專利名稱：高級脂肪酸衍生物的免疫抑制劑及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高級脂肪酸衍生物的免疫抑制劑，特別涉及用作免疫抑制劑的高 級脂肪酸化合物或其衍生物，在免疫抑制、炎癥、移植排斥及T細胞介導型自身免疫病治療 中的應用，所述T細胞介導型自身免疫病例如是糖尿病、多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎和全身性紅斑 狼瘡等，通過給予動物有效劑量的高級脂肪酸化合物，治療和/或預防免疫疾病如自身免 疫病或炎性疾病，減少移植物的免疫排斥。
背景技術(shù)：
在很多情況下期望調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，從抑制自身免疫應答，到控制傳染病和抑制移 植物/組織排斥。減輕排斥的主要途徑是藥理學上抑制受者的免疫系統(tǒng)。基于這種想法， 大部分目前使用的免疫調(diào)節(jié)化合物是抑制免疫的。從20世紀60年代早期起，可得的免 疫抑制劑僅限于少數(shù)藥物。但是，在20世紀80年代早期，除了硫唑嘌呤和皮質(zhì)類固醇以 外，環(huán)孢菌素開始得到并成為選擇藥物(Kobashigawa, trans, pro. 30 1095-1097，1998 ； Isoniemi，Ann. Chi. Gyn. 86 164-170，1997)。將環(huán)飽菌素 A(CsA)天然二級代謝產(chǎn)物、他克 莫司(Π(506)和雷帕霉素(RAPA)開發(fā)成免疫抑制劑，并通過發(fā)揮其在移植排斥(TIBS. 18 334-338,1993)和 GVHD(Ann hematol. 71 :301_306，1995)中的作用，是器官移植領(lǐng)域發(fā)生 了革命性的巨變。然而，這些藥物在使用中存在嚴重過的副作用，例如腎毒性、神經(jīng)毒性、 肝細胞毒性、內(nèi)分泌并發(fā)癥以及影響骨骼(New Engl. j. Med. 321 1725-1738，1989 ；外科學 97 :125，1985)。因此，需要為臨床上提供一類有免疫抑制效果，但無上述毒副作用的新化合 物。目前使用的免疫抑制藥包括抗增殖劑，如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和環(huán)磷酰胺。由于這 些藥物影響有絲分裂和細胞分裂，它們對有高周轉(zhuǎn)率的正常細胞如骨髓細胞等具有嚴重的 毒副作用(Miller Semin. Vet. Med. Surg. 12(3) 144-149，1997)。因此骨髓抑制和肝損傷 是常見的副作用。用于誘導免疫抑制的抗炎化合物包括腎上腺皮質(zhì)類固醇，如地塞米松和潑尼松 龍。使用這些化合物觀察到的常見的副作用為頻繁的感染、異常代謝、高血壓和糖尿病。其他目前用于抑制淋巴細胞活化和增殖的免疫抑制化合物包括CsA、Π(506和 RAPA。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調(diào)磷酸酶(CsA和Π(506)或抑制誘導生長因子的 P70S6 激酶(RAPA)。(Liu 等，Cell. 66 :807_815，1991 ；Bierer 等，Curr. Opin. Immun. 5 763-773,1993)。CsA及其相關(guān)物是最常用的免疫抑制劑之一。CsA代表性的用于預防或 治療腎、肝臟、心臟、胰腺、骨髓、和心肺移植的器官排斥，以及用于治療自身免疫病和炎性 疾病如局限性回腸炎、再生障礙性貧血、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、膽汁性肝硬變等。但是 CsA治療時間窗口小并具有嚴重的毒性作用，包括腎毒性，肝毒性、神經(jīng)毒性等(Philip和 Gerson, Clin. Lab. Med. 18 (4) :755_765，1998 ；Hojo 等，Nature. 397 :530_534，1999)。此外，單克隆抗體，如0KT3已被用于預防和/或治療移植物排斥。將單克隆抗 體引入患者，可導致嚴重的副作用，如寒戰(zhàn)和呼吸困難(Richards等，Cancer Res. 59(9)2096-2101，1999)。在許多威脅生命的疾病中，器官移植被認為是一種標準治療。在較多的情況下，僅 有的選擇只是死亡。由主要組織相容性復合物(MHC)編碼并存在所有細胞上的對移植物上 的外來細胞表面抗原的免疫應答，通常阻止組織和器官的成功移植。而且，隨著供體器官需 求的增加，目前移植器官的不足也在增加。因此異種移植成為深入研究的領(lǐng)域，但它面臨許 多與受體動物內(nèi)排斥有關(guān)的困難(Kaufman等，Annu. Rev. Immunol. 13 :339_367，1995)。宿主對器官同種異體移植物的應答涉及復雜的一系列T和B淋巴細胞以及巨噬 細胞或識別外來抗原并被外來抗原激活的樹突狀細胞之間的細胞相互作用(Abbas等，WB saunders Co. perm.，1994)。由活化的佐細胞(如巨噬細胞和樹突細胞)提供的共同刺激 因子和特異性細胞一細胞相互作用是T細胞增殖所必需的。這些巨噬細胞和樹突狀細胞 通過特異性粘附蛋白直接粘附在T細胞上，或者分泌刺激T細胞的細胞因子，如IL-12和 IL-15 (strom,Organ Transplantation :Current Clinical and Immunological Concepts, 1989)。來源佐細胞的共同刺激信號刺激IL-2基因轉(zhuǎn)錄的活化和T細胞中高親和力 IL-2 受體的表達(Cantrell 等，Science. 224 :1312，1991 ；Williams 等，J. Immunol. 132 2330-2337,1984)。IL-2—種15Kda蛋白，是由T淋巴細胞在抗原刺激時分泌的，并且是正 常免疫應答所需的。IL-2通過與IL-2細胞表面特異性受體(IL-2R)的結(jié)合刺激淋巴細胞 的增殖和分化。IL-2還引起輔助T細胞活化細胞毒性T細胞，并刺激干擾素(IFN- γ )的分 泌，其進而活化巨噬細胞的細胞殺傷能力(Farrar, J. Immunol. 126 :1120_1125，1981)。而 且，IFN- γ和IL-4還是移植器官的MHCII表達的重要活化劑，因而還通過增強移植器官的 免疫原性進一步擴展排斥級聯(lián)(Kelley等，J. Immunol. 132 =240-245,1984)。T細胞介導的應答模型表明T細胞是在次級淋巴器官的T細胞區(qū)內(nèi)，主要由樹突 細胞致敏。最初的相互作用需要抗原呈遞細胞(APCs)上攜帶抗原的MHC分子與T細胞上 的T細胞受體(TCR)/⑶3復合物之間的細胞接觸。TCR/⑶3復合物的結(jié)合誘導主要在⑶4T 細胞上的⑶154表達，進而通過⑶40結(jié)合活化APC導致改善抗原提呈(Grewall等，Annu. Rev. Immunol. 16 :111_135，1998)。這一部分是通過APC上的CD80和CD86表達的上調(diào)而 引起的，上述兩者都是T細胞上重要的CD28共刺激分子的配體。但是CD40的結(jié)合還導致 MHC-抗原復合物表面表達的延長，4-1BB和0X40的配體的表達，而且⑶40結(jié)合導致各種 細胞因子(IL-12、IL-15、TNF-a、IL_1、IL_6 和 IL-8)和趨化因子(ΜΙΡ-la 和 MCP-1)的分 泌，所有這些因子都對APC和T細胞的活化和成熟均具有重要作用(Mackey等，J. Leukoc. Biol. 63 :418-428，1998)。所有預防排斥和逆轉(zhuǎn)自身免疫策略的目標是抑制患者對抗原組織或試劑的免疫 活性，同時具有最低的發(fā)病率和死亡率。因此，目前正使用或研究大量藥物的免疫抑制性 質(zhì)。正如以上討論，最常用的免疫抑制劑為CsA，但使用CsA有許多副作用。因此考慮到具 有低毒性和可控的副作用的免疫抑制劑選擇相對較少，現(xiàn)有技術(shù)需要找到可供選擇的免疫 抑制劑。本發(fā)明正好滿足了這種需要，并提供了其他相關(guān)優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種高級脂肪酸衍生物免 疫抑制劑及其應用，以抑制患有自身免疫病、炎性疾病或移植物抗宿主疾病的動物的免疫
5應答，并具有低毒性和可控的副作用。本發(fā)明的高級脂肪酸衍生物的免疫抑制劑，包括如下式所述的化合物及其藥學上 可接受的鹽，溶劑化物或水合物中的一種或多種組合(1)化合物 I :CH3 (CH2)mlCH = CH(CH2)nlC0R其中10 彡 ml+nl 彡 22，ml = 1 13，nl = 1 21 ;R 為_CH3、_CH2CH3、-CH( CH3)2、-(CH2)3CH3, -(CH2)2CH2CH3, -c(CH3)3、環(huán)己烷基、苯甲基、乙醇胺基、二甲氨基乙胺 基，-N(CH2CH2Cl)2, -N(R1)CONHR2 ；禮、R2可以相同，也可以不同，為如下結(jié)構(gòu) A、B、C、D、E 獨立地選自-H、_0H、-NH2, -NO2, -CH3> -OCH3> _0CH2CH3、-CH2NH2 ；(2)化合物 II CH3(CH2)m2CH = CH(CH2)n2CH = CH(CH2)X1C0R其中m2+n2 彡 11 ;8 彡 m2+n2+xl 彡 20 ；m2 = 1、4、7、10 ；n2 = 1、4、7、10 ；xl 彡 1 ； R同化合物I式中的R ；(3)化合物 III =CH3(CH2)m3CH = CH(CH2)n3CH = CH(CH2)x2CH = CH(CH2)yC0R其中 m3+n3+x2 彡 9 ;6 彡 m3+n3+x2+y 彡 18 ；m2 = 1、4、7 ；n2 = 1、4、7 ；x2 == 1、 4、7 ；y ^ 1 ;R同化合物I式中的R ；(4)化合物 IV =CH3 (CH2) zC0R其中ζ = 12 24 ;R同化合物I式中的R。所述藥學上可接受的鹽是指與酸(如鹽酸，硫酸，磷酸)所形成的鹽，以及與強堿 (如氫氧化鈉、氫氧化鉀)所形成的鹽。所述化合物包括化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV的所有構(gòu)象異構(gòu)體 (例如順反異構(gòu)體，無論是否包括雙鍵)；化合物還包括化合物I、化合物II、化合物III、化 合物IV的所有旋光異構(gòu)體(例如對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體)以及外消旋體，非對映異構(gòu) 體和上述異構(gòu)體的混合物；還包括化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV的互變異構(gòu) 體及立體異構(gòu)體，以及任一上述形式的混合物。所述藥學上可接受的鹽是藥學上可接受的酸的加成鹽，藥學上可接受酸的加成鹽 的酸形成非毒性酸加成鹽的酸，即含有藥學上可接受的陰離子的鹽，例如鹽酸鹽，硝酸鹽， 硫酸鹽，硫酸氫鹽，磷酸鹽，乙酸鹽，乳酸鹽，檸檬酸鹽，酒石酸鹽，琥珀酸鹽，馬來酸鹽，葡糖 酸鹽，苯甲酸鹽，甲基磺酸鹽，苯基磺酸鹽，對甲苯磺酸鹽和二羥基萘酸鹽。所述藥學上可接受的鹽是藥學上可接受的堿加成鹽，藥學上可接受堿的加成鹽的 堿形成非毒性堿加成鹽的堿，非毒性堿的鹽包括但是不限于藥學上可接受的陽離子，例如 堿金屬陽離子(如鉀和鈉)，堿土金屬陽離子(如鈣和鎂)，銨或水溶性胺的加成鹽，以及低 級烷基銨和藥學上可接受的有機胺的其它堿性鹽。本發(fā)明還涉及在治療或預防哺乳動物患者疾病的藥物組合物中的應用，其中通過向下調(diào)節(jié)T-細胞介導的免疫應答達到治療效果，所述組合物包括有效量的(I，II，III，IV) 化合物及藥物載體。本發(fā)明涉及在治療或預防哺乳動物炎癥疾病的藥物組合物中的應用，所述組合物 包括有效量的(I，II，III，IV)化合物及藥物載體。本發(fā)明涉及在治療或預防哺乳動物過敏反應疾病的藥物組合物中的應用，所述組 合物包括有效量的(I，II，III，IV)化合物及藥物載體。本發(fā)明涉及在治療或預防哺乳動物T-細胞，白血病和T-細胞淋巴瘤的藥物組合 物中的應用，所述組合物包括有效量的(I，II，III，IV)化合物及藥物載體。本發(fā)明還涉及在治療或預防哺乳動物器官移植免疫排斥的藥物組合物中的應用。采用上述方案后，本發(fā)明適用于治療或預防哺乳動物移植排斥，治療或預防哺乳 動物自體免疫疾病，治療或預防哺乳動物過敏反應疾病，治療或預防哺乳動物炎癥疾病，抑 制哺乳動物患者T-細胞介導的免疫應答，其中通過維持所述免疫功能在正常范圍內(nèi)對哺 乳動物有利，抑制哺乳動物患者記憶性CD4+T細胞和記憶性CD8+T細胞介導的免疫應答，其 中通過維持所述免疫功能在正常范圍內(nèi)對哺乳動物有利。上述實踐中使用含有(I，II，III，IV)化合物和藥物載體的藥物組合物給藥。實驗證明，本發(fā)明可以抑制患有自身免疫病、炎性疾病或移植物抗宿主疾病的動 物的免疫應答，并具有低毒性和可控的副作用。以下實施方案中，本發(fā)明公開了一種通過給予動物有效量的具有化合物(I)結(jié)構(gòu) 的免疫抑制劑(化合物K)而抑制動物免疫應答，并且可以結(jié)合一種或幾種有抗炎作用或本 身能夠調(diào)節(jié)哺乳動物免疫系統(tǒng)的一個或多個成分或過程的制劑。在本發(fā)明的實施中，可以給予這些化合物以抑制患有自身免疫病、炎性疾病或移 植物抗宿主疾病的動物的免疫應答，還可以給予曾經(jīng)過同種異體移植或異種移植的動物。 本發(fā)明進一步包括給予本發(fā)明的化合物以抑制淋巴細胞的增殖，通過在移植(包括同種異 體和異種移植)過程之前、同時或之后給藥以提高移植后的移植物的存活，減輕淋巴細胞 分泌IL-12，和/或誘導活化T細胞的無反應性或細胞凋亡。此外本發(fā)明還涉及移植物的二 次移植，給予這些化合物可以有效的抑制移植物的排斥反應，同時這些化合物還對記憶性 ⑶4+T和記憶性⑶8+T細胞具有明顯的抑制作用。


圖1為描述在用ConA (刀豆蛋白A)和化合物K刺激脾臟淋巴細胞試驗中，隨著代 表性化合物K作用濃度的變化，48小時后檢測其對淋巴細胞增殖的抑制能力變化的條形圖 (BrdU 法)；圖2-A、圖2-B和圖2_C為描述在用在用ConA (刀豆蛋白A)，化合物K和Π(_506 刺激脾臟淋巴細胞(化合物K(40ug/ml)，H(-506(lug/ml)，半劑量化合物K(20ug/ml)，半劑 量 Π(-506 (0. 5ug/ml)及化合物 K (40ug/ml)與半劑量 Π(-506 (0. 5ug/ml)聯(lián)合用藥)，48 小 時后檢測脾臟淋巴細胞IL-2，IFN-Y和IL-10基因表達的條形圖(qRT-PCR)；圖3為描述在化合物K和FK-506刺激(化合物K (40ug/ml)，F(xiàn)K-506 (lug/ml)， 半劑量化合物K (20ug/ml)，半劑量FK-506 (0. 5ug/ml)及化合物K (40ug/ml)與半劑量 FK-506 (0. 5ug/ml)聯(lián)合用藥)的混合淋巴細胞反應(MLR)試驗中，72小時后檢測T細胞增
7殖抑制情況的條形圖(BrdU法)； 圖4-A、圖4-B和圖4-C為描述在化合物K和Π(_506刺激(化合物K (40ug/ml)， FK-506 (lug/ml)，半劑量化合物 K (20ug/ml)，半劑量 Π(-506 (0. 5ug/ml)及化合物 K (40ug/ ml)與半劑量Π(-506 (0. 5ug/ml)聯(lián)合用藥)的混合淋巴細胞反應(MLR)試驗中，72小時后 檢測T細胞中IL-2，IFN- γ和IL-10蛋白表達的條形圖(ELISA法)；圖5-A和圖5-B為描述在化合物K和Π(_506刺激(化合物K (40ug/ml)， FK-506 (lug/ml)，半劑量化合物 K (20ug/ml)，半劑量 Π(-506 (0. 5ug/ml)及化合物 K (40ug/ ml)與半劑量Π(-506 (0. 5ug/ml)聯(lián)合用藥)的混合淋巴細胞反應(MLR)試驗中，72小時后 檢測記憶性⑶4+T細胞和記憶性⑶8+T細胞增殖抑制情況的條形圖(BrdU法)；圖6為描述小鼠同種異體皮膚移植后移植物排斥情況，在皮膚移植第0-10天 給予免疫抑制劑治療，包括Π(-506 (2mg/kg/d)、半劑量(Sub) FK-506 (lmg/kg/d)、化合物 K(10mg/kg/d)、Sub Π(-506+化合物K，對照組腹腔及灌胃給生理鹽水，各組移植物的排斥情 況的線形圖；圖7為描述小鼠同種異體心臟移植后移植物排斥情況，在心臟移植第0-10天 給予免疫抑制劑治療，包括Π(-506 (2mg/kg/d)、半劑量(Sub) FK-506 (lmg/kg/d)、化合物 K(10mg/kg/d)、Sub Π(-506+化合物K，對照組腹腔及灌胃給生理鹽水，各組移植物的排斥情 況的線形圖；圖8為描述小鼠同種異體胰島移植后移植物排斥情況，在胰島移植第0-10天 給予免疫抑制劑治療，包括H(-506(2mg/kg/d)、半劑量(Sub) Π(-506 (lmg/kg/d)、化合物 K(10mg/kg/d)、Sub Π(-506+化合物K，對照組腹腔及灌胃給生理鹽水，各組移植物的排斥情 況的線形圖。
具體實施例方式按照本發(fā)明的實踐，通常使用以下定義。使用的術(shù)語“治療”是指逆轉(zhuǎn)，減輕和抑制過程，或者預防該術(shù)語所指的疾病或上 述疾病的一個或多個癥狀。使用術(shù)語“治療作用，，和上述“治療”含義相同。術(shù)語“移植”是指移植細胞，組織，器官或器官的部分以代替所有或部分組織功能， 如心臟、腎臟、肝臟、骨髓、皮膚、角膜、血管、肺、胰腺、腸、四肢、肌肉、神經(jīng)組織、小腸、胰島 細胞，術(shù)語“移植”還指通常和移植的細胞，組織及器官有關(guān)的大分子，無論是和細胞內(nèi)或 細胞膜有關(guān)的或本質(zhì)上是和細胞外有關(guān)。在這方面，特別有興趣的大分子類型是指與移植 組織細胞外基質(zhì)有關(guān)的大分子，T-細胞介導的對所述大分子的免疫應答可導致移植整體失 敗?！耙浦病卑ㄍN移植和異種移植。術(shù)語“免疫應答”指機體對外來或自身抗原的反應，以將它們中和和/或消滅。細 胞介導的免疫應答涉及胸腺對抗原接觸作出反應產(chǎn)生淋巴細胞(Τ細胞)。這種反應在遲發(fā) 型過敏反應，組織移植的排斥和某些傳染病中是重要的。在體液免疫應答中，對抗原接觸的 反應時產(chǎn)生漿細胞(B細胞)，并隨后形成抗體。這種應答可以產(chǎn)生免疫或過敏。非特異性 免疫應答或炎癥是機體組織和細胞對任何來源的損傷(如外傷、生物、化學、局部缺血等) 的應答。免疫系統(tǒng)對任何攻擊的最初應答涉及血管、化學和血細胞活性。當炎癥不足以對 付損傷或生物或藥劑的侵入時，需要進行特異性免疫應答。它是由T和B細胞指導和控制的。“腸道外給藥”是指包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉、關(guān)節(jié)內(nèi)注射或輸注、胸腔內(nèi)或腹腔內(nèi)給藥。本發(fā)明的實施本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)含有(I，II，III，IV)化合物和藥物載體的本發(fā)明藥物組合物用 于治療和/或預防動物受試者(優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人)免疫應答或免疫介導的應答和 疾病的用途，如預防或治療移植后的排斥；用于治療或預防移植物抗宿主疾病、自身免疫 病，如類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、重癥肌 無力、I型糖尿病眼色素層炎、青少年起病型或近期起病型糖尿病、眼色素層炎、格雷夫斯 病、牛皮癬、特應性皮炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎、自身抗體介導的疾病、埃文 斯綜合癥等等；還用于治療導致異常免疫應答和/或活化的傳染病，如創(chuàng)傷性或病原體誘 導的免疫失調(diào)，包括例如，有乙型和丙型肝炎感染、金黃色葡萄球菌感染、病毒性腦炎等導 致的免疫失調(diào)，其中損害時有炎癥反應誘導的(如麻風)；和用于預防或治療循環(huán)疾病，如 動脈硬化、動脈粥樣硬化、多動脈炎和心肌炎。此外，本發(fā)明還可以用于預防或抑制與基因 治療(如將外源基因引入自體細胞并表達編碼產(chǎn)物)有關(guān)的免疫應答。進一步的應用是指在藥物組合物中的應用，可以包括治療和/或預防免疫介導 疾病的炎性和過度增殖性皮膚病以及皮膚病癥狀，如血管性水腫、紅斑、痤瘡和脂溢性皮 炎；各種眼病(自身免疫性和其它)；變態(tài)反應，如花粉變態(tài)反應，可逆性阻塞性氣道疾病， 包括如下病癥如哮喘、支氣管炎、變應性鼻炎等等；粘膜和血管炎癥。在一個實施方案中，提供了一種用于治療動物病癥的方法，其通過抑制淋巴細胞 增殖和/或活化而記性或幫助治療，包括服用有效量的含有(I，II，III，IV)化合物和藥物 載體的本發(fā)明藥物組合物。其中，所述病癥可以使自身免疫、炎癥、移植物/組織排斥，或者 包括許多如本文所述的由免疫誘導的或加劇的適應癥中的任一種。因此本發(fā)明的一個實施方案是一種在治療自身免疫病的藥物組合物中的應用。而 本發(fā)明的的另一個實施方案是用于預防或治療外來器官移植物的排斥，所述應用包括給予 需要這種治療的患者有效量的本發(fā)明化合物。如上述，目前環(huán)孢菌素是用于防止移植器官排斥的主要藥物。此藥物通過抑制淋 巴細胞中鈣調(diào)磷酸酶的功能起作用的，從而防止機體免疫系統(tǒng)調(diào)動其大量的天然保護劑來 排斥移植物的外源蛋白。雖然環(huán)孢菌素可以有效地對抗移植物排斥，但它具有腎毒性，并已 知會導致一些不良的副作用，包括腎衰、肝功能異常、胃腸不適和誘發(fā)癌癥(Hojo等，自然 (Nature)397 :530_534，1999)。在本領(lǐng)域中一直在尋找具有較少毒副作用的更新、更安全的藥物。本發(fā)明提供了 這樣的免疫抑制劑，在不拘泥于具體的作用機制下，它似乎可以誘導持久的免疫耐受性?；?合物K可以抑制淋巴細胞的增殖，可以抑制T-細胞的增殖，還可以抑制記憶性CD4+T細胞 和記憶性⑶8+T細胞的增殖(如減少IL-2和IFN- γ的產(chǎn)生，增加了 IL-10的表達)。為了確定一種具體的化合物是否為有效地免疫抑制劑，可以運用本領(lǐng)域已知的多 種方法。在這方面，可以在與刺激同事或在刺激之后使淋巴細胞與所感興趣的化合物接觸 以后，測定其增殖和/或活化。例如，T細胞活化和隨后的增殖誘導(以及作為炎癥的起始 物)的關(guān)鍵標記是產(chǎn)生IL-2、IFN-γ、⑶25、⑶69或⑶154，它們可以由各種方法測得，包括ELISA，流式細胞儀和qRT-PCR。還可以使用其它常用于測定細胞增殖和細胞因子分泌的試 驗方法，包括使用碘化丙錠染色的比色試驗，MTT (3- [4，5- 二甲基噻唑-2-基])2-5- 二苯 基溴化四唑鐺，活體染色法，細胞計數(shù)，BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)或H3參入試驗(參見 如Avian Dis. 43(2) :172_181，1999 ；Anticancer Res.(抗癌研究)17(1B) :725_728，1997 ； Levine 等，Int. j. Immun.(國際免疫學雜志)7 (6) :891_904，1995 ；Hara 等，J. Exp. Med. (實驗醫(yī)學雜志)161 1513-1524,1985 ；Harding 等，Nature (自然)356 :607_609，1992 ； Linsley 等，Science (科學)257 :792_795，1992)?；罨馨图毎鸵虼舜碳ち馨图毎鲋车姆椒ㄔ诒绢I(lǐng)域中時已知的，所述方法包 括在IL-2存在或不存在下采用植物凝集素(PHA)、伴刀豆蛋白A(ConA)、抗CD3抗體(在抗 CD28抗體存在或不存在下)、同種異體細胞、超抗原或離子霉素/PMA進行刺激(Paul，基礎(chǔ) 免疫學(Fundamental Immunology),第 4 版，Lippincott-Raven, 1998)。有多種體外和動物模型用于測試和驗證本發(fā)明免疫抑制化合物及其對特定的與 免疫系統(tǒng)相關(guān)的疾病或適應癥的適用性。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地從本領(lǐng) 域現(xiàn)有的模型中選擇適宜的模型。這些模型包括代表性地用于自身免疫病和炎性疾病 的模型，如多發(fā)性硬化(EAE模型)、類風濕性關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主疾病(用于研究移植 物排斥的用皮膚移植模型、心臟移植、胰島移植、腎臟移植、大腸和小腸移植等等的移植 模型)、哮喘模型等等。(參見例如，Takakura等· Exp. Hematol.(實驗血液學)27 (12) 1815-821,1999 ；Hu 等，Immunology(免疫學)98(3) :379_385· 1999 ；Theofilopoulos 和 Dixon, Adv. Immunol.(免疫學進展)37 :269_389，1985 ；Bonnevilie 等，Nature (自然)344 163-165，1990 ；Dent 等，Nature (自然)343 :714_719，1990 ；Todd 等，Nature (自然)351 542-547，1991 ；Morris 等，Clin. Immunol. Immunopatho 1.(臨床免疫學免疫病理學)57 263-273,1990 ;Takahashi 等，Cell(細胞)76 :969_976，1994 ;Current Protocols in Immunology (最新免疫學方法)，Richard Coico (Ed.)，John Wiley & Sons，Inc.，第 15 章， 1998)。需要治療以抑制免疫系統(tǒng)的受試者包括患有自身免疫病的受試者；接受移植的受 試者；和患有心血管疾病的受試者；患有變態(tài)反應的受試者；和患有外傷或病原誘導的免 疫失調(diào)的受試者?！笆茉囌摺眱?yōu)選為哺乳動物如人，但是本發(fā)明也可以廣泛地用于治療其它 哺乳動物，例如寵物(如貓、狗等等)，農(nóng)場大型哺乳動物(如牛、羊等等)和實驗室動物(如 大鼠、小鼠、豚鼠等等)?！坝行Я俊笔菍崿F(xiàn)預期治療和/或預防效果所需的化合物的劑量；例如引起個體或 動物的原初或記憶免疫應答，或抑制受試者器官移植排斥的化合物的劑量?！邦A期治療和/ 或預防效果”包括例如對患有或可能患有自身免疫病的個體或動物延長壽命或改善癥狀， 所述自身免疫疾病如哮喘、牛皮癬、類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化等等?？梢愿纳频陌Y狀的 實施包括糖尿病中的高血糖；關(guān)節(jié)痛；類風濕性關(guān)節(jié)炎中的僵直和不動癥；多發(fā)性硬化中 的麻痹。在胰島素依賴型糖尿病方面，“預期治療和/或預防效果”包括減輕或預防由疾病 導致的繼發(fā)性并發(fā)癥，如血管疾病。適宜的劑量取決于受試者的年齡、健康和體重、疾病的 程度、同事進行的治療的種類(如果有的話)，治療頻率和預期效果的性質(zhì)。例如，劑量可以 從約0. 01到1000毫克/天。通常，一次或分多次應用0. 1-100毫克/天可以有效獲得預 期結(jié)果。在某些實施方案中，可以調(diào)整劑量以維持未活化的淋巴細胞和/或T細胞，而使活化的淋巴細胞和/或T細胞無反應性和/或暫時的功能性無應答。在其它實施方案中，高 級脂肪酸衍生物治療實現(xiàn)了免疫抑制效果；而在其它實施方案中，所用的劑量沒有明顯的 毒副作用。但是，在臨床試驗中可以用本領(lǐng)域可獲得的常規(guī)試驗方法，容易地確定有效劑量 范圍。這些劑量是用于預防或治療自身免疫病，預防或治療外來移植物排斥和/或相關(guān)的 痛苦、疾病和病癥的有效量。所述化合物可以單獨給藥或與其它藥學活性劑聯(lián)合給藥，如與其它免疫抑制劑或 與抗生素和/或抗病毒劑一起給藥。可以同時給藥的化合物包括固醇(如甲基潑尼松龍) NSAIDs和其它已知的免疫抑制劑，例如硫唑嘌呤、15-脫氧精胍菌素、環(huán)孢菌素、咪唑立賓、 布喹那鈉、來氟米特、Π(-506、雷帕霉素和相關(guān)化合物。這些藥物的劑量也取決于治療的條 件和個體變化?？梢酝ㄟ^適宜的途徑，以單劑或多劑對有效量的所述化合物進行給藥。藥物制劑藥學上可以接受的鹽包括金屬(無機)鹽和有機鹽，在Remington’ s Pharmaceutical Science，第17版，第1418頁(1985)中給出了這些物質(zhì)的清單。本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟知可以根據(jù)物理和化學穩(wěn)定性、流動性、吸水性和溶解度來選擇適宜的鹽形式。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解藥學上可接受的鹽包括但不限于無機酸鹽，如鹽酸鹽，硫酸鹽，磷 酸鹽，二磷酸鹽，氫溴酸鹽和硝酸鹽；或者有機酸鹽，如蘋果酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、酒 石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽或棕櫚酸鹽、水楊酸 鹽和硬脂酸鹽。類似地，藥學上可以接受的陽離子包括但不限于鈉、鉀、鈣、鋁、鋰、和銨。由 于上述原因而優(yōu)選的本發(fā)明的鹽包括鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽、和銨鹽。本發(fā)明的保護范圍還包括 本發(fā)明化合物的立體異構(gòu)體、晶形、水合物和溶劑化物。作為免疫抑制劑，這些化合物用于預防或治療自身免疫病，預防或治療外來移植 物排斥和/或相關(guān)的痛苦、疾病和病癥。根據(jù)本發(fā)明，可以通過任何使活性成分化合物與恒溫動物身體上的作用部位進行 接觸的方法給予本發(fā)明化合物，用于治療自身免疫病，預防外來器官移植排斥和/或相關(guān) 的痛苦、疾病和病癥。例如，可以通過口服、局部給藥，包括透皮、眼、口腔、鼻內(nèi)、吸入、陰道 內(nèi)、直腸、腦室內(nèi)和腸道外給藥。可以通過任何常規(guī)的與藥劑結(jié)合使用的方法，將所述化合物作為單獨的治療劑或 與治療劑組合進行給藥。它們可以單獨給藥，但一般與藥學載體一起給藥，這些載體根據(jù)所 選擇的給藥途徑和常規(guī)藥學實踐進行選擇。活性成分可以以下列形式口服給藥固體劑型，如膠囊、片齊IJ、錠齊IJ、糖衣丸、顆粒 劑和粉劑；或液體劑型，如糖漿、乳劑、分散體和懸浮液?；钚猿煞诌€可以以下列形式腸道 外給藥無菌液體劑型，如分散體、懸浮液或溶液。還可以使用其它劑型進行這種成分的給 藥，如作為用于局部給藥的軟膏、乳膏、滴劑、透皮貼片或粉劑，作為用于眼睛給藥的沿用溶 液或懸浮液構(gòu)成物，即眼用溶液滴劑，作為用于吸入或鼻內(nèi)給藥的氣霧劑或粉劑組合物，或 作為用于直腸或陰道給藥的乳膏、軟膏、噴霧劑或栓劑。明膠膠囊含有活性成分和粉末載體，如乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂 酸等等。可以用類似地稀釋劑制成壓片。片劑和膠囊都可以制成緩釋產(chǎn)物在數(shù)小時內(nèi)持續(xù) 釋放藥物?？梢詫浩M行糖包衣或薄膜包衣以掩蓋任何不適的味道和保護片劑免受空氣影響，或者進行腸包衣使片劑選擇性在胃腸道中崩解。用于口服給藥的液體劑型可以含有著色劑和調(diào)味劑使患者更能接受?！銇碚f，水、適宜的油、鹽水、右旋糖水溶液和相關(guān)的糖溶液與二醇如(丙二醇 或聚乙二醇)是適宜用于腸道外溶液的載體。用于腸道外給藥的溶液優(yōu)選包含活性成分 的水溶性鹽，適宜的穩(wěn)定劑，如需要還包含緩沖物。單獨或組合使用的抗氧化劑如酸式亞 硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸式適宜的穩(wěn)定劑。還使用檸檬酸及其鹽和乙二胺四乙酸鈉 (EDTA)。在某些實施方案中，可以通過使用5ml 95%乙醇來溶解稀釋30mg的高級脂肪酸衍 生物，然后再用磷酸鹽緩沖液(PBS)將所得溶液進一步稀釋至最終藥物濃度在0.01-6mg/ ml范圍內(nèi)。為進行吸入給藥，可以以加壓包裝或噴霧器噴出的氣霧劑形式方便給予本發(fā)明的 化合物。還可以以配制成的粉劑給予此化合物，這種粉劑組合物可以在吹入式粉劑吸入器 裝置的幫助下被治療者吸入。為進行眼睛給藥，可以在適宜眼用賦形劑中的本發(fā)明化合物的適宜重量百分比的 溶液或懸浮液配制眼用制劑，以使此化合物保持與眼表面接觸充足的時間以治療粘膜表面 或透過角膜或眼睛的內(nèi)部區(qū)域。本發(fā)明化合物分步給藥或與其它治療劑聯(lián)合給藥的時候一般可使用相同的劑型。當以物理聯(lián)合給藥時，應根據(jù)聯(lián)合藥物的相容性選擇劑型和給藥途徑。因此，術(shù)語 共同給藥應理解為包括同時或依次給予兩種藥劑，或者可作為兩種活性成分的固定劑量的 聯(lián)合。由此可見，雖然舉例說明，本文描述了本發(fā)明的具體實施方案，但可以在不背離本 發(fā)明的構(gòu)思和保護范圍的情況下進行各種改動。因此，除了由所附的權(quán)利要求限定之外，本 發(fā)明未被限定。而且，本文涉及的所有的期刊論文和參考文獻整體引入作為參考。實施例1脾臟淋巴細胞刺激和測定試驗的原始記錄如下藥物的處理1.取適量化合物于安培瓶中，用少量95%乙醇溶解，0.22um濾膜過 濾，用之前用1640 (Gibco, USA)培養(yǎng)液稀釋成一定濃度的溶液。2.將2mg Con A (Sigma, USA)用PBS平衡鹽溶液配成400ug/ml，于-20°C保存。斷頸處死C57bl/6小鼠，置75%酒精浸泡Imin后用無菌眼科剪、眼科鑷取下脾 臟。機械法搗碎脾臟，加3ml小鼠淋巴細胞分離液(好易得，北京達科為)，充分混勻后濾 網(wǎng)過濾，轉(zhuǎn)移到IOml離心管中，在分離液上方覆蓋500uL的1640培養(yǎng)液。2000r/min，離 心30min，取中間淋巴細胞層，PBS洗滌三遍得到淋巴細胞，計數(shù)，加淋巴細胞到96孔板中， 3 X IO5/孔，平行做3復孔。用1640培養(yǎng)液連續(xù)2倍稀釋化合物，設(shè)定化合物K的梯度濃度 2. 5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml，用 5ug/ml 的 Con A 處理 細胞作陽性對照，沒有Con A處理細胞作陰性對照。每孔補加適量10% 1640培養(yǎng)液，使終 體積為200ul/孔。在37°C培養(yǎng)箱(Thermo, USA)中培養(yǎng)48h，加入BrdU培養(yǎng)12小時后用 BrdU增殖試劑盒(Milipore，USA)進行檢測。結(jié)果如圖1，發(fā)現(xiàn)隨著化合物K的工作濃度的升高，其對淋巴細胞增殖的抑制作用 效果增強，但是濃度達到40ug/ml之后，后面濃度的抑制作用差別不大，可能后面隨著濃度的升高，其副作用也在增強或者是因為作用靶點已經(jīng)飽和。在40ug/ml的濃度下，對淋巴細 胞增殖的抑制效果最佳，說明化合物K對淋巴細胞有一定的免疫抑制效果。實施例2脾臟淋巴細胞IL-2，IL-10和IFN-γ基因表達測定，和臨床免疫抑制劑Π(-506比 較試驗的原始記錄如下藥物的處理1.取適量化合物于安培瓶中，用少量95%乙醇溶解，0.22um濾膜過 濾，用之前用1640 (Gibco，USA)培養(yǎng)液稀釋成一定濃度的溶液。2.將2mg Con A用PBS平衡 鹽溶液配成 400ug/ml，于-20°C保存。3.將 25mg FK-506 (ALEXIS, Switzerland)用 5mlPBS 溶解，分裝成200ul/管，于-20°C避光保存。分離得到脾臟淋巴細胞(同實施例1)計數(shù)，加淋巴細胞到96孔板中，3X IO5/孔， 平行做6復孔。用1640培養(yǎng)液分別稀釋化合物和Π(-506，設(shè)定如下實驗組化合物K(40ug/ ml)(實施例1證明其為有效抑制濃度)，Π(-506 (lug/ml)，半劑量化合物K (20ug/ml)，半劑 量Π(-506(0. 5ug/ml)及化合物 K (40ug/ml)與半劑量Π(_506 (0. 5ug/ml)聯(lián)合用藥。用 5ug/ ml的Con A處理細胞作陽性對照，沒有Con A處理細胞作陰性對照。每孔補加適量10% 1640培養(yǎng)液，使終體積為200ul/孔。在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，離心收集各組淋巴細胞。 提取RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄PCR得到cDNA樣本。之后取2uL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(每個樣本3復孔，每孔 2uL)，用實時定量PCR對其進行分析(ABI st印one系統(tǒng)，Biosystems)。以Syber Green I 和β-actin為參照，檢測各組移植物中IL-2、IFN-y和IL-IO基因的表達量。引物序列如 下β-actin forward 5' -CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3‘，and reverse 5' -ATGGAGCCACCGATCCACA-3‘；IL-2 forward 5' -GGAGCAGCTGTTGATGGACCTAC-3‘，and reverse 5' -AATCCAGAACATGCCGCAGAG-3‘；IFN-y forward5' -CGGCACAGTCATTGAAAGCCTA-3‘，and reverse 5' -GTTGCTGATGGCCTGATTGTC-3‘；IL-10 forward 5' -GACCAGCTGGACAACATACTGCTAA-3‘，and reverse 5' GATAAGGCTTGGCAACCCAAGTAA-3.結(jié)果如圖2-A、2-B、2_C，發(fā)現(xiàn)化合物K抑制淋巴細胞中IL-2和IFN-γ基因表達， 并且可明顯增強IL-10基因的表達。說明化合物可能通過抑制IL-2基因的表達來抑制淋 巴細胞增殖，也可能通過上調(diào)IL-10的表達來誘導調(diào)節(jié)型T細胞的生成，從而達到抑制細胞 增殖的目的。此外，化合物K與半劑量的Π(-506聯(lián)合作用的抑制效果最好，說明兩者具有 協(xié)同作用。實施例3T淋巴細胞增殖的測定，和臨床免疫抑制劑Π(-506比較試驗的原始記錄如下藥物的處理1.取適量化合物于安培瓶中，用少量95%乙醇溶解，0.22um濾 膜過濾，用之前用1640培養(yǎng)液稀釋成一定濃度的溶液。2.將25mg FK-506 (ALEXIS, Switzerland)用5mlPBS溶解，分裝成200ul/管，于_20°C避光保存。
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刺激細胞的制備斷頸處死BALB/c(H-2d)小鼠，置75%酒精浸泡Imin后用無菌 眼科剪、眼科鑷取下脾臟。機械法搗碎脾臟，加3ml小鼠淋巴細胞分離液，充分混勻后濾網(wǎng) 過濾，轉(zhuǎn)移到IOml離心管中，在分離液上方覆蓋500uL的1640培養(yǎng)液。2000r/min，離心 30min，取中間淋巴細胞層，PBS洗滌三遍。制成脾淋巴細胞懸液后用20 μ g/ml的絲裂霉素 (AMERESCO, USA)處理30min，作為刺激細胞。反應細胞的制備斷頸處死C57bl/6小鼠，制備脾臟淋巴細胞后準備適量尼龍毛 (Wako，Japan)，先將尼龍毛浸泡在適量PBS中5min，后用IOml含5%胎牛血清的1640培養(yǎng) 液洗滌柱子，洗完柱子后加適量體積的淋巴細胞，再在其上方覆蓋一層Iml培養(yǎng)液于37°C 細胞培養(yǎng)箱孵育lh，用IOml含5%胎牛血清的1640培養(yǎng)液將未結(jié)合的T淋巴細胞洗脫下 來。收集洗脫液到IOml離心管中離心，2000r/min, 5min,分離得到T細胞作為反應細胞。加板分別對刺激細胞和反應細胞計數(shù)，調(diào)刺激細胞濃度為2X IO6個/ml，反應細 胞濃度為5X IO6個/ml，分別加5X IO4個刺激細胞和5X IO5個反應細胞到96孔板中使刺 激細胞與反應細胞的比例為1 10，平行做3復孔。設(shè)置如下幾個檢測組化合物K (40ug/ ml)，F(xiàn)K-506 (lug/ml)，半劑量化合物 K (20ug/ml)，半劑量 FK-506 (0. 5ug/ml)及化合物 K(40ug/ml)與半劑量H(-506(0.5Ug/ml)。每孔補加適量10% 1640培養(yǎng)液，使終體積為 200ul/孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，加入BrdU培養(yǎng)12小時后用BrdU增殖試劑盒(Milipore， USA)進行檢測。結(jié)果如圖3，化合物K對T細胞增殖有一定的抑制作用，但發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組 對T細胞增殖的抑制效果最佳，說明化合物與Π(-506有協(xié)同抑制作用，這說明兩種藥物作 用機制可能不同。實施例4T淋巴細胞IL-2，IL_10和IFN-γ表達蛋白的測定，和臨床免疫抑制劑Π(-506比 較試驗的原始記錄如下主要過程同實施例3在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，收集各空細胞上清培養(yǎng)液。用ELISA試劑盒(BendenUSA) 檢測IL-2、IFN- γ和IL-10的表達水平，每組做3復孔。結(jié)果如圖4-A、4-B、4-C，化合物K對T細胞IL-2、IFN-Y表達具有一定的抑制 作用，可能說明化合物K作用機制類似于Π(-506。此外，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組對T細胞IL-2、 IFN-Y表達的抑制效果最佳，說明化合物與Π(-506有協(xié)同抑制作用，這也說明兩種藥物作 用機制可能不同；化合物K還可以增強IL-10的表達，可能通過誘導調(diào)節(jié)型T細胞的產(chǎn)生起 到一定的免疫抑制作用。實施例5記憶性⑶4+Τ細胞和記憶性⑶8+Τ細胞增殖的測定，和臨床免疫抑制劑Π(-506比 較試驗的原始記錄如下藥物的處理1.取適量化合物于安培瓶中，用少量95%乙醇溶解，0.22um濾 膜過濾，用之前用1640培養(yǎng)液稀釋成一定濃度的溶液。2.將25mg FK-506 (ALEXIS, Switzerland)用5mlPBS溶解，分裝成200ul/管，于_20°C避光保存。刺激細胞的制備同實施例3。
反應細胞的制備斷頸處死一只一個月前移植BALB/c(H-2d)皮膚的C57bl/6小 鼠，置75%酒精浸泡Imin后用無菌眼科剪、眼科鑷取下脾臟。機械法搗碎脾臟，加3ml小鼠 淋巴細胞分離液(好易得，北京達科為)，充分混勻后濾網(wǎng)過濾，轉(zhuǎn)移到IOml離心管中，在 分離液上方覆蓋500uL的1640培養(yǎng)液。2000r/min，離心30min，取中間淋巴細胞層，PBS洗 滌三遍得到淋巴細胞，計數(shù)，分別用記憶性CD4+T細胞和記憶性CD8+T細胞磁珠分離試劑盒 (R&D Systems, Inc. USA)，按照制造商的說明書分離得到⑶4+T細胞和記憶性⑶8+T細胞。加板分別對刺激細胞和反應細胞計數(shù)，調(diào)刺激細胞濃度為2X IO6個/ml，反應 細胞濃度為5X IO6個/ml，分別加5X IO4個刺激細胞和5X IO5個反應細胞到96孔板中 使刺激細胞與反應細胞的比例為1 10，平行做3復孔。設(shè)置如下幾個檢測組化合物 K(40ug/ml)，F(xiàn)K-506 (lug/ml)，半劑量化合物 K (20ug/ml)，半劑量 Π(-506 (0. 5ug/ml)及化 合物K(40ug/ml)與半劑量Π(-506 (0. 5ug/ml)。每孔補加適量10% 1640培養(yǎng)液，使終體積 為200ul/孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，加入BrdU培養(yǎng)12小時后用BrdU試劑盒(Milipore, USA)進行檢測。結(jié)果如圖5-A和5-B，化合物K分別對⑶4+T細胞和記憶性⑶8+T細胞細 胞增殖有一定的抑制作用，但發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組對T細胞增殖的抑制效果最佳，說明化合物 與Π(-506對CD4+T細胞和記憶性CD8+T細胞細胞增殖有協(xié)同抑制作用，這也說明兩種藥物 作用機制可能不同。實施例6預防和/或延遲小鼠皮膚移植排斥的發(fā)生本實施例舉例說明了代表性的化合物K預防和/或延遲小鼠皮膚移植排斥的發(fā)生 的能力。皮膚移植模型的制備用戊巴比妥鈉皮下注射麻醉供者鼠(BALB/c(H-2d)小鼠)， 用膠布背部向上固定于另一個操作臺上，背部皮膚備皮、酒精消毒。在小鼠頸部胸骨上切跡 水平及肋脊角水平分別做橫切口，沿兩側(cè)腋后線做縱行切口，完整取下背部皮膚。將背部皮 膚置于4°C生理鹽水中修剪成直徑略大于1. 2cm的圓形皮片。用Iml注射器吸取進口麻醉 (Hypnorm Midazolam NaCl = I 1 2)按 0. lml/10g 皮下注射給受體鼠(C57bl/6 小 鼠)。約5min后，小鼠麻醉狀態(tài)良好，遂將受體鼠背部向上用膠布將四肢固定于操作臺上， 背部皮膚備皮、酒精消毒。用眼科彎剪剪除直徑約1. 5cm的圓形背部皮膚，將修剪好的供體 皮片平整置于皮膚缺損處。用5-0絲線連續(xù)縫合皮膚。將移植模型放在加熱墊上，IOmin左 右蘇醒后放回籠中飼養(yǎng)。給藥在移植第0-10天給予免疫抑制劑治療，包括Π(-506 (2mg/ kg/d)、半劑量(Sub) FK-506 (lmg/kg/d)、化合物 K (10mg/kg/d)、Sub FK-506+ 化合物 K，對照 組腹腔及灌胃給生理鹽水。術(shù)后皮膚生長情況判斷移植物是否存活，皮膚脫落即判斷為完 全排斥，每天觀察一次，直至移植物完全排斥。結(jié)果如圖6所示，正常的皮膚排斥時間為11-15天，而使用Π(-506后，移植的皮 膚平均存活時間為52. 5天，使用半劑量Π(-506的平均存活天數(shù)為32天，使用化合物K的 平均存活天數(shù)為33天，化合物K和半劑量Π(-506聯(lián)合用藥的存活天數(shù)為56. 5天。說明化 合物K具有抑制移植皮膚排斥的能力，與半劑量Π(-506聯(lián)合用藥可以達到甚至超過全劑量 FK-506的效果，這在臨床應用上具有重要的意義。實施例7預防和/或延遲小鼠心臟移植排斥的發(fā)生
本實施例舉例說明了代表性的化合物K預防和/或延遲小鼠心臟移植排斥的發(fā)生 的能力。心臟移植模型的制備用Iml注射器吸取進口麻醉劑 (Hypnorm Midazolam NaCl = I 1 2)按 0. lml/10g 皮下注射給 C57bl/6 小鼠。約 5min后，小鼠麻醉狀態(tài)良好，遂將受體鼠腹部向上用膠布將四肢固定于操作臺上。在小鼠頸 部于正中線、下頌到胸骨上切跡2/3處做橫切口。找到頸外靜脈，游離3 5mm，將側(cè)支電 凝。然后近心端用血管夾夾閉，于遠心端結(jié)扎、切斷。將一段外層套管套在近心端頸靜脈外 側(cè)，用小彎鉤(1號注射器針頭制備)鉤出頸外靜脈，插入內(nèi)層套管。用鑷子將斷端靜脈向 外側(cè)翻轉(zhuǎn)套住外管，露出內(nèi)膜。在外翻處用6-0絲線節(jié)結(jié)扎，拔出內(nèi)管。向深部分離組織， 暴露頸動脈，方法同上制作頸動脈套管。用戊巴比妥鈉皮下注射麻醉BALB/c(H-2d)小鼠， 用膠布腹部向上固定于另一個操作臺上，做腹正中切口開腹，撥開腸道暴露下腔靜脈，順血 流方向注射含10%肝素的生理鹽水0. 5ml沖洗心臟，然后將腔靜脈和肺靜脈結(jié)扎，離斷；將 主動脈和肺動脈離斷；將胸主動脈套到頸動脈套管上，其內(nèi)膜與頸動脈外翻的內(nèi)膜相接，在 外側(cè)用6-0絲線節(jié)扎；將上腔靜脈套到頸靜脈套管上，其內(nèi)膜與頸靜脈外翻的內(nèi)膜相接，在 外側(cè)用6-0絲線節(jié)扎；打開頸動脈和頸靜脈的血管夾，移植心臟復蘇。用6-0絲線連續(xù)縫合 皮膚。將移植模型放在加熱墊上，IOmin左右蘇醒后放回籠中飼養(yǎng)。給藥在移植第0-10天給予免疫抑制劑治療，包括Π(-506 (2mg/kg/d)、半劑量 (Sub)FK-506(lmg/kg/d)、化合物 K(10mg/kg/d)、Sub FK-506+ 化合物 K，對照組腹腔及灌胃 給生理鹽水。術(shù)后由頸部搏動情況判斷移植物是否存活，搏動停止即判斷為完全排斥，每天 觀察兩次，直至移植物完全排斥。結(jié)果如圖7所示，正常的同種異體小鼠心臟移植排斥時間為6-8天，而使用 FK-506后，移植的皮膚平均存活時間為19天，使用半劑量Π(-506的平均存活天數(shù)為13. 5 天，使用化合物K的平均存活天數(shù)為13. 5天，化合物K和半劑量Π(-506聯(lián)合用藥的存活天 數(shù)為22天。說明化合物K具有抑制移植心臟排斥的能力，與半劑量Π(-506聯(lián)合用藥可以 達到甚至超過全劑量Π(-506的效果，這在臨床應用上具有重要的意義。實施例8預防和/或延遲小鼠胰島移植排斥的發(fā)生本實施例舉例說明了代表性的化合物K預防和/或延遲小鼠胰島移植排斥的發(fā)生 的能力。糖尿病模型的誘導胰島移植前一周，通過對受體小鼠注射STZ注射(180mg/ kg. bw, BBI, USA)誘導糖尿病模型。自第3天開始每天使用血糖儀(FreeStyle，Abbott, USA)檢測血糖，連續(xù)兩次血糖> 16. 7mmol/L定義為建模成功。胰島的分離、純化與移植按需用D-HBSS配制lg/L的膠原酶P溶液，融化后按每 個胰腺3ml準備到IOml注射器中并接好頭皮針；另準備50ml離心管，每管每只鼠加入Iml CLSV，一并置于冰中。將BALB/c (H-2d)小鼠用4ml/kg的10%水合氯醛加2ml/kg的芬太尼 麻醉。75%乙醇消毒腹部皮膚，打開腹腔，將內(nèi)臟撥至右側(cè)，肝臟外展暴露胰腺及膽總管，在 膽總管進入十二指腸處用將其夾畢。剪心放血處死小鼠。體視顯微鏡下用4. 5號頭皮針穿 刺膽總管，緩慢注入膠原酶V溶液3ml，使胰腺逆行進入胰腺總管，充分均勻膨脹胰腺。用無 損傷鑷子沿十二指腸邊緣自十二指腸向小腸方向剝離胰腺組織，分離脾臟和脂肪組織后，
16將胰腺轉(zhuǎn)移至備好的50ml離心管中，冰上保存。38°C水浴靜止準確消化20min，劇烈震蕩5 次使其成細砂狀，加入冰浴的含10%新生牛血清的洗滌液I至終體積50ml終止消化，在冰 上用20目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，無制動離心機點轉(zhuǎn)離心，轉(zhuǎn)速達1360rpm后停止離心并棄去上 清，洗滌液II洗滌一次，IOml洗滌液II重懸沉淀。將懸液轉(zhuǎn)移至IOml離心管中，無制動離 心機點轉(zhuǎn)離心，轉(zhuǎn)速達1360rpm后停止離心，充分棄去上清。加入4ml淋巴細胞分離液，輕 柔吹吸混勻沉淀，向上層緩慢加入HBSS溶液2ml，無制動離心機離心1600rpm，20min。離心 完畢，5ml槍頭吸取界面層，置于另一加入含40ml HBSS的50ml離心管中，充分混勻，無制動 離心機點轉(zhuǎn)離心，轉(zhuǎn)速達1360rpm后停止離心，棄去上清后將重懸的沉淀經(jīng)IOOum尼龍濾網(wǎng) 過濾，轉(zhuǎn)移未濾過物至一次性培養(yǎng)皿中，體式顯微鏡下手挑胰島至用含抗生素和10%小牛 血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。胰島挑取完畢，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備實驗，培養(yǎng) 時間< 24h。用供體鼠同樣的麻醉方法麻醉C57bl/6小鼠，左側(cè)身體向上側(cè)臥固定四肢，左 腎周圍備皮，酒精消毒整理毛發(fā)。在左腎上方皮膚剪開小口，使左腎可以恰好擠出體外。用 針頭在左腎下極側(cè)開小口，用4號平口工程針扇形分離腎被膜。將注射裝置插入腎被膜深 處，旋轉(zhuǎn)移液槍注射胰島，防止胰島外流。注射完成后，電凝器封住腎被膜上切口并縫合小 鼠皮膚。整個操作須在電熱毯上進行，完成后注意小鼠護理。給藥在移植第0-10天給予免疫抑制劑治療，包括Π(-506 (2mg/kg/d)、半劑量 (Sub)FK-506(lmg/kg/d)、化合物 K(10mg/kg/d)、Sub FK-506+ 化合物 K，對照組腹腔及灌胃 給生理鹽水。術(shù)后每天使用血糖儀(FreeStyle，Abbott，USA)檢測血糖，連續(xù)兩次血糖濃度 大于11. lmmol/L判斷為胰島已經(jīng)排斥。結(jié)果如圖8所示，正常的同種異體小鼠胰島移植平均排斥時間為14天，而使用 Π(-506后，移植的皮膚平均存活時間為47.5天，使用半劑量冊-506的平均存活天數(shù)為 24. 5天，使用化合物K的平均存活天數(shù)為27. 5天，化合物K和半劑量Π(_506聯(lián)合用藥的存 活天數(shù)為68天。說明化合物K具有抑制移植胰島排斥的能力，與半劑量Π(-506聯(lián)合用藥 超過使用全劑量Π(-506的效果，這在臨床應用上具有重要的意義。綜上所述，本發(fā)明給出了含有化合物(I)結(jié)構(gòu)的化合物K在預防或治療多種疾病 藥物組合物的應用，當然，含有化合物(II，III，IV)或化合物(I，II，III，IV)中的幾種組 合的免疫抑制劑對預防或治療多種疾病也有同樣的功效，本文對其實驗不做贅述。
1權(quán)利要求
高級脂肪酸衍生物的免疫抑制劑，其特征在于包括如下式所述的化合物及其藥學上可接受的鹽，溶劑化物或水合物中的一種或多種組合(1)化合物ICH3(CH2)m1CH＝CH(CH2)n1COR其中10≤m1+n1≤22，m1＝1～13，n1＝1～21；R為 CH3、 CH2CH3、 CH(CH3)2、 (CH2)3CH3、 (CH2)2CH2CH3、 C(CH3)3、環(huán)己烷基、苯甲基、乙醇胺基、二甲氨基乙胺基， N(CH2CH2Cl)2， N(R1)CONHR2；R1、R2可以相同，也可以不同，為如下結(jié)構(gòu)A、B、C、D、E獨立地選自 H、 OH、 NH2、 NO2、 CH3、 OCH3、 OCH2CH3、 CH2NH2；(2)化合物IICH3(CH2)m2CH＝CH(CH2)n2CH＝CH(CH2)X1COR其中m2+n2≤11；8≤m2+n2+x1≤20；m2＝1、4、7、10；n2＝1、4、7、10；x1≥1；R同化合物I式中的R；(3)化合物IIICH3(CH2)m3CH＝CH(CH2)n3CH＝CH(CH2)x2CH＝CH(CH2)yCOR其中m3+n3+x2≤9；6≤m3+n3+x2+y≤18；m2＝1、4、7；n2＝1、4、7；x2＝＝1、4、7；y≥1；R同化合物I式中的R；(4)化合物IVCH3(CH2)zCOR其中z＝12～24；R同化合物I式中的R。FSA00000066336900011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高級脂肪酸衍生物的免疫抑制劑，其特征在于所述藥學上 可接受的鹽是指與酸所形成的鹽，以及與強堿所形成的鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高級脂肪酸衍生物的免疫抑制劑，其特征在于所述化合物 包括化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV的所有構(gòu)象異構(gòu)體；化合物還包括化合物 I、化合物II、化合物III、化合物IV的所有旋光異構(gòu)體以及外消旋體，非對映異構(gòu)體和上述 異構(gòu)體的混合物；還包括化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV的互變異構(gòu)體及立體 異構(gòu)體，以及任一上述形式的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高級脂肪酸衍生物的免疫抑制劑，其特征在于所述藥學上 可接受的鹽是藥學上可接受的酸的加成鹽，藥學上可接受酸的加成鹽的酸形成非毒性酸加 成鹽的酸，即含有藥學上可接受的陰離子的鹽，例如鹽酸鹽，硝酸鹽，硫酸鹽，硫酸氫鹽，磷 酸鹽，乙酸鹽，乳酸鹽，檸檬酸鹽，酒石酸鹽，琥珀酸鹽，馬來酸鹽，葡糖酸鹽，苯甲酸鹽，甲基 磺酸鹽，苯基磺酸鹽，對甲苯磺酸鹽和二羥基萘酸鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高級脂肪酸衍生物的免疫抑制劑，其特征在于所述藥學上 可接受的鹽是藥學上可接受的堿加成鹽，藥學上可接受堿的加成鹽的堿形成非毒性堿加成 鹽的堿，非毒性堿的鹽包括但是不限于藥學上可接受的陽離子，例如堿金屬陽離子，堿土金 屬陽離子，銨或水溶性胺的加成鹽，以及低級烷基銨和藥學上可接受的有機胺的其它堿性
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高級脂肪酸衍生物的免疫抑制劑在治療或預防哺乳動物患者疾病的藥物組合物中的應用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高級脂肪酸衍生物的免疫抑制劑在治療或預防哺乳動物炎 癥疾病的藥物組合物中的應用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高級脂肪酸衍生物的免疫抑制劑在治療或預防哺乳動物過 敏反應疾病的藥物組合物中的應用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高級脂肪酸衍生物的免疫抑制劑在治療或預防哺乳動物 T-細胞，白血病和T-細胞淋巴瘤的藥物組合物中的應用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高級脂肪酸衍生物的免疫抑制劑在治療或預防哺乳動物器 官移植免疫排斥的藥物組合物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種高級脂肪酸衍生物免疫抑制劑，包括化合物I，CH3(CH2)m1CH＝CH(CH2)n1COR，化合物II，CH3(CH2)m2CH＝CH(CH2)n2CH＝CH(CH2)X1COR，化合物III，CH3(CH2)m3CH＝CH(CH2)n3CH＝CH(CH2)x2CH＝CH(CH2)yCOR，化合物IV，CH3(CH2)zCOR及其藥學上可接受的鹽，溶劑化物或水合物中的一種或多種組合。此免疫抑制劑適用于治療或預防哺乳動物患者疾病，治療哺乳動物炎癥疾病，治療哺乳動物過敏反應疾病，治療哺乳動物T-細胞，白血病和T-細胞淋巴瘤，治療哺乳動物疾病，可以抑制患有自身免疫病、炎性疾病或移植物抗宿主疾病的動物的免疫應答，并具有低毒性和可控的副作用。
文檔編號A61K31/121GK101919832SQ201010148460
公開日2010年12月22日 申請日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者王永志, 秦箐, 鄺曉慧, 齊志權(quán) 申請人:廈門大學