專利名稱：一種預(yù)防和/或治療自身免疫疾病的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和/或治療自身免疫疾病的疫苗。
背景技術(shù)：
自身免疫疾病是由自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。自身免疫疾病是常見病，如I型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、卵巢炎、心肌炎、慢性甲狀腺炎、重癥肌無力、紅斑狼瘡、毒性彌漫性甲狀腺腫Graves’病、干燥綜合征、葡萄膜視網(wǎng)膜炎等。我國患病率超過5％。治療此類疾病主要是使用免疫抑制劑，在臨床上通常使用的免疫抑制劑和方法有如下幾個(gè)方面利用化學(xué)藥品如普樂可復(fù)(FK506)，環(huán)孢素A(CsA)，驍悉(MMF)，硫唑嘌呤(Aza)，強(qiáng)的松(Pred)，早基強(qiáng)的松龍(MP)；利用抗體如抗淋巴細(xì)胞球蛋白(ALG)，抗CD4單克隆抗體(OKT4)。每年治療費(fèi)用在幾十億元。但以上的免疫抑制劑都有其毒副作用，若使用不當(dāng)，一方面可因過度抑制機(jī)體免疫反應(yīng)性而引發(fā)多種并發(fā)癥，另一方面也可因其自身的毒副作用導(dǎo)致抑制器官功能衰竭。所以，目前無特效的治療手段。
I型糖尿病以CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤胰島而造成胰島中產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞被破壞為特征的一類自身免疫疾病。它約占所有糖尿病患者的5-10％(ADA[American Diabetes Association].1997.Report of the expert committee on thediagnosis and classification of diabetes mellitus.Diabetes Care201183-1197；Atkinson MA，Leiter EH.1999.The NOD mouse model of type 1diabetesAs good as it gets？Nature 5601-604)。主要發(fā)病機(jī)理是自身反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞破壞了胰腺中產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞引起的，以CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤胰島而造成胰島中產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞被破壞為特征的一類自身免疫疾病(Atkinson MA，Maclaren NK.1994.The pathogenesis of insulin-dependentdiabetes mellitus.N Engl J Med 3311428-1436；Benoist C，Mathis D.1997.Autoimmune diabetesRetrovirus as trigger，precipitator or marker？Nature388833-834；Bjork S.2001.The cost of diabetes and diabetes care.DiabetesRes Clin Pract 54(Suppl 1)13-18)。在歐洲后裔中發(fā)病率較高，約有200萬患者。具有發(fā)病率明顯的地理分布特點(diǎn)芬蘭兒童中I型糖尿病的發(fā)病率是委內(nèi)瑞拉兒童的400倍。有報(bào)道稱，I型糖尿病的全球發(fā)病率在2010年將比在1998年提高40％。這個(gè)快速的增長速度表明，環(huán)境因素作用于易患基因，共同引起了1型糖尿病的發(fā)病率上升。
人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)I型糖尿病胰島炎現(xiàn)象，即淋巴細(xì)胞浸潤胰島，以后相繼在I型糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)了抗胰島細(xì)胞自身抗體(ICA)，對(duì)胰島素、羧肽酶、熱休克蛋白產(chǎn)生自主反應(yīng)的T細(xì)胞，至1990年Beakkeskov證明I型糖尿病患者血清中存在的64K抗體就是谷氨酸脫羧酶(GAD)自身抗體和自主反應(yīng)的T細(xì)胞，認(rèn)為GAD是I型糖尿病自身免疫反應(yīng)的關(guān)鍵抗原(Immune modulation for prevention of type 1 diabetesmellitus.Itamar Razl，Roy Eldor2 and Yaakov Naparstek.TRENDS inBiotechnology 23128，2005.龍秀榮，杜文斌，蘇鐘浦，魏慶琤.兒童糖尿病的谷氨酸脫羧酶抗體檢測.中華兒科雜志.1998年第10期)。
目前臨床上主要是給與胰島素的補(bǔ)償性治療，但是還沒有能夠預(yù)防或延緩發(fā)病的好方法。圍繞1型糖尿病的研究方向有很多，主要目標(biāo)是抵抗自身免疫的發(fā)生，到晚期也有采取誘導(dǎo)細(xì)胞再生等方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防和/或治療自身免疫疾病的疫苗。
本發(fā)明所提供的預(yù)防和/或治療自身免疫疾病的疫苗，它的活性成分是下述混合物造成自身免疫疾病的蛋白抗原或其表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入自身蛋白抗原或其表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物；所述自身蛋白抗原為胰島素、谷氨酸脫羧酶、熱休克蛋白、髓磷脂寡突細(xì)胞糖蛋白(MOG)、二種髓磷脂抗原(MBP和PLP蛋白脂蛋白)、卵透明帶蛋白3(ZP3)、肌球蛋白、II型膠原蛋白、甲狀腺球蛋白、細(xì)胞膜表面抗原、第二型膠質(zhì)抗原(CA2)、乙酰膽堿受體、甲狀腺細(xì)胞表面抗原(TSH)、唾液腺管蛋白、甲狀腺球蛋白、抗原包括超抗原(S-Ag)或感光器間受體樹脂樣結(jié)合蛋白。
上述預(yù)防和/或治療自身免疫疾病的疫苗具體可為預(yù)防和/或治療I型糖尿病的疫苗。
所述預(yù)防和/或治療I型糖尿病的疫苗，它的活性成分是下述任一種混合物1)I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物；2)I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物；3)I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物；
4)I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物；所述I型糖尿病自身蛋白抗原為胰島素或谷氨酸脫羧酶或熱休克蛋白。
在共免疫組合物中，也可以采用I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物。此混合物同樣可以產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而抑制I型糖尿病發(fā)生。
同樣，也可以采用I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物。此混合物同樣可以產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而抑制I型糖尿病發(fā)生。
采用以上兩種混合物免疫產(chǎn)生的效果與I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物產(chǎn)生的效果相同。
其中，所述胰島素可來源于人、狗、貓。人的胰島素可以用于小鼠的I型糖尿病治療。人、狗、貓和鼠的基因序列非常相似。在核酸序列水平上，鼠與人胰島素相似性為95％，貓與人的相似性為84％，狗與人的相似性為89％。
所述谷氨酸脫羧酶可來源于人、狗、貓。人的谷氨酸脫羧酶也用于小鼠I型糖尿病治療。在核酸序列水平上，兩者的序列相似度為90％。
所述熱休克蛋白可來源于人、狗、貓。
所述I型糖尿病自身蛋白抗原具體可為人胰島素。所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽的氨基酸序列是序列表中的序列1，該多肽的名稱為B9-23。用于插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原編碼基因或所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體可為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，如pcDNA3.0或pVAX1或provax(涂亦嫻，金華利，張馨玉，楊若耶，楊富，張富春，王賓。豬瘟病毒E2基因真核表達(dá)載體表達(dá)效率和免疫效果的比較。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，10(6)37-41)。
所述預(yù)防和/或治療I型糖尿病的疫苗的活性成分具體可為人胰島素蛋白和pVAX-insulin，還可為B9-23和pcDB9-23。
所述預(yù)防和/或治療I型糖尿病的疫苗的活性成分中，1)I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1∶5-5∶1；優(yōu)選為1∶1-1∶2；2)I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1∶5-5∶1；優(yōu)選為1∶1-1∶2；3)I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1∶5-5∶1；優(yōu)選為1∶1-1∶2；4)I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1∶5-5∶1；優(yōu)選為1∶1-1∶2。
所述預(yù)防和/或治療I型糖尿病的疫苗可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入機(jī)體。
所述預(yù)防和/或治療I型糖尿病的疫苗的用量一般為200ug-10mg活性成分/kg體重/次，每7-30天給藥一次，一般共需2-5次。
小鼠實(shí)驗(yàn)證明，I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物，和I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物，可抑制免疫小鼠的T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)免疫抑制的產(chǎn)生，并能夠有效地預(yù)防I型糖尿病的發(fā)生。同理，此疫苗方法和手段也可以用于對(duì)于其它由于自身抗原誘發(fā)的自身免疫性疾病。


圖1a為pVAX-insulin的EcoR I和Xho I酶切鑒定結(jié)果。
圖1b為pcDB9-23載體的EcoR I和Xho I酶切鑒定結(jié)果。
圖1c為RT-PCR方法分析pVAX-insulin在BHK21細(xì)胞中的表達(dá)。
圖2a為刺激48小時(shí)的pcDB9-23和B9-23共免疫組的T細(xì)胞增情況。
圖2b為刺激96小時(shí)的pcDB9-23和B9-23共免疫組的T細(xì)胞增情況。
圖3a為刺激48小時(shí)的各免疫組的T細(xì)胞增情況圖3b為在圖3a中各免疫組的T細(xì)胞增情況比較。
圖3c為在不同共免疫組中不同免疫劑量的T細(xì)胞增情況比較。
圖4為預(yù)防NOD小鼠發(fā)病的比較實(shí)驗(yàn)。
圖5為免疫的NOD小鼠的胰腺組織切片HE染色結(jié)果。
圖6a為小鼠MZP3基因序列與絨猴、人、狗、貓、二花臉豬和亞洲原牛同的核酸源性分析。MZP3小鼠；Marmosets絨猴；Human人；Canis familiaris狗；felis catus貓；Sus scrofa二花臉豬；Bos taurus亞洲原牛。
圖6b為小鼠MZP3基因序列與絨猴、人、狗、貓、二花臉豬和亞洲原牛的氨基酸序列同源性分析。MZP3小鼠；Marmosets絨猴；Human人；Canis familiaris狗；felis catus貓；Sus scrofa二花臉豬；Bos taurus亞洲原牛。
圖7為真核表達(dá)載體pcDmzp3的鑒定及表達(dá)分析。(a)載體用EcoR I和Xho I進(jìn)行酶切分析。MDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)；1，2重組質(zhì)粒pcDmzp3用EcoR I和Xho I進(jìn)行酶切。(b)RT-PCR方法分析pcDmzp3在BHK21細(xì)胞中的表達(dá)。MDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)；1pcDmzp3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞MZP3的表達(dá)；2未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)照。
圖8為原核表達(dá)載體pGEX-4T-1/MZP3的鑒定，蛋白表達(dá)及純化。(a)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/MZP3的酶切鑒定。MDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)；1，2重組質(zhì)粒pGEX一4T-1/MZP3用EcoR I和Xho I進(jìn)行酶切。(b)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。M蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌蛋白；2IPTG誘導(dǎo)的全菌蛋白；3超聲破碎的上清蛋白；4超聲破碎的沉淀蛋白。(c)純化后的MZP3蛋白。M蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1純化后的蛋白蛋白樣品。箭頭指向目的條帶。
圖9a為自身免疫疾病卵巢炎的發(fā)病率和嚴(yán)重程度。C57BL/6小鼠通過腳掌和肌肉注射100ul PBS為陰性對(duì)照組，只注射100ul弗氏完全佐劑(CFA)的小鼠為佐劑組，注射100ul的含100μg MZP3蛋白的CFA乳化液。
圖9b為注射后14天檢測卵巢組織學(xué)變化。C57BL/6小鼠通過腳掌和肌肉注射100ul PBS為陰性對(duì)照組，只注射100ul弗氏完全佐劑(CFA)的小鼠為佐劑組，注射100ul的含100μg MZP3蛋白的CFA乳化液。陰性對(duì)照組，正常卵巢組織；CFA，只注射CFA的小鼠卵巢組織，卵巢沒有炎癥反應(yīng)；長箭頭表示正在生長的卵泡，箭頭表示原始卵泡(放大倍數(shù)為100和400倍)；MZP3，卵巢出現(xiàn)了炎癥細(xì)胞的浸潤，嚴(yán)重的丟失了卵子。
圖9c為抗體滴度(每組3只小鼠)。C57BL/6小鼠通過腳掌和肌肉注射100μgMZP3蛋白和CFA，對(duì)照為只注射CFA的小鼠。注射14天后收集血清并通過ELISA的方法檢測抗體，抗體滴度根據(jù)OD值進(jìn)行計(jì)算。
圖9d為來自腿彎處淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞對(duì)MZP3蛋白的特異性T細(xì)胞反應(yīng)。C57BL/6小鼠通過腳掌和肌肉注射100ul PBS為陰性對(duì)照組，只注射100ul弗氏完全佐劑(CFA)的小鼠為佐劑組，注射100ul的含100μg MZP3蛋白的CFA乳化液。T細(xì)胞從小鼠中分離(每組3只)，體外用MZP3蛋白作為特異性抗原進(jìn)行刺激并用CFSE方法進(jìn)行檢測。圖中的百分?jǐn)?shù)為增殖程度，數(shù)值越大表明增殖程度越高，M1表示細(xì)胞增值的百分比。
圖10a為細(xì)胞因子IL-2的表達(dá)。C57BL/6小鼠通過腳掌和肌肉注射100ul PBS為陰性對(duì)照組( )，只注射100ul CFA的小鼠為佐劑組，注射100ul的含100μgMZP3蛋白的CFA乳化液。
圖10b為用流式細(xì)胞儀分析IFN-γ的表達(dá)。注射14天后，T細(xì)胞從C57BL/6小鼠的脾臟和腿彎處淋巴結(jié)分離并用MZP3蛋白在體外刺激8小時(shí)。用胞內(nèi)染色的方法分析CD4+細(xì)胞INF-γ的表達(dá)和總細(xì)胞IL-12的表達(dá)。陽性細(xì)胞的百分率顯示在圖中。a，淋巴節(jié)；b，脾臟。
圖10c為用流式細(xì)胞儀分的IL-12的表達(dá)。注射14天后，T細(xì)胞從C57BL/6小鼠的脾臟和腿彎處淋巴結(jié)分離并用MZP3蛋白在體外刺激8小時(shí)。用胞內(nèi)染色的方法分析CD4+細(xì)胞INF-γ的表達(dá)和總細(xì)胞IL-12的表達(dá)。陽性細(xì)胞的百分率顯示在圖中。a，淋巴節(jié)；b，脾臟。
圖11a為和對(duì)照組相比，共免疫pcDmzp3和MZP3蛋白組AOD被減輕了。
圖11b為第二次免疫后第7天的卵巢組織學(xué)檢測圖11c為用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞因子IL-12的表達(dá)。A，淋巴結(jié)；B，脾臟。
圖111d為用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞因子INF-γ的表達(dá)。A，淋巴結(jié)；B，脾臟。
圖11e為共免疫DNA和蛋白誘導(dǎo)了抗原特異性的免疫抑制。比較共免疫了抗原匹配型和抗原錯(cuò)配型DNA和蛋白小鼠的T細(xì)胞擴(kuò)增情況。第二次免疫后第7天分離T細(xì)胞，體外用特異性抗原MZP3蛋白重新刺激，BSA作為無關(guān)蛋白對(duì)照，Con A作為陽性對(duì)照。用MTT方法進(jìn)行檢測并以刺激指數(shù)的方式表示。
圖11f為用ELISA法檢測血清中的抗體水平。
圖12a為共免疫誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)IL-10。第二次免疫后第7天分離T細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞因子IL-10和FoxP3的表達(dá)。A，淋巴結(jié)；B，脾臟。
圖12b為共免疫誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)FoxP3。第二次免疫后第7天分離T細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞因子IL-10和FoxP3的表達(dá)。A，淋巴結(jié)；B，脾臟。
圖13為共免疫沒有改變CD4+CD25+細(xì)胞的數(shù)量。從免疫不同組合的小鼠中分離T細(xì)胞，抗CD4和抗CD25的單克隆抗體進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。A，淋巴結(jié)；B，脾臟。
圖14為質(zhì)粒T-MOG352c的酶切鑒定結(jié)果。
圖15為質(zhì)粒pVAXMOG352c的酶切鑒定結(jié)果。
圖16為質(zhì)粒pVAXMOG352c在BHK21細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果。
圖17為免疫誘導(dǎo)小鼠EAE模型的發(fā)病情況，縱坐標(biāo)為發(fā)病指數(shù)，橫坐標(biāo)為天數(shù)。
圖18為陰性小鼠經(jīng)過繼轉(zhuǎn)移發(fā)病小鼠脾臟來源的T細(xì)胞后，在皮下一次免疫CFA佐劑乳化的MOG抗原200ug后的發(fā)病情況，縱坐標(biāo)為發(fā)病指數(shù)，橫坐標(biāo)為天數(shù)。
圖19為陰性小鼠經(jīng)過繼轉(zhuǎn)移發(fā)病小鼠的淋巴結(jié)來源T細(xì)胞，在皮下一次免疫CFA佐劑乳化的MOG抗原200ug后的發(fā)病情況，縱坐標(biāo)為發(fā)病指數(shù)，橫坐標(biāo)為天數(shù)。
圖20為誘導(dǎo)小鼠發(fā)病后針對(duì)自身MOG抗原的T細(xì)胞擴(kuò)增情況。
圖21為誘導(dǎo)小鼠發(fā)病后針對(duì)自身MOG抗原的T細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)一些細(xì)胞因子的情況。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、預(yù)防和/或治療I型糖尿病的疫苗本實(shí)施例中預(yù)防和/或治療I型糖尿病的疫苗有4種1)由人胰島素蛋白(Sigma公司，I-9278)和pVAX-insulin組成，2)由人胰島素中B鏈上的9-23蛋白(B9-23)和pcDB9-23組成，3)由人胰島素蛋白(Sigma公司，I-9278)和pcDB9-23組成，4)由B9-23和pVAX-insulin組成。
B9-23的氨基酸序列是S H L V E A L Y L V C G E R G(序列1)。胰島素中B鏈上的9-23蛋白(B9-23)由北京aoke公司合成。
其中，pVAX-insulin和pcDB9-23按照如下方法構(gòu)建取人胰腺組織，利用購自Takara公司的RNA提取試劑盒，在TrizoL試劑中充分研磨，并根據(jù)說明書進(jìn)行總RNA的提取。根據(jù)已發(fā)表的基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列為擴(kuò)增人胰島素cDNA基因的引物mInsulinp1 atggccctgttggtgcacttcctacmInsulinp2 ttagttgcagtagttctccagctgg擴(kuò)增人胰島素B鏈上自氨基末端第9至23位氨基酸殘基組成的多肽B9-23的引物B9-23p1agcaggaagcctatcttccaggttaB9-23p2gcagaggggtaggctgggtagtggtB9-23的氨基酸序列是S H L V E A L Y L V C G E R G。
依照TaKaRa RNA PCR Kit操作指南進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄用Oligo(dT)作下游引物，反應(yīng)條件42℃30min，99℃5min，5℃5min。PCR反應(yīng)用基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增參數(shù)94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃70s35個(gè)循環(huán)；72℃10min，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明人胰島素的RT-PCR產(chǎn)物得到一條約750bp的條帶，B9-23的RT-PCR產(chǎn)物得到一條約250bp的條帶。
利用Takara公司PCR Fragment Recovery Kit按其說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收?；厥盏腸DNA片段與pMD 18-T載體(購自Takara公司)在T4DNA連接酶的作用下16℃過夜，使人胰島素的cDNA或B9-23的編碼序列連接到pMD 18-T的載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒的提取按參考文獻(xiàn)(Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T.Molecular CloningA Laboratory Manual，(2nded).New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989.19-56)。提取后的質(zhì)粒用EcoRI和HindIII雙酶切進(jìn)行重組質(zhì)粒的鑒定，酶切反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，正確的克隆進(jìn)行質(zhì)粒的大量提取。為鑒定克隆的cDNA序列，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行純化，并用BcaBEST primer RV-M和BcaBEST primer M13-47對(duì)cDNA在PE377全自動(dòng)測序儀進(jìn)行雙向DNA序列測定，所得序列用PE公司SeqEd v1.0.3軟件進(jìn)行分析。將經(jīng)酶切和測序鑒定含有核苷酸序列是GenBank Accession NumberAY899304的自5′端第56位至388位脫氧核糖核苷酸的人胰島素eDNA基因的質(zhì)粒命名為pMD-insulin，含有核苷酸序列是GenBank Accession Number AY899304的自5′端第152位至196位脫氧核糖核苷酸的B9-23的cDNA基因的質(zhì)粒命名為pMD-B9-23。
用EcoRI和XhoI從pMD-insulin和pMD-B9-23分別切下人胰島素基因片段和B9-23片段，人胰島素基因片段連接到同樣酶切的真核表達(dá)載體pVAX1(Invitrogen公司)上，B9-23片段連接到同樣酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3.0(Invitrogen公司)上，重組質(zhì)粒用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定和測序鑒定。將經(jīng)酶切和測序鑒定含有核苷酸序列GenBank Accession Number AY899304的自5′端第56位至388位脫氧核糖核苷酸的人胰島素脫氧核糖核苷酸的人胰島素cDNA基因的質(zhì)粒命名為pVAX-insulin，含有核苷酸序列GenBank Accession Number AY899304的自5′端第152位至196位脫氧核糖核苷酸的B9-23的cDNA基因的質(zhì)粒命名為pcDB9-23。
pVAX-insulin的EcoR I和Xho I酶切鑒定結(jié)果如圖1a所示，0.7％瓊脂糖凝膠電泳表明pVAX-insulin經(jīng)EcoRI和Xho I酶切后，得到約750bp的人胰島素cDNA基因片段。圖1a中，1DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(10000bp、5000bp、2500bp、1000bp和250bp，購自Takara公司)；2，3重組質(zhì)粒pVAX-insulin用EcoR I和Xho I進(jìn)行酶切。
pcDB9-23載體的EcoR I和XhoI酶切鑒定結(jié)果如圖1b所示，0.7％瓊脂糖凝膠電泳表明pcDB9-23經(jīng)EcoR I和Xho I酶切后，得到約250bp的B9-23 cDNA基因片段。圖1b中，3是DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，購自Takara公司)；2重組質(zhì)粒pCDB9-23用EcoR I和Xho I進(jìn)行酶切。
pVAX-insulin參照lipofectamine產(chǎn)品說明書利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞(美國ATCC公司)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后收集細(xì)胞，提取總RNA以mInsulinp1和mInsulinp2為引物用RT-PCR方法檢測目的基因的表達(dá)。結(jié)果如圖1c所示，表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有750bp的人胰島素eDNA基因片段，說明pVAX-insulin在mRNA水平能有效在體外表達(dá)。1DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(10000bp、5000bp、2500bp、1000bp和250bp，購自Takara公司)；2、3pVAX-insulin轉(zhuǎn)染的細(xì)胞insulin的表達(dá)；4未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)照。
實(shí)施例2、預(yù)防和/或治療I型糖尿病的疫苗的效果試驗(yàn)分別免疫實(shí)驗(yàn)用的Balb/c小鼠和NOD小鼠。肌肉注射。Balb/c小鼠每組3只。NOD小鼠每組16只。
一、Balb/c小鼠實(shí)驗(yàn)1、在Balb/c小鼠上的細(xì)胞免疫反應(yīng)Balb/c小鼠9只，均分為3組，每組3只，第1組(pcDB9-23免疫組)每只分別免疫含100微克pcDB9-23的0.9％NaCl水溶液100微升，第2組(B9-23免疫組)每只分別免疫含100微克B9-23的0.9％NaCl水溶液100微升，第3組(pcDB9-23和B9-23共免疫組)每只分別免疫含100微克pcDB9-23和100微克B9-23的0.9％NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等劑量加強(qiáng)免疫一次，并于第二次免疫后第7天按如下方法進(jìn)行T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。
利用T細(xì)胞增殖試驗(yàn)，CFSE染色，流式細(xì)胞儀檢測，用來反映T淋巴細(xì)胞針對(duì)特定抗原的增殖能力。集體內(nèi)淋巴細(xì)胞在收到抗原等特異或非特異的刺激后，導(dǎo)致細(xì)胞活化，細(xì)胞因子合成、細(xì)胞因子受體表達(dá)及活化的細(xì)胞發(fā)生增殖。細(xì)胞增殖反應(yīng)在一定的程度上可以反映細(xì)胞的功能狀態(tài)。
具體方法如下1，脫臼處死小鼠，用70％乙醇浸泡15分鐘；2，在提前紫外燈滅菌20分鐘的超凈工作臺(tái)中，無菌條件下取出小鼠脾臟于提前加有2ml RPMI1640培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中；3，將銅網(wǎng)灼燒后降溫放入平皿中，利用無菌注射器將脾臟磨碎，制成細(xì)胞懸浮液，并過濾到13ml細(xì)胞離心管內(nèi)；4，將離心管口用封口膜封好，離心2000轉(zhuǎn)，10分鐘；5，棄上層培養(yǎng)液，加2～3ml紅細(xì)胞裂解液，懸浮細(xì)胞，裂解2分鐘后，加等體積RPMI1640培養(yǎng)基(或胎牛血清)中止反應(yīng)，將離心管口用封口膜封好，離心2000轉(zhuǎn)，10分鐘；6，棄上層培養(yǎng)液，加3～4ml RPMI1640(含2％胎牛血清)培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞；7，用玻璃棉37℃慢慢濾過細(xì)胞，保證細(xì)胞充分和玻璃棉結(jié)合以除去B細(xì)胞；8，用血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)；9，用PBS洗掉培養(yǎng)基，并最終用PBS溶液1ml懸浮2×107個(gè)細(xì)胞；10，加入3uM CFSE儲(chǔ)備液至終濃度為1.5uM，室溫下輕輕振蕩8分鐘；11，加入等體積胎牛血清終止反應(yīng)，將細(xì)胞放入水浴10分鐘，2000rpm 5分鐘離心，棄上清，懸浮細(xì)胞，并用1ml每106個(gè)細(xì)胞的含有PBS溶液洗細(xì)胞，離心棄上清，重復(fù)3次；12，將每組細(xì)胞懸液分4份加入96孔培養(yǎng)板中。其中一份加入100μl Con A(有絲分裂原)至終濃度為5μg/ml，一份加入相應(yīng)的特異性抗原(B9-23)作為刺激物至終濃度為5μg/ml，一份不加刺激物，一份加入100μlBSA至終濃度為2μg/ml作為無關(guān)抗原。同時(shí)設(shè)有不加刺激物和不用CFSE染色的細(xì)胞對(duì)照；13，將細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，37℃，5％CO2培養(yǎng)，分別在48，96小時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖情況。
48小時(shí)和96小時(shí)的檢測結(jié)果表明，pcDB9-23和B9-23共免疫組的T細(xì)胞增殖程度(增殖0.08％)明顯低于pcDB9-23免疫組(增殖22.32％)和B9-23免疫組(增殖8.94％)，證明pcDB9-23和B9-23共免疫組出現(xiàn)了免疫抑制現(xiàn)象。圖2a和圖2b中的百分?jǐn)?shù)為增殖程度，數(shù)值越大表明增殖程度越高，M1表示細(xì)胞增值的百分比。
2、細(xì)胞免疫反應(yīng)的特異性為了進(jìn)一步探索免疫抑制反應(yīng)是否具有專一性，即只有對(duì)胰島素抗原的蛋白和DNA之間才會(huì)產(chǎn)生抑制現(xiàn)象。將Balb/c小鼠21只，均分為7組，每組3只，第1組(陰性對(duì)照組)每只分別免疫0.9％NaCl水溶液100微升，第2組(pVAX-insulin免疫組)每只分別免疫含100微克pVAX-insulin的0.9％NaCl水溶液100微升，第3組(人胰島素蛋白免疫組)每只分別免疫含100微克人胰島素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第4組(pVAX1免疫組)每只分別免疫含100微克pVAX1的0.9％NaCl水溶液100微升，第5組(pVAX-insulin和VP1共免疫組)每只分別免疫含100微克pVAX-insulin和100微克口蹄疫病毒VP1(按照文獻(xiàn)金華利，張富春，單文娟，張愛蓮，李軼杰，王賓.口蹄疫vp1蛋白在酵母中的表達(dá)及免疫原性分析.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2004年，20(5)513-516中描述的方法制備)的0.9％NaCl水溶液100微升，作為對(duì)照組；第6組(pVAX1和人胰島素蛋白共免疫組)每只分別免疫含100微克pVAX1和100微克人胰島素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第7組(pVAX-insulin和人胰島素蛋白共免疫組)每只分別免疫含100微克pVAX-insulin和100微克人胰島素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等劑量加強(qiáng)免疫一次，并于第二次免疫后第7天按找上述步驟1的方法進(jìn)行T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。刺激后48小時(shí)的結(jié)果如圖3a和3b所示，表明只有當(dāng)胰島素蛋白與其對(duì)應(yīng)的DNA混合在一起時(shí)(pVAX-insulin和人胰島素蛋白共免疫組)，才出現(xiàn)免疫抑制現(xiàn)象，其它混合組與對(duì)照組比較，T細(xì)胞活性沒有明顯的下降。說明共免疫是同種抗原的蛋白與DNA之間存在免疫抑制現(xiàn)象的特異性關(guān)系。圖3a中的百分?jǐn)?shù)為增殖程度，數(shù)值越大表明增殖程度越高，M1表示細(xì)胞增值的百分比。圖3b中，pI表示pVAX-insulin免疫組，Insulin表示人胰島素蛋白免疫組，pVAX表示pVAX1免疫組，pI+VP1表示pVAX-insulin和VP1共免疫組，pVAX+In表示pVAX1和人胰島素蛋白共免疫組，pI+In表示pVAX-insulin和人胰島素蛋白共免疫組， 表示陰性對(duì)照組。
3、細(xì)胞免疫反應(yīng)的劑量關(guān)系實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步探索抑制現(xiàn)象出現(xiàn)最佳效果時(shí)蛋白與DNA之間的劑量關(guān)系。將Balb/c小鼠24只，均分為8組，每組3只，第1組(陰性對(duì)照組)每只分別免疫0.9％NaCl水溶液100微升，第2組(pVAX-insulin免疫組)每只分別免疫含100微克pVAX-insulin的0.9％NaCl水溶液100微升，第3組(人胰島素蛋白免疫組)每只分別免疫含100微克人胰島素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第4組(pVAX-insulin和人胰島素蛋白1:4共免疫組)每只分別免疫含25微克pVAX-insulin和100微克人胰島素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第5組(pVAX-insulin和人胰島素蛋白1:2共免疫組)每只分別免疫含50微克pVAX-insulin和100微克人胰島素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第6組(pVAX-insulin和人胰島素蛋白1:1共免疫組)每只分別免疫含100微克pVAX-insulin和100微克人胰島素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第7組(pVAX-insulin和人胰島素蛋白2:1共免疫組)每只分別免疫含200微克pVAX-insulin和100微克人胰島素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第8組(pVAX-insulin和人胰島素蛋白4:1共免疫組)每只分別免疫含400微克pVAX-insulin和100微克人胰島素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等劑量加強(qiáng)免疫一次，并于第二次免疫后第7天按找上述步驟1的方法進(jìn)行T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。刺激后48小時(shí)的結(jié)果如圖3c所示，當(dāng)質(zhì)粒與蛋白之間的比例是2∶1，抑制現(xiàn)象最明顯。圖3c中， 表示陰性對(duì)照組，pI表示pVAX-insulin免疫組，In表示人胰島素蛋白免疫組，1:4、1:2、1:1、2:1、4:1分別表示pVAX-insulin和人胰島素蛋白1:4共免疫組、pVAX-insulin和人胰島素蛋白12共免疫組、pVAX-insulin和人胰島素蛋白1:1共免疫組、pVAX-insulin和人胰島素蛋白2:1共免疫組和pVAX-insulin和人胰島素蛋白4:1共免疫組。
二、NOD小鼠上共免疫預(yù)防實(shí)驗(yàn)將64只雌性NOD小鼠均分為4組，每組16只，第1組(陰性對(duì)照組)每只分別免疫0.9％NaCl水溶液100微升，第2組(pVAX-insulin免疫組)每只分別免疫含100微克pVAX-insulin的0.9％NaCl水溶液100微升，第3組(人胰島素蛋白免疫組)每只分別免疫含100微克人胰島素蛋白的0.9％NaCl水溶液100微升，第4組(pVAX-insulin和人胰島素蛋白共免疫組)每只分別免疫含100微克pVAX-insulin和100微克人胰島素蛋白的O.9％NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等劑量加強(qiáng)免疫一次，并于第二次免疫后每周用血糖儀(購自北京怡成公司)檢測小鼠的血糖變化并記錄。若連續(xù)兩周小鼠的血糖水平超過200mg/dl，即認(rèn)為此NOD患有糖尿病。
如圖4所示，統(tǒng)計(jì)每組NOD小鼠的發(fā)病率，正常情況下，雌性NOD小鼠的糖尿病的發(fā)病率是60％左右。在pVAX-insulin和人胰島素蛋白共免疫組里，NOD小鼠的發(fā)病率有了明顯的將低，只有一只小鼠發(fā)病，并且發(fā)病的時(shí)間也有了明顯的延遲。說明共免疫pVAX-insulin和人胰島素蛋白可有效地預(yù)防I型糖尿病。圖4中， NOD表示陰性對(duì)照組小鼠，Insulin表示人胰島素蛋白免疫組小鼠，pVAX-insulin表示pVAX-insulin免疫組小鼠，Insulin+pVAX-insulin表示pVAX-insulin和人胰島素蛋白共免疫組小鼠。
對(duì)陰性對(duì)照組小鼠、已發(fā)病的糖尿病小鼠和pVAX-insulin和人胰島素蛋白共免疫組的胰腺組織進(jìn)行切片、HE染色，結(jié)果也表明，在pVAX-insulin和人胰島素蛋白共免疫組的胰島組織中，淋巴細(xì)胞的浸潤比其它發(fā)病組的情況要輕微，與正常的未發(fā)病的NOD小鼠(陰性對(duì)照組小鼠)相近(圖5)。
該實(shí)驗(yàn)證明了共免疫胰島素DNA和蛋白，能夠有效地預(yù)防I型糖尿病的發(fā)生。在本次實(shí)驗(yàn)中重復(fù)驗(yàn)證了共免疫現(xiàn)象的免疫抑制性。尤其在NOD小鼠上，能夠預(yù)防工型糖尿病的發(fā)生。
總之，該實(shí)驗(yàn)證明了一種預(yù)防I型糖尿病的新方法。進(jìn)一步探討相關(guān)機(jī)制可能會(huì)發(fā)展出對(duì)人和動(dòng)物自身免疫疾病治療的新方法。
實(shí)施例3、采用共免疫的方法治療/預(yù)防自主性卵巢炎摘要 自身免疫卵巢疾病(AODautoimmune ovarian disease)是人類早期卵巢敗育(POFpremature ovarian failure)的誘因之一。AOD的自身蛋白抗原有卵透明帶蛋白(ZP3)。
用MZP3蛋白和CFA誘導(dǎo)的AOD小鼠模型，我們探討了一個(gè)更實(shí)用的治療卵巢炎的技術(shù)。根據(jù)我們以前觀察到的結(jié)果一共免疫匹配的DNA和蛋白可以誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)的免疫抑制，我們采用共免疫的方法來改善AOD。結(jié)果顯示，共免疫M(jìn)ZP3 DNA和蛋白改善了AOD，并且抑制了抗原特異性的T細(xì)胞反應(yīng)，減低了炎癥因子IL-12和INF-γ的表達(dá)水平，這些作用可能是由于共免疫誘導(dǎo)出了一群特異性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來完成的。這群調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特征是CD4+/CD25-/FoxP3+，并能表達(dá)IL-10。我們第一次報(bào)道了用共免疫DNA和蛋白的方法來治療自身免疫疾病。
近百年來，近年來研究發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)之間存在著密切而復(fù)雜的關(guān)系[1，2]。據(jù)此關(guān)系建立了新型免疫不育技術(shù)，該技術(shù)是利用基因重組等分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，以生殖過程中的關(guān)鍵因子為靶抗原的疫苗，利用免疫系統(tǒng)對(duì)外加的靶抗原產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答，使體內(nèi)的靶生殖抗原喪失功能，阻斷過度繁殖動(dòng)物的生育力，破壞過度繁殖動(dòng)物的正常生殖過程，維持生物物種之間及其與環(huán)境之間的動(dòng)態(tài)平衡[3]。鼠的卵膜外都有由一層卵透明帶所完全包圍。卵透明帶是在初級(jí)卵母細(xì)胞成熟過程中的早期，由卵母細(xì)胞和初級(jí)卵母細(xì)胞分泌而形成的一層含糖蛋白的嗜酸性膜，由ZP1、ZP2、ZP3組成[4]。卵透明帶在受精過程中有兩個(gè)重要作用一是使精子附著在卵透明帶上，二是在精子結(jié)合以后誘導(dǎo)精子的頂體反應(yīng)使精子進(jìn)入卵中[5]，其中ZP3是ZP中的一種主要糖蛋白，作為精子的初級(jí)受體，在精卵結(jié)合過程中更為重要，已被認(rèn)為是一種理想的不育疫苗[6]。
但是在免疫不育疫苗的制備工程中發(fā)現(xiàn)常伴隨卵巢炎的發(fā)生，Dunbar等[7]用天然的豬ZP糖蛋白和去糖基的ZP蛋白主動(dòng)免疫雌性個(gè)體而導(dǎo)致阻斷受精。但是，研究表明免疫后的動(dòng)物在排卵周期、激素水平和卵巢中卵泡發(fā)育方面，有的出現(xiàn)了短暫的變化，有的出現(xiàn)了不可逆的改變。
婦女更年期的正常年齡一般為50歲，如果在40歲以前喪失了卵泡的功能就可被認(rèn)為是患有早期卵巢敗育(POFpremature ovarian failure)，這種疾病在婦女中的發(fā)病率一般為1-2％，嚴(yán)重的可能在十幾歲就會(huì)患這種疾病[8]。自身卵巢免疫疾病(AODautoimmune ovarian disease)被認(rèn)為是POF的主要誘因之一[9-11]；Rhim等采用腳底和皮下注射MZP3的一段短肽(330 to 342)建立了一個(gè)新的小鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型用于卵巢自身免疫疾病的研究，這個(gè)模型可在一定程度上模擬婦女早期卵巢敗育[12]。這種自身免疫疾病是由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的，并且Lou等發(fā)現(xiàn)自身抗體的產(chǎn)生可以改變T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的分布，并且會(huì)導(dǎo)致靶器官功能單位的喪失[13]。
作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)控者——調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以負(fù)調(diào)控機(jī)體對(duì)自身抗原的免疫反應(yīng)，從而使機(jī)體免受自身免疫疾病的傷害。天然的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞一般為CD4+CD25+雙陽性T細(xì)胞，這類細(xì)胞可以表達(dá)一種功能性轉(zhuǎn)錄因子——FoxP3，這種細(xì)胞因子是正常免疫系統(tǒng)重要的細(xì)胞組成成分[14]。這類細(xì)胞的存在使得研究者使用抗原特異性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞去治療自身免疫疾病和同種異體移植排斥[15-17]。Samy等使用抗原依賴性的CD4+CD25+雙陽性調(diào)節(jié)T細(xì)胞控制了自身免疫疾病——卵巢炎的發(fā)生[18]。Jin等發(fā)現(xiàn)采用蛋白和DNA共免疫的方法可以抑制抗原特異性的細(xì)胞反應(yīng)[19]，這種抑制功能可能與誘導(dǎo)出了抗原特異性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有關(guān)，所以本論文以小鼠為動(dòng)物模型，利用蛋白和DNA共免疫抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法探索治療自身免疫疾病——卵巢炎的方法及相應(yīng)的機(jī)理。
1材料和方法1.1材料和試劑pMD18-T測序載體購自Takara公司，大腸桿菌DH5α菌株為我們實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。RNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA marker、限制性內(nèi)切酶、exTaq酶以及RT-PCR和PCR引物均購自Takara公司；測序試劑盒購自美國PE公司，其它試劑均為分析純。
1.2mzp3基因的克隆取性成熟小鼠卵巢，在Trizo中充分研磨，并根據(jù)說明書進(jìn)行總RNA的提取。根據(jù)已發(fā)表的基因序列(GenBank numberBC103585)設(shè)計(jì)引物，引物序列為MZP3 P1AATGAATTCATGAATTCCCAGACTCTGTGGCMZP3 P2TTACTCGAGTTAAGTCCAGCCTTCCACAGTCT擴(kuò)增片段為MZP3的核酸序列第63到1143位堿基。
依照TaKaRa RNA PCR Kit操作指南進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄用Oligo(dT)作下游引物，反應(yīng)條件42℃30min，99℃5min，5℃5min。PCR反應(yīng)用mzp3基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增參數(shù)94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃70s 35個(gè)循環(huán)；72℃10min，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。按Takara公司PCR Fragment Recovery Kit說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收?；厥盏膍zp3 cDNA片段與pMD 18-T載體在T4 DNA連接酶的作用下16℃過夜，使mzp3 cDNA連接到pMD 18-T的載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化按參考文獻(xiàn)(Sambrook J等1989)[20]。按相關(guān)的參考文獻(xiàn)(Sambrook J等1989)進(jìn)行質(zhì)粒DNA的小量提取，提取后的質(zhì)粒用BamHI和HindIII雙酶切進(jìn)行重組質(zhì)粒的鑒定，酶切反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，正確的克隆進(jìn)行質(zhì)粒的大量提取。為鑒定克隆的cDNA序列，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行純化，并用BcaBEST primer RV-M和BcaBEST primer M13-47對(duì)mzp3 cDNA在PE377全自動(dòng)測序儀進(jìn)行雙向DNA序列測定，所得序列用PE公司SeqEd v1.0.3軟件進(jìn)行分析。
1.3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及組質(zhì)粒在BHK21細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)將上述經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切，連接到同樣酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3，該載體命名為pcDmzp3，經(jīng)序列鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行真核轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。具體轉(zhuǎn)染方法參照lipofectamine產(chǎn)品說明書。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDmzp3轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，具體操作步驟見說明書。轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后收集細(xì)胞，提取總RNA以MZP3 P1和MZP3 P2為引物用RT-PCR方法檢測目的基因的表達(dá)。
1.4原核表達(dá)載體的構(gòu)建、蛋白表達(dá)及蛋白純化重組質(zhì)粒pMD18-T/MZP3經(jīng)EcoRI和Xho I雙酶切，連接到同樣酶切的真核表達(dá)載體pGEX-4T-1，經(jīng)序列鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行蛋白表達(dá)。挑取單個(gè)菌落，接種于新鮮的LB(含Amp+50mg/L)培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過夜。次日，按1％的接種量轉(zhuǎn)種于新鮮的LB(含Amp+50mg/L)培養(yǎng)基中。當(dāng)A600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，在1.0mmol/LIPTG的誘導(dǎo)下，于37℃表達(dá)5h。取1mL菌液離心收集菌體，再用雙蒸水洗1次，懸于1×SDS樣品加樣液中，置沸水浴中煮10min。以12000g離心2min，取15μL上清液進(jìn)行100g/L SDS-PAGE，并以考馬斯亮藍(lán)染色。
離心收集誘導(dǎo)后的E.coli BL21(DE3)菌體，用PBS洗滌后，用1/20原培養(yǎng)體積的細(xì)胞裂解液L1(10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA和200mmol/L NaCl)重懸細(xì)菌沉淀，冰浴15min后，超聲裂解細(xì)菌至菌液不再粘稠。然后4℃，12000g離心10min去上清，收集沉淀獲得初制的MZP3包涵體蛋白。將初制包涵體蛋白用L1和4M尿素洗滌，70℃保溫10min，4℃，12000g離心5min，重復(fù)3次。用L3(10mmol/LTris-HCl、1mol/L NaCl、8M尿素、5mmol/L β-巰基乙醇和5mmol/L DTT，pH10)溶解包涵體蛋白，55℃保溫10min，4℃，12000g離心5min去除沉淀，上清裝入透析袋中在含4M尿素的L2(10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)和1mol/L NaCl)中透析8h，之后在含2M尿素的L2中透析8h，逐級(jí)遞減尿素的濃度，直至將尿素從蛋白溶液中除去，用Bradford測定蛋白含量。
1.5卵巢炎模型的誘導(dǎo)6-8周齡，雌性，C57BL/6小鼠，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。將濃度為2mg/ml蛋白與完全傅式佐劑(CFAcomplete Freund’s adjuvant)1∶1混合，乳化完全后每只小鼠通過腳掌和肌肉免疫100μl，既每只小鼠免疫100μg蛋白。只免疫CFA的小鼠作為對(duì)照。14天后采血，收集血清，間接ELISA檢測相應(yīng)的抗體滴度。以純化的GST-MZP3融合蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，ELISA法檢測小鼠血清中MZP3蛋白的特異性抗體水平。將蛋白稀釋成5μg/ml，96孔酶標(biāo)板用100μl/孔包被4℃過夜；棄去包被液PBST洗板3次，5％脫脂奶粉-PBST在37℃封閉1h；洗板后加入不同稀釋度的小鼠血清37℃孵育2h；洗板后加入1∶1000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(HRP-IgG)，50μl/孔，37℃孵育2h后棄去；洗板，加入50μL/孔TMB室溫避光顯色反應(yīng)30min；2mol/L硫酸中止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定0D450/650的值。組織學(xué)評(píng)價(jià)卵巢疾病卵巢在Bouin’s固定液中固定24小時(shí)，進(jìn)行石蠟包埋，然后連續(xù)切片(5μm)并進(jìn)行H.E(hematoxylin and eosin)染色。按嚴(yán)重程度對(duì)卵巢病理學(xué)進(jìn)行分級(jí)，1間質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)炎癥；2和3增加的多個(gè)位點(diǎn)的炎癥反應(yīng)或卵泡之間和內(nèi)部的肉芽腫；4卵泡消失和卵巢閉鎖?？乖禺愋粤馨图?xì)胞增殖反應(yīng)免疫后14d將小鼠處死，無菌取出腿彎處淋巴節(jié)，將淋巴節(jié)研碎，2000rpm離心5min后棄去上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×107/mL。取2×107個(gè)細(xì)胞，2000rpm離心5min后棄去上清，用無菌PBS重懸細(xì)胞，加入1.5μlCFSE(1mmol/ml)，37℃輕搖10min，加入等體積的牛血清終止反應(yīng)，2000rpm離心5min后棄去上清，用PBS洗滌3次；最后用1ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，每空加100μl細(xì)胞，用MZP3(10μg/ml)蛋白來刺激T細(xì)胞增殖，用BSA(2μg/ml)作為非特異性抗原對(duì)照，ConA(10μg/ml)作為陽性對(duì)照，用流式細(xì)胞儀檢測增殖情況。采用胞內(nèi)染色的方法檢測細(xì)胞因子IL-12和INF-γ免疫后14d將小鼠處死，無菌取出脾臟，將脾臟組織研碎，2000rpm離心5min后棄去上清，用1-2mL紅細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞2-3min，加6-12mL含4％血清的RPMI 1640培養(yǎng)基終止，2000rpm，離心5min后棄去上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度到2×106/mL。淋巴節(jié)單細(xì)胞懸液的制備同上，每孔加入2×106個(gè)細(xì)胞(100μl)，用10μg/ml的MZP3蛋白刺激4-6個(gè)小時(shí)，加入莫輪菌素(monencin)抑制1-2小時(shí)。然后進(jìn)行胞內(nèi)染色，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞因子的表達(dá)情況。具體過程如下(1)小鼠在免疫后21天處死，制備脾臟單細(xì)胞懸液，加入2ml紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞，用洗液洗一遍，離心重懸細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；(2)抗Fcg抗體封閉各組取1×106個(gè)細(xì)胞，加入適量抗Fcg抗體(用量見試劑說明書)，封閉30分鐘；(3)加入2-3ml洗液，2000rpm離心5分鐘，棄去上清，各管加入適量熒光標(biāo)記抗體充分混勻，4℃避光反應(yīng)30分鐘；(4)加入2-3ml洗液，2000rpm離心5分鐘，棄去上清，加入0.2ml 4％多聚甲醛于4℃固定20分鐘；(5)加入2-3ml洗液，2000rpm離心5分鐘，棄去上清，加入0.2ml破膜劑細(xì)胞打孔，充分混勻，室溫避光反應(yīng)15分鐘；(6)加入2-3ml洗液，充分混勻，2000rpm離心5分鐘，棄去上清，各管加入適量的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記的熒光標(biāo)記單克隆抗體(用量按試劑說明書取用)，做細(xì)胞胞內(nèi)分析物的標(biāo)記；(7)細(xì)胞內(nèi)染色抗體與細(xì)胞充分混勻，室溫避光反應(yīng)30分鐘；(8)加入2-3mL洗液，充分混勻，500xg離心5分鐘，棄去上清，每管加入300μL洗液重懸細(xì)胞；(9)流式細(xì)胞儀分析。采用RT-PCR方法檢測細(xì)胞因子IL-2按照TRIZOLReagent(Gibco)說明書，每組取107個(gè)細(xì)胞，用1ml TRIzol Reagent裂解，然后加200μl氯仿，混勻后，12000r/min，4℃離心15min，取上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管，加500μl異丙醇，混勻后室溫靜置10min，12000r/min，4℃離心10min，棄去上清，RNA沉淀用75％的乙醇洗滌后，溶于20μl經(jīng)DEPC處理的超純水中，-80℃儲(chǔ)存。取1μlRNA樣品加599μl超純水，在紫外分光光度計(jì)上比色，讀取A260和A280的OD值。根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.6共免疫治療卵巢炎將濃度為2mg/ml蛋白與CFA1∶1混合，乳化完全后每只小鼠通過腳掌和肌肉免疫100μl，14d后通過肌肉免疫pcDmzp3+MZP3各100μg，免疫pcDNA3、pcDNA3+MZP3、pcDmzp3、pcDmzp3+OVA和MZP3作為對(duì)照組，14d后加強(qiáng)免疫，在加強(qiáng)免疫后一周，無菌取小鼠的脾臟細(xì)胞，通過MTT法進(jìn)行T細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，MZP3蛋白抗原來刺激T細(xì)胞增殖，用BSA作為非特異性抗原對(duì)照，用ConA作為陽性對(duì)照。具體過程如下用MTT法檢測小鼠T細(xì)胞體外增殖活性(1)取脾臟加強(qiáng)免疫后7d將小鼠處死，無菌取出脾臟；(2)制成單細(xì)胞懸液將脾臟組織研碎，2000rpm離心5min后棄去上清，用1-2mL紅細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞2-3min，加6-12mL含4％血清的RPMI 1640培養(yǎng)基終止；2000rpm，離心5min后棄去上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
(3)細(xì)胞計(jì)數(shù)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度到3×106/mL；(4)加入細(xì)胞板每孔加入100μl細(xì)胞，分別加入ConA(終濃度10μg/ml)，MZP3蛋白(終濃度10μg/ml)，BSA(非特異性抗原，終濃度2μg/ml)刺激48-72h；(5)顯色每孔加入MTT溶液20μL，37℃，5％CO2，培養(yǎng)3-4h，2000rpm離心5min，棄上清，每孔加100μl二甲基亞砜，37℃輕搖20-30min；(6)讀數(shù)用酶標(biāo)儀(Magellan，Tecan Austria GmbH)測定595nm的OD值；(7)結(jié)果計(jì)算刺激指數(shù)SI＝(各刺激孔的OD值-培養(yǎng)基OD值)/(未刺激孔的OD值-培養(yǎng)基OD值)。
淋巴細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)無菌條件下取小鼠腿彎處淋巴節(jié)，將淋巴節(jié)研碎，2000rpm離心5min后棄去上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度到3×106/mL，其余過程同上。
細(xì)胞因子IL-2、IL-12、INF-γ、IL-10、FoxP3和CD25的檢測及卵巢炎的評(píng)價(jià)同上。
2結(jié)果2.1基因克隆及序列分析采用提取的總RNA，以寡聚脫氧胸腺嘧啶為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到單鏈cDNA，再以設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增得到MZP3基因片段。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見一條約1200bp的條帶，與我們預(yù)計(jì)的一致。RT-PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-T/MZP3。重組質(zhì)粒用Bam HI和Hind III酶切，切出約1200bp DNA片段，與預(yù)計(jì)的連接片段大小相同。對(duì)pMD18-T/MZP3重組質(zhì)粒用BcaBESTprimer RV2M和BcaBEST primer M13247進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果顯示與已發(fā)表的序列同源性為99％。用DNAMAN對(duì)絨人、猴、狗、貓、豬、和牛MZP3基因進(jìn)行同源性分析，其同源性到達(dá)了73％(圖6a)，氨基酸序列同源性達(dá)到了71％(圖6b)。
2.2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組質(zhì)粒在BHK21細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)重組質(zhì)粒pMD18-T/MZP3及真核表達(dá)載體pcDNA3用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切，回收純化后進(jìn)行連接，將MZP3基因克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3中獲得重組載體pcDmzp3。重組質(zhì)粒以EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切，經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳顯示在大約1200bp處有一個(gè)條帶(圖7中a)，說明重組質(zhì)粒pcDmzp3構(gòu)建成功。將純化并定量好的質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)良好的BHK21細(xì)胞，并且72h收集細(xì)胞，以MZP3p1和MZP3p2為引物用RT-PCR方法檢測目的基因的表達(dá)情況，在1200bp處出現(xiàn)相應(yīng)條帶如圖7中b，表明重組載體在mRNA水平能有效在體外表達(dá)。
2.3原核表達(dá)載體的構(gòu)建，蛋白表達(dá)及純化重組質(zhì)粒pMD18-T/MZP3及真核表達(dá)載體pGEX4T-1用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切，回收純化后進(jìn)行連接，將MZP3基因克隆入真核表達(dá)載體pGEX4T-1中獲得重組載體pGEX4T-1/MZP3。重組質(zhì)粒以EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切，經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳顯示在大約1200bp處有一個(gè)條帶(見圖8中a)，說明重組質(zhì)粒pGEX4T-1/MZP3構(gòu)建成功。將純化并定量好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3)，將構(gòu)建的E.coliBL21(DE3)/MZP3轉(zhuǎn)化子在新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集轉(zhuǎn)化菌。取其全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。蛋白電泳結(jié)果表明，MZP3基因在E.coli BL21(DE3)中得到了大量表達(dá)(圖8中b)。收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體按超聲裂菌處理。SDS-PAGE結(jié)果表明誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)條帶存在于細(xì)菌裂解物的沉淀中，說明蛋白是以包含體的方式表達(dá)的。我們用純化包含體的方法對(duì)蛋白進(jìn)行了溶解，洗滌和復(fù)性，得到了純度較高的蛋白(圖8中c)。
2.4自主免疫疾病——卵巢炎的誘導(dǎo)將上述純化的MZP3蛋白的濃度調(diào)整到2mg/ml和等體積的完全弗氏佐劑(CFA)完全乳化，通過腳掌和肌肉注射的方法免疫8-10周齡雌性C57BL/6小鼠，每只小鼠100μl，注射100ul弗氏完全佐劑(CFA)的小鼠為佐劑對(duì)照組，注射100ul PBS為陰性對(duì)照組。14天后處死小鼠，取出卵巢，在Bouin’s固定液中固定24小時(shí)，然后用石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)切片和H.E(hematoxylin and eosin)染色。結(jié)果表明，免疫M(jìn)ZP3蛋白和CFA的小鼠8只中有7只出現(xiàn)了不同程度的卵巢炎，發(fā)病率為87.5％(圖9a)。在卵巢的間質(zhì)和正在生長的以及成熟的卵泡中均發(fā)現(xiàn)了炎癥反應(yīng)。卵泡被炎癥細(xì)胞浸潤并且嚴(yán)重的導(dǎo)致了卵子的丟失(圖9b)。相比而言，只注射CFA的小鼠沒有出現(xiàn)卵巢炎。
我們用ELISA法對(duì)采集的血清檢測了抗MZP3的抗體，免疫14天后，與對(duì)照組相比血清中出現(xiàn)了MZP3抗體，抗體滴度達(dá)到了25600(圖9c)。免疫M(jìn)ZP3蛋白和CFA引起了強(qiáng)烈的T細(xì)胞反應(yīng)(圖9d)，細(xì)胞因子IL-2(圖10a)，INF-γ(圖10b)和IL-12(圖10c)的表達(dá)水平得到了提高，這表明Th1型的免疫反應(yīng)被激活了。這些結(jié)果顯示卵巢炎被成功誘導(dǎo)，并且能夠用來評(píng)價(jià)這種方法的治療效果。
2.5共免疫M(jìn)ZP3 DNA和蛋白抑制了AOD的發(fā)生我們用構(gòu)建的AOD模型檢測共免疫策略治療卵巢炎的能力。C57BL/6小鼠先通過腳掌和肌肉注射MZP3蛋白和CFA，14天后，肌肉免疫M(jìn)ZP3蛋白和質(zhì)粒pcDmzp3，兩周后加強(qiáng)免疫。二免后7天檢測卵巢炎的發(fā)病情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有共免疫質(zhì)粒pcDmzp3和MZP3蛋白(命名為pcDmzp3+MZP3)的小鼠才出現(xiàn)了AOD的抑制現(xiàn)象(圖11a)。為了排除非特異性因素的影響，如質(zhì)粒的骨架序列或無關(guān)蛋白等，我們同時(shí)設(shè)立了免疫空質(zhì)粒pcDNA3和MZP3蛋白共免(命名為pcDNA3+MZP3)、質(zhì)粒pcDmzp3和OVA蛋白共免(命名為pcDmzp3+OVA)組作為對(duì)照。結(jié)果顯示對(duì)照組并沒有出現(xiàn)AOD的抑制現(xiàn)象，說明只有共免pcDmzp3+MZP3的小鼠才能抑制AOD的發(fā)生，進(jìn)而說明這種抑制是抗原特異性的。組織學(xué)分析也揭示了免疫pcDNA3+MZP3或pcDmzp3+OVA的小鼠卵巢出現(xiàn)了炎癥細(xì)胞浸潤，而免疫pcDmzp3+MZP3的小鼠卵巢沒有炎癥細(xì)胞浸潤(圖11b)。
IL-2、IL-12和INF-γ高水平表達(dá)是Th1型CD4+T細(xì)胞反應(yīng)的特點(diǎn)并且這些免疫調(diào)節(jié)因子在幾種自主免疫疾病中起了重要作用[21-26]。我們檢測了共免pcDmzp3+MZP3的小鼠這些細(xì)胞因子的表達(dá)是否發(fā)生了變化。免疫pcDNA3+MZP3或pcDmzp3+OVA的小鼠IL-12和INF-γ的表達(dá)沒有被抑制，而免疫pcDmzp3+MZP3的小鼠IL-12(圖11c)和INF-γ(圖11d)的表達(dá)被抑制。這就暗示了共免pcDmzp3+MZP3的小鼠出現(xiàn)了抗炎癥免疫調(diào)節(jié)的功能。
T細(xì)胞反應(yīng)被認(rèn)為參與了AOD的發(fā)生，所以我們檢測了從小鼠脾臟中分離的T細(xì)胞，這些小鼠首先被免疫了MZP3蛋白和CFA，14天后免疫pcDNA3、pcDNA3+MZP3、pcDmzp3、pcDmzp3+MZP3、pcDmzp3+OVA和MZP3，兩周后加強(qiáng)免疫，在二免后第7天取出脾臟。這些T細(xì)胞被用來分析對(duì)MZP3蛋白抗原的反應(yīng)能力。從免疫pcDmzp3+MZP3的小鼠中分離的T細(xì)胞基本上沒有擴(kuò)增能力，而從其它組分離的T細(xì)胞顯示出了很強(qiáng)的擴(kuò)增能力(圖11e)。這些結(jié)果顯示共免疫pcDmzp3+MZP3出現(xiàn)的AOD抑制現(xiàn)象與沒有抗原特異性的T細(xì)胞反應(yīng)是相關(guān)的。進(jìn)一步說明共免疫pcDmzp3+MZP3出現(xiàn)的AOD抑制現(xiàn)象是通過下調(diào)炎癥因子的表達(dá)和抑制T細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生的?？偟膩碚f，AOD的抑制是抗原特異性的，因?yàn)殄e(cuò)配的組合沒有產(chǎn)生同共免疫pcDmzp3+MZP3一樣的結(jié)果。
MZP3自主抗體在指導(dǎo)自身免疫炎癥反應(yīng)的分布方面起到了重要作用并且能夠增強(qiáng)自身免疫疾病的嚴(yán)重程度[13]。所以我們接下來檢測了共免疫是否抑制了抗MZP3抗體的產(chǎn)生。然而結(jié)果顯示自主抗體的滴度在免疫組pcDmzp3+MZP3、pcDNA3+MZP3或MZP3之間是相同的(圖11f)。這個(gè)結(jié)果同以前的研究是一致的，如果沒有T細(xì)胞反應(yīng)只轉(zhuǎn)移抗體不能誘導(dǎo)自身免疫卵巢炎疾病[13]。
2.6定性共免疫誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特征調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠抑制T細(xì)胞反應(yīng)并且阻止自身免疫免疫疾病的發(fā)生。細(xì)胞因子IL-10和FoxP3在T細(xì)胞反應(yīng)抑制過程中起到了重要作用[27-29]。為了檢測由共免疫誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能否表達(dá)特征性的細(xì)胞因子和標(biāo)志，我們從分別免疫了pcDNA3、pcDNA3+MZP3、pcDmzp3、pcDmzp3+MZP3、pcDmzp3+OVA和MZP3的小鼠中分離出T細(xì)胞。這些細(xì)胞因子或標(biāo)志用特異性的熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行胞內(nèi)染色，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。從免疫pcDmzp3+MZP3的小鼠中分離的T細(xì)胞能夠高水平表達(dá)IL-10(圖12a)和FoxP3(圖12b)，相反，對(duì)照組只能表達(dá)低水平的IL-10和FoxP3。轉(zhuǎn)錄因子FoxP3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特征性因子[30，31]，所以我們推測共免疫可能誘導(dǎo)出了一種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。我們檢測了這類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是不是屬于CD4+CD25+雙陽性的，對(duì)CD25的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)各組之間CD25的表達(dá)是基本相同的(圖13)。
綜合以上數(shù)據(jù)，采用共免疫相同基因的DNA和蛋白我們可能誘導(dǎo)出了一類CD4+CD25-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，這類T細(xì)胞可以抑制抗原特異性的T細(xì)胞反應(yīng)并能阻止自身免疫疾病的發(fā)生。
討論我們的研究證明了共免疫M(jìn)PZ3 DNA和蛋白誘導(dǎo)了一種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，這種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以抑制自身免疫疾病卵巢炎的發(fā)生。這種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表型為CD4+CD25-Foxp3+，表達(dá)IL-10并且能夠抑制抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，減少細(xì)胞因子IL-12和INF-γ的表達(dá)。
卵透明帶蛋白在哺乳動(dòng)物中是非常保守的，在小鼠中建立AOD模型可以更好的理解其它動(dòng)物尤其是人類自身免疫疾病卵巢炎的發(fā)病機(jī)理。通過腳掌和皮下注射15個(gè)氨基酸的ZPP3短肽(328-342)與CFA，在B6AF1小鼠[(C57BL/6 X A/J)F1]上誘導(dǎo)出了自身免疫疾病卵巢炎[12，13]，而C57BL/6小鼠沒有卵巢炎的發(fā)生。通過在腳掌和肌肉注射MZP3蛋白和CFA，我們?cè)贑57BL/6小鼠上成功建立了卵巢炎模型，盡管疾病的嚴(yán)重程度不如以前報(bào)道的[13]。推測以下兩個(gè)原因可能造成了這一差異。(1)我們使用的MZP3蛋白含有更多的T細(xì)胞表位，這些細(xì)胞表位引起了更強(qiáng)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，而AOD就是由T細(xì)胞反應(yīng)引起的[12]。(2)將皮下注射改為肌肉注射和更多的B細(xì)胞表位誘導(dǎo)產(chǎn)生了更高水平的自身免疫抗體。自身免疫抗體可以改變T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的分布并能加重炎癥反應(yīng)[13]。
天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+CD25+可以抑制T細(xì)胞反應(yīng)并維持了自身免疫耐受。如果將調(diào)節(jié)性T細(xì)胞去除則可引起疾病的發(fā)生[32，33，34]，所以這些細(xì)胞在阻止自身免疫疾病發(fā)生中起到了重要的作用。這些特征使得調(diào)節(jié)性T細(xì)胞成為了潛在的自身免疫疾病治療工具[35]。最近是一些研究結(jié)果表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞確實(shí)可以治療自身免疫疾病，這些調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以是抗原非特異性的[36-38]，也可以是抗原特異性的[18，39]。之前，我們也報(bào)道過共免疫pcD-VP1和146S抗原誘導(dǎo)了T細(xì)胞反應(yīng)免疫抑制[19]。在這個(gè)研究中我們用這種方法去抑制AOD，既共免疫M(jìn)ZP3 DNA和蛋白?？乖禺愋缘腡細(xì)胞反應(yīng)被抑制，并且細(xì)胞因子IL-12和INF-γ的表達(dá)也被下調(diào)，而IL-10和FoxP3的表達(dá)水平是上升的，我們推測可能誘導(dǎo)出了一類抗原特異性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。CD25的染色結(jié)果表明，誘導(dǎo)的這一類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能是CD25-的。因此我們得出結(jié)論，共免疫誘導(dǎo)出了抗原特異性的免疫抑制，這種免疫抑制是由CD4+CD25-FoxP3+IL10+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的。
總之，我們證明了一種改善自身免疫疾病的新方法。一類新的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能被誘導(dǎo)并介導(dǎo)了抗原特異性的T細(xì)胞免疫抑制。因此，進(jìn)一步探討相關(guān)機(jī)制可能會(huì)發(fā)展出對(duì)人和動(dòng)物自身免疫疾病治療的新方法。
該實(shí)施例中的參考文獻(xiàn)出處如下1鄒邵林、郭聰、劉新平.洞庭湖區(qū)洲灘環(huán)境演變對(duì)東方田鼠爆發(fā)成災(zāi)的影響[J]自然災(zāi)害報(bào)，第9卷2期2000年5月118-122.
2包維楷等.生態(tài)恢復(fù)重建研究與發(fā)展現(xiàn)狀及存在的主要問題[J].世界科技研究與發(fā)展.第23卷1期44-48.
3 Joseph Kim，Joo-Sung Yang，Kelledy H.etal.Modulation ofantigen-specific cellular immune responses to DNA vaccination in rhesusmacaques through the use of IL-2，IFN-g，or IL-4 gene adjuvants[J].Vaccine，2001，19 2496-2505.
4 Gwatkin，R.B.L.Effect of viruses on early mammalian development，Iaction of Mengo Encephalitis Virus on mouse ova cultivated in vitro[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1963，50576-581.
5 Baltz，J.M.，Katz，R.A.The mechanics of sperm-egg interaction at the zonapellucida[J].Biophys.J，1988，54(4)643～654.
6 Lloyd ML，Shellam GR，Papadimitriou JM，et al.Immunocontraception isinduced in BALB/c mice inoculated with murine cytomegalovirus expressingmouse zona pellucida 3[J].Biol Reprod，2003，68(6)2024-2032.
7 Dunbar，B.S.，Bundman，D.S.，Evidence for a role of the majorglycoprotein in the structural maintenance of the pig zona pellucida[J].J.Reprod.Fertil，1987，81，363-376.
8 Burton K A，Vanee C C，Purcell K，WinshipI，Shelling A N.Autosomaltranslocation associated with premature ovarian failure.J Med Genet 2000，371-29.Wheatcroft N，Weetman.Is premature ovarian failure an autoimmunedisease？Autoimmunity 1997，25157-16510.Hoek A，Schoemaker J，Drexhage HA.Premature ovarian failure andovarian autoimmunity.Endocr Rev 1997，18107-13411.Coulam CB，Kempers RD，Randall RV.Premature ovarian failureevidence for the autoimmune mechanism.Fertil Steril 1981，36238-24012.Rhim S H，Millar SE，Robey F，Luo A M，Lou Y H，Yule T，Allen P，DeanJ，Tung K S K.Autoimmune disease of the ovary induced by a ZP3 peptide fromthe mouse zona pellucida.J Clin Invest 1992，8928-3513 Lou Y，Park K，Agersborg S，Alard P，Tung K S K.Retargeting TCell-Mediated InflammationA New Perspective on Autoantibody Action.TheJournal of Immunology，2000，1645251-5257.
14 Sakaguchi，S.2005.Naturally arising Foxp3-expressing CD25(+)CD4(+)regulatory T cells in immunological tolerance to self and nonself.Nat.Immunol.6345-352.
15.Viglietta，V.，C.Baecher-Allan，H.L.Weiner，and D.A.Hafler.2004.Loss of functional suppression by CD4+CD25+regulatory T cells in patientswith multiple sclerosis.J.Exp.Med.199971-979.
16.Ehrenstein，M.R.，J.G.Evans，A.Singh，S.Moore，G.Warnes，D.A.Isenberg，and C.Mauri.2004.Compromised function of regulatory T cells inrheumatoid arthritis and reversal by anti-TNFalpha therapy.J.Exp.Med.200277-285.
17.Kriegel，M.A.，T.Lohmann，C.Gabler，N.Blank，J.R.Kalden，and H.M.Lorenz.2004.Defective suppressor function of human CD4+CD25+regulatoryT cells in autoimmune polyglandular syndrome type II.J.Exp.Med.1991285-1291.
18 Samy，E T，Parker L A，Sharp C P，Tung K S K.Continuous control ofautoimmune disease by antigen-dependent polyclonal CD4+CD25+regulatory Tcells in the regional lymph node.JEM，2005，202771-78119 Jin，H.，Y.Kang，G.Zheng，Q.Xie，C.Xiao，X.Zhang，Y.Yu，K.Zhu，G.Zhao，F(xiàn).Zhang，A.Chen，and B.Wang.2005.Induction of active immunesuppression by co-immunization with DNA-and protein-based vaccines.Virology 337183-191.
20 Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T.Molecular CloningA LaboratoryManual，(2nded).New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989.19~5621 Sharp C，Thompson C，Samy E T，Noelle R，Tung K S K.CD40 Ligand inPathogenesis of Autoimmune Ovarian Disease of Day 3-Thymectomized MiceImplication for CD40 Ligand Antibody Therapy.The Journal of Immunology，2003，1701667-1674.
22.Neurath，M.F.，I.Fuss，B.L.Kelsall，E.Stuber，and W.Strober.1995.Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitisin mice.J.Exp.Med.1821281.
23.Leonard，J.P.，K.E.Waldburger，and S.J.Goldman.1995.Preventionof experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies againstinterleukin 12.J.Exp.Med.181381.
24.Tarrant，T.K.，P.B.Silver，J.L.Wahlsten，L.V.Rizzo，C.C.Chan，B.Wiggert，and R.R.Caspi.1999.Interleukin 12 protects from a T helpertype 1-mediated autoimmune disease，experimental autoimmune uveitis，througha mechanism involving interferon γ，nitric oxide，and apoptosis.J.Exp.Med.189219.
25.McIntyre，K.W.，D.J.Shuster，K.M.Gillooly，R.R.Warrier，S.E.Connaughton，L.B.Hall，L.H.Arp，M.K.Gately，and J.Magram.1996.Reduced incidence and severity of collagen-induced arthritis ininterleukin-12-deficient mice.Eur.J.Immunol.262933.
26.Okura，Y.，K.Takeda，S.Honda，H.Hanawa，H.Watanabe，M.Kodama，T.Izumi，Y.Aizawa，S.Seki，and T.Abo.1998.Recombinant murineinterleukin-12 facilitates induction of cardiac myosin-specific type 1helper T cells in rats.Circ.Res 821035.
27.Fontenot，J.D.，M.A.Gavin，and A.Y.Rudensky.2003.Foxp3 programsthe development and function of CD4+CD25+regulatory T cells. Nat Immunol4330-336.
28.Roncarolo，M.G.，R.Bacchetta，C.Bordignon，S.Narula，and M.K.Levings.2001.Type 1 T regulatory cells.Immunol Rev18268-79.
29.Stock，P.，O.Akbari，G.Berry，G.J.Freeman，R.H.Dekruyff，andD.T.Umetsu.2004.Induction of T helper type 1-like regulatory cells thatexpress Foxp3 and protect against airway hyper-reactivity.Nat Immunol51149-1156.
30.Khattri，R.，D.Kasprowicz，T.Cox，M.Mortrud，M.W.Appleby，M.E.Brunkow，S.F.Ziegler，and F.Ramsdell.2001.The Amount of Scurfin ProteinDetermines Peripheral T Cell Number and Responsiveness.J Immunol1676312-6320.
31.Khattri，R.，T.Cox，S.A.Yasayko，and F.Ramsdell.2003.Anessential role for Scurfin in CD4+CD25+T regulatory cells.Nat Immunol4337-342.
32.Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，Itoh M，Toda M.Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor achains.J Immunol 1995；1551151-64.
33.Sakaguchi S，Takahashi T，Nishizuka Y.Study on cellular events inpostthymectomy autoimmune oophoritis in mice.I.Requirement of Lyt-1effector cells for oocytes damage after adoptive transfer.J Exp Med 1982；1561565-76.
34.Asano M，Toda M，Sakaguchi N，Sakaguchi S.Autoimmune disease as aconsequence of developmental abnormality of a T cell subpopulation.J ExpMed 1996；184387-96.
35 Nielsen J，Holm T L and Claesson M H.CD4+CD25+regulatory T cellsII.Origin，disease models and clinical aspects.APMIS 112642-50，200436.KohmAP，Carpentier PA，Anger HA，Miller SD.Cutting edgeCD4+CD25+regulatory T cells suppress antigen-specific autoreactive immune responsesand central nervous system inflammation during active experimentalautoimmune encephalomyelitis.J Immunol.2002；1694712-4716.
37.Zhang X，Koldzic DN，Izikson L，et al.IL-10 is involved in thesuppression of experimental autoimmune encephalomyelitis by CD25(+)CD4(+)regulatory T cells.Int Immunol.2004；16249-256.
38.Mottet C，Uhlig HH，Powrie F.Cutting edgecure of colitis byCD4+CD25+regulatory T cells.J Immunol.2003；1703939-3943.
39.Tang Q，Henriksen KJ，BiM，et al.In vitro-expanded antigen-specificregulatory T cells suppress autoimmune diabetes.J Exp Med.2004；1991455-1465.
實(shí)施例4、采用共免疫的方法治療/預(yù)防多發(fā)型硬化癥多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性脫髓鞘疾病的代表，屬于自身免疫疾病。研究MS的最常見的動(dòng)物模型稱為“實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎”(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)，動(dòng)物的EAE臨床表現(xiàn)及病理改變與急性多發(fā)性硬化極其相似，因此成功建立EAE動(dòng)物模型是研究EAE的先決條件。
本實(shí)驗(yàn)題目的目的就是基于聯(lián)合免疫引起的免疫抑制，在小鼠的EAE模型中進(jìn)行治療或預(yù)防EAE的發(fā)生，并在研究過程中進(jìn)一步探討MS發(fā)病的相關(guān)免疫機(jī)制。
多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)的自身蛋白抗原有髓磷脂寡突細(xì)胞糖蛋白(MOG)和二種髓磷脂抗原(MBP和PLP蛋白脂蛋白)。
目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，僅停留在EAE小鼠模型的誘導(dǎo)及相關(guān)MOG基因DNA的構(gòu)建上，還未深入展開，初步結(jié)果總結(jié)如下。
1、MOG35-55 2copies基因的克隆與表達(dá)1.1材料和試劑pMD18-T測序載體購自Takara公司，大腸桿菌DH5α菌株為我們實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA marker、限制性內(nèi)切酶、exTaq酶以及RT-PCR和PCR引物均購自Takara公司；測序試劑盒購自美國PE公司，其它試劑均為分析純。
1.2方法1.2.1 MOG35-55基因克隆誘導(dǎo)動(dòng)物的EAE模型常用的自身抗原為MOG(Myelin OligodendrocyteGlycoprotein)的35-55個(gè)氨基酸(氨基酸序列為MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)，其DNA序列為GAGGTGGGTTGGTACCGTTCTCCCTTCTCAAGAGTGGTTCACCTCTACCGAAATGGCAAG根據(jù)基因序列，設(shè)計(jì)合成引物及DNA片斷，通過Overlap PCR的方法構(gòu)建兩拷貝MOG35-55的質(zhì)粒DNA。
Overlap DNA片斷設(shè)計(jì)fragment 15’-ATGGAGGTGGGTTGGTACCGTTCTCCCTTC TCAAGAGTGG-3’fragment 25’-CCTCCATCTTGCCATTTCGGTAGAGGTGAACCACTCTTGAGAAGGGAGAA-3’fragment 35’-CCGAAATGGCAAGATGGAGGTGGGTTGGTACCGTTCTCCCTTCTCAAGAG-3’fragment45’-TTACTTGCCA TTTCGGTAGA GGTGAACCAC TCTTGAGAAGGGAGAACGG-3’引物設(shè)計(jì)MOG35 P15’-AAGGATCCATGGAGGTGGGTTG-3’MOG35 P25’-GCTCTAGATTACTTGCCATTTC-3’PCR反應(yīng)用所設(shè)計(jì)的DNA及引物，擴(kuò)增參數(shù)94℃2min；94℃30s，60℃40s，72℃35s 35個(gè)循環(huán)；72℃10min，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。按Takara公司PCR Fragment Recovery Kit說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收?；厥盏腗OG35-55 2copies片段與pMD 18-T載體在T4 DNA連接酶的作用下16℃過夜，使其連接到pMD 18-T的載體上。構(gòu)建的質(zhì)粒命名為T-MOG352c。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α菌株的感受態(tài)細(xì)胞。小量提取質(zhì)粒并用EcoRII和Hind III雙酶切進(jìn)行重組質(zhì)粒的鑒定，酶切反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。為鑒定克隆的DNA序列，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行純化并進(jìn)一步序列分析，后應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行分析結(jié)果。
1.2.1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及組質(zhì)粒在BHK21細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)將序列分析正確的質(zhì)粒經(jīng)BamHI和Hind III雙酶切，連接到同樣酶切的真核表達(dá)載體pVAX1上，該載體命名為pVAXMOG352c，經(jīng)序列鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行真核轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。具體轉(zhuǎn)染方法參照lipofectamine產(chǎn)品說明書。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pVAXMOG352c轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，提取總RNA以MOG35 P1和MOG35 P2為引物用RT-PCR方法檢測目的基因的表達(dá)。
1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)粒T-MOG352c的酶切鑒定結(jié)果如圖14所示。質(zhì)粒pVAXMOG352c的酶切鑒定結(jié)果如圖15所示，質(zhì)粒pVAXMOG352c在BHK21細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果如圖16所示。
2、EAE動(dòng)物模型的誘導(dǎo)及鑒定2.1直接免疫的方法C57BL/6小鼠，背部皮下免疫用弗氏完全佐劑充分乳化的短肽MOG35-55200ug(1ug/ul，200ul，并且內(nèi)含結(jié)合桿菌BCG750ug)，同時(shí)在免疫的第0、2天尾靜脈注射百日咳桿菌(108-109個(gè))，7天后加強(qiáng)一次免疫M(jìn)OG200ug。
評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)0——無任何臨床癥狀。
1——?jiǎng)游镂膊繜o力，癱軟。
2——?jiǎng)游镂膊繜o力，前肢或后肢中等無力。
3——前肢或后肢嚴(yán)重?zé)o力，人為翻身后不能恢復(fù)。
4——肢體麻痹，人為翻身后不能恢復(fù)。
5——瀕死狀態(tài)。
結(jié)果如圖17(不同顏色表示不同的小鼠個(gè)體)40天后的較嚴(yán)重發(fā)病率(發(fā)病指數(shù)＞2)可達(dá)70％。
☆最近免疫的一批(20只)，初免后五周發(fā)病到4的有5只。
2.2過繼轉(zhuǎn)移發(fā)病小鼠T細(xì)胞誘導(dǎo)模型圖18為陰性小鼠經(jīng)過繼轉(zhuǎn)移發(fā)病小鼠脾臟來源的T細(xì)胞后，在皮下一次免疫CFA佐劑乳化的MOG抗原200ug；圖19為陰性小鼠經(jīng)過繼轉(zhuǎn)移發(fā)病小鼠的淋巴結(jié)來源T細(xì)胞，在皮下一次免疫CFA佐劑乳化的MOG抗原200ug；結(jié)論過繼轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)來源的T細(xì)胞比脾臟來源的T細(xì)胞小鼠發(fā)病早，癥狀變化穩(wěn)定。但轉(zhuǎn)移脾臟T細(xì)胞的小鼠發(fā)病指數(shù)較高。
2.3發(fā)病小鼠的一些生理指標(biāo)檢測圖20顯示誘導(dǎo)小鼠發(fā)病后針對(duì)自身MOG抗原的T細(xì)胞擴(kuò)增情況。
結(jié)論患病小鼠外周免疫器官有針對(duì)自身抗原MOG的強(qiáng)烈的T細(xì)胞擴(kuò)增反應(yīng)。
圖21顯示誘導(dǎo)小鼠發(fā)病后針對(duì)自身MOG抗原的T細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)一些細(xì)胞因子的情況。
3、聯(lián)合免疫治療EAE小鼠3.1策略按照2.1的方法，用C57小鼠誘導(dǎo)EAE模型，記錄臨床癥狀，至所有小鼠的臨床指數(shù)達(dá)到3以上水平。將患病小鼠分組如下，分別進(jìn)行免疫，免疫方法為肌肉注射。
1、MOG35-55肽100ul(與弗氏完全佐劑1∶1混合完全乳化至濃度1ug/ul)
2、pVAXMOG352c質(zhì)粒DNA 100ul(濃度為1ug/ul)3、pVAXMOG352cMOG35-55肽+pVAXMOG352c分別100ul(濃度同上)4、pVAXMOG352cMOG35-55肽+pVAX1分別100ul(濃度同上)5、不治療組14天后加強(qiáng)一次免疫。
自第一次治療免疫起觀察記錄臨床發(fā)病癥狀，并評(píng)分。加強(qiáng)免疫后7天，無菌取各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟，通過MTT法進(jìn)行T細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。同時(shí)取小鼠大腦，小腦，脊髓用4％多聚甲醛固定組織，進(jìn)行組織切片的制作，鏡檢病變情況。IL-1、IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10、FoxP3、IL17、TGF等細(xì)胞因子的檢測分為脾臟細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)情況以及腦脊液中細(xì)胞因子的表達(dá)情況兩種。下一步實(shí)驗(yàn)是在動(dòng)物模型建立健全的基礎(chǔ)上進(jìn)行免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證共免疫的應(yīng)用。
序列表<160>1<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和/或治療自身免疫疾病的疫苗，它的活性成分是下述混合物由造成自身免疫疾病的蛋白抗原或其表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入自身蛋白抗原或其表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物；所述自身蛋白抗原為胰島素、谷氨酸脫羧酶、熱休克蛋白、髓磷脂寡突細(xì)胞糖蛋白、二種髓磷脂抗原、卵透明帶蛋白3、肌球蛋白、II型膠原蛋白、甲狀腺球蛋白、細(xì)胞膜表面抗原、第二型膠質(zhì)抗原、乙酰膽堿受體、甲狀腺細(xì)胞表面抗原、唾液腺管蛋白、甲狀腺球蛋白、超抗原或感光器間受體樹脂樣結(jié)合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述預(yù)防和/或治療自身免疫疾病的疫苗為預(yù)防和/或治療I型糖尿病的疫苗；所述預(yù)防和/或治療I型糖尿病的疫苗的活性成分是下述混合物1)由I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物；2)由I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物；3)由I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物；4)由I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物；所述I型糖尿病自身蛋白抗原為胰島素或谷氨酸脫羧酶或熱休克蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于所述胰島素來源于人、狗或貓；所述谷氨酸脫羧酶來源于人、狗或貓；所述熱休克蛋白來源于人、狗或貓。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于所述I型糖尿病自身蛋白抗原為人胰島素。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽的氨基酸序列是序列表中的序列1。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于用于插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原編碼基因或所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體為pcDNA3.0或pVAX1或provax。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗，其特征在于所述預(yù)防和/或治療I型糖尿病的疫苗的活性成分是人胰島素蛋白和pVAX-insulin。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗，其特征在于所述預(yù)防和/或治療I型糖尿病的疫苗的活性成分是B9-23和pcDB9-23。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于1)所述I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1∶5-5∶1；優(yōu)選為1∶1-1∶2；2)所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1∶5-5∶1；優(yōu)選為1∶1-1∶2；3)所述I型糖尿病自身蛋白抗原和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1∶5-5∶1；優(yōu)選為1∶1-1∶2；4)所述I型糖尿病自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入所述I型糖尿病自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1∶5-5∶1；優(yōu)選為1∶1-1∶2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)防和/或治療自身免疫疾病的疫苗。它的活性成分是下述混合物造成自身免疫疾病的蛋白抗原或其表位多肽和在多克隆位點(diǎn)插入自身蛋白抗原或其表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物。該自身蛋白抗原為胰島素、谷氨酸脫羧酶或熱休克蛋白、髓磷脂寡突細(xì)胞糖蛋白、二種髓磷脂抗原、卵透明帶蛋白3、肌球蛋白、II型膠原蛋白、甲狀腺球蛋白、細(xì)胞膜表面抗原、第二型膠質(zhì)抗原、乙酰膽堿受體、甲狀腺細(xì)胞表面抗原、唾液腺管蛋白、甲狀腺球蛋白、超抗原和感光器間受體樹脂樣結(jié)合蛋白。該疫苗可抑制免疫動(dòng)物和人體的T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)免疫抑制的產(chǎn)生，并能夠有效地預(yù)防和/或治療自身免疫疾病。
文檔編號(hào)A61P3/10GK101020063SQ200710064769
公開日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2007年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月26日
發(fā)明者王賓, 金華利, 康友敏, 張文娟, 于楊, 李金耀 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)