專利名稱：自身免疫性脫髓鞘疾病的診斷和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及自身免疫性脫髓鞘疾病(autoimmune demyelinating disease)(諸如多發(fā)性硬化病(multiple sclerosis, MS))的診斷和治療。
背景技術(shù)：
骨髓細胞是自身免疫性脫髓鞘疾病中的主要效應(yīng)細胞(Barnett等，Multiple Sclerosis (多發(fā)性硬化病)12，121—132，2006 ；Benveniste, Journal of Molecular Medicine (分子醫(yī)學(xué)雜志)75，165-173，1997)。CNS-浸潤性骨髓群體由定居小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、炎性樹突細胞、類漿細胞樹突細胞和常規(guī)的樹突細胞組成。由于表達MHCII和⑶86 的骨髓樹突細胞(DCs)重新激活抗原特異性T細胞的能力(Deshpande等，J Immunol (免疫學(xué)雜志)178，6695-6699，2007)和它們參與導(dǎo)致復(fù)發(fā)疾病的表位擴散(Miller等，J Immunol (免疫學(xué)雜志)178，6695-6699，2007)，它們已經(jīng)受到特別的關(guān)注。除了作為抗原呈遞細胞，炎性DCs通過分泌促炎性細胞因子和活性氧中間體而直接調(diào)節(jié)局部的細胞外環(huán)境，導(dǎo)致進行性的脫髓鞘和軸突損失。這些產(chǎn)生TNF-和iNOS的樹突細胞的前體細胞，還稱為TipDCs (Serbina等，Immunity (免疫性)19，59-70，2003)，其是循環(huán)中存在的炎性單核細胞，并且被募集到CNS炎癥區(qū)域。通過乙酸格拉默(glatiramer acetate，一種批準(zhǔn)用于MS 的藥物)將炎性轉(zhuǎn)化為II型抗炎癥的單核細胞導(dǎo)致EAE嚴(yán)重性的逆轉(zhuǎn)(Weber等，Nature Medicine (自然醫(yī)學(xué))13，935-943，2007)，這進一步強調(diào)這些骨髓細胞在調(diào)節(jié)疾病嚴(yán)重性中的重要作用。先前已經(jīng)鑒定了 CNS浸潤性骨髓細胞的其它負調(diào)節(jié)劑。例如，在定居小膠質(zhì)細胞和浸潤性骨髓細胞二者上表達的TREM-2在通過吞噬髓鞘質(zhì)碎片消退CNS炎癥方面起重要作用(Piccio 等，European Journal of Immunology (歐洲免疫學(xué)雜志)37，1290-1301， 2007 ；Takahashi 等，PLoS Medicine (PLoS 醫(yī)學(xué))4，el24，2007 ；Takahashi 等，The Journal of Experimental Medicine (實驗醫(yī)學(xué)雜志)201，647-6572005，2005)。類似地，在骨髓細胞上的IFNAR下調(diào)CNS中的炎性反應(yīng)(Prinz等，Immunity (免疫性)28，675-686，2008)。然而，沒有一種受體對歸巢于CNS的炎性骨髓來源的單核細胞是特異性的。在尋找對于骨髓功能的負調(diào)節(jié)是重要的骨髓特異性細胞表面受體中鑒定了 CLM-I (MAIR-V, LMIR-3，DigR2)。CLM-I 是 CMRF 家族的一部分，CMRF 家族是在人染色體 17 上的多基因簇，其小鼠直向同源物位于染色體11上。所有家族成員包含細胞外IgV結(jié)構(gòu)域。在該簇中的兩個家族成員(CLM-1和CLM-8)在細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包含ITIM序列，其余成員在跨膜區(qū)具有帶電荷殘基，其可以作為招募信號傳導(dǎo)連接物。CLM-1，為人CD300f的鼠源直向同源物(Clark 等，Trends in Immunology (免疫學(xué)趨勢)30，209-217，2009)，最初描述為骨誘裂發(fā)生(osteoclastogenesis)的負調(diào)節(jié)劑(Chung等，J. Immunol (免疫學(xué)雜志)171，6M1-6548，2003)。后續(xù)研究已經(jīng)表明，CLM-I在Fc-受體介導(dǎo)的細胞反應(yīng)中起抑制作用(Alvarez-Errico 等，The Journal of Experimental Medicine (實驗醫(yī)學(xué)雜志)206, 595-606,2004 ；Fujimoto 等，International Immunology(國際免疫學(xué))18，1499—1508， 2006)。迄今為止，還沒有記述在自身免疫性疾病中的生物學(xué)作用。
發(fā)明_既述本發(fā)明至少部分基于CLM-I的鑒定，其被鑒定為通過抑制炎性細胞因子和活性氧類別的釋放而作為CNS中炎性DCs活性的負調(diào)節(jié)劑。因此，在本發(fā)明中，CLM-I被鑒定為CNS 炎癥和脫髓鞘(demyelination)的骨髓特異性負調(diào)節(jié)劑。在一個方面中，本發(fā)明涉及治療哺乳動物受試者中的脫髓鞘疾病的方法，所述方法包括給所述受試者施用有效量的CLM-I激動劑。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于治療脫髓鞘疾病的藥物組合物，其包含與藥用賦形劑混合的有效量的CLM-I激動劑。在另一個方面中，本發(fā)明涉及有效量的CLM-I激動劑在制備用于治療脫髓鞘疾病的藥物中的應(yīng)用。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于治療脫髓鞘疾病的CLM-I激動劑。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于診斷脫髓鞘疾病的方法，所述方法包括檢測 CLM-I功能中的缺陷。在另一個方面中，本發(fā)明涉及包括用于治療脫髓鞘疾病的CLM-I激動劑和使用說明書的試劑盒。在所有方面中，本發(fā)明特別包括下述實施方案在一個實施方案中，所述哺乳動物受試者是人。在另一個實施方案中，所述脫髓鞘疾病是脫髓鞘自身免疫病。在另一個實施方案中，所述脫髓鞘自身免疫病影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。在另一個實施方案中，所述脫髓鞘自身免疫病選自由下列組成的組多發(fā)性硬化病(multiple sclerosis，MS)，復(fù)發(fā)性減輕的 MS (relapsing remitting MS，RRMS)，原發(fā)性禾口繼發(fā)性進 亍性形式的 MS (primary and secondary progressing forms of MS)，進 亍性復(fù)發(fā)形式的 MS (progressice relapsing forms of MS),腦脊髓炎(encephalomyelitis), 白質(zhì)腦炎(leukoenc印halitis)，橫貫性脊髓炎(transverse myelitis)，視神經(jīng)脊髓炎 (neuromyelitis optica)(德維克病(Devic's disease)),禾口視神經(jīng)炎(optic neuritis)。在另一個實施方案中，所述脫髓鞘自身免疫病是MS。在不同的實施方案中，所述脫髓鞘自身免疫病影響外周神經(jīng)系統(tǒng)，包括，但不限于，急性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy) (AIDP ；吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome))；慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病 (chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)；抗一MAG 夕卜周神經(jīng)??；以及運動和感覺神經(jīng)病(Motor and Sensory Neuropathy) (HMSN)(還已知為遺傳性感覺運動神經(jīng)病(Hereditary Sensorimotor Neuropathy) (HSMN)，或月非骨肌萎縮癥(Peroneal Muscular Atrophy)，和進行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-Tooth Disease))。在另一個實施方案中，所述CLM-I激動劑是激動劑抗-CLM-I抗體。附圖簡述

圖1. CLM-I在CNS炎性損傷中的炎性樹突細胞上表達。(A)在疾病最嚴(yán)重處在脊髓中增加的CLM-mRNA轉(zhuǎn)錄物。(B)在CNS定居⑶lib+ 細胞上不存在CLM-I表達。(C)在⑶lib⑶Ilc+骨髓細胞上的CLM-I表達。(D)在疾病最嚴(yán)重處(胸段，背側(cè)角)在CNS炎性損傷中的CLM-I⑶Ilc共表達DCs。(E)表達CLM-I的
4DCs表達iNOS和TNF α。數(shù)值表示為平均值+S. D.。(D)中刻度條是50 μ m。圖2. CLM-I在炎性單核細胞和樹突細胞上表達。(A)CLM-I在(^3(^^0)11(:+1^61^陽性炎性單核細胞上表達，但不在Cx3crlhi常規(guī)DC前體上表達。(B)CLM-I在放射線敏感的骨髓來源的細胞上表達，但是不在輻射線抗性CNS定居小膠質(zhì)細胞上表達。(C) CLM-I在CUcrl1。炎性DCs但是不在Cx3crlhi小膠質(zhì)細胞上表達。(D)在免疫后14天，Cx3crl和CLM-I在脊髓切片上(胸段)表達。在髓膜外周觀察到共染色(箭頭)，而Cx3crIhi小膠質(zhì)細胞(箭形符號)不攜帶CLM-I?？潭葪l B (100 μ m)，D (50 μ m) O圖3.缺乏CLM-I或用CLM-I融合蛋白治療導(dǎo)致提高的EAE。(A)在由CLM-I敲除(ko)小鼠獲得的骨髓來源的DCs中缺乏CLM-I蛋白的表達 (左側(cè)圖)。在由疾病最嚴(yán)重處的脊髓獲得的DCs上有相似水平的MHC II和CD86(右側(cè)圖)。(B)與ko小鼠相比，在CLM-Iwt中，缺少CLM-I染色，保持的形態(tài)學(xué)和相似的炎性細胞數(shù)目。(C)在用CLM-I-Fc融合蛋白治療的CLM-Iko小鼠或(D)CLM-Iwt小鼠中增加的疾病嚴(yán)重性。(B)中的刻度條是50 μ m。圖4. CLM-I缺乏不影響T細胞致敏。(A)在CLM-Iwt和ko小鼠中，重新刺激的抗原特異性外周淋巴結(jié)T細胞的增殖和細胞因子反應(yīng)是相似的。⑶在野生型接受體中，來自CLM-Iko或wt供體小鼠的T細胞誘導(dǎo)相似的疾病(左側(cè)圖)。與CLM-Iwt野生型接受體相比，在CLM-Iko接受體中，來自CLM-Iwt 供體的T細胞誘導(dǎo)提高的疾病嚴(yán)重性(右側(cè)圖)。圖5. CLM-I調(diào)節(jié)骨髓-而非T細胞特異性炎性調(diào)節(jié)劑的釋放。(A)當(dāng)重新激活獲自免疫的CLM-Iwt和ko小鼠的MOG反應(yīng)性脊髓T細胞時，在 Thl, Thl7和調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)目中沒有差別。(B)在獲自CNS炎性損傷的CLM-Iwt和ko 骨髓細胞中增加的DC活化。*p<0.01。圖6. CLM-I調(diào)節(jié)自身免疫性脫髓鞘。(A)CNS損傷中的CLM-I陽性細胞和MOG陽性髓鞘質(zhì)的重疊合圖像。(B)和(C) 與wt小鼠相比，在CLM-Iko中有增加的脫髓鞘作用(由在B中白線標(biāo)記的區(qū)域所示并且在 C中定量)。圖7.小鼠(SEQ ID NO 1)和人(SEQ ID NO 2) CLM-I多肽的氨基酸序列。補充的圖1.小鼠Clm-I基因的靶向破壞的策略。通過同源重組產(chǎn)生Clm-I外顯子-1被替換為新霉素抗性基因的ES細胞。顯示了 Clm-I基因的靶向區(qū)的結(jié)構(gòu)。El和E2表示Clm-I基因的的外顯子1和外顯子2。顯示了用于通過Southern印跡篩選ES克隆的探針定位(5’和3’)。補充的圖2. CLM-I不影響T細胞增殖。(A)在存在增加濃度的OVA肽的條件下，將由OVA轉(zhuǎn)基因T細胞獲得的T細胞用由CLM-Iwt或ko小鼠獲得的骨髓來源的樹突細胞溫育。(B)混合的淋巴細胞反應(yīng)。將由 Balb/c背景的CLM-Iwt或ko小鼠獲得的骨髓樹突細胞用不同比率的獲自C57B1/6背景的小鼠的T細胞溫育。增殖由H3胸苷摻入量反映。補充的圖3. (A)Clm-I不影響外周淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的產(chǎn)生。(B)Clm-I 不影響CNS中T淋巴細胞的極化(polarization)。
優(yōu)選實施方案詳述I.定義術(shù)語“CLM-1”和“Cmrf-樣分子_1”(還已知為 MAIR-V，LMIR_3，DigR2 和 IgSF13) 在本文中互換使用，指天然序列哺乳動物CLM-I受體，具體地包括，但不限于，小鼠CLM-I多肽 SEQ ID NO :1(NCBI CAM21607)及其人直向同源物 SEQ ID NO 2 (NCBI AAH28188，還已知為CD300f，IREM1，IgSF13，35-L5，和CMRF-35A5)，以及它們天然存在的變體。關(guān)于進一步的詳情和命名參見Clark等，2009，同前所述?！疤烊恍蛄小倍嚯氖蔷哂信c天然來源的多肽(例如，ErbB受體或ErbB配體)相同的氨基酸序列的多肽。所述天然序列多肽可以由自然分離，或可以通過重組或合成方式產(chǎn)生。因此，天然序列多肽可以具有天然存在的人多肽、鼠多肽、或來自任何其它哺乳動物物種的多肽的氨基酸序列。術(shù)語“氨基酸序列變體”是指具有在某種程度上不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列變體與天然ErbB配體的至少一個受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或與天然 ErbB受體的至少一個配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有至少約70%的同源性，優(yōu)選地，它們與所述受體或配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域至少約80%、更優(yōu)選至少約90%同源。所述氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列中的特定位置具有置換、缺失、和/或插入。“同源性”定義為在比對序列并且在需要時引入缺口以獲得最大同源性百分?jǐn)?shù)之后在氨基酸序列變體中相同的殘基的百分?jǐn)?shù)。用于比對的方法和計算機程序在本領(lǐng)域中是公知的。一種這樣的計算機程序是〃 Align 2〃，由Genentech，Inc.(健泰科生物技術(shù)公司公司)所有，其于1991年12月10日提交至華盛頓特區(qū)20559的美國版權(quán)局進行使用者備案。術(shù)語“抗體”在本文中以最廣義使用，并且具體涵蓋單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所需要的生物學(xué)活性。術(shù)語“單克隆抗體”用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即除了可能以極小量存在的可能天然存在的突變外，構(gòu)成該群體的各個抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異的，針對單個的抗原位點。此外，與包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物相反，每種單克隆抗體針對在抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性之外，單克隆抗體的有利之處還在于它們可以在不被其它抗體污染的情況下合成。修飾語 “單克隆”表示抗體的特征在于由基本上同質(zhì)的抗體群體獲得，不應(yīng)該解釋為要求通過任何特定方法生產(chǎn)抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可以通過最初由Kohler等，NatUre(自然)，256 =495(1975)描述的雜交瘤方法制備，或可以通過重組DNA方法制備(見，例如美國專利號4，816，567)。所述“單克隆抗體”還可以使用例如在Clackson等，Nature (自然)， 352 :624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，222 :581-597 (1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離。單克隆抗體在本文中特別包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出所需要的生物學(xué)活性(美國專利號.4，816，567 ；和Morrison
6等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 81 :6851-6855 (1984))。本文的目的嵌合抗體包含“靈長類動物化(primatized) ”抗體，所述“靈長類動物化”抗體包含衍生自非人靈長類動物(例如，獼猴(Old World Monkey)，猿等)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列?！翱贵w片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選地包含完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab' )2，和Fv片段；雙抗體；直鏈抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體?！巴暾笨贵w是包含抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CJ和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域， CH1, Ch2和Ch3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如，人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，完整的抗體具有一種或多種效應(yīng)子功能?？贵w“效應(yīng)子功能”指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體 Fc區(qū))的生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)子功能的實例包括Clq結(jié)合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)的下調(diào)等取決于它們重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，完整抗體可以指定為不同的“類別”。 存在五種主要類型的完整抗體IgA，IgD, IgE, IgG，和IgM，并且這些中的一些可以進一步分成“亞類”(同種型)，例如，IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgA,和IgA2。與不同抗體類別相對應(yīng)的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α，δ，ε，Y，和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是公知的?！翱贵w依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性”和“ADCC”指這樣的細胞介導(dǎo)的反應(yīng)，S卩，其中表達Fc受體(FcRs)的非特異性細胞毒性細胞(例如，天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上的結(jié)合抗體，并且隨后引起靶細胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細胞即NK細胞只表達Fc γ RIII，而單核細胞表達Fc γ RI、FcyRII和Fc yRIII。fcivetch 和 Kinet，免疫學(xué)年評(Annu. Rev. Immunol.) 9 :457-92(1991)第 464 頁表 3 總結(jié)了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利號5，500，362或5，821，337中所記載的測定法?？捎糜诖祟悳y定法的效應(yīng)細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。備選地或另外地，可在體內(nèi)評估目的分子的ADCC 活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等，PNAS (USA) 95 :652-656(1998)中所公開的動物模型?！叭诵?yīng)細胞”指表達一種或多種FcRs并行使效應(yīng)子功能的白細胞。優(yōu)選地，該細胞至少表達Fc YRIII并行使ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞；其中優(yōu)選PBMCs和NK細胞。如本文所述，效應(yīng)細胞可以從其天然來源，例如從血液或PBMCs中分
1 O術(shù)語“Fe受體”或“FcR”用于描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR( γ受體)，包括Fc γ RI、Fc γ RII和 FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括 Fc y RIIA ( “活化受體”)和FcyRIIB( “抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。活化受體Fc y RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fc γ RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見在 Da e ron,免疫學(xué)年評(Annu. Rev. Immunol.) 15 :203-234(1997) 中的綜述Μ)。FcR的綜述參見Ravetch和Kinet，免疫學(xué)年評(Annu. Rev. Immunol.) 9 457-92(1991) ；Capel 等，免疫方法(Immunomethods)4 :25-34(1994)；及 de Haas 等，實驗室臨床醫(yī)學(xué)雜志(J. Lab. Clin. Med.) 126 :330-41 (1995)。在本文中的術(shù)語“FcR”涵蓋其它FcR，包括未來將會鑒定的那些。該術(shù)語還包括新生兒受體，F(xiàn)cfoi，它負責(zé)將母體IgGs 轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol. ) 117 =587(1976)和Kim等，免疫學(xué)雜志 (J. Immunol. )24 :249 (1994))?！把a體依賴性細胞毒性”或“CDC”指存在補體時分子裂解靶標(biāo)的能力。補體激活途徑是由補體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合與相關(guān)抗原復(fù)合的分子(例如抗體)起始的。為了評估補體激活，可進行⑶C測定法，例如如feizzano-Santoro等，免疫方法雜志(J. Immunol. Methods) 202 :163(1996)中所記載的?！疤烊豢贵w”通常是一種約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩個相同的輕 (L)鏈和兩個相同的重(H)鏈組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵連接于重鏈，而在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間，二硫鍵的數(shù)目是不同的。每條重鏈和輕鏈也具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，其后是多個恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(\)，在其另外一端具有恒定結(jié)構(gòu)域。將輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域比對，將輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈可變結(jié)構(gòu)域比對。認(rèn)為特定氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間形成界面。術(shù)語“可變的”指可變結(jié)構(gòu)域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛并且用于每種具體的抗體針對其特定抗原的結(jié)合和特異性的事實。然而，變異性在抗體的整個可變結(jié)構(gòu)域中并不是均勻分布的。其集中在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域二者中的三個稱為高變區(qū)的區(qū)段中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的更加高度保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FRs)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包含四個FRs，它們大多采取β -折疊構(gòu)型，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成 β -折疊結(jié)構(gòu)的一部分的三個高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過FRs非常接近地保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見Kabat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，公共衛(wèi)生局 (Public Health Service), M^MM^ffLpJf (National Institute of Health) ,Bethesda, MD. (1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)子功能，諸如抗體在抗體依賴性細胞毒性(ADCC)中的參與。術(shù)語“高變區(qū)”在用于本文時指抗體中負責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基 24-34 (Li)、50-56 (L2)和 89-97 (L3)，和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基 31-35 (Hl)、50-65 (H2) 禾口 95-102 (H3) ；Kabat 等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第 5 版，公共衛(wèi)生局(Public Health Service)，國家健康研究所(National Institute of Health), Bethesda, MD. (1991))和 / 或那些來自“高變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中殘基沈-32 (Li)、50-52 (L2)和91-96 (L3)，和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中殘基洸-32 (Hl)、53-55 (H2)和 96-101 (H3) ；Chothia 和 Lesk，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)196 :901-917(1987))?！翱蚣軈^(qū)”或“FR”殘基是除本文定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生稱作“Fab”片段的兩個相同的抗原結(jié)合片段(每個具有單個抗原結(jié)合位點)，和一個殘余“Fe”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F(ab’)2片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點且仍能夠交聯(lián)抗原?！癋v”是包含完整抗原識別位點和抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。該區(qū)域由一個重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域以緊密的、非共價締合的二聚體組成。以這種構(gòu)型，每個可變結(jié)構(gòu)域的三個高變區(qū)相互作用，從而在二聚體表面上限定抗原結(jié)合位點?？偟膩碚f，六個高變區(qū)賦予抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變結(jié)構(gòu)域(或只包含對抗原特異的三個高變區(qū)的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，但是親和性低于完整的結(jié)合位點。Fab片段還包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CHl)。Fab’片段與 Fab片段的不同之處在于在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基端加入幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab’ -SH是本文關(guān)于Fab’的名稱，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基具有至少一個游離硫醇基。F(ab’)2抗體片段最初作為在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸的 Fab'片段對產(chǎn)生。還已知抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)?？梢曰谄浜愣ńY(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，將來自任何脊椎動物物種的抗體“輕鏈”指定為兩種明顯不同的類型中的一種，所述兩種明顯不同的類型稱為kappa(K)和
lambda (入)?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單一多肽鏈中。優(yōu)選的是，F(xiàn)v多肽在Vh和\結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv能夠形成期望的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pliickthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies (單克隆抗體藥理學(xué))，卷 113，Rosenburg 和 Moore 編輯，Springer-Verlag, New ￥0『1^，第洸9-315頁(1994)?？筥ErbB2抗體scFv片段記述在W093/16185 ；美國專利號5，571，894 ；和美國專利號5，587，458中。術(shù)語“雙抗體(diabodies) ”是指具有兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，所述片段包含在同一多肽鏈(Vh-VJ中與可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(\)連接的可變重鏈結(jié)構(gòu)域(Vh)。通過使用太短而不允許同一鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，促使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈中的互補結(jié)構(gòu)域配對，并且產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體在例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；和 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報),90 :6444-6448 (1993)中有更充分的描述。非人(例如嚙齒動物)抗體的“人源化”形式指包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在最大程度上，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(接受體抗體)，其中接受體的高變區(qū)殘基用具有期望的抗體特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體) (諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物)的高變區(qū)殘基替換。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在接受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上全部或至少一個、典型地兩個這樣的可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，典型地是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見Jones等，Nature (自然)321 :522-525(1986) ；Riechmann等， Nature (自然)332 :323-3 (1988)；和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol.(結(jié)構(gòu)生物學(xué)新觀點)2 :593-596(1992)?！胺蛛x的”抗體是已經(jīng)鑒定且與其天然環(huán)境的成分分離和/或從中回收的抗體。 抗體的天然環(huán)境的污染性成分指將會干擾抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、 和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至(1)如通過Lowry法測定，超過95重量％的抗體，和最優(yōu)選地超過99重量％的抗體，( 足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀(spinning cup sequenator)獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或C3)通過使用考馬斯藍或優(yōu)選地銀染色在還原性或非還原性條件下的 SDS-PAGE，達到同質(zhì)。由于不會存在抗體的天然環(huán)境的至少一種成分，故分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常通過至少一個純化步驟來制備?！敖Y(jié)合”目的抗原的抗體是能夠以足夠的親和力結(jié)合所述抗原的抗體，從而該抗體可用作靶向表達該抗原的細胞的治療劑。術(shù)語“脫髓鞘疾病”在本文中用來指神經(jīng)元的髓鞘被損壞的任何神經(jīng)系統(tǒng)疾病。該定義包括影響少突膠質(zhì)細胞的完整性及其產(chǎn)生和維持髓鞘質(zhì)的能力的疾病和直接損壞髓鞘的疾病。所述疾病擾亂有髓鞘的白質(zhì)途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且產(chǎn)生寬泛的運動、感覺、和認(rèn)知功能障礙，包括對感覺、運動、認(rèn)知、和/或其它功能的損害，這取決于所涉及的是哪些神經(jīng)， 包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNQ神經(jīng)和外周神經(jīng)。本文的“自身免疫性疾病(autoimmune disease) ”是這樣的疾病或病癥，由個體自身的組織引起和針對個體自身的組織或其共分離或表現(xiàn)或由其導(dǎo)致的病況。自身免疫性疾病或病癥的實例包括，但不限于，關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)、
(juvenile rheumatoid arthritis)(osteoarthritis) >
銀屑病關(guān)節(jié)炎(psoriatic arthritis)、和強直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)), 銀屑病(psoriasis)，皮炎(dermatitis)，其包括特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis)； 慢性特發(fā)性蕁麻疹(chronic idiopathic urticaria)，其包括慢性自身免疫性蕁麻疹 (chronic autoimmune urticaria)、多肌炎(polymyositis) / 皮肌炎(dermatomyositis)、 中毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermal necrolysis)、系統(tǒng)性硬皮病(systemic scleroderma)禾口硬化病(sclerosis)，與炎性腸病(inflammatory bowel disease, IBD) 相關(guān)的反應(yīng)(局限性回腸炎(Crohn' s disease)、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)、 和具有壞疽性膿皮病(pyoderma gangrenosum)共分離的IBD、結(jié)節(jié)性紅斑(erythema nodosum)、原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis)、和/或鞏膜外層炎(印iscleritis))，呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome)，包括成人呼吸窘迫綜合征(adult respiratory distress syndrome, ARDS)，腦膜炎(meningitis), IgE-介導(dǎo)的疾病(IgE-mediateddiseases)，諸如過敏反應(yīng)(anaphylaxis)與變應(yīng)性鼻炎 (allergic rhinitis)，腦炎(encephalitis)，諸如 Rasmussen ‘ s 腦炎(Rasmussen ‘ s enc印halitis)，葡萄膜炎(uveitis)，結(jié)腸炎(colitis)，諸如微觀結(jié)腸炎(microscopic colitis)和膠原性結(jié)腸炎(collagenous colitis)，腎小球腎炎(glomerulon印hritis， GN)，諸如膜性 GN (membranous GN)、特發(fā)性膜性 GN (idiopathic membranous GN)、膜性增生性GN(membranous proliferative GN, MPGN)(其包括I型和II型)、和迅速進行
10性 GN(rapidly progressive GN)，過敏性病癥(allergic conditions)，濕疫(eczema)， 哮喘(asthma)，涉及T細胞浸潤和慢性炎癥反應(yīng)的病癥(conditions involving infiltration of T cells and chronic inflammatory responses)，動脈粥樣硬化 (atherosclerosis),自身免疫性心肌炎(autoimmune myocarditis),白細胞黏附不足 (leukocyte adhesion deficiency)，系統(tǒng)j"生紅斑:(systemic lupus erythematosus, SLE)，如皮膚性 SLE (cutaneous SLE)，狼瘡(lupus)(包括腎炎(nephritis)，大腦炎 (cerebritis)，兒童(pediatric)狼瘡，非腎(non-renal)狼瘡，盤狀(discoid)狼瘡，脫發(fā)(alopecia)狼瘡)，青少年發(fā)作型糖尿病(juvenile onset diabetes)，多發(fā)性硬化病(multiple sclerosis，MS)，諸如脊髓-視覺 MS (spino-optical MS)，變應(yīng)性腦脊髓炎 (allergic enc印halomyelitis)，與由細胞因子和T淋巴細胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)(acute and delayed hypersensitivity)相關(guān)的免疫應(yīng)答，月市結(jié)核(tuberculosis), 結(jié)節(jié)病(sarcoidosis)，肉芽腫病(granulomatosis)，包括韋格納肉芽腫病(Wegener' s granulomatosis), SgIfi(agranulocytosis), IfiliW^ (vasculitis) (1 i；ifiliW 血管炎(Large Vessel vasculitis)(包括風(fēng)濕性多肌痛(Polymyalgia Rheumatica) 和巨大細胞(高安)動脈炎(Giant CelKTakayasu' s) Arteritis))，中血管血管炎 (Medium Vessel vasculitis)(包括川崎病(Kawasaki ‘ s Disease)和結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎(Polyarteritis Nodosa)), CNS血管炎，和ANCA-相關(guān)性血管炎，諸如丘-施血管炎 IE (Churg-Strauss vasculitis or syndrome, CSS)),(aplastic
anemia), Coombs 陽性貧血(Coombs positive anemia)，戴-布貧血(Diamond Blackfan anemia)，免疫性溶血性貧血(immune hemolytic anemia)，包括自身免疫性溶血性貧血 (autoimmune hemolytic anemia, AIHA),惡性貧血(pernicious anemia),單純紅細胞性再生障礙(pure red cell aplasia，PRCA)，因子 VIII 缺乏癥(Factor VIII deficiency), 血友病A (hemophilia A)，自身免疫性中性粒細胞減少(autoimmune neutropenia)，全血細胞減少(pancytopenia)，白細胞減少(leukopenia)，涉及白細胞血細胞滲出的疾病(diseases involving leukocyte diapedesis)，CNS 炎性病癥，多器官損傷綜合征 (multiple organ injury syndrome)，重癥肌無力(myasthenia gravis)，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病(antigen-antibody complex mediated diseases),抗腎小球基底膜病 (anti-glomerular basement membrane disease)，抗憐月旨抗體綜合征(anti-phospholipid antibody syndrome)，變應(yīng)性神經(jīng)炎(allergic neuritis)， Bechet 病，卡斯?fàn)柭C合征 (Castleman ‘ s syndrome)，古德中白斯丘綜合征(Goodpasture ‘ s Syndrome)，蘭伯特-伊頓肌無力綜合征(Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome),Reynaud' s綜合征，舍格倫綜合征(Sjorgen' s syndrome)，斯蒂文斯-約翰遜綜合征(Stevens-Johnson syndrome)，實體器官移植排異(solid organ transplant rejection)(包括對高組反應(yīng)性抗體滴度(high panel reactive antibody titers)、組織中IgA沉積的預(yù)處理，和由腎臟移植、肝臟移植、 腸移植、心臟移植引起的排異，等)，移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD), 大皰性類天皰瘡(pemphigoid bullous)，天皰瘡(pemphigus)(包括尋常型(vulgaris)天皰瘡，落葉型(foliaceus)天皰瘡，和天皰瘡粘膜性類天皰瘡(pemphigus mucus-membrane pemphigoid)),自身免疫性多內(nèi)分泌腺病(autoimmune polyendocrinopathies),萊特爾病(Reiter' s disease)，僵人綜合征(stiff-man syndrome)，免疫復(fù)合物腎炎(immunecomplex nephritis), IgM 多神經(jīng)病(IgM polyneuropathies)或 IgM_ 介導(dǎo)的神經(jīng)病(IgM mediated neuropathy),特發(fā)性血小板減少癥性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP),血檢個生血/J、板減少個生紫療(thrombotic throbocytopenic purpura, TTP), 血小板減少癥(thrombocytopenia)(如例如由心肌梗死患者發(fā)展的)，包括自身免疫性血小板減少癥(autoimmune thrombocytopenia),自身免疫性睪丸禾口卵巢疾病(autoimmune disease ofthe testis and ovary),包括自身免疫性辜丸炎禾口卵巢炎(autoimune orchitis and oophoritis),原發(fā)個生甲狀腺機能減退癥(primary hypothyroidism)； 自身免疫性內(nèi)分泌病(autoimmune endocrine diseases)，包括自身免疫性甲狀腺炎 (autoimmune thyroiditis)，慢性甲狀腺炎(chronic thyroiditis)(橋本甲狀腺炎 (Hashimoto' s Thyroiditis))，亞急性甲狀腺炎(subacute thyroiditis)，特發(fā)性甲狀腺機能減退癥(idiopathic hypothyroidism)，艾迪生病(Addison‘ s disease)，格雷夫斯病 (Grave‘ s disease)，自身免疫性多腺體綜合征(autoimmune polyglandular syndromes) (或多腺體內(nèi)分泌綜合征(polyglandular endocrinopathy syndromes))，I型糖尿病，還稱為胰島素依賴性糖尿病(insulin-d印endent diabetes mellitus, IDDM)，包括兒童IDDM， 和希恩綜合征(Sheehan' s syndrome)；自身免疫性肝炎(autoimmune h印atitis)，淋巴樣間質(zhì)性肺炎(Lymphoid interstitial pneumonitis，HIV)，相對NSIP的閉塞性細支氣管炎(非移植性)(bronchiolitis obliterans (non-transplant) vsNSIP)，吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre Syndrome)，貝格爾病(Berger ‘ s Disease) (IgA 腎病)，原發(fā)性膽汁性肝硬變(primary biliary cirrhosis)，口炎性腹瀉(celiac sprue)(麩質(zhì)性腸病 (gluten enteropathy))，具有共分離皰疹樣皮炎的難治的口炎性腹瀉(refractory sprue with co-segregate dermatitis herpetiformis)，冷球蛋白血癥(cryoglobulinemia) ,|j/L ^^ !!1! ^ (amyIotrophic lateral sclerosis) (ALS ；'^llIl-^l (Lou Gehrig' s disease))，冠狀動脈病(coronary artery disease),自身免疫性內(nèi)耳病(autoimmune inner ear disease, AIED),自身免疫個生聽力喪失(autoimmune hearing loss),視個生目艮陣牽肌陣牽綜合征(opsoclonus myoclonus syndrome, OMS),多軟骨炎(polychondritis)如難治個生多軟骨炎(refractory polychondritis)，月市泡蛋白沉禾只癥(pulmonary alveolar proteinosis)，淀粉樣變性(amyloidosis)，巨細胞性肝炎(giant cell h 印 atitis)，鞏膜炎(scleritis)，不確定/未知重要性的單克隆丙球蛋白病(monoclonal gammopathy of uncertain/unknown significance，MGUS)，周圍神經(jīng)病(peripheral neuropathy)，副月中瘤綜合征(paraneoplastic syndrome)，通道病變(channelopathies)如癒癇癥(epilepsy), 偏頭痛(migraine)，心律不齊(arrhythmia)，肌肉病癥(muscular disorders)，耳聾(deafness)，失明(blindness)，周期性癱瘓(periodic paralysis)，和 CNS 通道 (channelopathies of the CNS) ； 5H ^ ^E (autism), ^ ^E Iil (inflammatory myopathy),禾口局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)。 術(shù)語“特征在于自身免疫性脫髓鞘的疾病”和“脫髓鞘自身免疫病”可互換使用，并且是指至少部分由自身免疫反應(yīng)引起的脫髓鞘疾病。脫髓鞘自身免疫病包括復(fù)發(fā)性或慢性進行性脫髓鞘疾病，諸如多發(fā)性硬化病(MQ及其變異，和單相脫髓鞘疾病，諸如視神經(jīng)炎(optic neuritis)，急性播散性腦脊髓炎(acute disseminated
12enc 印 halomyelitis)，和橫貫性脊髓炎(transverse myelitis)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS) 的脫髓鞘自身免疫病包括，但不限于，MS和MS變異，諸如復(fù)發(fā)性緩和型MS (relapsing remitting MS, RRMS)以及原發(fā)性和繼發(fā)性進行性形式，和進行性復(fù)發(fā)性形式的MS，腦脊髓炎，白質(zhì)腦炎(leukoenc印halitis)，橫貫性脊髓炎，視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica)(德維克病(Devic' s disease))，和視神經(jīng)炎(optic neuritis)。影響外周神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘自身免疫病包括，例如，急性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy, AIDP ；吉蘭-巴雷綜合征)；慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病 (chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)；抗-MAG周圍神經(jīng)病(anti-MAG peripheral neuropathy)；禾口運動與感覺神經(jīng)病(Motor and Sensory Neuropathy, HMSN)，還己知為遺傳學(xué)感覺運動神經(jīng)病(Hereditary Sensorimotor Neuropathy, HSMN)，或腓骨肌萎縮癥(Peroneal Muscular Atrophy)，或進行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮癥 (Charcot-Marie-Tooth Disease)。“治療”指治療性治療和預(yù)防性或防止性措施二者。需要治療的那些包括已經(jīng)患有疾病的那些以及其中疾病有待預(yù)防的那些。因此，本文中待治療的哺乳動物可以已被診斷患有所述病癥或可能是傾向于或易于患有所述病癥。例如，預(yù)防性治療包括防止完全發(fā)展的臨床形式，或更嚴(yán)重的疾病形式，諸如防止MS發(fā)展為復(fù)發(fā)性緩和型MS (RRlK)。治療性治療可以目的在于減緩疾病的進展，減少疾病發(fā)生(疾病發(fā)作(attacks))的頻率，在發(fā)作后恢復(fù)功能，防止新的發(fā)作，并且防止或減緩與所述病癥相關(guān)或由所述病癥導(dǎo)致的無能力 (disabilities)的發(fā)展。術(shù)語“CLM-1激動劑”在本文中以最廣泛意義應(yīng)用，并且包括在體外、原位或體內(nèi)部分或完全增強、刺激或激活一種或多種CLM-I生物學(xué)活性的任何分子。例如，所述激動劑因其與CLM-直接結(jié)合可以行使功能在體外、原位或體內(nèi)部分或完全增強、刺激或激活一種或多種CLM-I生物學(xué)活性，與CLM-的直接結(jié)合引起受體活化或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。所述激動劑還可以因為例如刺激另一種效應(yīng)分子(其然后引起CLM-I活化或信號轉(zhuǎn)導(dǎo))而間接行使功能在體外、原位或體內(nèi)部分或完全增強、刺激或激活一種或多種CLM-I生物學(xué)活性。此處的生物學(xué)活性是脫髓鞘疾病(諸如上文定義的脫髓鞘自身免疫病)的負調(diào)節(jié)。激動劑具體包括 CLM-I配體和針對CLM-I的激動劑抗體。用于治療目的的“哺乳動物”指分類為哺乳動物的任何動物，包括人、非人高等靈長動物、家畜和農(nóng)場動物，和動物園動物、競技動物或?qū)櫸飫游铮T如狗、馬、貓、母牛等。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。術(shù)語“治療有效量”指有效治療哺乳動物中疾病或病癥的藥物量。在本情形中，治療有效量是有效治療(包括預(yù)防)脫髓鞘疾病(如前文定義的脫髓鞘自身免疫疾病)的 CLM-I激動劑的量?！爸|(zhì)體"是由用于將藥物(如本文公開的抗_ErbB2抗體，和任選地化療劑)遞送到哺乳動物的各種類型的脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小泡。脂質(zhì)體的成分通常以雙分子層結(jié)構(gòu)排列，類似于生物膜的脂質(zhì)排列。術(shù)語“包裝插頁”用來指通常包含在治療性產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的使用說明，其包含關(guān)于適應(yīng)證、應(yīng)用、劑量、施用、禁忌癥和/或關(guān)于所述治療性產(chǎn)品應(yīng)用的警告的信息。II.詳述
多發(fā)性硬化病(MQ及其潛伏性等價的實驗性自身免疫性腦脊髓炎 (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)特征在于血管周炎癥和脫髓鞘。來源于循環(huán)的祖細胞的骨髓細胞是炎性滲出物的主要成分，并且認(rèn)為組成負責(zé)細胞因子生產(chǎn)、脫髓鞘、軸突損傷和運動功能障礙的最終效應(yīng)細胞。對怎樣調(diào)節(jié)這些骨髓細胞的細胞毒性活性理解得很少。本發(fā)明至少部分是基于將Cmrf-樣分子-I(CLM-I)鑒定為自身免疫性脫髓鞘的負調(diào)節(jié)劑。在用MOG肽免疫小鼠后，CLM-I表達在外周血中的炎性單核細胞上和在CNS脫髓鞘區(qū)域中存在的炎性樹突細胞上。在CNS浸潤性炎性樹突細胞上缺乏CLM-I 導(dǎo)致顯著增加的一氧化氮和促炎性細胞因子產(chǎn)生，以及增加的軸突脫髓鞘和變差的臨床得分，而T細胞應(yīng)答保持不受影響。因此，本文將CLM-I鑒定為骨髓細胞活化和自身免疫性脫髓鞘的負調(diào)節(jié)劑。骨髓細胞是自身免疫性脫髓鞘疾病中的主要效應(yīng)細胞(Barnett等，Multiple Sclerosis (多發(fā)性硬化病)(Houndmilis, Basingstoke, England) 12,121-132,2006 ； Benveniste, Journal of Molecular Medicine ( ^v ^ E 1 ；^ ) (Berlin,德 _ )75, 165-173,1997)。CNS-浸潤性骨髓群體由定居小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、炎性樹突細胞、類漿細胞樹突細胞和常規(guī)的樹突細胞組成。由于表達MHCII和CD86的骨髓樹突細胞(DCs)重新激活抗原特異性T細胞的能力(Deshpande等，J Immunol (免疫學(xué)雜志)178，6695-6699， 2007)和它們參與導(dǎo)致復(fù)發(fā)疾病的表位擴散(Miller等，Annals of the New York Academy of Sciences(紐約科學(xué)院年刊)1103,179-191,2007)，它們已經(jīng)受到特別的關(guān)注。除了作為抗原呈遞細胞，炎性DCs通過分泌促炎性細胞因子和活性氧中間體而直接調(diào)節(jié)局部的細胞外環(huán)境，導(dǎo)致進行性的脫髓鞘和軸突損失。這些產(chǎn)生TNF和iNOS的樹突細胞的前體細胞， 還稱為TipDCs (Serbina等，Immunity (免疫性)19，59-70，2003)，其是循環(huán)中存在的炎性單核細胞，并且被募集到CNS炎癥區(qū)域。通過乙酸格拉默(glatiramer acetate，一種批準(zhǔn)用于MS的藥物)將炎性轉(zhuǎn)化為II型抗炎癥的單核細胞導(dǎo)致EAE嚴(yán)重性的逆轉(zhuǎn)(Weber等， Nature Medicine (自然醫(yī)學(xué))13，935-943，2007)，這進一步強調(diào)這些骨髓細胞在調(diào)節(jié)疾病嚴(yán)重性中的重要作用。先前已經(jīng)鑒定了 CNS浸潤性骨髓細胞的其它負調(diào)節(jié)劑。例如，在定居小膠質(zhì)細胞和浸潤性骨髓細胞二者上表達的TREM-2在通過吞噬髓鞘質(zhì)碎片消退CNS炎癥方面起重要作用(Piccio 等，European Journal of Immunology (歐洲免疫學(xué)雜志)37，1290-1301， 2007) (Takahashi 等，PLoS Medicine (PLoS 醫(yī)學(xué))4，el24，2007) (Takahashi 等，The Journal of Experimental Medicine (實驗醫(yī)學(xué)雜志)201，647-657，2005)。類似地，在骨髓細胞上的IFNAR下調(diào)CNS中的炎性反應(yīng)(Prinz等，Immunity (免疫性)28,675-686, 2008)。然而， 沒有一種受體對歸巢于CNS的炎性骨髓來源的單核細胞是特異性的。在尋找對于骨髓功能的負調(diào)節(jié)是重要的骨髓特異性細胞表面受體中鑒定了 CLM-I (MAIR-V, LMIR-3，DigR2)。CLM-I 是 CMRF 家族的一部分，CMRF 家族是在人染色體 17 上的多基因簇，其小鼠直向同源物位于染色體11上。所有家族成員包含細胞外IgV結(jié)構(gòu)域。在該簇中的兩個家族成員(CLM-1和CLM-8)在細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包含ITIM序列，其余成員在跨膜區(qū)具有帶電荷殘基，其可以作為招募信號傳導(dǎo)連接物。CLM-1(SEQ ID N0:1)，為人 CD300f(SEQ ID NO 2)的鼠源直向同源物(Clark 等，Trends in Immunology (免疫學(xué)趨勢)30，209-217，2009)，最初描述為骨誘裂發(fā)生(osteoclastogenesis)的負調(diào)節(jié)劑(Chung等，J. Immunol (免疫學(xué)雜志)171，6Μ1-6548，2003)。后續(xù)研究已經(jīng)表明，CLM-1在Fc-受體介導(dǎo)的細胞反應(yīng)中起抑制作用(Alvarez-Errico等，2004 ;Fujimoto等，2006)。迄今為止，還沒有記述在自身免疫性疾病中的生物學(xué)作用。在本發(fā)明中，我們將CLM-I鑒定為通過抑制炎性細胞因子和活性氧類別的釋放而作為CNS中炎性DCs活性的負調(diào)節(jié)劑。因此，本研究將CLM-I鑒定為CNS炎癥和脫髓鞘的骨髓特異性負調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明涉及用CLM-I拮抗劑診斷和治療脫髓鞘疾病的方法，所述脫髓鞘疾病如脫髓鞘自身免疫病。在具體的實施方案中，CLM-I激動劑是針對CLM-I的激動劑抗體。Si^本發(fā)明的抗體包括抗-CLM-I抗體或CLM-I的抗原-結(jié)合片段，或本文所述的其他抗體。示例性的抗體包括，例如，多克隆抗體、單克隆抗體、人源化的抗體、片段、多特異性抗體、雜綴合物(heteroconjugate)抗體、多價抗體、效應(yīng)子功能抗體等。在本發(fā)明的特定實施方案中，所述抗體是激動劑抗體。多克隆抗體本發(fā)明的抗體可以包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是專業(yè)技術(shù)人員已知的。例如，針對CLM-I的多克隆抗體在動物中通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑來產(chǎn)生。將相關(guān)抗原與在待免疫的物種中是免疫原性的蛋白綴合可以是有用的， 例如，使用雙官能或衍生化試劑(例如馬來酰亞胺苯甲酰磺基琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基綴合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、或SOCl2)，所述
抗原可以綴合于匙孔蜮血藍蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。通過將例如100 μ g或5 μ g蛋白質(zhì)或綴合物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和并將該溶液皮內(nèi)注射于多個部位，將動物針對CLM-1、免疫原性綴合物或衍生物進行免疫。一個月后，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中初始量1/5-1/10 的肽或綴合物對動物進行加強免疫。7-14天后，采集動物的血液，并測定血清的抗體滴度。 對動物進行加強免疫，直到滴度達到平臺(plateau)。典型地，將動物用相同抗原但是綴合到不同的蛋白和/或通過不同的交聯(lián)劑綴合的綴合物加強。綴合物還可在重組細胞培養(yǎng)物中作為蛋白質(zhì)融合物來制備。同樣，適當(dāng)使用凝聚劑(諸如明礬)來增強免疫應(yīng)答。單克隆抗體單克隆抗體可以使用最初由Kohler等，自然(Nature) 256 :495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法(美國專利號4，816，567)來制備。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物(諸如倉鼠或獼猴) 以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)。 或者，可以在體外免疫淋巴細胞。然后，使用合適的融合劑(諸如聚乙二醇)將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞(Goding，單克隆抗體原理和實踐(Monoclonal Antibodies principles and Practice)，第 59-103 頁，(學(xué)術(shù)出版社，1986))。將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選地含有一種或多種抑制未融合的母體骨髓瘤細胞生長或存活的物質(zhì)。例如，若母體骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型地將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷細胞的生長。
典型的骨髓瘤細胞是那些有效融合、支持所選抗體生成細胞穩(wěn)定的高水平生成抗體、并對針對培養(yǎng)基(如HAT培養(yǎng)基)敏感的細胞。這些中優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，諸如可從美國加利福尼亞州圣地亞哥的索爾克研究所細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA)獲得的 M0PC-21 和MPC-Il小鼠腫瘤衍生的那些及可從美國馬里蘭州羅克維爾的美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA)獲得的 SP-2 或 X63_Ag8_653 細胞衍生的那些。人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細胞系也已記載用于生成人單克隆抗體(Kozbor，免疫學(xué)雜志(J. Immunol. 133 =3001(1984) ；Brodeur等，單克隆抗體產(chǎn)生技術(shù)和應(yīng)用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications),第 51-63 頁， (Marcel Dekker, Inc.，紐約，1987))。對雜交瘤細胞正在其中生長的培養(yǎng)基進行測定，測定針對CLM-I的單克隆抗體的生成。通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法(諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA))測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。這樣的技術(shù)和測定在本領(lǐng)域中是已知的。單克隆抗體的結(jié)合親和性可通過例如Munson和Pollard，Anal. Biochem.(生物化學(xué)年刊)107 =220(1980)所述的斯卡查德分析Gcatchard analysis)來確定。在鑒定到生成具有期望特異性、親和性和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，該克隆可通過有限稀釋方法進行亞克隆并通過標(biāo)準(zhǔn)方法進行培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體原理和實踐(Monoclonal Antibodies principles and Practice)，第 59-103 頁(學(xué)術(shù)出版社， 1986))。適于這一目的的適合培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水瘤進行體內(nèi)培養(yǎng)。通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法，諸如例如蛋白A-kpharose、羥磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分離。單克隆抗體還可以通過重組DNA法(諸如在美國專利號4，816，567中所述的那些)制備。編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)方法分離和測序(例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針進行)。雜交瘤細胞可充當(dāng)此類 DNA的來源。一旦分離，可將DNA置于表達載體中，然后將該表達載體轉(zhuǎn)染入不另外生成免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細胞(諸如大腸桿菌(E. coli)細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞或骨髓瘤細胞)以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成?？贵w重組生成將在下文中更詳細地描述。在另一個實施方案中，可以從使用McCafferty等，自然(Nature) 348 552-554(1990)所記載的技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫分離抗體或抗體片段。Clackson 等，自然(Nature) 352 :624-628(1991)和 Marks 等，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 222 581-597(1991)分別記載了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。后續(xù)出版物記載了通過鏈改組(Marks等，生物/技術(shù)(Bio/Technology) 10 :779-783 (1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse等，核酸研究(Nuc. Acids. Res. ),21 2^5-2266(1993))，生成高親和性(nM范圍)的人抗體。如此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方案。還可以修飾DNA，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域編碼序列置換同源鼠序列(美國專利號4,816,567 ；Morrison等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 81 :6851 (1984))，或通過將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽編碼序列的全部或部分共價連接進行。典型地，用所述非免疫球蛋白多肽置換抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或者用它們置換抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變結(jié)構(gòu)域，以產(chǎn)生嵌合二價抗體，其包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結(jié)合位點和對不同抗原具有特異性的另一個抗原結(jié)合位點。人源化的和人抗體本發(fā)明的抗體可以包括人源化的抗體或人抗體。人源化的抗體具有由非人來源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為“輸入”殘基，其典型的取自“輸入”可變結(jié)構(gòu)域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法(Jones等，自然(Nature)，321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，自然(Nature),332 :323-327 (1988)； Verhoeyen 等，科學(xué)(Science)，239 1534-1536 (1988)),通過用嚙齒類動物 CDR 或 CDR 序列置換人抗體的相應(yīng)序列進行。因而，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利號 4，816，567)，其中基本上少于整個人可變結(jié)構(gòu)域用來自非人物種的相應(yīng)序列置換。在實踐中，人源化抗體典型地是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類動物抗體中類似位點的殘基置換的人抗體。用于制備人源化抗體的人可變結(jié)構(gòu)域(輕鏈和重鏈二者)的選擇對于減少抗原性是非常重要的。依照所謂的“最適”(best-fit)方法，針對已知的人可變結(jié)構(gòu)域序列的整個文庫篩選嚙齒類動物抗體的可變結(jié)構(gòu)域序列。接受與嚙齒類動物的序列最接近的人序列作為用于人源化的抗體的人構(gòu)架(FR) (Sims等，J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)，151 =2296(1993)； Chothia等，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，196 :901 (1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定構(gòu)架。同一構(gòu)架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter 等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad Sci. USA)，89 :4285 (1992)； Presta 等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.)，151 2623 (1993))。更重要的是，抗體應(yīng)該被人源化，同時保留針對抗原的高親和性和其他有利的生物學(xué)特性。為了獲得該目標(biāo)，按照典型的方法，人源化的抗體通過使用母體和人源化序列的三維建模分析母體序列和各種概念上的人源化產(chǎn)物的方法制備。通?？色@得三維免疫球蛋白模型并且其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟悉的。可獲得這樣的計算機程序，其舉例說明并且展示選定的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。檢查這些展示允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。以這種方法，可以選擇并組合來自接受體和輸入序列的FR殘基，從而實現(xiàn)需要的抗體特征，如關(guān)于靶抗原的增加的親和性。一般地，CDR殘基直接并且最實質(zhì)地參與影響抗原結(jié)合。備選地，現(xiàn)在可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)，其在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下，能夠在免疫后產(chǎn)生人抗體的完整全集。例如，已經(jīng)描述在嵌合的和種系突變體小鼠中純合缺失抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因?qū)е峦耆种苾?nèi)源抗體產(chǎn)生。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到所述種系突變體小鼠中導(dǎo)致在抗原攻擊后產(chǎn)生人抗體。見，例如，Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報)，90 :2551(1993)； Jakobovits 等，Nature (自然)，362 :255-258 (1993) ；Bruggemann 等，Year in Immuno. , 7 33(1993)；和Duchosal等Nature (自然)355 :258 (199 。人抗體還可以來源于噬菌體展示文庫(Hoogenboom 等，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，227 :381 (1991) ；Marks 等，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，222 :581-597(1991) ；Vaughan 等 Nature Biotech (自然生物技術(shù))14 :309(1996))。人抗體還可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)產(chǎn)生，包括噬菌體展示文庫 (Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，227 :381 (1991) ；Marks 等， J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，222:581 (1991))。依照這種技術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域基因以符合讀碼框的方式克隆入絲狀噬菌體(諸如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA 拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進行的選擇也導(dǎo)致編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。由此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以以多種形式進行，綜述參見例如 Johnson, K S，和 Chiswell，D J.，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的當(dāng)前觀點(Current Opinion in Structural Biology) 3 :564-571 (1993)。V基因區(qū)段的數(shù)種來源可用于噬菌體展示。例如，Clackson等， 自然(Nature) 352 =624-628(1991)從衍生自經(jīng)免疫小鼠脾的小型V基因隨機組合文庫分離得到大量不同的抗噁唑酮抗體。例如，通過基本上遵循Marks等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol. Biol. )222 :581-597(1991)或 Griffith 等，EMBO J. 12 :725-734(1993)記載的技術(shù)，可以自未免疫人供體構(gòu)建V基因全集和可以分離針對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。 還參見美國專利號5，565，332和5，573，905。Cole等和Boerner等的技術(shù)也可以用于制備人單克隆抗體(Cole 等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (單克隆抗體與癌癥治療)，Alan R. Liss，第 77 頁(1985)和 Boerer 等，J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)，147 (1) 86-95(1991))。還可以由體外激活的B細胞來生成人抗體(參見美國專利5，567，610和 5，229，275)?？贵w片段本發(fā)明還包括抗體片段。已經(jīng)開發(fā)了用于生產(chǎn)抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimoto等，生物化學(xué)和生物物理方法雜志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods) 24 :107-117 (1992)禾口 Brerman等，科學(xué)(Science) 2 :81 (1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。例如，抗體片段可以從上文討論的抗體噬菌體文庫分離。備選地，可直接從大腸桿菌 (E. coli)回收Fab，-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab' ).sub.2片段(Carter等，生物/技術(shù)(Bio/Technology) 10 163-167 (199 )。依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物分離F(ab' ). sub. 2片段。用于產(chǎn)生抗體片段的其它技術(shù)對于熟練從業(yè)人員將是顯而易見的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見W093/16185 ；美國專利號5，571，894 ；及美國專利號5，587，458。Fv和sFv是具有完整結(jié)合位點、缺少恒定區(qū)的唯一類型；如此，它們適于在體內(nèi)使用時降低非特異性結(jié)合?？蓸?gòu)建sFv融合蛋白以產(chǎn)生效應(yīng)子蛋白質(zhì)在sFv的氨基或羧基末端的融合。參見抗體改造(Antibody Engineering), Borrebaeck編，見上文?？贵w片段還可以是“直鏈抗體”，例如如美國專利號5，641，870中所記載的。此類直鏈抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。多特異性(例如，雙特異性)抗體本發(fā)明的抗體還包括，例如，多特異性抗體，其具有針對至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性。盡管此類分子通常將僅結(jié)合兩種抗原(即，雙特異性抗體，BsAbs)，但是，當(dāng)用在本文中時，這一表述涵蓋具有額外的特異性的抗體，如三特異性抗體。用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein等， 自然(Nature) 305 :537-539(198 )。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤 (四源雜交瘤(quadroma))產(chǎn)生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。 類似的方法披露于 WO 93/08829 及 Traunecker 等，EMBO J. 10 :3655-3659 (1991)。依照一種不同的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列融合。優(yōu)選的是，融合體具有包含至少部分鉸鏈區(qū)、 CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和需要時的免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同的表達載體，并共轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物體。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時提供需要的雙特異性抗體的最佳產(chǎn)量的實施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了更大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達導(dǎo)致高產(chǎn)量時或在該比例沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體。在該方法的一個實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性) 構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)便于將想要的雙特異性化合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露于WO 94/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如Suresh等，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology) 121 :210 (1986)。依照W096/27011中記載的另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重組細胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含抗體恒定結(jié)構(gòu)域CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)置換。通過將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)置換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈大小相同或相似的補償性“空腔”。 這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物(諸如同型二聚體)提高異二聚體產(chǎn)量的機制。文獻中還記載了由抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。Brerman等，科學(xué)(Science) 2 :81(198 記載了通過蛋白水解切割完整抗體以產(chǎn)生F(ab’)2片段的方法。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉時還原， 以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab'片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿狨?TM)衍生物。然后Fab' -TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成 Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab' -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。還記載了從重組細胞培養(yǎng)物直接產(chǎn)生和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。 例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.)， 148(5):巧47-1553(199幻。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接?？贵w同型二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同型二聚體。Hollinger等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad. Sc i. USA), 90 :6444-6448(1993)記載的“雙抗體”技術(shù)提供了生成雙特異性抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域相連的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(V. sub. H)，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。因而，迫使一個片段上的Vh和\結(jié)構(gòu)域與另一個片段上的互補\和Vh結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點。還報道了通過使用單鏈Fv (sFv) 二聚體生成雙特異性抗體片段的另一種策略。參見 Gruber 等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.)，152 :5368 (1994)。預(yù)期具有超過兩種效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學(xué)雜志 (J. Immunol.) 147 :60(1991)。異源偶聯(lián)抗體雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異源偶聯(lián)”抗體，它們是本發(fā)明的抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可以與抗生物素蛋白偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，已經(jīng)提議將此類抗體用于將免疫系統(tǒng)細胞靶向不需要的細胞(美國專利號4，676，980)，并且用于治療HIV感染(W0 91/00360, WO 92/200373，和EP 03089)。異源偶聯(lián)抗體可以使用任何便利的交聯(lián)方法進行制備。合適的交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是公知的，并且與多種交聯(lián)技術(shù)一起公開在美國專利號4，676，980中。多價抗體本發(fā)明的抗體包括多價抗體。多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達該抗體所結(jié)合的抗原的細胞的內(nèi)在化(和/或異化(catabolized))。本發(fā)明的抗體可以是可容易的通過重組表達編碼抗體多肽鏈的核酸而生成的、具有三個或更多抗原結(jié)合位點(例如四價抗體)的多價抗體(其是IgM類別以外的)。多價抗體可包含二聚化結(jié)構(gòu)域和三個或更多抗原結(jié)合位點。優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)c區(qū)或鉸鏈區(qū)(或由其組成)。在這種情況中， 抗體將包含F(xiàn)c區(qū)及Fc區(qū)氨基末端的三個或更多抗原結(jié)合位點。本文中優(yōu)選的多價抗體包含三個至約八個但優(yōu)選四個抗原結(jié)合位點(或由其組成)。多價抗體包含至少一條多肽鏈 (和優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或更多可變結(jié)構(gòu)域。例如，多肽鏈可包含 VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VDl是第一可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二可變結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，Xl和X2代表氨基酸或多肽，而η是0或1。例如，多肽鏈可包含=VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-Fc區(qū)鏈；或VH-CHl-VH-CHl-Fc區(qū)鏈。本文中的多價抗體優(yōu)選進一步包含至少兩條(和優(yōu)選四條)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽。本文中的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽。本文涵蓋的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，且任選進一步包含CL結(jié)構(gòu)域。效應(yīng)子功能工程改造可能希望在效應(yīng)子功能方面修飾本發(fā)明的抗體，例如，從而增強抗體的治療疾病的效力。例如，可向Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而使得在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此生成的同型二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力。參見Caron等，J. Exp. Med (實驗醫(yī)學(xué)雜志)176 :1191-1195(1992) ^P Shopes, B.免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 148 :2918-2922 (1992)。 為了延長抗體的血清半衰期，可如例如美國專利號5，739，277中記載的將補救受體結(jié)合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于本文時，術(shù)語“補救受體結(jié)合表位”指IgG分子(例如 IgG. sub. 1，IgG. sub. 2，IgG. sub. 3，或 IgG. sub. 4)的 Fc 區(qū)中負責(zé)延長 IgG 分子體內(nèi)血清半衰期的表位。其他抗體修飾本發(fā)明考慮抗體的其他修飾。例如，抗體可以連接到多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)的聚合物上，例如，連接到聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧烯烴、或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物上。抗體還可以被截留在制備的微膠囊中，例如，通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合法(例如，分別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)進行，截留在膠質(zhì)藥物遞送系統(tǒng)中(例如，脂質(zhì)體、清蛋白微膠囊、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊中)，或截留在粗乳液中。此類技術(shù)公布于雷明頓藥物科學(xué)(Remington' s Pharmaceutical Sciences)，第16 版，Oslo, Α.，Ed.，(1980)。脂質(zhì)體和納米顆粒本發(fā)明的CLM-I抗體還可以配制為免疫脂質(zhì)體。包含多肽的脂質(zhì)體通過本領(lǐng)域已知的方法制備，所述方法諸如記述在Epstein等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)，82 3688 (1985) ；Hwang 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報)， 77 =4030(1980)；和美國專利號4，485，045與4，M4，545中。具有增加的循環(huán)時間的脂質(zhì)體公布于美國專利號5，013，556中。通常，脂質(zhì)體的配制和應(yīng)用對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。特別有用的脂質(zhì)體可以通過反相蒸發(fā)法產(chǎn)生，具有包含磷脂酰膽堿、膽固醇和 PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組成。脂質(zhì)體通過限定孔尺寸的濾器擠壓，以產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明的多肽可以通過二硫鍵交換反應(yīng)綴合到脂質(zhì)體上，如在 Martin等J.Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)257 :286-288 (1982)中所述(例如，抗體的Fab' 片段)。納米顆?；蚣{米膠囊也可以用來截留本發(fā)明的多肽。在一個實施方案中，生物可降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯(polyalky-cyanoacrylate)納米顆?？梢杂糜诒景l(fā)明的多肽。本發(fā)明的進一步的詳情通過下述非限制性實施例舉例說明。本說明書中所有引用的公布通過引用明確結(jié)合于此。實施例材料與方法動物所有的動物保持在無菌無病原體條件下，并且動物實驗得到Genentech機構(gòu)動物護理和應(yīng)用委員會的批準(zhǔn)。為了產(chǎn)生Clm-I敲除(KO)小鼠，將包含新霉素抗性基因(NecZ)的線性化的靶向載體電穿孔到C57B1/6來源的C2胚胎干(ES)細胞中。選擇新霉素抗性ES克隆用于同源重組的Southern印跡分析(補充的附圖)。將Clm-I外顯子1成功被Nec/基因替換的ES克隆注射到C57BL/6胚細胞中，并且隨后轉(zhuǎn)移到假孕雌性中以產(chǎn)生嵌合后代。嵌合體與C57BL/6小鼠雜交以產(chǎn)生雜合體。將具有靶向的等位基因的種系傳遞的雜合體與C57BL/6回交至少10代，之后異種雜交以產(chǎn)生Clm-I野生型(WT) 和KO小鼠。C57BL/6(在CD45. 1或CD45. 2同基因型背景下)小鼠購自Jackson實驗室。 Cx3crlgfp/+C57BL/6報道子小鼠在Genentech公司的無病原體動物機構(gòu)中繁殖和保持。所有動物在8-12周齡使用，例外的是CD45. 1/CD45. 2骨髓嵌合體實驗，其中使用6周齡的 C57BL/6 (CD45. 1)作為骨髓接受體。所有實驗流程得到Genentech公司機構(gòu)動物護理和應(yīng)用委員會的批準(zhǔn)。
抗體和重組蛋白下述抗體購自BD生物科學(xué)(BD Biosciences)抗-FcyRIII/ II(CD32/16，克隆 2.4G2) ；PE-, APC-，APC_Cy7_ 標(biāo)記的抗-CDllb (M1/70)；生物素-，PE-, APC-標(biāo)記的抗-CDllc (HL3) ；PE-, APC-標(biāo)記的抗 _CD4(GK1. 5) ；APC-標(biāo)記的抗-CD3(145-2C11) ；PE-Cy7-標(biāo)記的抗-B220 (RA3-6B2) ；PE-標(biāo)記的抗-I-A/ I-E (M5/114. 15. 2)；生物素-，PE-標(biāo)記的抗-CD86 (GLl) ；APC_Cy7_ 標(biāo)記的抗-Gr-1(RB6-8C5) ；PE-標(biāo)記的抗-CD45. 1 (A20)；生物素 _，F(xiàn)ITC_標(biāo)記的抗-CD45. 2 (104)； Alexa Fluor 488-標(biāo)記的抗 _FoxP3 (MF23) ；PE-標(biāo)記的抗-IL-17 (TC11-18H10)； FITC-標(biāo)記的抗-IFN □ (XMG1. 2) ；FITC-, PE-標(biāo)記的抗-TNF α (ΜΡ6-ΧΤ22)；生物素-， ΡΕ-，PerCP-Cy5.5-標(biāo)記的抗-CD45(30-F11)；多克隆兔抗-iNOS II型抗體。下述抗體購自 eBioscience Pacific blue-標(biāo)記的抗-CDllb (Ml/70) ；PE-Cy7-標(biāo)記的抗-CD llc(N418) ；PE-Cy5-標(biāo)記的抗-I-A/I-E(M5/114. 15. 2) ；APC-Alexa Fluor 750-標(biāo)記的抗-F4/80(BM8)。鏈霉抗生物素蛋白I^acific Orange購自hvitrogen。PE-標(biāo)記的驢抗-兔 IgG和Cy3_標(biāo)記的抗-倉鼠IgG購自Jackson ImmunoResearch。單克隆抗-肌動蛋白抗體(AC-40)購自Sigma-Aldrich。為了產(chǎn)生鼠Clm-I-Fc融合蛋白，將鼠Clm-I的細胞外結(jié)構(gòu)域(EOT)克隆到修飾的編碼鼠IgGlFc片段的pRK5表達載體中。將該表達載體轉(zhuǎn)染到 CHO細胞中，并且通過蛋白質(zhì)A親和層析以及隨后的Superdex 200凝膠過濾純化細胞培養(yǎng)物上清中包含的Clm-I-Fc融合蛋白。純化的蛋白的性質(zhì)通過質(zhì)譜分析驗證，內(nèi)毒素水平為 < 0. 05 EU/mg。將鼠抗-gpl20抗體(IgGl)用作對照。針對鼠Clm-I的E⑶的單克隆抗體通過用鼠Clm-I-E⑶-His融合蛋白免疫亞美尼亞倉鼠產(chǎn)生。將來自免疫動物的脾B細胞與骨髓瘤融合，以產(chǎn)生雜交瘤?；谂c鼠Clm-I的反應(yīng)性，通過ELISA，F(xiàn)ACS, Western印跡和免疫組織化學(xué)分析選擇陽性克隆?；谏鲜鰳?biāo)準(zhǔn)選擇克隆3F6用于研究中。Alexa熒光染料088或647)-綴合的Clm-I抗體使用Alexa Fluor 蛋白標(biāo)記試劑盒(Invitrogen)產(chǎn)生。EAE的活性誘導(dǎo)和臨床評估小鼠用在200 μ 1乳液(包含100 μ 1 PBS和100 μ 1完全弗氏佐劑(CFA))中的200 μ g M0G35_55肽皮下免疫。CFA通過將不完全弗氏佐劑(DIFC0 實驗室)與ang/ml結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)H37RA(無活力且干的； DIFCO實驗室)混合而制備。每只小鼠還在第0天和免疫后第2天腹膜內(nèi)注射在100 μ IPBS 中的200ng百日咳毒素(Calbiochem)。使用下述分級系統(tǒng)評估臨床跡象0，無異常；1，軟弱無力的尾部或后肢虛弱；2，軟弱無力的尾部和后肢虛弱；3，部分后肢麻痹；4，完全的后肢麻痹；5，垂死狀態(tài)。對于Clm-I-Fc融合蛋白實驗，在免疫的第0天開始，將小鼠用在100 μ 1 PBS中的200 μ gClm-1-Fc融合蛋白或用對照Fc蛋白(抗-gpl20)每周皮下處理三次。數(shù)據(jù)報告為平均每日臨床得分和平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。骨髓嵌合體將6周齡的C57BL/6 (⑶45. 1)接受體小鼠每只用兩劑量的500rad致死性輻照。通過用注射器和27號針頭將骨骼用含有5% FBS的Hanks平衡的鹽溶液(HBSS ； Hyclone)沖洗，由C57BL/6 (CD45. 2)供體小鼠無菌收集來自大腿骨和脛骨的骨髓細胞。紅細胞通過ACK裂解緩沖劑裂解。將細胞在HBSS/FBS中以400g洗滌5分鐘，重懸，并且通過尼龍網(wǎng)(BD Falcon)以去除碎片。然后，將細胞用PBS洗滌兩次，并且以IO8個細胞/ml的濃度重懸。將輻照的接受體小鼠通過尾靜脈注射& IO7個細胞/200μ1。將重構(gòu)的小鼠保持在無病原體機構(gòu)中8周，以允許與供體骨髓的完全植入。骨髓的完全重構(gòu)通過對于淋巴和骨髓區(qū)室中的⑶45. 1和⑶45. 2同基因型標(biāo)記的外周血的FACS分析進行驗證。如上述， 在重構(gòu)的接受體小鼠中誘導(dǎo)EAE。EAE的過繼轉(zhuǎn)移如關(guān)于活性EAE的誘導(dǎo)所述，將Clm-IWT或KO小鼠用M0G35_55肽免疫，不同的是，小鼠不注射百日咳毒素。免疫后10-12天，收集引流(腹股溝和臂)淋巴結(jié)，并且通過70-μ m細胞粗濾器搗碎而獲得單細胞懸液。細胞在完全培養(yǎng)基(RPMI 1640， 10% FBS，2mM谷氨酰胺，IOmM HEPES，ImM丙酮酸鈉，0. 05mMβ -巰基乙醇，100U/ml青霉素， 100mg/ml鏈霉素)中以切106個細胞/ml用20 μ g/ml M0G35_55肽和20ng/ml重組鼠IL-2 (R&D 系統(tǒng))重新刺激4天。接受體小鼠通過尾靜脈注射IO7個細胞。在同一天和兩天后，接受體小鼠還將注射200ng百日咳毒素，如上所述。EAE疾病的臨床評估如上述進行。脊髓和淋巴結(jié)的FACS分析在EAE疾病最嚴(yán)重時(免疫后第14_15天)，將小鼠麻醉并且用含有10U/ml肝素的PBS經(jīng)心臟灌流。脊髓切開并且用膠原酶lK2mg/ml ；Roche Diagnostics (羅氏診斷))消化。通過將組織通過70-μ m細胞粗濾器(BD生物科學(xué))，然后Percoll梯度(80% /70% /60% /30% )離心而分離單核細胞。從30% /60%界面處收集細胞并洗滌。還如上所述從引流淋巴結(jié)(DLNs)分離細胞。在FACS染色緩沖液(PBS， 0.5%牛血清清蛋白，2mM EDTA)中，將細胞用抗-Fc □ RIII/II在4°C Fc封閉30分鐘。洗滌后，將細胞用熒光綴合的mAbs在4°C染色30分鐘。對于iNOS的細胞內(nèi)染色，將細胞用針對Clm-1(3F6)，⑶45，⑶lib和⑶Ilc的抗體染色，然后用在PBS溶液中的3%多聚甲醛在室溫下固定20分鐘。然后，將細胞重懸在100 μ 1透化溶液(在PBS中的0. Triton-X) 中。將細胞用在透化溶液中的1 μ g/ml兔抗-iNOS抗體在室溫下染色15分鐘，然后用 PE-標(biāo)記的驢抗-兔IgG在室溫下染色15分鐘。為了分析Treg細胞，將如上述分離自脊髓和DLNs的單細胞懸液用⑶45和⑶4染色，然后用Cytofix/Cytoperm固定/透化試劑盒 (BD生物科學(xué))按照供應(yīng)商的使用說明進行R)xP3的細胞內(nèi)染色。對于細胞因子的細胞內(nèi)染色，將細胞在96孔圓底平板中以虹105個細胞/200 μ 1完全培養(yǎng)基在37°C用100 μ g/ml M0G35_55肽刺激18-20小時。在刺激的最后4小時內(nèi)，將細胞用GolgiPlug(BD生物科學(xué))以 1 1000稀釋處理。IL-17和IFN □的細胞內(nèi)染色基本上按R)xP3染色進行。染色的細胞用 FACSCaliber 或 LSRII 流式細胞儀(Becton Dickinson)分析。使用 FlowJo 軟件(Tree Star)分析數(shù)據(jù)。通過Wfestern印跡的Clm-I表達按所述產(chǎn)生骨髓來源的樹突細胞(BMDCs) (Inaba 等，The Journal of Experimental Medicine (實驗醫(yī)學(xué)雜志)176，1693-1702，1992)。在存在10ng/ml GM-CSF (R&D系統(tǒng)(R&D Systems))條件下，培養(yǎng)BMDCs，每三天更換培養(yǎng)基。 第7天，通過FACS分析細胞。BMDC純度為90-95%⑶11c+，⑶lib+。通過用標(biāo)準(zhǔn)方法用抗-Clm-IAb (3F6)免疫印跡分析來自BMDCs的全細胞裂解物。Clm-I表達的實時PCR分析如上述，在EAE的第0，7，14和21天，由小鼠分離脊髓和 DLNs。使用 RNeasy 保護迷你試劑盒(RNeasy Protect Mini Kit) ^jIAGEN)分離總 RNA。使用高能力 cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit) (Applied Biosystems (應(yīng)用生物系統(tǒng)))，用1 μ gRNA合成cDNA。分別使用iTaqMan通用PCRMaster混合物和驗證引物和探針組(Mm00467508_ml 與 Hs03003631_gl) (Applied Biosystems (應(yīng)用生物系統(tǒng)))測量Clm-ImRNA和18s rRNA。細胞因子和一氧化氮產(chǎn)生的測量如上述，在EAE第15天，從脊髓分離單核細胞。將單細胞懸液在96孔圓底平板中在37°C在有或無100 μ g/ml M0G35_55肽的完全培養(yǎng)基中 (5x10s個細胞/200 μ 1)培養(yǎng)。36小時后收集培養(yǎng)物上清。通過Luminex使用Bio-Plex小鼠細胞因子23-plex組(Bio-Rad)測量細胞因子釋放。一氧化氮產(chǎn)生使用Griess測定法 (Promega)按照供應(yīng)商的使用說明進行測量。體外抗原特異性回憶反應(yīng)如上述，在EAE第14天，由小鼠收集引流淋巴結(jié)。將單細胞懸液在96孔圓底平板中在37°C在有或無滴定量的M0G35_55肽的完全培養(yǎng)基中(5xl05個細胞/200 μ 1)重新刺激3天。然后，將細胞用0.5 μ Ci/孔『H]胸苷脈沖培養(yǎng)的最后6小時。 通過用 iTopcount 微量平板液閃計數(shù)器(Topcount Microplate Scintillation Counter) (Packard Instruments (Packard儀器))檢測的[3H]胸苷攝入而確定增殖。備選地，在第 3天收集上清用于細胞因子分析。通過ELISA (BD Biosciences (BD生物科學(xué)))進行細胞因子測量。免疫組織化學(xué)在所示的免疫后天數(shù)，如上述，將小鼠麻醉，并用30ml PBS灌流，然后用IOml 4%多聚甲醛(PFA)灌流。通過切開取出脊髓并且在4% PFA中固定過夜，然后依次浸沒在10 %，20 %，40 %蔗糖溶液中。然后，將脊髓在干冰上冷凍在OCT中，并且在塑料袋中保存在-80°C，以防止脫水。切割七微米厚的橫截切片并且封固在Superfrost Plus載玻片(Fisher Scientific)上。對于Clm-I和⑶45. 2共染色，將載玻片用倉鼠血清和生物素封閉試劑盒(Sigma)封閉。將組織用倉鼠抗-Clm-I (3F6)和生物素-綴合的抗-⑶45. 2 染色，然后用Cy3-抗-倉鼠IgG和Alexa Fluor 488-鏈霉抗生物素蛋白(Invitrogen)檢測。對于Clm-I和⑶Ilc共染色，載玻片首先用抗-Clm-I染色，然后用Cy3_抗-倉鼠IgG 檢測。然后，將載玻片用生物素-抗-⑶Ilc(HU)染色并用Alexa Fluor 488-鏈霉抗生物素蛋白檢測。對于髓鞘質(zhì)和⑶Ilc共染色，載玻片首先用生物素-抗-⑶Ilc染色，并用Alexa Fluor 594-鏈霉抗生物素蛋白(Invitrogen)檢測。然后，髓鞘質(zhì)用FluoroMyelin 綠色熒光髓鞘質(zhì)染色試劑盒(Invitrogen)染色。切片用具有DAPI的延長金抗衰退介質(zhì)(Prolong Gold antifade medium) (Invitrogen)蓋片。檢驗載玻片，并且使用 Olympus BX61 熒光顯微鏡捕獲圖片。為了檢測脫髓鞘的程度，將頸段和胸段脊髓切片用FluoroMyelin 綠色熒光髓鞘質(zhì)染色試劑盒染色。通過手工描摹總橫切面積和每個切片的脫髓鞘化面積估算脫髓鞘面積?？偟拿撍枨时硎緸榭偧顾杳娣e的百分?jǐn)?shù)。統(tǒng)計學(xué)分析假定方差不相等，通過雙尾配對斯氏t檢驗，進行任意兩組小鼠之間的EAE臨床得分、脫髓鞘或其它細胞計數(shù)和細胞因子產(chǎn)生的比較。ρ值< 0. 05被認(rèn)為是顯著性的。結(jié)果和討論在CNS炎癥部位，Clm-I在產(chǎn)生TNF和iNOD的⑶Ilc+細胞上表達Clm-I最先通過搜索編碼單跨膜、含有免疫-酪氨酸抑制基序(ITIM)的Ig-超家族成員的基因組預(yù)測序列的生物信息學(xué)途徑鑒定(Abbas等，Genes and Immunity (基因和免疫性)6，319-331，200幻。然后，基于在用髓鞘質(zhì)少突細胞糖蛋白(MOG)肽免疫后在脊髓中表達水平的變化選擇候選的含有ITIM的基因的小鼠同源物。與首次用于實驗的(naiVe )小鼠相比，在疾病最嚴(yán)重時Clm-I表達增加超過100倍(圖1A，左側(cè)圖)。產(chǎn)生針對CLM-I 細胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，以確定CLM-I的細胞來源。在首次用于實驗的小鼠中，在局部小膠質(zhì)細胞群體上不存在CLM-I (圖1B)。在來自MOG-免疫的小鼠的脊髓中，CLM-I表達
24在⑶lib/⑶lie雙陽性細胞上，具有高的MHC II類和⑶86表達(圖1C)。在疾病發(fā)作時， CLM-I⑶Ilc雙陽性細胞沿髓膜和血管分布(結(jié)果未顯示)。在疾病最嚴(yán)重時，Clm-I+細胞成簇位于胸段和腰段脊髓的背角和腹角的白質(zhì)中(圖1D)。進一步的分析表明，Clm-I+細胞表達iNOS和TNF (圖1E)，并且因此在表型上類似于Tip-DCs，Tip-DCs最初描述為有效的病原體消除所需要的骨髓細胞子集(Serbina等，Immunity (免疫性)19，59-70，2003)。在后續(xù)EAE研究中已經(jīng)將TipDCs及其前體鑒定為對EAE的發(fā)病機理起作用的致病效應(yīng)細胞 (King等，Blood(血液)113，3190-3197，2009)。因此，在CNS中在炎性骨髓細胞上增加的 CLM-I表達可能表明在EAE發(fā)病機理中的調(diào)節(jié)功能。在自身免疫性脫髓鞘疾病過程中，CLM-I在遷移到CNS的循環(huán)Ly6+骨髓前體上表達為了進一步確定CLM-I陽性細胞所來源的骨髓譜系，我們利用Cx3Crl+/gfp報道株，其在單核細胞和巨噬細胞/樹突細胞譜系的細胞中表達綠色熒光蛋白(Geissmarm等， Immunity (免疫性)19，71-82，2003)。在外周血中，在 MOG 免疫后，CLM-I 在 CxScrlltIyeChi ⑶115+CD62L+Ly6G_炎性單核細胞上表達，但是在首次用于實驗的小鼠和經(jīng)免疫的小鼠中，不存在于 Cx3crIhiCDIlc+ 普通 DC 前體上(圖 2A) (Auffray 等，The Journal of Experimental Medicine (實驗醫(yī)學(xué)雜志)206，595-606，2009 ；Liu等，kience (科學(xué))，324， 392-397,2009)。為了進一步確定發(fā)炎的CNS中的CLM-I陽性細胞是否確實來源于輻照-敏感性的骨髓來源的細胞并且不來源于輻照-抗性的CNS小膠質(zhì)細胞，將具有CD45. 1異型的小鼠進行輻照，并用具有⑶45. 2異型的供體細胞重建。CLM-I表達不存在于輻照-抗性的小膠質(zhì)細胞上，但是存在于歸巢于CNS的骨髓來源的供體細胞上(圖2B)。驗證了這些結(jié)果，CLM-I不存在于首次用于實驗的脊髓的Cxcrfhi定居小膠質(zhì)細胞上，但是在疾病最嚴(yán)重時，在CX3crl+⑶Ilc+細胞的分群體上高度表達(圖2C)。發(fā)現(xiàn)CLM-l+CUcrl1。雙陽性細胞鄰近胸段和腰段脊髓以及正中隆起的背角和腹角的髓膜，但是保持不存在于位于脊髓背角和腹角的灰質(zhì)中的定居小膠質(zhì)細胞上(圖2D)。綜合這些，這些結(jié)果表明，CLM-I在CNS炎性損傷中的炎性單核細胞和骨髓來源的DCs上表達，但是不在循環(huán)的普通DC前體或CNS定居小膠質(zhì)細胞上表達。缺乏CLM-I導(dǎo)致MOG-誘導(dǎo)的EAE增加的疾病嚴(yán)重性由于CLM-I在其細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含兩個ITIM和一個ITSM基序(Chung等，J Immunol (免疫學(xué)雜志)171,6M1-6548，2003)并且能夠在受迫過表達系統(tǒng)中在與激活受體交聯(lián)后募集SHP-I (Izawa等，The Journal of Biological Chemistry (生物化學(xué)雜志)282， 17997-18008，2007)，所以我們確定CLM-I是否能夠起作用抑制MOG-誘導(dǎo)的EAE中的炎性反應(yīng)。通過同源重組，產(chǎn)生缺乏CLM-I外顯子1的小鼠，其導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄體和蛋白的缺乏(補充的圖1)。CLM-Iko小鼠是存活的，并且以預(yù)測的孟德爾比率出生。在6、9和12周齡測量時， 小鼠在體重或骨骼參數(shù)方面沒有區(qū)別(結(jié)果未顯示)。在CLM-Iko和wt小鼠中，在腹股溝 (inguinual)淋巴結(jié)、脾和血液中的骨髓和淋巴細胞子集是相似的(結(jié)果未顯示)。通過流式細胞術(shù)和Western印跡分析驗證在ko小鼠中CLM-I基因的成功消除(圖3A，左側(cè)圖)。在來自于CLM-Iwt和ko小鼠的骨髓來源的DCs (BMDCs)上，與抗原呈遞和共刺激相關(guān)的細胞表面分子的表達水平相似(圖3A，右側(cè)圖)，CMRF簇中其他成員的表達水平也相似(結(jié)果未顯示)。在CLM-Iwt和ko小鼠中，在疾病最嚴(yán)重時，各種炎性細胞群體的樹突細胞形態(tài)(圖3B，左側(cè)圖)和數(shù)目(圖3B，右側(cè)圖)是相似的。當(dāng)MOG免疫時，CLM-Iwt和ko小鼠都以相似的發(fā)病率患病。然而，在缺乏CLM-I的小鼠中，疾病的嚴(yán)重性顯著增加(圖3C)。為了確定該表型是否是由于推定的配體對CLM-I的結(jié)合，將小鼠用CLM-I可溶性對應(yīng)體(CLM-I-Fc 融合蛋白)處理。與在CLM-Iko小鼠中獲得的結(jié)果一致，與用對照融合蛋白處理的小鼠相比，在CLM-I-Fc處理的小鼠中，疾病嚴(yán)重性顯著增加，而疾病發(fā)病率保持相似(圖3D)。因此，缺乏CLM-I受體功能導(dǎo)致增加的疾病嚴(yán)重性，這指出在CNS炎癥中潛在的抑制性作用。Clm-I不調(diào)節(jié)T細胞致敏CLM-I的剪截變體，即Digrl，先前鑒定為T細胞反應(yīng)的負調(diào)節(jié)劑(Shi等， Blood (血液)108，2678-2686, 2006)。由于EAE可以通過抗原特異性T細胞致敏所誘導(dǎo)，我們進一步確定CLM-I是否影響T細胞反應(yīng)。將來源于CLM-Iwt和ko小鼠的脾cDCs或BMDCs 用同種異基因T細胞或用表達對OVA肽特異性的TCR的T細胞溫育。增殖(補充的圖2) 和細胞因子反應(yīng)(結(jié)果未顯示)不依賴于CLM-I狀態(tài)。為了進一步確定CLM-I是否在體內(nèi)影響T細胞致敏，將在MOG免疫后7天由外周淋巴結(jié)分離的T細胞分離并且用MOG肽重新刺激。CLM-I狀態(tài)不影響外周淋巴結(jié)(PLN)細胞中的T細胞增殖、細胞因子反應(yīng)或R)Xp3調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生(圖4A和補充的圖3a)。最后，為了鞏固CLM-I在體內(nèi)調(diào)節(jié)T細胞效應(yīng)子功能的作用，將來自CLM-Iwt和ko供體的T細胞分別過繼轉(zhuǎn)移到ko和wt接受體中。在 T細胞供體中，疾病嚴(yán)重性不受CLM-I狀況的影響，但是在缺乏CLM-I的T細胞接受體中顯著增加(圖4B)。這表明，在MOG免疫后，CLM-I在效應(yīng)子階段而不是在起始的T細胞致敏階段起作用調(diào)節(jié)疾病嚴(yán)重性。接著，我們驗證CLM-I是否影響CNS浸潤性⑶4+T細胞的重新激活和炎性DCs的細胞毒性活性。在疾病最嚴(yán)重時由脊髓收集并且在存在抗原呈遞細胞的條件下用MOG肽重新刺激的CNS白細胞表現(xiàn)出針對Thl，Thl7和R)xp3Treg細胞的相似的極化和相似的T細胞特異性細胞因子反應(yīng)(圖5A和補充的圖北)。相反，與wt小鼠相比，由CLM-Iko小鼠的脊髓獲得的白細胞產(chǎn)生顯著升高水平的一氧化氮和骨髓特異性促炎性細胞因子(圖5B)。 因此，在MOG-誘導(dǎo)的EAE中，CLM-I負調(diào)節(jié)骨髓效應(yīng)子功能而不影響T細胞反應(yīng)。我們接著確定用MOG肽免疫的CLM-Iko小鼠的增加的麻痹是否是由脊髓中骨髓細胞增加的活性所導(dǎo)致。發(fā)現(xiàn)CLM-I陽性細胞在頸段和胸段脊髓的背角中的脫髓鞘部位簇集。發(fā)現(xiàn)細胞與髓鞘質(zhì)折疊相對并且通常包繞髓鞘質(zhì)折疊(圖6A)，在一些情形中，MOG-陽性的髓鞘質(zhì)殘余物存在于CLM-I陽性細胞內(nèi)(結(jié)果未顯示)。由于CLM-I是抑制性受體， 并且浸潤性骨髓細胞的程度在CLM-Iwt和ko小鼠中是相似的，我們推理，CLM-I的缺乏可能導(dǎo)致每個細胞增加的激活和效應(yīng)子活性，這導(dǎo)致增加的脫髓鞘作用。CLM-I的缺乏導(dǎo)致增加的脫髓鞘作用(圖6B和C)，這表明在缺乏CLM-I的CDllc+細胞中增加的細胞毒性活性。因此，CLM-I負調(diào)節(jié)骨髓細胞激活，這在脊髓的軸突脫髓鞘中產(chǎn)生中斷。盡管在其細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包含ITIM序列的受體的數(shù)目穩(wěn)定遞增，但是，對于多種這些受體的生物學(xué)作用仍然了解很少。本研究首次將CLM-I鑒定為CNS浸潤性炎性DCs上的抑制性受體。我們進一步表明，該受體的可溶性對應(yīng)體可以加重疾病嚴(yán)重性，這表明細胞外結(jié)構(gòu)域作為針對某種尚未鑒定的配體的誘餌受體。盡管推定的配體的鑒定將無疑增加我們對CLM-I生物學(xué)的理解，但是，本研究清楚地說明CLM-I在控制CNS中的骨髓細胞激活和脫髓鞘作用方面起著并非冗余的作用。
權(quán)利要求
1.一種用于治療哺乳動物受試者中的脫髓鞘疾病的方法，所述方法包括給所述受試者施用有效量的CLM-I激動劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物受試者是人。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述脫髓鞘疾病是脫髓鞘自身免疫病。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述脫髓鞘自身免疫病影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述脫髓鞘自身免疫病選自由下列組成的組多發(fā)性硬化病(MQ，復(fù)發(fā)性減輕的MS (RRMS)，原發(fā)性和繼發(fā)性進行性形式的MS,進行性復(fù)發(fā)形式的MS, 腦脊髓炎，白質(zhì)腦炎，橫貫性脊髓炎，視神經(jīng)脊髓炎(德維克病)，和視神經(jīng)炎。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述脫髓鞘自身免疫病是MS。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述脫髓鞘自身免疫病影響外周神經(jīng)系統(tǒng)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述脫髓鞘自身免疫病選自由下列組成的組急性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病(AIDP;吉蘭-巴雷綜合征)；慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病；抗-MAG外周神經(jīng)病；以及運動和感覺神經(jīng)病(HMSN)(還已知為遺傳性感覺運動神經(jīng)病(HSMN)，或腓骨肌萎縮癥，或進行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮癥)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中所述CLM-I激動劑是激動劑抗-CLM-I抗體。
10.用于治療脫髓鞘疾病的藥物組合物，其包含與藥用賦形劑混合的有效量的CLM-I 激動劑。
11.權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所述脫髓鞘疾病是脫髓鞘自身免疫病。
12.權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所述脫髓鞘自身免疫病是多發(fā)性硬化病(MS)。
13.有效量的CLM-I激動劑在制備用于治療脫髓鞘疾病的藥物中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求13的應(yīng)用，其中所述脫髓鞘疾病是脫髓鞘自身免疫病。
15.權(quán)利要求11的應(yīng)用，其中14所述脫髓鞘自身免疫病是多發(fā)性硬化病(MS)。
16.權(quán)利要求13-15中任一項的應(yīng)用，其中所述CLM-I激動劑是激動劑抗-CLM-I抗體。
17.用于治療脫髓鞘疾病的CLM-I激動劑。
18.權(quán)利要求17的CLM-I激動劑，其中所述脫髓鞘疾病是脫髓鞘自身免疫病。
19.權(quán)利要求18的CLM-I激動劑，其中所述脫髓鞘自身免疫病是MS。
20.權(quán)利要求17-19中任一項的CLM-I激動劑，其中所述CLM-I激動劑是激動劑抗-CLM-I抗體。
21.一種用于診斷脫髓鞘疾病的方法，所述方法包括檢測CLM-I功能的缺陷。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述脫髓鞘疾病是脫髓鞘自身免疫病。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述脫髓鞘自身免疫病是MS。
24.一種用于治療脫髓鞘疾病的試劑盒，其包括CLM-I激動劑和使用說明書。
25.權(quán)利要求M的試劑盒，其中所述脫髓鞘疾病是脫髓鞘自身免疫病。
26.權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述脫髓鞘自身免疫病是MS。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過CLM-I激動劑對自身免疫性脫髓鞘疾病(諸如多發(fā)性硬化病(MS))的診斷和治療。
文檔編號C07K16/28GK102471381SQ201080030562
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日
發(fā)明者門諾·凡盧克倫·康帕涅 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司