專利名稱：胸腺素α1在免疫疾病治療中的用途的制作方法
胸腺素Ctl在免疫疾病治療中的用途 本發(fā)明涉及胸腺素ot 1在制備用于治療移植物抗宿主病的藥劑中
的用途。
在骨髓移植或輸血、或從供體到與供體無組織相容性的受體的器 官移植中，供體的淋巴細胞遷移入受體。如果受體不能排斥供體的淋 巴細胞，供體的淋巴細胞在受體體內占據并增殖，并攻擊組織，誘導疾病。
對于患有白血病、晚期腎病、心臟病、肺病或肝衰竭的患者，治 療中最經常使用器官移植。例如，目前常規(guī)進行的是多種類型的同種 異體移植物(從除患者自身或該移植物的宿主/受體以外的供體得到器 官移植物)，例如腎、心臟、肺、肝、骨髓、胰、角膜、小腸和皮膚 (如表皮細胞膜片)。臨床中也使用異種移植物(從非人動物得到器 官移植物)，如豬心臟瓣膜，以替換喪失功能的相應人器官。
為保證器官移植成功，希望從患者的同卵雙生兄弟/姐妹或其直系
家庭成員得到移植物。這是因為器官移植引起多種宿主免疫應答，其
導致移植排斥和移植物抗宿主病(以下稱為"GVHD")。
免疫應答主要由T細胞通過識別同種異型抗原而觸發(fā)，且移植排 斥中的主要靶點是I類和II類主要組織相容性復合物(MHC)抗體的 非自身等位基因形式。在急性排斥中，供體的抗原呈遞細胞(如樹突
細胞和單核細胞)從同種異體移植物遷移到局部淋巴結，在那里，它 們被受體CD4+ th細胞識別為異物，刺激Th細胞増殖。隨著L細胞增 殖，產生效應細胞群(包括細胞毒性CD8+T細胞和CD4+T細胞)，這 些細胞遷移并侵潤到移植物，并且調節(jié)移植排斥(Noelle Ws/. (1991) FASEB 5 (13) :2770 )。
盡管急性排斥是依賴于T細胞的過程，但有廣泛的效應機理參與移植排斥。多種淋巴細胞(包括CDf T細胞、CD8+細胞毒性T細胞、 抗體形成B細胞及其他促炎白細胞)通過釋放細胞因子及細胞間相互 作用被募集到抗同種異體移植物應答?？乖蔬f移植細胞直接被細胞 毒性CD8+T細胞消滅?；罨腃D4+T細胞產生白細胞介素-2 (以下稱 為"IL-2"),其對CD8+T細胞和B細胞的活化是必需的。另外，CD4+ T細胞產生其他細胞因子，如IFN-y和IL-4,它們也參對同種異體移 植物的破壞。不僅如此，干擾素y (以下稱為"IFN-y，，)誘導移植 組織中I類和II類MHC分子表達升高，所述移植組織更容易被同種異 體反應效應細胞攻擊。IFN-y增強巨噬細胞活性，且作用于許多炎性 細胞而引起遲發(fā)性過敏反應和炎癥，導致對移植物的的非特異性損傷。 這些反應似乎是早期急性排斥(可發(fā)生于移植后的頭幾周內)的主要 原因。如果不治療，急性排斥發(fā)展成快速、嚴重的過程，而在數日內 破壞移植物。
另一方面，當來自供體的T淋巴細胞基于一組遺傳標簽(一般稱 之為人白細胞抗原(HLA))而識別差異時，其開始攻擊新的機體(即 患者的機體)。盡管大多數患者和供體針對HLA標簽都盡可能匹配。 但除非患者和供體是同卵雙生兄弟/姐妹，否則供體和患者之間的很多 次要標簽是不同的。移植前，對供體和受體進行廣泛的配型，以保證 供體和受體在免疫學上非常接近。盡管進行了這樣的配型，但還是有 檢測不到的免疫學差異，且可檢測到供體移植物中的T淋巴細胞。結 果，供體的T淋巴細胞開始攻擊受體的機體，并引發(fā)GVHD。
有兩種形式的GVHD:急性和慢性GVHD。急性GVHD通常發(fā)生在移 植后的頭三個月內。存在于供體骨髓中的T細胞在移植時攻擊患者的 皮膚、肝、胃和/或腸。急性GVHD的早期體征通常是出現在手、足和 臉的皮滲。除了皮膚水皰，患有重度GVHD的患者還產生大量水性或血 性腹瀉，伴有痙攣，這是源于供體的T細胞攻擊胃和腸。黃疸(皮膚 和眼變黃)是涉及肝的GVHD病常見的適應癥。牽連的器官越多，且癥 狀越惡化，GVHD病越惡化。
尤其在骨髓移植的情況下，GVHD是接受移植的患者存活的另一個
4障礙。Storb (1984) " Pathophysiology and prevention of graft-versus-host disease." In Advances in Immunobiology: Blood cell antigens and bone marrow transplantation, McCullogh and Sandier, editors, Alan， Inc., N. Y. ， p. 337。 一大部分患有 GVHD的個體死于GVHD。 Weiden et al. (1980) "Graf t-versus-host disease in allogeneic marrow transplantation" ， in Biology of Bone-Marrow Transplantation, Gale and Fox， editors, Academic Press, N. Y. , p37。
胸腺素al是醫(yī)藥領域熟知的化合物。
此化合物是存在于胸腺提取物中的酸性肽，其在多個體外及體內 分析中顯示出免疫調節(jié)特性(1972; ProcNatl. Acad. Sci. U. S. A. 69， 1800-1803)。
胸腺素ccl之前的應用是已知的。
WO2004087067涉及胸腺素a 1在經骨髓移植的免疫減弱宿主中預 防煙曲霉(Aspergillus fumigatus )感染的用途。
給預先接種人非小細胞肺癌("NSCLC")細胞的棵鼠皮下施用胸 腺素cc 1顯著減小了腫瘤體積。
胸腺素al也可降低患有曱基膽蒽(methycholanthrene)誘導的 纖維肉瘤的小鼠的肺轉移，并且在用胸腺素otl處理BALB/c小鼠中顯 著降低局部肉瘤生長及淋巴肉瘤細胞的肝和肺轉移。
胸腺素a 1用于制備預防或治療GVHD的藥物的用途在本領域中是 未知的。
已使用多種免疫抑制劑用于保護患者免于GVHD。目前用于控制移 植排斥的免疫抑制劑有如環(huán)孢菌素A、硫唑嘌呤、皮質類固醇(包 括潑尼松和曱基潑尼松龍)、環(huán)磷酰胺及FK506。環(huán)孢菌素A是最強 效且最常用的免疫抑制劑，革新了器官移植手術領域。在治療和/或預 防器官移植排斥中也已經使用了其他免疫抑制劑，如FK506、雷帕霉 素、霉酚酸、15-脫氧精胍菌素、mimoribine、米索前列醇、0KT3和 抗IL-2受體抗體。Briggs, Immunology letters, 29(1-2)， 89—94，1991; FASEB 3:3411， 1989。盡管新免疫抑制藥物的開發(fā)對患者的存 活率產生了實質性的改善，但這些藥物也伴有高發(fā)生的副作用，例如 腎毒性和/或肝毒性。
例如，環(huán)孢菌素A在甚至以治療劑量使用時都伴有毒性和副作用。 盡管FK506抑制體外活化誘導的IL2轉錄及體內移植排斥的效力比環(huán) 孢菌素高出約IO-IOO倍，但它還是顯示出副作用，如神經毒性和腎毒 性。因此，仍需在治療和預防GVHD的同時改善毒性。
已發(fā)現胸腺素cc 1是用于抑制或治療哺乳動物受試者器官移植中 移植物抗宿主病或移植排斥反應的有效制劑。
因此本發(fā)明的目的是胸腺素ct 1用于制備用于預防或治療接受細 胞、組織或器官的哺乳動物受試者(如人患者)器官移植后的移植物 抗宿主病或移植排斥反應的藥物中的用途。
本發(fā)明中所述細胞、組織或器官可選自干細胞、造血干細胞、 骨髓、心臟、肝、腎、肺、胰、小腸、角膜或皮膚。
可將本發(fā)明的胸腺素ccl施用給于清髓性或非清髄性預處理方案 中的受試者。
可將藥學有效量的本發(fā)明的胸腺素ocl任選與免疫抑制劑組合， 在移植前和/或移植后的預定時間窗口內施用給患者，所述免疫抑制劑 選自潑尼松、曱基潑尼松龍、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢菌素A、 FK506、沙立度 胺、硫哇嘌呤、達珠單抗(Dacliz畫b )、英夫利西單抗(infliximab )、 MEDI-205、 abx-cbl或ATG。
以下實施例進一步示例說明本發(fā)明。
簡介
胸腺素ctl是天然存在的胸腺肽(Expert Opin. Biol. Ther. 2004;4:559-573 )，其通過Tol 1樣受體(TLRs，包括TLR9 )信號轉 導促進人和小鼠DCs 的成熟和細胞因子釋放(Blood. 2004; 103: 4232-4239 )。胸腺素oc 1通過影響產生IL-12的DCs和產 生IL-10的DCs的平衡起免疫調節(jié)劑的作用，其能夠誘導抗煙曲霉(^;ypei^/7/us /wz /^^M) 的保護寸生免疫 (Blood. 2004; 103: 4232-4239 ) 。 TLR9刺激還可通過包括自分泌I型IFN信號 轉導的機制引起ID0的活化(J. Immunol. 2005; 175: 5601-5605; Eur. J. Immunol. 2005;36:8-11)，并可促進pDC調節(jié)的CD4+CD25+細胞產 生(J. Immunol. 2004;173:4433-4442 )，這類細胞是對真菌的ID0 依賴性保護性免疫的必要成分(J. Immunol. 2005;174:2910-2918; J Immunol. 2006;176:1712-1723 )。本發(fā)明評估了胸腺素ot 1在平衡通 過DCs的免疫和耐受以及T reg細胞產生中的活性。用GM-CSF/IL-4
(GM-DCs)或FLn配體(FL-DCs)，從骨髓(小鼠)或外周血(人) 前體衍生出的DCs,已知其擴增具有或不具有胸腺素otl的常規(guī)DCs 和pDCs (J. Immunol. 2005; 174:6592-6597 )。分析了DCs的IDO表 達及調節(jié)Thl/T reg引發(fā)體外和體內抗煙曲霉和同種異體抗原的能力。 發(fā)現了由不同DC群的引發(fā)和耐受中的特化和互補性。但胸腺素ctl在 DC分化過程中通過TLR9和I型IFNR信號轉導活化IDO依賴性致耐受 性程序來改變炎癥和耐受的平衡。
材料與方法 小鼠
8-10周齡的近交系BALB/c和C57BL6雌性小鼠得自Charles River/Harlan育種實驗室(Calco， Italy )。在Perugia大學(Perugia ) 的動物研究室中于特定的無病原體條件下繁育C57BL6背景的純合的 TLR9-/-或IFN-aPR-Z-小鼠。涉及動物及其保護的步驟遵循國家法律
和政策進行。 供體和患者
在有書面的知情同意的情況下，從健康供體和7位T細胞缺乏的 單倍體相合HSCT的受體中得到人外周血單核細胞。如(Blood. 2005;106:4397-4406 )所述評價了供體的配型、植入和GVHD。給實驗 HSCT模型致死劑量照射(8Gy)的C57BL6小鼠輸注來自BALB/c小鼠 的去除T細胞的骨髓細胞(Blood. 2003; 102: 3807-3814 )。對于GVHD，
7將純化的供體CD3+ T脾細胞加入到移植物中(Science. 2002;295:2097-2100 )。每周根據GVHD標準將單個小鼠分為0-2的等 級(見圖3的圖例)，而不清楚實驗組。 煙曲霉感染
煙曲霉菌林的培養(yǎng)條件和感染如Blood. 2004; 103: 4232-4239所 述。用2.5%的三溴乙醇(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO)麻醉 小鼠。通過殼多糖測定量肺中的真菌生長，結果表示為jag葡糖胺每 對肺，，,并如Blood. 2004; 103: 4232-4239所述進4亍PAS染色。
試劑
提供純化的，無內毒素的無菌的凍干的乙?；亩嚯男问降男叵?素ccl和亂序的肽(s胸腺素ocl) (二者均得自SciClone Pharmaceuticals, Inc. SanMateo, CA) ( Blood. 2004;103:4232-4239 )。將凍干粉重新溶于無菌水中。
DC亞類的產生和培養(yǎng)
從來自健康供體或移植患者(HSCT后1個月的)的，在rGM-CSF (Schering-Plough， Milan, Italy)和rlL-4 (Peprotech, Inalco， Milan, Italy)或FLT3-L ( Immu認Corporation, Seattle, WA )的 存在下于Iscove，s改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-9天的純化的CD14+單核細 胞中得到的GM-DCs或FL-DCs (Blood. 2004; 103:4232-4239 )。從移 植患者中得到的細胞培養(yǎng)物中的DC回收降低20-30°/。。如Blood. 2004;103:4232-4239所述，從7-9天骨髓細胞得到小鼠GM-DCs或 FL-DCs。向培養(yǎng)物中加入20ng/mL的胸腺素ocl和s胸腺素a 1。通過 磁活化細胞分選用CDllc MicroBeads和MidiMacs ( Milteny Biotech ) 從脾(spDCs)中純化DCs (超過99°/。的CDllc+由90-95% CD8-、 5-10% CD8+和1-5% B220+細胞組成)。使用CD8或B220 MicroBeads( Mi 1 teny Biotech)將DC群進一步分為CD8-、 CD8+和B220+部分。如述用活的 未受調理素作用的曲霉分生孢子或來自釀酒酵母(Sigma )的酵母多糖 或CpG-ODN 2006在無血清Iscove培養(yǎng)基中沖擊DCs 24小時。如Blood. 2004; 103: 4232-4239所述進行吞噬作用。^使用高分辨率顯微彩色照相機AxioCam，使用AxioVision軟件Rel. 3.1 (Carl Zeiss, Milan, Italy)獲取照片。 流式細胞術
使用配備有CELLQuestTM軟件的流式細胞熒光測量儀(Becton Dickinson, Mountain View, CA)， 并使用Pharmingen的綴合mAbs 分析DCs的抗原表達(Blood. 2004; 103:4232-4239 )。
ID0表達和功能分析
如 Nat. Immunol. 2002; 3: 1097-1101，Generation, purif icationand activity of T reg eel 1 s所述評價ID0的表達和 功能活性。在流式細胞計數或ELISPOT分析前，將脾CD4+T細胞與用 分生孢子沖擊的DCs共培養(yǎng)5天。使用2 ju M的1-MT( Sigma-Aldrich )。 用磁性細胞分選從肺和TLN中分離CD4+CD25+和CD4+CD25-細胞(在 FACS分析中的純度>90%) (J. Immunol. 2006;176:1712-1723 )。 對于T reg細胞抑制，將5 x 104個TLN T reg細胞加入3 x 105個 CD4+CD25-細胞(二者均來自移植小鼠)中，于H3-胸苷標記前用來自 初次受試供體小鼠的3 x 104個自體曲霉分生孢子沖擊spDCs或1.5 x 105個同種異體spDCs刺激5天。使純化的腹膜CDllb+Gr-1+ PMN (在FACS分析中的純度>98%) ( 2 x 106個)在4 x 105個CD4+CD25+ 存在下與靜息的分生孢子接觸60分鐘(以產生氧化劑)或24小時(以 產生細胞因子)(J, Immunol. 2006;176:1712-1723 )。
細胞因子和ELISPOT分析
通過酶聯(lián)免疫吸附分析(Endogen Human Elisa Kits, R&D Systems and Euroclone， Milan, Italy)評估細胞因子含量。對用分生孢子 沖擊的DCs共培養(yǎng)物5天的純化的脾CD4+T細胞用AID-EliSpot分析 試劑盒(Ampl imedical， Buttigliera Alta， Turin, Italy)， 以計 算產生細胞因子的細胞數量(Blood. 2003; 102:3807-3814 )。使用2 jaM的l-MT。
過繼轉移、真菌攻毒及對保護的評價
小鼠于HSCT的第二天開始每周接受兩次腹膜內DCs注射，于最后一次DC施用后一周時感染。三天后，評價了用特定的Milteni Biotec 分離試劑盒純化的肺勻漿物、CD4+ T細胞(在FACS分析中純度>98% )、 CD4+CD25- ( >98%)或CD4+CD25+ ( >82%)的促炎及抗炎才莫式(肺勻漿 中的TNF-a/IL-10)、經用曲霉沖擊刺激的CD4+細胞的Thl ( IFN-.) 或Th2 ( IL-4)細胞因子產生(Blood. 2003; 102: 3807-3814 ) 、 CD25+ IL-10+ TGF-P+ T reg細胞的頻率、淋巴細胞增殖和基因表達(通過 RT-PCR)。在做H3-胸苷標記前，將TLNCD4+T淋巴細胞(105個細胞/ 孔)與105個細胞/孔經照射的同種異體脾細胞或用分生孢子或10ju g/mL Con A沖擊5天的自體spDCs平板接種，進行增殖。 曲霉特異性的人T細胞克隆的產生和淋巴細胞增殖 通過將外周血CD4+CD45RA+ T細胞以有限稀釋濃度加入到經照射
(20Gy )的自身外周血飼養(yǎng)細胞，產生曲霉特異性的人CD4+ T細胞克 隆，并對其用分生孢子沖擊的DCs或同種異體DCs刺激(Blood. 2005; 106: 4397-4406 )。通過『-胸苷(Amersham Biosciences, Little Chalfont， UK )標記或2天后上清液中的細胞因子含量，評價生長中 的克隆的對真菌沖擊DCs的特異性、同種異體DCs、經照射的自體細 胞(作為陰性對照)和0. 5%植物血凝素(作為陽性對照)的特異性
(Blood. 2005; 106: 4397-4406 )。 反轉錄(RT)-PCR
如J Immunol. 2006; 176: 1712-1723所述完成RNA提取、cDNA合 成和PCR、基因特異性引物序列、退火溫度和擴增循環(huán)數。用GAPDH 確認并標準化擴增效率。
統(tǒng)計分析
使用學生配對t檢驗以確定實驗組中數值的顯著性(將P<0. 05 定義為顯著)。用Mann-Whitney U檢驗分析存活率的數據。體內組由 6只動物組成。
實施例1
胸腺素al擴增來自骨髓前體的pDCs，并活化色氨酸分解代謝
10為評價胸腺素ocl如何影響小鼠DCs的表形和功能特性，在胸腺 素ct 1或對照——亂序肽的存在下，于含有GM-CSF/IL4或FLT3L的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)骨髓細胞7-9天。成熟后，通過流式細胞術和光學顯微鏡 分析細胞(圖1A)。通過FACS分析得到的B220+CDllc+細胞的百分比 及用光學顯微鏡的形態(tài)檢查看出，相比FLT3L，僅用GM-CSF/IL4處理 不產生高比例的pDCs。但通過B220+CDllc+ DCs數量增多及常規(guī)的 CDllb+CDllc+細胞回收稍微減少可以看出，胸腺素otl不影響細胞總 產率，而大大增加GM-DCs中pDCs的出現率。
盡管已知胸腺素otl影響造血作用，僅用胸腺素ccl時未觀察到 B220+CDllc+細胞擴增。經胸腺素ot 1處理的FL-DC或經對照肽處理的 GM-DCs中，B220+CDllc+細胞未增加。在來自TLR9-/-或IFNct P R-/-小鼠的GM-DC中未觀察到由胸腺素ccl產生的pDCs擴增，表明胸腺素 cc 1的影響依賴于TLR9和I型IFNR信號轉導。
實施例2
胸腺素ocl促進骨髓DCs誘導IL-12，并促進pDCs誘導IL-IO 胸腺素oc 1誘導GM-DCs響應曲霉分生孢子釋放IL-12和IL-IO， 且i秀導FL-DCs響應曲霉分生孢子釋放IL-IO多于IL-12(圖1B)。 DCs 響應真菌產生IL-10受IDO依賴性通路的調節(jié)(J Immunol. 2005;174:2910-2918 )。當前條件下，來自TLR9-/-或IFNotPR-/-小鼠的細胞中均不發(fā)生響應胸腺素ctl的IL-IO產生，通過向培養(yǎng)物 中加入IDO抑制劑——l-甲基-DL-色氨酸(1-MT)也同樣阻斷IL-IO 的產生(圖IB)。通過免疫印記分析和根據DC將色氨酸轉化為犬尿 氨酸的酶活性評價，證實了胸腺素al在FL-DCs和GM-DCs內均i秀導 功能性IDO。而且，在來自TLR9-/-或IFNa PR-/-小鼠的DC中未觀 察到胸腺素al誘導IDO蛋白和功能(圖1C)。 實施例3
經胸腺素a 1誘導的ID0+ DCs體外活化T reg細胞 為將DCs表達IDO和產生IL-10通過可能的調節(jié)活性相關聯(lián)，我 們檢測了經胸腺素ctl誘導DCs,從而誘導體外脾004+ T淋巴細胞響應曲霉分生孢子的抗原特異性Thl/Treg引發(fā)的相對能力。圖2A顯示 胸腺素ot 1提高了 GM-DCs對產生IFN-. -/IL-10的CD4+ T細胞的啟動， 和FL-DCs對產生IL-10的細胞的啟動。與IDO阻斷類似，從胸腺素a l-GM-DCs耗盡B220+CDllc+消除了 T reg細胞活化(數據未顯示)。 用l-MT阻斷IDO阻止產生IL-10的CD4+ T細胞的活化，但對產生 IFN-.-的細胞無作用，提示IDO有原因地并選擇性地與產生IL-10的 T細胞的啟動相關聯(lián)。因為TLR9刺激活化IDO ( J. Immunol. 2005;175:5601-5605 )，并且也促進pDC調節(jié)的CD4+CD25+ T reg細 胞的產生(J. Immunol. 2004; 173:4433-4442 )，表達T reg活性的 標簽(如叉頭轉錄因子Foxp3和細胞毒性T淋巴細胞抗原-4( CTLA-4 )) 的CD4+CD25+ T細胞的發(fā)生。細胞熒光分析顯示，通過與DCs共培養(yǎng) 可擴增CD4+CD25+ T細胞(圖2B )。但在經胸腺素a l-誘導的DCs存 在下培養(yǎng)時，顯著比例的CD4+CD25+ T細胞由于胞內Foxp3和表面 CTLA-4被染為陽性。IDO阻斷使該效應無效。FL-DCs還誘導Foxp3+ T reg細胞，盡管程度較低。根據圖1C中的數據提示，FLT3L增強色氨 酸分解代謝，1-MT似乎干擾與FL-DCs共培養(yǎng)的Foxp3+CTLA4+CD25+T 細胞的擴增。因此，CD4+CD25+T reg細胞的體外發(fā)育似乎通過涉及 DC色氨酸分解代謝的機制而發(fā)生，且受胸腺素al的促進。 實施例4
經胸腺素a 1調整的GM-DCs在HSCT中保護宿主免于曲霉病 經真菌沖擊的DCs在實驗性HSCT中發(fā)揮有效真菌疫苗的作用。因 為調控HSCT24，25及抗真菌免疫中的炎癥和耐受的平衡是絕對需要的 (J. Immunol. 2005;174:2910-2918 )。
檢測了經胸腺素a 1處理的DCs是否會影響HSCT實驗性配置中的 體內啟動和耐受。給移植的小鼠輸注經真菌沖擊的DCs,用曲霉分生 孢子感染，并監(jiān)視存活率、真菌生長和肺中的炎性病理。與脾DCs類 似，FL-DCs (而非GM-DCs)以劑量依賴的方式賦予對感染的抗性，因 為在轉移5 x 105個(圖3A)(而非5 x 104個)DCs后，小鼠在感染中 存活，并控制了真菌生長。在用GM-DCs處理的小鼠中觀察到矛盾的效果，即盡管小鼠有效控制了真菌生長，但它們未能在攻毒中存活。但
通過轉移經胸腺素ot 1處理的GM-DCs可起到的完全保護顯示，胸腺素 al處理不能影響FL-DCs的接種潛力，卻可顯著提高GM-DCs的接種 潛力(圖3A) 。 FL-DCs包括等同于新鮮收獲的脾CD8+、 CDS-和 B220+LyC6+pDCs的混合物的群體。為仔細分析不同亞類在DCs的接種 潛力中的貢獻，檢測了單獨的或組合的純化自FL-DC或脾細胞群體的 部分在誘導針對HSCT中的曲霉病的保護中的能力。結果顯示，從廣泛 的真菌生長和傳播判斷，CD8- DCs和CD8+ DCs都不能單獨賦予對感 染的抗性。但在這兩個亞類的組合中觀察到保護，并且所述保護類似 于使用從脾或FL-DC培養(yǎng)物中純化的pDCs時所觀察到的保護(數據未 顯示)。因此，功能上不同活性的組合可能是產生FL-DCs和經胸腺素 al處理的GM-DCs在HSCT中的曲霉病的實驗性配置下起體內保護作 用的原因。 實施例5
GM-DCs的胸腺素a 1調整產生免疫組分鈍化的免疫毒性(immune component blunting immunotoxicity )
組織病理學揭示局部炎性細胞募集和反應在經GM-DC處理的小鼠 肺中高，但在輸注經胸腺素al處理的GM-DCs或輸注FL-DCs的小鼠 中低(圖3B)。這些發(fā)現提示，重度炎性毒性可能與GM-DCs的轉移 有關，并被經胸腺素a l預調整的GM-DCs所緩解。為直接揭示DCs的 免疫毒性的潛力，及其被胸腺素otl所緩和，將不同的DC群體輸注到 隨移植接受不同數量供體T細胞的小鼠中。
未經感染的小鼠用于評價GVHD，而將感染后的小鼠用于評價對感 染的易感性。盡管干細胞移植后GVHD的起始依賴于宿主APCs的直接 抗原呈遞(Science. 1999; 285:412-415; Nat Med. 2004; 10: 510-517 ), 也描述了由供體APCs的非直接抗原呈遞(Nat Med。 2004; 10: 987-992 )。與之前的發(fā)現(Science. 2002; 295:2097-2100 ) —致， 從分別輸注5 x 105個或1 x 105個T細胞后10和30天內所觀察到的 GVHD體征來看，GVHD的嚴重性依賴于輸注的T細胞數量。GM-DCs共施用大大加速由105個T細胞誘導的GVHD，但類似于FL-DCs,經胸 腺素a 1處理的GM-DCs完全防止所述效應(圖3C )。在對感染的易感 性方面，在單獨或伴隨GM-DCs輸注供體T細胞后，存活率未改變。相 反，類似于施用FL-DCs的小鼠，輸注經胸腺素otl處理的GM-DCs的 小鼠在感染中存活(圖3D)?？傊@些結果提示，如同spDCs， FL-DCs 在過繼轉移后的HSCT受體中完全有能力誘導抗真菌保護。相反， GM-DCs賦有免疫毒性，包括促進炎癥和GVHD (受胸腺素cc 1體外起始 的調控作用影響的宿主活性)。 實施例6
經胸腺素oc 1誘導的DCs啟動抗真菌的Thl/T reg應答 為測定經胸腺素al處理的DCs是否會體內誘導T reg細胞，評 價了肺勻漿中TNF-a/IL-10的產生水平、TLN CD4+ T細胞的 IFN-. /IL-4產生水平及TLN CD4+ T細胞中編碼IFN- 、 Th2-特異性 轉錄因子GATA-3和Foxp3的基因的表達水平。還評價了肺和TLN中 CD4+CD25+ T細胞的存在，因為在患有曲霉病的小鼠的肺和TLN中發(fā) 現了功能性不同的Treg細胞群(J. Immunol. 2006;176:1712-1723 )。 結果顯示，不同組中TNF-a/IL-10的產生模式完全不同。在未處理或 輸注GM-DCs的小鼠中TNF-a高，IL-IO低；在接受FL-DCs，且尤其是 接受經胸腺素otl處理的GM-DCs的小鼠中則反之(圖4A)。對CD4+T 細胞實際產生的IFN-./IL-4的評價顯示，在施用經胸腺素ccl處理的 GM-DCs或施用FL-DCs (無論其如何處理)的小鼠中，無論何種處理 IFN-.的量更高，IL-4的量更低(圖4A)。 PCR分析顯示，Ifng的mRNA 表達始終存在；在未處理或經未與胸腺素al接觸的FL-DCs處理的小 鼠中檢測到Gata3的mRNA;在施用FL-DCs (無論是否與胸腺素ot 1接 觸)或施用經胸腺素al處理的GM-DCs的小鼠中表達Foxp3的mRNA (圖4B)。評價了糖皮質激素可誘導的TNF受體(GITR)的表達水平， 并發(fā)現其廣泛表達，在實驗組間無顯著差異。細胞熒光分析顯示，輸 注任何類型的DC(無論未處理的或經胸腺素al處理的)的小鼠的TLN 和肺中，CD4+CD25+ T細胞數量增加(圖4C )。有趣的是，觀察到某GM-DCs在肺中比在TLN中誘 導了更多的Treg，經胸腺素ccl處理的FL-DCs則反之。從施用經胸 腺素otl處理的GM-DCs或FL-DCs的小鼠中回收的CD4+CD25+ T細胞 對于CD69活化標簽不被染成陽性，如從施用未處理的GM-DCs的小鼠 中回收的細胞中所觀察到的一樣(圖4C)。與移植物的接受需要引流 淋巴結的遷移和占據的觀點一致，從施用FL-DCs或經胸腺素ccl處理 的GM-DCs的小鼠回收的CD25+T細胞也由CD62L標簽染成陽性。TLN T reg細胞含有大量的產生IL-10的細胞或產生TGF-3的細胞(圖4A)， 而肺T reg細胞含有的產生IL-10的細胞比產生TGF-0的細胞多。
總之，這些結果提示，在體內過繼轉移后，GM-DCs與胸腺素ccl 接觸可將炎性/Thl應答轉換成保護性Thl/Treg應答。但是，所發(fā)現 的被誘導的T reg細胞返回不同的區(qū)域與不同T reg細胞群體間的可 能的表型及功能差異相關。這與所發(fā)現的功能上不同的T reg細胞群 體(在接觸曲霉的小鼠的肺和TLN中被協(xié)同活化)之間發(fā)生作用分工 是一致的(J. Immunol. 2006;176:1712-1723 )。備選地，在'淋巴結 中由同種識別引發(fā)的一級活化和啟動之后，活化的T reg細胞可變成 效應T reg細胞，其可運輸到受感染組織，在那里，它們控制局部炎 癥應答。
實施例7
抗真菌T reg細胞抑制同種異體反應性和炎癥
為評價CD25+ T reg細胞的抑制活性，評價了來自施用不同DC 亞類的小鼠的TLN細胞響應同種異體脾細胞、曲霉分生孢子或絲裂原 的增殖性。結果顯示，在僅接受T細胞或接受T細胞連同GM-DCs的小 鼠中觀察到同種異體，而非曲霉特異性增殖。相反，在接受FL-DCs 或經胸腺素ocl處理的GM-DCs的小鼠中同種異體反應性降低，但病原 體-特異性反應性恢復，盡管供體對照相比其程度較低(圖5A)。因 為在經DC處理的小鼠中對絲裂原的響應相當，這些結果提示，T reg 細胞直接影響同種異體和病原體-特異性Thl反應性。為弄清這個問 題，評價來自TLN的純化的CD4+CD25+T細胞的阻斷相應CD4+CD25-T
15細胞的曲霉特異性或同種異體抗原特異性增殖及相應CD4+CD25- T細 胞的IFN.產生的能力。盡管CD4+CD25+ T細胞低程度應答同種異體 抗原和曲霉，但存在來自接受FL-DCs或經胸腺素otl處理的GM-DCs 的小鼠的CD4+CD25+ T細胞時，同種異體反應性和抗原特異性應答均 降低(圖5B)。因為肺T reg細胞在肺曲霉病中賦有有效的抗炎活性 (J. Immunol. 2006;176:1712-1723 )，也檢測了肺CD4+CD25+ T細 胞對嗜中性粒細胞的抗真菌效應子活性(如產生TNF-a和氧化劑)的 抑制活性，因為這些功能對于T reg細胞的抑制活性強烈敏感(J. Immunol. 2006;176:1712-1723 )。這兩個功能^皮肺T reg細胞，且 尤其是被經胸腺素a 1處理的GM-DCs誘導的T reg顯著抑制(圖5B )。 實施例8
胸腺素a 1促進人DCs的運動性和Thl/T reg抗真菌啟動 為評價胸腺素a 1是否影響人DCs的Thl/T reg啟動潛力，在胸 腺素otl存在下，從健康供體的外周CD14+細胞衍生出GM-或FL-DCs。 因為在鼠DC培養(yǎng)物中，胸腺素al在促進CD123+pDCs的運動性的同 時降低經GM-CSF/IL-4處理的培養(yǎng)物中CDla+DCs的運動性。
未在FLT3-L培養(yǎng)物中觀察到該效應(圖6A)。胸腺素al顯著改 變GM-DCs或FL-DCs就對吞噬作用來說對樣支生物的感知(GM-DCs的吞 噬作用從30%到56%， FL-DCs的吞噬作用從32°/。到58°/。)。但有趣的 是，胸腺素ctl還促進衍生自移植手術后一個月的患者的GM-DCs和 FL-DCs的吞噬作用(圖6B)。胸腺素ocl的功能活性是，將產生IL-12 的炎性GM-DCs轉變成致耐受性pDCs (類似于FL-DCs),從而產生增 加水平的IL-IO (圖6C)并體外啟動產生IL-IO的CD4+ T細胞(圖 6D)。因為已知I型產生IFNs的pDCs參與耐受的誘導和維持及胸腺 素cxl的致耐受作用，所以也比較了響應曲霉分生孢子或酵母多糖(是 對GM-DCs的陽性對照)或CpG ODN (是FL-DCs的陰性對照)的IFN-a 的產生。IFN-a主要由FL-DCs或經胸腺素al處理的GM-DCs產生(圖 6C)。最后檢測了胸腺素al處理是否會改變DCs活化真菌特異性或 同種異體抗原特異性T細胞反應性的能力。圖6E顯示，胸腺素al既未改變DCs誘導的抗原特異性T細胞應答也未改變任何類型的DC的同 種異體刺激能力。事實上，來自移植患者的DCs中完全沒有真菌特異 性T細胞反應性的誘導。這些數據從而表明，胸腺素ctl可通過控制 炎性DCs,在造血干細胞移植(hematopoietic transplantation )中， 符合無同種異體反應性中的成功抗真菌Thl/T reg細胞啟動的要求。
如上述實施例中所報道的，所得結果顯示胸腺素ocl擴增GM-DCs 中的pDC部分，其勝任IDO功能，并且顯示需要ID(H pDCs且其足以 在實驗性HSCT中調節(jié)抗微生物免疫和同種異體抗原耐受。
這證實胸腺素al作為天然激素發(fā)揮作用，參與對生理和副生理 (paraphysiology )狀態(tài)下外周耐受的誘導和維持。
本發(fā)明包括用于給在治療的患者分配或用于在分配中使用的治療 包，用于預防或治療患者器官移植中的移植物抗宿主病或移植排斥反 應，包括一個或多個單元劑量，每個單元劑量包含一定量的胸腺素al, 且任選包含一定量的免疫抑制劑。
本發(fā)明包括制品，其包括包裝材料和胸腺素al，及任選的含于所 述包裝材料內的免疫抑制劑，其中所述胸腺素al在預防或治療器官 移植中的移植物抗宿主病或移植排斥反應中治療有效，且其中所述包 裝材料包括指示胸腺素al可用于預防或治療器官移植中的移植物抗 宿主病或移植排斥反應的簡要說明。
根據本發(fā)明，將胸腺素al與任選的免疫抑制劑以分開的形式施 用，或以包含活性成分和任選的藥學上可接受的稀釋劑或賦形劑的單 位劑量的形式實施。
根據本發(fā)明，當胸腺素ctl與所述免疫抑制劑分開施用時(即2 次不同施用)，可依次(即同時)或根據上述簡要說明中建議的時間 表依次施用所述活性成分。
根據本發(fā)明的用途，術語"治療"具有其通常的含義，包括預 防、阻止、減輕、抑制、改善、停止、遏制、延緩或反轉GVHD的進展、 活化或降低其嚴重性。
根據本發(fā)明的用途，術語"有效量"指化合物可達到目標結果的量。例如，為治療GVHD施用的胸腺素otl及任選的免疫抑制劑的有效 量是指預防、阻止、減輕、改善、停止、遏制、延緩或反轉所述GVHD 的進展或降低其嚴重性所需的量，用于施用的每日劑量取決于主治醫(yī) 師根椐受試者體重、年齡及患者的總體病況的判斷。
本發(fā)明還包括使用藥學制劑的方法，所述藥學制劑含有作為活性 成分的胸腺素otl，和任選的免疫抑制劑，伴有藥學載體。本領域技術 人員熟悉所述制劑及其生產，見如REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, (16th ed. 1980)。
可將所述制劑制成活性成分的單元劑型。術語"單元劑型"指適 于用作人受試者的單次劑量的物理離散的單元，每個單元含有預定量 的胸腺素ctl，和任選的免疫抑制劑(經計算產生所需藥學效應)，伴 有合適的藥學賦形劑。
可以以與藥學上可接受的載體或賦形劑結合的藥學組合物的形式 施用胸腺素ctl和任選的免疫抑制劑，由所選載體和/賦形劑中化合物 的可溶性和化學性質確定栽體和/賦形劑的比例和性質，所選的施用途 徑及標準藥學實踐決定所述比例和性質。
才艮據藥學領域熟知的方法制備藥學組合物，見如REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, (16th ed. 1980)。
所述載體或賦形劑可以是固體、半固體或液體材料，其可用作所 述活性成分的載體或介質。本領于熟知合適的載體或賦形劑。藥學組 合物可適合于口服、吸入、腸外或局部使用，且可以以片劑、膠嚢、 氣霧劑、吸入劑、栓劑、溶液、分散劑、脂質體等形式施用至患者。
圖1
胸腺素otl擴增來自骨髓前體的pDCs，并活化色氨酸分解代謝 (A) DCs上的CDllc、 CDllb和B220的表面表達，所述DCs f汴生 自C57BL6、 TLR9-/-或IFN-a P R-/-小鼠的骨髓并且在胸腺素a 1 ( + ) 或亂序肽()的存在下與GM-CSF/IL-4 ( GM-DCs )或FLT3L ( FL-DCs )
18培養(yǎng)。顯示了雙陽性細胞的百分比。
(B) 在含有未受調理素作用的曲霉分生孢子(5xl07mL)的無血 清的培養(yǎng)基(1 x 1(T個細胞/mL)中培養(yǎng)24小時的GM-DCs或FL-DCs 的細胞因子產生(ELISA)。添加2 jjM的IDO抑制劑l-MT。數據是3 次獨立實驗的累計結果。對IL-12p70的分析的檢出限(pg/mL)是〈16， 對IL-10的分析的檢出限是<12。
(C) 如(A)衍生出的DCs中IDO功能和表達的提高。評價細胞的 IDO蛋白表達(通過免疫印記法)和犬尿氨酸生成。陽性和陰性對照 分別由表達IDO蛋白的MC24轉染子和模擬轉染的MC22細胞組成(圖 中未顯示)。
數據是3次實驗中有代表性的一次實驗中的3個平行樣品的平均 ±SE。 圖2
經胸腺素ct 1誘導的IDO+ DCs體外活化T reg細胞
(A) 被經曲霉沖擊的經胸腺素ccl處理的GM-DCs或FL-DCs活化 的產生IFN-.-/IL-10的脾CD4+ T細胞的頻率。所選培養(yǎng)物中存在 1-MT。用AID-EliSpot讀數系統(tǒng)(Amplimedical )讀取平板。值是3-5 次實驗中樣品的平均土SE/1(T個細胞，用細胞的2倍連續(xù)稀釋液的重 復實驗計算。(*)P<0.05，接觸分生孢子的細胞相比未接觸的細胞；
(**)P<0. 05,接觸胸腺素的細胞相比未接觸的細胞。
(B) 僅培養(yǎng)CD4+細胞(-)或如(A)所述培養(yǎng)的CD4+細胞的 表形分析。數值代表雙陽性細胞的百分比。
圖3
經胸腺素a 1處理的DCs在實驗性HSCT中保護免于曲霉病 經致死劑量照射的C57BL6小鼠在氣管內注射2 x 10V80ja 1曲霉 分生孢子鹽水2周前，接受來自BALB/c小鼠的2xl06個去除T細胞 的同種異體骨髓細胞。移植后1天和7天，小鼠通過腹膜內注射接受 培養(yǎng)于胸腺素otl中的曲霉沖擊的GM-或FL-DCs。
以MST (平均存活時間，以"日"計)和感染后3天或死亡時肺中的真菌生長(JUg/器官中葡糖胺含量，"短線"表示標準誤差)評
價對感染的抵抗(A)。圖中也顯示了在供體T細胞存在下的炎性肺病 理(B) 、 GVHD反應性的出現(C)及對感染的易感性(D) 。 (B)未 處理(未處理)或接受不同類型DCs 3天前，從感染曲霉分生孢子的 小鼠肺中制備高碘酸希夫染色切片。在未處理或經GM-DCs處理的小鼠 肺中觀察到支氣管壁損傷和壞死的嚴重體征及少見的炎性細胞募集， 這與接受經胸腺素ctl處理的GM-DCs或FL-DCs的小鼠相反，這些小 鼠肺的特征在于極少的炎性細胞治愈浸潤(healing infiltrates)， 沒有支氣管壁損傷和炎癥反應的跡象。放大倍數x 200。 (*)P<G. 05， 接受DCs的小鼠相比未處理的小鼠。(C)具有移植物，接受不同數量 的單獨供體T細胞或供體T細胞連同不同DC類型的代表性的小鼠的病 理評分。通過綜合5種臨床參數(體重減輕、姿勢(身體彎成弓狀)、 活力、毛紋和皮膚完整性)的變化的評分系統(tǒng)評價了全身GVHD的程度 (最大指數-10)。 (*)P<0.05，接受T細胞+胸腺素ct l-GM-DCs的 小鼠相比接受T細胞+未處理GM-DCs的小鼠。(D)如(C)所述處理 的小鼠在感染中的存活率。 圖4
經胸腺素ot 1誘導的DCs體內啟動抗真菌Thl/T reg響應 如圖2所示處理的小鼠感染后3天的炎性/Th/T reg響應模式。
(A) 通過對肺勻漿的特異ELISA評價了 TNR-a/IL-10水平，并評 價了與經曲霉沖擊DCs共培養(yǎng)的TLN CD4+ T細胞中的IFN-. /IL-4的 產生。"短線"表示標準誤差。通過ELISPOT分析對產生IL-10或TGF-P的TLN CD4+CD25+T細胞進行計數。結果表示為每2xl()5個細胞中 產生細胞因子的細胞的平均數(±SE) 。 *P<0. 05，經DC處理的小鼠 相比未處理的小鼠。(**) P<0. 05，經胸腺素al處理的DCs相比未 處理的DCs。
(B) 從新鮮純化的來自處理或未處理(未處理)小鼠TLN的CD" T細胞中提取總RNA。通過RT-PCR測定每個細胞群體中不同mRNA的表 達。將持家基因Gapdh的mRNA表達用作內部對照。所示數據是3次實驗中有代表性的結果。
(C)從輸注或未輸注(未處理)不同類型DCs的小鼠的肺或TLN 中分離的細胞的表型分析，(-)表示未感染，未處理的小鼠。使004+ T細胞依次與PE綴合的抗-CD 25( PC61 )和FITC綴合的抗-CD69( HI. 2F3 克隆)mAbs反應。數值代表陽性細胞占所分析的總細胞的百分比。用 無關的Ab對照染色細胞，以獲得背景焚光值。直方圖是4次獨立實驗 中有代表性的一次的。
圖5
經胸腺素ctl誘導的T reg細胞抑制同種異體反應性 (A)用經照射的同種異體脾細胞、經分生孢子或伴刀豆球蛋白A 刺激的自體脾DCs刺激來自移植小鼠TLN的小鼠CD4+ T淋巴細胞。通 過5天的MLR分析評價T細胞增殖，并通過于最后8小時內摻入『胸 苷對其進行測量。(*)P<0. 05,移植小鼠相比供體小鼠。(**)P<0. 05, 經T細胞和/或DC處理的小鼠相比未處理小鼠。(*** ) P<0. 05，經胸 腺素otl處理的DCs相比未處理的DCs。 (B和C)由來自受體小鼠的 純化的CD4+CD25-T細胞，在來自接受FL-DCs( a )或胸腺素cc 1-GM-DCs (b)的受體小鼠的TLN CD4+CD25+T細胞的存在下，針對經曲霉分生 孢子沖擊的自體脾DCs (B)或同種異體(BALB/c)脾DCs (C)的增殖 活性和IFN-.產生。所示數據是3次獨立實驗中的一次有代表性的結 果。(*)P<0. 05，曲霉或同種異體抗原特異性反應細胞相比未刺激的 細胞。(** ) P<0. 05，經胸腺素ct 1處理的DCs相比未處理的DCs。在 來自經FL-DC處理(a )或經胸腺素a 1-GM-DCs處理的小鼠(b )的肺 CD4+CD25+T細胞的存在下，使腹膜嗜中性粒細胞(PMN )與靜息的分 生孢子接觸60分鐘(為產生氧化劑，以"nmol 02-/106個細胞"表示) 或24小時(為產生細胞因子，通過ELISA檢測，以pg/mL計)。(*) P<0. 05，接觸分生孢子的PMN相比未接觸的PMN。 ( ** ) P<0. 05，未 接觸的PMN相比接觸T reg的PMN。 ( *** ) P<0. 05, CD25+a) T reg 相比CD25+b) T reg。 圖6
21胸腺素cc 1促進人DCs的運動性和Thl/T reg抗真菌啟動
(A) 在胸腺素ocl的存在下，從具有GM-CSF/IL-4 ( GM-DCs )或 FLT3L(FL-DCs)的不同供體的外周CD14+細胞衍生出的DCs上CDllc、 CDla和CD123的表面表達。表示了陽性細胞的百分比。
(b) 與胸腺素al接觸(+ )或未接觸(-)的來自7個T細胞缺 乏的單倍體相合HSCT受體的GM-DCs或FL-DCs對分生孢子的吞噬作 用。數據是平均土SE，表示為"內化(internalization) %，，(圖中 的數值)。(*)P<0.05，經胸腺素otl處理的細胞相比未處理細胞。
(C) 來自健康供體的，在具有未受調理素作用的曲霉分生孢子(5 x 107mL)或10pg/mL酵母多糖或2 m g/mLCpG-b ODN 2006的無血清 培養(yǎng)基(lxl()6細胞/ mL)中培養(yǎng)24小時的經胸腺素al處理的DCs 的細胞因子產生(通過ELISA檢測，以pg/mL計)。數據是3次獨立 實驗的累計結果，且表示為平均士SD。對IL-12p70的分析的檢出限
(pg/mL)是〈3，對IL-10的分析的檢出限是〈5，及對IFN-a的分析的 檢出限是<3。
(D) 來自健康供體的外周血曲霉特異性CD4+ T細胞克隆響應A 中所述經曲霉沖擊的DCs的細胞因子產生。"短線"表示標準誤差。 對IL-4和IFN-.的分析的檢出限(pg/mL)是<0. 5。 *P<0. 05，經分生 孢子刺激的細胞相比未經刺激細胞。(**)P<0.05，接觸胸腺素ctl 的細胞相比未接觸細胞。
(E) 曲霉特異性或同種異體反應性T細胞克隆分別響應來自健康 供體或移植患者的不同類型的經真菌沖擊或未經沖擊的DCs的頻率。 用DCs刺激2天后評價了生長中克隆的特異性。(*)P<0. 05， GM-DCs 相比外周血細胞(-)。(**) P<0. 05， HSCT-DCs相比所有其他DCs。 nd，未進行測試。
權利要求
1. 胸腺素α1在制備用于預防或治療哺乳動物受試者器官移植中的移植物抗宿主病或移植排斥反應的藥物中的用途。
2. 權利要求l的用途，其中哺乳動物受試者是人類患者。
3. 權利要求1或2的用途，其中所述患者是細胞、組織或器官 的受體。
4. 權利要求3的用途，其中所述用于移植的細胞、組織或器官 選自干細胞、造血干細胞、骨髓、心臟、肝、腎、肺、胰、小腸、角膜或皮膚。
5. 權利要求l的用途，其中所述患者于清髓性預處理方案中。
6. 權利要求1的用途，其中所述患者于非清髓性預處理方案中。
7. 權利要求1的用途，其中將藥學有效量的胸腺素ccl在移植 前和/或移植后的預定時間窗口內施用給患者。
8. 權利要求1的用途，其中將胸腺素ocl與選自下列的免疫抑 制劑組合實施潑尼松、甲基潑尼松龍、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢菌素A、 FK506、 沙立度胺、硫唑嘌呤、達珠單抗、英夫利西單抗、MEDI-205、 abx-cbl 或ATG。
全文摘要
描述了胸腺素α1在制備可用于預防或治療哺乳動物受試者器官移植中的移植物抗宿主病或移植排斥反應的藥物中的用途，其中用于移植的細胞、組織或器官選自干細胞、造血干細胞、骨髓、心臟、肝、腎、肺、胰、小腸、角膜或皮膚。
文檔編號A61K38/22GK101448519SQ200780018267
公開日2009年6月3日 申請日期2007年4月4日 優(yōu)先權日2006年5月19日
發(fā)明者E·加拉希, F·貝斯東尼, L·羅曼尼 申請人:希格馬托制藥工業(yè)公司