細胞幼稚化的活性。
9.如權(quán)利要求1～8任一項所述的自身免疫增強方法，其特征在于，液體提取物促進氚標記胸苷向細胞核內(nèi)的吞噬。
10.如權(quán)利要求1～9任一項所述的自身免疫增強方法，其中，液體提取物包含糖和蛋白質(zhì)，且該蛋白質(zhì)的質(zhì)量相對于糖的質(zhì)量為0.4或0.4以下。
11.如權(quán)利要求1～10任一項所述的自身免疫增強方法，其中，液體提取物包含1～60質(zhì)量％的硫酸。
12.由江蘺屬紅藻類(Gracilaria sp.)的鹽類水溶液得到的液體提取物作為人體的自身免疫增強劑的用途。
13.如權(quán)利要求12所述的液體提取物作為自身免疫增強劑的用途，其中，江蘺屬紅藻類為龍須菜(Gracilaria verrucosa)、繩龍須菜(Gracilaria chorda)或者它們的亞種。
14.如權(quán)利要求12或13所述的液體提取物作為自身免疫增強劑的用途，其特征在于，液體提取物具有使經(jīng)過鏈霉蛋白酶處理的羊紅細胞凝集的活性，并且該凝集活性不受單糖類或二糖類的抑制，但受到胎球蛋白、脫唾液胎球蛋白的抑制。
15.如權(quán)利要求12～14任一項所述的液體提取物作為自身免疫增強劑的用途，其特征在于，液體提取物的相對于兔紅細胞的凝集活性因離子濃度的變化而變化。
16.如權(quán)利要求12～15任一項所述的液體提取物作為自身免疫增強劑的用途，其特征在于，液體提取物是在使用球形蛋白質(zhì)作為標準分子量物質(zhì)的凝膠過濾色譜中，洗脫為分子量相當(dāng)于100,000或100,000以上的級分。
17.如權(quán)利要求12～16任一項所述的液體提取物作為自身免疫增強劑的用途，其特征在于，液體提取物具有激活細胞性免疫能力的活性。
18.如權(quán)利要求12～17任一項所述的液體提取物作為自身免疫增強劑的用途，其特征在于，液體提取物是在經(jīng)過100℃、10分鐘的熱處理后仍具有糖鏈結(jié)合活性的提取物。
19.如權(quán)利要求12～18任一項所述的液體提取物作為自身免疫增強劑的用途，其特征在于，液體提取物具有將人淋巴細胞幼稚化的活性。
20.如權(quán)利要求12～19任一項所述的液體提取物作為自身免疫增強劑的用途，其特征在于，液體提取物促進氚標記胸苷向細胞核內(nèi)的吞噬。
21.如權(quán)利要求12～20任一項所述的液體提取物作為自身免疫增強劑的用途，其中，液體提取物包含糖和蛋白質(zhì)，且該蛋白質(zhì)的質(zhì)量相對于糖的質(zhì)量為0.4或0.4以下。
22.如權(quán)利要求12～21任一項所述的液體提取物作為自身免疫增強劑的用途，其中，液體提取物包含1～60質(zhì)量％的硫酸。
23.一種用于自身免疫增強方法中的自身免疫增強成分的制造方法，其特征在于，使用鹽類水溶液從江蘺屬紅藻類中提取，在得到的提取液中，通過加入硫酸銨使最終濃度達到20～40％飽和濃度以進行第一階段的鹽析，除去沉淀的雜質(zhì)，然后向該提取液中通過進一步加入硫酸銨使最終濃度達到60～80％飽和濃度以進行第二階段的鹽析，回收沉淀形式的粗活性級分，通過使用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙獬恋?，分離、收集顯示激活細胞性免疫能力活性的液體提取物。
24.如權(quán)利要求23所述的用于自身免疫增強方法中的自身免疫增強成分的制造方法，其中，對液體提取物進一步在100℃進行1～10分鐘的熱處理除去雜質(zhì)蛋白質(zhì)，接著通過凝膠過濾色譜分離得到的分子量為100,000或100,000以上的級分，然后通過色譜分離、純化該級分。
25.權(quán)利要求23或24所述的用于自身免疫增強方法中的自身免疫增強成分的制造方法，其中，鹽類水溶液為包含氯化鈉的磷酸緩沖液。
26.權(quán)利要求23或24所述的用于自身免疫增強方法中的自身免疫增強成分的制造方法，其中，鹽類水溶液為包含選自氯化鉀、硫酸鋅以及2-巰基乙醇中的至少一種的三(羥基甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液。
27.一種化妝品原料，其特征在于，包含通過權(quán)利要求23～26任一項所述的制造方法得到的自身免疫增強成分。
全文摘要
提供了一種通過給予特殊活性成分的增強自身免疫的新方法，所述的特殊活性成分不會由于加熱而導(dǎo)致其糖結(jié)合性消失、顯示出良好的識別糖鏈的選擇性以及激活細胞性免疫能力等的自身免疫增強活性。該活性成分是通過如下方法得到的在以鹽類水溶液從江蘺屬紅藻類提取的提取液中，通過加入硫酸銨使最終濃度達到20～40％飽和濃度以進行第一階段的鹽析，除去所沉淀的雜質(zhì)，然后通過進一步加入硫酸銨使最終濃度達到60～80％飽和濃度以進行第二階段的鹽析，回收沉淀形式的粗活性級分，通過使用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙獬恋淼玫揭簯B(tài)粗活性級分；進一步根據(jù)需要，通過進行100℃的1～10分鐘的熱處理除去雜質(zhì)蛋白質(zhì)，接著通過凝膠過濾色譜分離分子量為100,000或100,000以上的級分，并進一步通過色譜分離該成分，收集顯示激活細胞免疫能力的級分，而得到該活性成分。
文檔編號A61P37/04GK1767840SQ200480008558
公開日2006年5月3日 申請日期2004年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月31日
發(fā)明者垣田浩孝, 上嵨洋 申請人:獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)總合研究所