專利名稱：自身免疫性脫髓鞘疾病及其它自身免疫疾病或炎性疾病的治療方法
自身免疫性脫髓鞘疾病及其它自身免疫疾病或炎性疾病的治療方法相關(guān)申請本申請要求美國專利申請序列號(hào)US 61/306,043的優(yōu)先權(quán)，該美國專利申請于2010年2月19日提交；其全部內(nèi)容通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
當(dāng)機(jī)體自身免疫系統(tǒng)損傷神經(jīng)時(shí)將發(fā)生自身免疫性多發(fā)性神經(jīng)病變。這些疾病的癥狀包括麻木、肌肉無力、肢體疼痛、痙攣、觸碰敏感和腱反射減弱。通常，可以將自身免疫多發(fā)性神經(jīng)病變歸類為脫髓鞘和軸突神經(jīng)病變。脫髓鞘神經(jīng)病變中的一類為慢性炎性脫髓鞘神經(jīng)病變(CIDP)。CIDP的發(fā)病率為每100，000人中約9個(gè)病人(Laughlin等，Neurology 73 :39(2009))。而各種類型脫髓鞘神經(jīng)病變的總發(fā)病率為每100，000人中約20個(gè)病人。另外一種類型的脫髓鞘神經(jīng)病變?yōu)榧毙匝仔悦撍枨噬窠?jīng)病變(AIDP，格林-巴利綜合癥)，其發(fā)病率為每年每100，000人中2-3個(gè)病人。至少一種類型的神經(jīng)病變與抗體的存在相關(guān)，所述抗體為抗髓磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG)抗體的抗體。身免疫性軸突神經(jīng)病變包括血管炎性神經(jīng)病變、感覺性神經(jīng)節(jié)神經(jīng)炎(舍格倫綜合癥和其它膠原血管病)、自身免疫性自主神經(jīng)病變、非全長依賴性小纖維神經(jīng)病變和副腫瘤性神經(jīng)病變。已使用皮質(zhì)激素和/或免疫抑制劑治療這些類型的自身免疫性神經(jīng)病變，但是能靶向至與神經(jīng)病變發(fā)病相關(guān)的特定生物分子的新療法可能更為有效。發(fā)明概沭本發(fā)明涉及在所需哺乳動(dòng)物中抑制自身免疫性脫髓鞘神經(jīng)病變以及巨噬細(xì)胞浸潤的其它自身免疫疾病或炎性疾病的方法。該方法包括在有效抑制此類自身免疫疾病或炎性疾病發(fā)展的條件下，向患有此類疾病的哺乳動(dòng)物給予與巨噬細(xì)胞清道夫受體I類(MSRl)結(jié)合的抑制劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，抑制劑是抗-MSRl抗體的Fab片段。此類抗體可以是其單克隆或多克隆或功能性部分。哺乳動(dòng)物可以是家兔、大鼠、小鼠、馬、牛、山羊、靈長類或人，優(yōu)選人。本發(fā)明的一方面涉及一種治療哺乳動(dòng)物自身免疫疾病或炎性疾病的方法，該方法包括在有效抑制自身免疫疾病或炎性疾病的條件下，向所需哺乳動(dòng)物給予MSRl抑制劑，其中疾病包括巨噬細(xì)胞浸潤。MSRl抑制劑的例子包括抗-MSRl抗體、抗-MSRl抗體片段、抗-MSRl抗體的Fab片段、抗-MSRl抗體的F(ab)2片段，和/或這些抗體和抗體片段的功能等效物。在某些實(shí)施方式中，使用MSRl抑制劑的組合。當(dāng)抑制劑是抗體時(shí)，可以是任意類型的抗體。例如，抗體可以是單克隆抗體，和/或從單克隆抗體獲得的抗體片段或Fab片段。在其它實(shí)施方式中，抗體是多克隆抗體和/或從多克隆抗體制品獲得的抗體片段或Fab片段。在某些實(shí)施方式中，抗-MSRl的抗體、抗-MSRl抗體的抗體片段或Fab片段來自重組抗體文庫。重組抗體、抗體片段和/或Fab片段可以在真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物或酵母細(xì)胞)或原核細(xì)胞(例如，細(xì)菌)中表達(dá)。抗-MSRl的抗體、抗-MSRl抗體的抗體片段和/或Fab片段還可以通過體外技術(shù)產(chǎn)生。例如，可以產(chǎn)生、獲得或使用抗-MSRl的抗體、抗-MSRl抗體的抗體片段或Fab片段的文庫，其中抗體、抗體片段或Fab片段展示于噬菌體、細(xì)胞或核糖體?？贵w、抗體片段、Fab片段或其功能等效物可以結(jié)合于任意MSRl多肽或肽，包括任意哺乳動(dòng)物MSR1。例如，抗體、抗體片段、Fab片段或其功能等效物可以結(jié)合的哺乳動(dòng)物MSRl多肽和肽包括人、大鼠、小鼠、山羊、馬、犬、貓或鳥類的MSRl。在某些實(shí)施方式中，抗體、抗體片段、Fab片段或其功能等效物可以與SEQ ID NO : 1_9中任意一個(gè)所示的序列結(jié)
八 口 ο采用本發(fā)明所述方法進(jìn)行治療的哺乳動(dòng)物可以是人類，或家養(yǎng)動(dòng)物或動(dòng)物園的動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，疾病是自身免疫疾病，包括本文公開的任意自身免疫疾病。例如，自身免疫疾病可以是自身免疫性脫髓鞘神經(jīng)病變?nèi)缏匝仔悦撍枨识喟l(fā)性神經(jīng)病變(CIDP)或格林-巴利綜合癥(GBS)。在其它實(shí)施方式中，疾病是炎性疾病，包括本文公開的任意炎性疾病。盡管并未限定為特定作用機(jī)制，但是MSRl抑制劑在哺乳動(dòng)物中可以，例如將此前已活化的巨噬細(xì)胞去活化、抑制巨噬細(xì)胞活化、抑制巨噬細(xì)胞相互作用、抑制抗原提呈，和/或抑制細(xì)胞外粘附。有效抑制自身免疫疾病或炎性疾病的條件可以包括給予治療有效量的MSRl抑制齊U。這些治療有效量的MSRl抑制劑能夠?qū)⒋饲耙鸦罨木奘杉?xì)胞去活化、抑制巨噬細(xì)胞活化、抑制巨噬細(xì)胞相互作用、抑制抗原提呈，和/或抑制細(xì)胞外粘附。在某些實(shí)施方式中，治療有效量的MSRl抑制劑在哺乳動(dòng)物中減輕炎癥、減少脫髓鞘、減少軸突丟失和/或減少神經(jīng)元丟失。有效抑制自身免疫疾病或炎性疾病的發(fā)病或持續(xù)的條件還可以包括，在有效治療疾病或抑制所述疾病發(fā)病的給藥間隔內(nèi)給予MSRl抑制劑。例如，在某些實(shí)施方式中，抑制劑每日給予一次、兩次或三次。在其它實(shí)施方式中，抑制劑每周給予一次、兩次或三次，或者每月給予一次、兩次或三次。附圖的簡要說明為進(jìn)一步研究MSRl和AIF-I在疾病發(fā)病過程中的作用，發(fā)明人生產(chǎn)了抗-MSRl和抗-AIF-I的Fab抗體片段，并在大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(EAN)模型中檢測其作用。EAN是人自身免疫性脫髓鞘神經(jīng)病變的實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型。誘發(fā)EAN后，向大鼠給予抗-MSRl和抗-AIF-I的Fab抗體片段。圖I。EAN的臨床過程中，用特異性和非特異性抗體治療的效果。在第7天和第12天(箭頭指向)，向經(jīng)P2肽的完全弗氏佐劑(CFA)免疫以誘導(dǎo)EAN的動(dòng)物，腹腔注射給予Img MSRl或AIF-I特異性IgG的Fab片段，對(duì)于同型對(duì)照則給予正常山羊IgG(Fab)。各實(shí)驗(yàn)組均顯示了平均臨床評(píng)分。在第12-17天之間，未治療的EAN大鼠與經(jīng)抗-MSRl治療大鼠之間的疾病嚴(yán)重程度存在顯著性差異P < O. 05(*)。圖2。與未經(jīng)治療的EAN動(dòng)物相比，經(jīng)抗-MSRl治療的動(dòng)物的炎性單核細(xì)胞浸潤更少。蘇木精和伊紅染色的坐骨神經(jīng)的石蠟切片，坐骨神經(jīng)來自疾病過程第17天處死的代表性動(dòng)物圖 2A/D，未經(jīng)治療的 EAN(100X/400X);圖 2B/E，抗-MSRl 治療的 EAN(100X/400X)；圖2C/F，正常對(duì)照(100X/400X)。代表性的經(jīng)抗-AIF-I或抗-IgG治療的EAN坐骨神經(jīng)與未經(jīng)治療的EAN類似，數(shù)據(jù)未顯示。圖3。如用抗大鼠MSRl Fab片段免疫染色的人皮膚活檢石蠟切片所示，抗大鼠MSRl肽的抗-MSRl Fab抗體與人細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)。圖3A(200X)、3B和3D(400X)顯示了用抗-MSR IFab片段進(jìn)行免疫染色的人皮膚活檢石蠟切片，所述抗-MSR IFab片段用于對(duì)上述圖I和2中所描述的EAN研究中。圖3C(200X)顯示了用正常山羊IgG Fab抗體(陰性對(duì)照)染色的連續(xù)切片。發(fā)明詳沭在說明書的下文中，引用了作為本發(fā)明一部分的附圖，并通過舉例說明展示了可以實(shí)施的特定實(shí)施方式。對(duì)這些實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述以使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明，可以理解的是，可以利用其它實(shí)施方式，在不脫離本發(fā)明范圍的情況下，進(jìn)行結(jié)構(gòu)和 邏輯上的改變。因而，下文對(duì)示例性實(shí)施方式的描述并不是為了限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍由本發(fā)明的權(quán)利要求確定。本發(fā)明涉及在所需的哺乳動(dòng)物中抑制自身免疫疾病和炎性疾病的發(fā)病和/或治療所述疾病進(jìn)程的方法。能夠通過本發(fā)明的方法抑制或治療的自身免疫疾病和炎性疾病包括涉及巨噬細(xì)胞浸潤的疾病。在某些實(shí)施方式中，自身免疫疾病是自身免疫性脫髓鞘神經(jīng)病變。該方法涉及在有效抑制自身免疫疾病和/或炎性疾病發(fā)展的條件下，向哺乳動(dòng)物給予巨噬細(xì)胞清道夫受體I類(MSRl)的抑制劑。哺乳動(dòng)物可患有自身免疫疾病或炎性疾病，或易于患上此類自身免疫疾病或炎性疾病。如本文所使用的，MSRl抑制劑抑制哺乳動(dòng)物的自身免疫疾病和/或炎性疾病的發(fā)病和/或治療。因此，抑制劑是疾病抑制劑，并且在某些實(shí)施方式中，抑制劑可能并不直接抑制MSRl的功能。相反，抑制劑與MSRl結(jié)合，進(jìn)而有效地治療和/或抑制疾病。在其它實(shí)施方式中，抑制劑以抑制MSRl功能的方式與MSRl相互作用并結(jié)合至MSRl。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，抑制劑是抗-MSRl的抗體或其Fab片段。此類抗體可以是單克隆或多克隆抗體，抗體片段，或此類抗體和/或片段的功能等效物。哺乳動(dòng)物可以是人或家養(yǎng)或動(dòng)物園動(dòng)物。所患疾病可以被抑制或治療的哺乳動(dòng)物的例子包括家兔、大鼠、小鼠、馬、牛、山羊、靈長類或人。在某些實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物是人。巨噬細(xì)胞清道夫受體I類(MSRl)MSRl是一種在巨噬細(xì)胞上表達(dá)的多配體受體(Usui等，Diabetes 56 =363(2007)；Husemann 等，Glia 40:195(2002) ;Platt 等，J. Clin. Invest. 108:649(2001))。MSRl 也被稱為SR-AI/II、⑶204、A類清道夫受體，成員I。它是在巨噬細(xì)胞和某些肥大細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的跨膜受體。細(xì)胞外膠原區(qū)域含有配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。MSRl識(shí)別多種內(nèi)源性配體，其中某些內(nèi)源性配體與抗原、乙酰化低密度脂蛋白(LDL)、β -淀粉樣蛋白、晚期糖基化終產(chǎn)物、細(xì)胞外基質(zhì)，和凋亡細(xì)胞的疾病和病癥有關(guān)。可以從本領(lǐng)域，例如NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得不同類型和種屬M(fèi)SRl多肽的氨基酸序列的示例。參見網(wǎng)站ncbi. nlm. nih. gov。因而,例如，NCBI數(shù)據(jù)庫提供了人巨曬細(xì)胞清道夫受體I類(MSRl)的氨基酸序列，其登記號(hào)為P21757. l(gi :127357)。在下文中將該序列簡稱為 SEQ ID NO loI MEQffDHFHNQ QEDTDSCSES VKFDARSMTA LLPPNPKNSP41 SLQEKLKSFK AALIALYLLV FAVLIPLIGI VAAQLLKffET81 KNCSVSSTNA NDITQSLTGK GNDSEEEMRF QEVFMEHMSN121 MEKRIQHILD MEANLMDTEH FQNFSMTTDQ RFNDILLQLS161 TLFSSVQGHG NAIDEISKSL ISLNTTLLDL QLNIENLNGK
201 IQENTFKQQE EISKLEERVY NVSAEIMAMK EEQVHLEQEI241 KGEVKVLNNI TNDLRLKDffE HSQTLRNITL IQGPPGPPGE281 KGDRGPTGES GPRGFPGPIG PPGLKGDRGA IGFPGSRGLP321 GYAGRPGNSG PKGQKGEKGS GNTLTPFTKV RLVGGSGPHE361 GRVEILHSGQ WGTICDDRWE VRVGQVVCRS LGYPGVQAVH401 KAAHFGQGTG PIffLNEVFCF GRESSIEECK IRQffGTRACS441 HSEDAGVTCT L該MSRl多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO : I所示序列的氨基酸77-451。在下文中將該序列簡稱為SEQ ID NO :2。77KffET81 KNCSVSSTNA NDITQSLTGK GNDSEEEMRF QEVFMEHMSN121 MEKRIQHILD MEANLMDTEH FQNFSMTTDQ RFNDILLQLS161 TLFSSVQGHG NAIDEISKSL ISLNTTLLDL QLNIENLNGK201 IQENTFKQQE EISKLEERVY NVSAEIMAMK EEQVHLEQEI241 KGEVKVLNNI TNDLRLKDffE HSQTLRNITL IQGPPGPPGE281 KGDRGPTGES GPRGFPGPIG PPGLKGDRGA IGFPGSRGLP321 GYAGRPGNSG PKGQKGEKGS GNTLTPFTKV RLVGGSGPHE361 GRVEILHSGQ WGTICDDRWE VRVGQVVCRS LGYPGVQAVH401 KAAHFGQGTG PIffLNEVFCF GRESSIEECK IRQffGTRACS441 HSEDAGVTCT L如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在包括MSRl多肽的人類多肽中，可能存在序列變異。因而，至少存在MSRl的三種同種型。通過對(duì)該基因的選擇性剪接可以產(chǎn)生這三種不同的同種型。這些受體或同種型是巨噬細(xì)胞特異性的三聚體整合膜糖蛋白。I型和2型同種型是功能性受體，其能夠介導(dǎo)修飾的低密度脂蛋白(LDL)的內(nèi)吞。盡管3型同種型具有I型和2型同種型中介導(dǎo)此功能的結(jié)構(gòu)域，但是3型同種型并不內(nèi)化修飾的LDL(乙?；?LDL)。其具有不同的細(xì)胞內(nèi)加工并且被捕獲在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，導(dǎo)致其不能進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)化。當(dāng)共表達(dá)時(shí)，3型同種型能夠抑制I型和2型同種型的功能，這表明存在顯著的負(fù)效應(yīng)并且提示存在一種在巨噬細(xì)胞中調(diào)節(jié)清道夫受體活性的機(jī)制。例如，MSRlI型和II型同種型的I型的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的登記號(hào)為NP_619729. l(gi :20357512)。在下文中將該序列簡稱為 SEQ ID NO :3。I MEQffDHFHNQ QEDTDSCSES VKFDARSMTA LLPPNPKNSP41 SLQEKLKSFK AALIALYLLV FAVLIPLIGI VAAQLLKffET
81 KNCSVSSTNA NDITQSLTGK GNDSEEEMRF QEVFMEHMSN121 MEKRIQHILD MEANLMDTEH FQNFSMTTDQ RFNDILLQLS161 TLFSSVQGHG NAIDEISKSL ISLNTTLLDL QLNIENLNGK201 IQENTFKQQE EISKLEERVY NVSAEIMAMK EEQVHLEQEI241 KGEVKVLNNI TNDLRLKDffE HSQTLRNITL IQGPPGPPGE281 KGDRGPTGES GPRGFPGPIG PPGLKGDRGA IGFPGSRGLP321 GYAGRPGNSG PKGQKGEKGS GNTLTPFTKV RLVGGSGPHE 361 GRVEILHSGQ WGTICDDRWE VRVGQVVCRS LGYPGVQAVH401 KAAHFGQGTG PIffLNEVFCF GRESSIEECK IRQffGTRACS441 HSEDAGVTCT LMSRl的2型同種型的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的登記號(hào)為NP_002436. I (gi 4505259)。在下文中將該序列簡稱為SEQ ID NO :4。I MEQffDHFHNQ QEDTDSCSES VKFDARSMTA LLPPNPKNSP41 SLQEKLKSFK AALIALYLLV FAVLIPLIGI VAAQLLKffET81 KNCSVSSTNA NDITQSLTGK GNDSEEEMRF QEVFMEHMSN121 MEKRIQHILD MEANLMDTEH FQNFSMTTDQ RFNDILLQLS161 TLFSSVQGHG NAIDEISKSL ISLNTTLLDL QLNIENLNGK201 IQENTFKQQE EISKLEERVY NVSAEIMAMK EEQVHLEQEI241 KGEVKVLNNI TNDLRLKDffE HSQTLRNITL IQGPPGPPGE281 KGDRGPTGES GPRGFPGPIG PPGLKGDRGA IGFPGSRGLP321 GYAGRPGNSG PKGQKGEKGS GNTLRPVQLT DHIRAGPS此外，在某些實(shí)施方式中，給予直接針對(duì)來自非人種屬的MSRl多肽的抗體可能是有用的。小鼠MSRl氨基酸序列的一個(gè)例子為登記號(hào)為NP_001106797. l(gi :164664520)的序列。在下文中將該序列簡稱為SEQ ID N0:5。I MTKEMTENQR LCPHEQEDAD CSSESVKFDA RSMTASLPHS41 TKNGPSLQEK LKSFKAALIA LYLLVFAVLI PVVGIVTAQL81 LNWEMKNCLV CSLNTSDTSQ GPMEKENTSK VEMRFTIIME121 HMKDMEERIE SISNSKADLI DTERFQNFSM ATDQRLNDIL161 LQLNSLISSV QEHGNSLDAI SKSLQSLNMT LLDVQLHTET201 LNVRVRESTA KQQEDISKLE ERVYKVSAEV QSVKEEQAHV241 EQEVKQEVRV LNNITNDLRL KDffEHSQTLK NITFIQGPPG281 PQGEKGDRGL TGQTGPPGAP GIRGIPGVKG DRGQIGFPGG321 RGNPGAPGKP GRSGSPGPKG QKGEKGSVGG STPLKTVRLV361 GGSGAHEGRV EIFHQGQffGT ICDDRWDIRA GQVVCRSLGY401 QEVLAVHKRA HFGQGTGPIff LNEVMCFGRE SSIENCKINQ441 WGVLSCSHSE DAGVTCTSMSRl多肽序列的其它例子可以見于NCBI數(shù)據(jù)庫中。例如，有用的MSRl核酸和多肽序列包括用以下登記號(hào)表示的那些序列NM_001191939(RNA)，ΧΡ_001065601 (蛋白)；
NM_138715(RNA)，NP_619729(蛋白);NM_002436 (RNA)，NP_002436 (蛋白)；以及NM_001113326(RNA)，NP_001106797 (蛋白)。用上述登記號(hào)表示的多肽能夠用于制備抗原肽，所述抗原肽可用于產(chǎn)生抗-MSRl的抗體。來自上述多肽序列的抗原肽的例子包括下列所述。大鼠MSRl (SEQ ID NO 6) RSGFPGPKGQKGEKGRAG(aa 328-345)人MSR1，I (SEQ ID NO 7) RPGNSGPKGQKGEKGSGN(aa 325-342)A MSRl, II (SEQ ID NO 8) RPGNSGPKGQKGEKGSGN(aa 325-342)小鼠MSRl (SEQ ID NO 9) RSGSPGPKGQKGEKGSVG (aa 332-349) 根據(jù)本發(fā)明，直接針對(duì)MSRl多肽的抗體，以及此類抗體的功能等效物可用于治療自身免疫疾病和炎性疾病。因此，MSRl多肽和MSRl多肽的片段，包括MSRl和MSRl表位的抗原片段，可以用于產(chǎn)生抗-MSRl抗體。能夠用于產(chǎn)生抗-MSRl抗體的此類多肽的例子包括SEQ ID NO :1-5所示序列的任意一個(gè)。而且，MSRl片段和抗原肽，包括MSRl多肽的任意細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，能夠用于產(chǎn)生抗-MSRl抗體。能夠用于產(chǎn)生抗-MSRl抗體的MSRl片段和抗原肽的例子包括SEQ ID N0:2、6、7、8和9所示的序列。能夠用于本文所述方法的抗體的功能等效物包括嵌合抗體、修飾抗體、人源化抗體、重組抗體和/或這些抗體、嵌合抗體、修飾抗體、人源化抗體和/或重組抗體的片段。嵌合抗體包括非人類抗體的可變區(qū)。人源化抗體包括非人類抗體的高可變區(qū)(CDR)。人源化抗體除高可變區(qū)外的可變區(qū)，例如框架可變區(qū)，和恒定區(qū)均為人類抗體。修飾抗體能夠去免疫化，使其對(duì)給定種屬例如人的免疫原性低于未經(jīng)修飾的對(duì)應(yīng)物的免疫原性?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的多種方法制備人類抗體，包括免疫已轉(zhuǎn)染人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(Hudson P and Souriau C, Nature Medicine 9:129(2003))?？梢杂哨噙|菌體展不文庫或mRNA(核糖體)展示文庫通過分子克隆、產(chǎn)生多樣性和提高的親和性，以及體外系統(tǒng)中的蛋白表達(dá)，產(chǎn)生工程化的重組人抗體(MacCafferty J等，Nature348 :552(1990);見綜述Benhar I, Expert Opin. Biol. Ther. 7 :763 (2007)和 Li J and Zhu Z, Acta Pharmacol.Sin. 31 :1198(2010))?？贵w或抗體的功能等效物以親和性和/或特異性與MSRl相互作用，例如結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，抗-MSRl抗體和/或此類抗體的功能等效物以高親和性和/或高選擇性與MSRl結(jié)合。例如?？贵w或功能等效物能夠以至少IO7M4的親和常數(shù)與人MSRl結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，抗體或功能等效物能夠以IO8M-1和IOwM-1之間或約IO9M-1的親和常數(shù)與人MSRl結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，抗體或其功能等效物也可以與MSRl的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，最優(yōu)選人MSRl的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，相互作用或結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，抗體或其片段為重組或修飾的抗-MSRl抗體，其選自，例如嵌合抗體、人源化抗體、去免疫化抗體或體外產(chǎn)生的抗體或其片段。對(duì)于本申請的目的而言，合適的非人類抗體可變區(qū)和高可變區(qū)可以來自任意非人類哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的抗體，單克隆抗體產(chǎn)生于所述非人類哺乳動(dòng)物。人以外的合適的哺乳動(dòng)物的例子包括，例如家兔、大鼠、小鼠、馬、山羊、美洲駝或靈長類。優(yōu)選小鼠?？梢岳帽绢I(lǐng)域任意公知的方法將抗體人源化或去免疫化。
功能等效物進(jìn)一步包括抗體片段，其結(jié)合特性與完整抗體相同或相當(dāng)。此類片段可以，例如，包含F(xiàn)(ab' )2片段的一個(gè)或兩個(gè)Fab片段。優(yōu)選地，抗體片段包含整個(gè)抗體的全部六個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)，抗體片段也包括功能片段，所述功能片段包含少于全部此類片段，如三個(gè)、四個(gè)、或五個(gè)⑶R。優(yōu)選的片段為單鏈抗體，或Fv片段。單鏈抗體是至少包含抗體重鏈可變區(qū)的多肽，該抗體重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)連接，可以帶有或不帶互相連接的連接子。因而，F(xiàn)v片段包含整個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。這些鏈可以在細(xì)菌或真核細(xì)胞中生產(chǎn)。抗體和功能等效物可以是任意分類免疫球蛋白成員，如IgG、IgM、IgA、IgD，或IgE,及其亞類。Fab片段也可以來自任意此類免疫球蛋白，并且功能等效物也可以是任意上述免疫球蛋白分類和亞類的等效物或組合。本發(fā)明的抗體能夠與MSRl結(jié)合，并且可以具有抑制其活性的功能。此類抗體可能具有潛在治療作用，特別是通過抑制巨噬細(xì)胞的功能治療自身免疫性疾病。 本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體或其功能等效物。本發(fā)明的抗體能夠與MSRl結(jié)合，并且可以具有抑制其活性的功能。此類抗體可能具有潛在治療作用，特別是通過抑制MSRl的功能治療自身免疫性脫髓鞘神經(jīng)病變或涉及巨噬細(xì)胞浸潤的其它自身免疫疾病?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體。該程序包括從哺乳動(dòng)物(例如，小鼠)的脾臟中獲得免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)，該哺乳動(dòng)物已在體內(nèi)或體外被目標(biāo)抗原免疫。然后將分泌抗體的淋巴細(xì)胞與(小鼠)骨髓瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞融合，其能夠在細(xì)胞培養(yǎng)過程中無限復(fù)制，由此產(chǎn)生永生化的分泌免疫球蛋白的細(xì)胞系。培養(yǎng)得到的融合細(xì)胞或雜交瘤，篩選得到集落，以生產(chǎn)所需的單克隆抗體?？寺‘a(chǎn)生此類抗體的集落，使其在體內(nèi)或體外生長，以生產(chǎn)大量抗體。對(duì)此類細(xì)胞融合的理論基礎(chǔ)和實(shí)施方法學(xué)的描述參見Kohler等.，Nature 256 :495 (1975)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。用全長天然抗原或代表全長抗原的一個(gè)或多個(gè)表位的肽對(duì)動(dòng)物(例如，小鼠)進(jìn)行體內(nèi)免疫，從而免疫哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞。如有必要，在至多數(shù)周時(shí)間間隔內(nèi)重復(fù)進(jìn)行此類免疫，以獲得足夠的抗體滴度。在末次抗原加強(qiáng)后，處死動(dòng)物并取脾細(xì)胞?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)的和公知的技術(shù)實(shí)現(xiàn)與哺乳動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞的融合，或與其它在細(xì)胞培養(yǎng)中具有無限復(fù)制能力的融合伴侶的融合，例如通過使用聚乙二醇(“PEG”)或其它融合劑(Kohler G and Milstein C.，Eur. J. Tmmunol. 6 :511 (1976),其整體通過引用并入本文)。該永生化細(xì)胞系，應(yīng)選擇為缺乏利用某些營養(yǎng)物質(zhì)所必需的酶，能夠迅速生長并且具有良好的融合能力的細(xì)胞系，該永生化細(xì)胞系優(yōu)選鼠源性的，但也可以使用來自其它哺乳動(dòng)物種屬的細(xì)胞，其它哺乳動(dòng)物種屬包括但不限于大鼠和人。此類細(xì)胞中的多數(shù)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，其它細(xì)胞也經(jīng)常被描述。單克隆抗體也可以通過篩選重組組合文庫獲得，例如抗體噬菌體展示文庫。參JAL f歹lj女口，Phage ^isplay 八 Laboratory ^anual Bcirbcis ，Gels. Co I d Spring Hcirbor LciborcitoryPress,冷泉港，紐約，2001 ;和 Kontermann &Diibel, Antibody Engineeeing, Heidelberg Springer-Verlag.柏林，2001。編碼抗-MSRl抗體的核酸可以來自經(jīng)MSRl多肽、表位或抗原肽免疫的動(dòng)物，通過使用動(dòng)物B細(xì)胞或血漿細(xì)胞的RNA獲得表達(dá)文庫，然后篩選編碼抗體的序列來產(chǎn)生編碼抗-MSRl 抗體的核酸。參見，例如，Antibodies, A Laboratory Manual by Harlow andLane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,冷泉港，紐約，1988,和Molecular Cloning,A Laboratory Manual by Sambrook,等· , Cold Spring Harbor Laboratory Press,冷泉港，紐約，(1989)，上述公開的內(nèi)容通過引用并入本文。簡言之，可以使用免疫細(xì)胞，該免疫細(xì)胞對(duì)特定抗原(如單核細(xì)胞)敏感，或?qū)碜杂肕SRl多肽、表位或抗原肽免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞敏感。根據(jù)Barbas等.，Proc.Natl. Acad. Sci.，USA 88 :7978-7982 (1991);以及美國專利號(hào) 5，580，717 ;5，972，656 ；6，113，898 ;和6，140, 470中所描述的噬菌體展示技術(shù)處理細(xì)胞。這些文件公開的內(nèi)容通過引用并入本文。從細(xì)胞中分離總RNA，可以對(duì)RNA進(jìn)行處理以獲得聚腺苷酸化RNA(p0ly-ARNA)。經(jīng)寡d (T)引物雜交后，逆轉(zhuǎn)錄RNA (mRNA)以產(chǎn)生相應(yīng)的cDNA。將該cDNA用于分離編碼本發(fā)明抗體的核酸?？梢酝ㄟ^聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得編碼本發(fā)明抗體的核酸。在PCR中使用選定的引物，以分離核酸，該核酸編碼多肽片段，例如VH、'、以及恒定區(qū)。通過使用本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)能夠?qū)DNA或PCR產(chǎn)物插入載體，例如噬菌 體、噬菌?；蛸|(zhì)粒。參見，Sambrook等.(1989)?？梢詫⒑衏DNA或PCR產(chǎn)物的載體引入細(xì)菌以生成表達(dá)文庫，其成員表達(dá)cDNA或PCR產(chǎn)物編碼的多肽，例如全長輕鏈或重鏈多肽、單鏈可變多肽、或單鏈Fab或Fab’。該方法還能夠用于生產(chǎn)融合至噬菌體衣殼蛋白的多肽。可以按照上述參考文獻(xiàn)和專利中所描述的對(duì)重組噬菌體文庫進(jìn)行篩選，以選擇表達(dá)與E2糖蛋白或E1E2復(fù)合物特異性結(jié)合抗體的文庫成員?？梢酝ㄟ^將文庫與免疫抗原結(jié)合、除去未結(jié)合的噬菌體、然后除去結(jié)合的曬菌體完成篩選。宿主細(xì)菌細(xì)胞如E. coli或其它合適的細(xì)菌，可以用表達(dá)與選定的MSRl多肽、表位或抗原結(jié)合的抗體的噬菌體文庫成員轉(zhuǎn)染?？梢酝ㄟ^連續(xù)稀釋和鋪板將得到的細(xì)菌細(xì)胞分離成集落，這樣各集落單獨(dú)表達(dá)其獨(dú)特的抗體。噬菌體還可以攜帶選擇性標(biāo)記，如抗生素抗性基因，這樣通過在含有所述抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞文庫，可以鑒定出表達(dá)本發(fā)明抗體的宿主細(xì)菌細(xì)胞。通過用MSRl多肽、表位或抗原肽進(jìn)行結(jié)合檢測，對(duì)來自單一集落的培養(yǎng)物進(jìn)行檢測，以鑒定出表達(dá)具有特定免疫反應(yīng)性抗體的集落。在對(duì)表達(dá)具有特定免疫反應(yīng)性的抗體的細(xì)菌集落進(jìn)行選擇后，可以采用已知的核苷酸測序方法，確定選定的培養(yǎng)物中編碼CDR、框架區(qū)，或者可變區(qū)或恒定區(qū)的核酸序列。因此，可以從噬菌體文庫獲得編碼本發(fā)明抗體CDR序列、框架序列和/或恒定區(qū)的核酸?？梢愿鶕?jù)Sastry 等.，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 86 :5728 (1989)和 Barbas等·，Phage Display Laboeatoey Ma NUAL. New York Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中的描述，對(duì)來自源單核細(xì)胞mRNA的Fd和κ區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用mRNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA和用于重鏈序列或輕鏈序列擴(kuò)增的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。信使RNA(mRNA)的PCR擴(kuò)增可以用于克隆和表達(dá)來自B細(xì)胞的重鏈序列(例如，F(xiàn)d片段的擴(kuò)增)和K輕鏈序列，用在擴(kuò)增產(chǎn)物末端摻入限制性位點(diǎn)的寡核苷酸從單核細(xì)胞分離信使RNA (mRNA)。用于這些擴(kuò)增的寡核苷酸引物與已成功用于Vh和'序列擴(kuò)增的那些引物類似(參見 Sastry 等.，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. ,86, 5728 (1989)和 Barbas 等.，Phage Display :A Laboeatoey Manual. New York Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001))。具有代表性的，在這些引物中并入限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列，以使得擴(kuò)增片段克隆至適當(dāng)載體(即，噬菌?；颚耸删w)的預(yù)定閱讀框，以用于表達(dá)。噬菌體通過類似擠出的過程通過細(xì)菌膜進(jìn)行組裝。例如，絲狀噬菌體Μ13可以用于此過程。該噬菌體具有406個(gè)殘基的微小噬菌體衣殼蛋白(cpIII)，其在擠出前表達(dá)并在E. coli外周胞質(zhì)的內(nèi)膜側(cè)蓄積。cpIII的兩個(gè)功能性質(zhì)，即感染性和正常(非多聚噬菌體)形態(tài)發(fā)生，大致分配于該基因的第一和第二部分。cpIII的N-末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合至F'菌毛，使得其感染E. coli，而膜結(jié)合的C-末端結(jié)構(gòu)域P198-S406起形態(tài)發(fā)生的作用，即根據(jù)載體聚合模型在絲狀體尾部末端加帽?？梢酝ㄟ^構(gòu)建噬菌粒載體將抗體片段鏈如Fab、Fab’或Fd鏈與cpIII的C-末端結(jié)構(gòu)域融合(參見 Barbas 等·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :7978 (1991))?？梢允褂萌狈τ行蚨?jí)結(jié)構(gòu)的柔性五氨基酸鏈(GGGGS ；SEQ ID NO :13)將已表達(dá)的片段鏈和cpIII結(jié)構(gòu)域間隔開，以最小化相互作用。還可以構(gòu)建噬菌粒載體，使之包含編碼Fab片段輕鏈的核 苷酸。可以在單獨(dú)的Iac啟動(dòng)子/操縱子序列的控制下放置cpIII/Fd片段融合蛋白和輕鏈蛋白，并通過PelB前導(dǎo)序列將其引導(dǎo)至外周胞質(zhì)區(qū)，以便在膜上進(jìn)行功能性組裝。載體中包含的噬菌體Fl基因間隔區(qū)可以使單鏈?zhǔn)删Ｔ谳o助噬菌體的幫助下進(jìn)行包裝。使用輔助噬菌體過度感染，可以引起兩種形式的cpIII的表達(dá)。cpIII/Fd片段融合蛋白與輔助噬菌體的天然cpIII之間會(huì)為了整合入病毒粒而競爭，因此使得正常噬菌體的形態(tài)發(fā)生紊舌L。得到的經(jīng)包裝的噬菌?？梢詳y帶天然cpIII，其對(duì)于感染是必要的，以及包括Fab片段的融合蛋白，其被展示并用于與抗原發(fā)生相互作用以及用于選擇。在噬菌粒方法中有必要在C-末端結(jié)構(gòu)域融合cpIII，因?yàn)榕c感染性N-末端結(jié)構(gòu)域的融合將使得宿主細(xì)胞對(duì)感染具有抗性。結(jié)果為獲得展示抗體結(jié)合位點(diǎn)(“Phabs”)的噬菌體。抗體結(jié)合位點(diǎn)，例如Fab片段，展不于卩遼菌體的衣殼。此項(xiàng)技術(shù)可以用于在絲狀曬菌體如M13的卩遼菌體外殼上生產(chǎn)Phabs，其展示重組產(chǎn)生的Fab片段，例如與抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的重組產(chǎn)生的Fab片段。已有關(guān)于在絲狀噬菌體表面展示抗體Fab片段的噬菌粒載體(B卩，pComb3或pComb3H)的描述(參見 Barbas 等·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :7978 (1991))。pComb3和pComb3H中包含了用于克隆重鏈Fd序列的Xho I和Spe I位點(diǎn)，其中重鏈Fd序列經(jīng)PCR擴(kuò)增。還提供了用于克隆抗體輕鏈的Sac I和Xba I位點(diǎn)，其中抗體輕鏈經(jīng)PCR擴(kuò)增。這些克隆位點(diǎn)與已知的小鼠和人PCR引物相容(參見，例如Huse等.，Science 246 1275-1281(1989))。pelB前導(dǎo)序列的核苷酸序列從λ HC2和λ LC2構(gòu)建體中募集，如上文所述的Huse等中所描述,并保留了閱讀框。用Spe I和Nhe I對(duì)編碼選定Fab的pComb 3和pComb3H進(jìn)行消化，以除去基因III片段，其包括編碼抗體Fab片段的核苷酸序列。因?yàn)镾pe I和Nhe I產(chǎn)生相容的粘性末端，所以經(jīng)消化的載體還可以重新連接，以產(chǎn)生能生成可溶性Fab的噬菌粒。可以通過對(duì)含有噬菌粒的細(xì)胞(例如，感染的E. coli XL-I藍(lán)菌株)感染過夜，以生產(chǎn)Phabs，其產(chǎn)生的典型滴度為10ncfU/ml。通過使用編碼不同抗生素抗性的噬菌粒，在選擇性板上根據(jù)滴度可以容易地確定不同克隆的噬菌體的比率。在單通道濃縮實(shí)驗(yàn)中，可以用抗原-包被的板孵育克隆的混合噬菌體。通過洗滌除去非特異性噬菌體，然后可以使用酸洗脫分離結(jié)合的噬菌體。本發(fā)明的方法中使用的抗體或抗體片段還可以是多克隆抗體或其片段。
制備多克隆抗體的程序也是已知的。一般地，可以通過皮下給予動(dòng)物天然抗原或其肽(例如，與半抗原偶聯(lián)的合成肽)生產(chǎn)此類抗體。能夠用于生產(chǎn)多克隆抗體的動(dòng)物包括小鼠、大鼠、山羊、新西蘭白兔、馬、猴和其它動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，首先對(duì)動(dòng)物進(jìn)行取血以獲得免疫前血清?？梢愿鶕?jù)選定動(dòng)物的種屬注射適當(dāng)體積的抗原。例如，家兔每個(gè)位點(diǎn)和多個(gè)位點(diǎn)(例如，六個(gè)不同位點(diǎn))可以注射的總體積為約lOOul。注射材料的一個(gè)例子可以是含有有效佐劑如弗氏完全佐劑的抗原乳劑。在首次注射約兩周后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行取血，并使用相同的抗原定期加強(qiáng)，例如在六周內(nèi)注射約三次。然后在各次加強(qiáng)注射后約10天收集血清樣品。再從血清中回收多克隆抗體?？梢酝ㄟ^使用相應(yīng)抗原的親和層析，通過抗原捕獲抗體回收多克隆抗體。最后，將動(dòng)物安樂死。例如，靜脈注射150mg/Kg戊巴比妥使家兔安樂死。用于制備多克隆抗體的該方法和其它方法，包括在其它種屬如山羊中制備，已在Harlow 等，editors, Antibodies :A Laboratory Manual (1988)中公開，其全部內(nèi)容通過引用并入本文?？梢栽谵D(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中，特別是經(jīng)過遺傳修飾以表達(dá)人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠中，生產(chǎn)基本是人類的抗體。制備嵌合抗體和人源化抗體的方法也是本領(lǐng)域所公知。 例如，制備嵌合抗體的方法包括在美國專利號(hào)4，816，397和4，816，567中所描述的方法，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。制備人源化抗體的方法在美國專利號(hào)5，225，539中有描述，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。用于抗體人源化的一種方法稱為CDR-移植。在CDR-移植中，將與抗原結(jié)合直接相關(guān)的小鼠抗體區(qū)域，即CDR的互補(bǔ)決定區(qū)，移植至人可變區(qū)，構(gòu)建出“改造的”人可變區(qū)。然后將這些完全人源化的可變區(qū)與人恒定區(qū)連接，以構(gòu)建完整的“完全人源化”抗體。為構(gòu)建能夠與抗原較好結(jié)合的完全人源化抗體，需要仔細(xì)設(shè)計(jì)改造的人可變區(qū)。仔細(xì)選擇將要移植入人可變區(qū)的CDR。可以在人可變區(qū)的框架區(qū)(FR)的不同位置改變少量氨基酸。例如，改造的人可變區(qū)可以在選定人輕鏈可變區(qū)的FR內(nèi)有至多十個(gè)氨基酸的改變，以及在選定人重鏈可變區(qū)的FR內(nèi)有至多十二個(gè)氨基酸的改變。分別將編碼這些改造的人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的DNA序列，與編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因，優(yōu)選Yl和κ，的DNA序列連接。然后在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)改造的人源化抗體，并將其針對(duì)靶點(diǎn)的親和性與相應(yīng)的鼠源性抗體和嵌合抗體比較。選擇將被取代的人源化抗體殘基以及制備取代物的方法均為本領(lǐng)域的公知常識(shí)。參見，例如，Co 等·，Nature 351 :501-502 (1991) ；Queen 等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 :10029-1003(1989)和 Rodrigues 等· ,Int. J. Cancer，副刊 7 :45-50 (1992)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。對(duì)225抗EGFR單克隆抗體進(jìn)行人源化和改造的方法，作為一個(gè)例子，在TO 96/40210中有相關(guān)描述，其全部內(nèi)容通過引用并入本文?？梢詫⒃摲椒ㄓ糜卺槍?duì)其它蛋白的抗體人源化和改造。制備單鏈抗體的方法也是本領(lǐng)域的公知常識(shí)。一些例子包括歐洲專利申請?zhí)?02812和Wels等.，Int. J. Cancer 60:137-144(1995)中所描述，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。也可以通過篩選噬菌體展示文庫制備單鏈抗體。用于生產(chǎn)抗體的功能等效物的其它方法已在WO 93/21319、歐洲專利申請?zhí)?39 400、WO 89/09622、歐洲專利申請?zhí)?38 745、美國專利號(hào)5，658，570、美國專利號(hào)5，693，780、和歐洲專利申請?zhí)?32 424中公開，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。給予MSRl抑制劑在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，通過全身或局部向?qū)ο蠼o予抑制劑(例如，抗體或其片段)實(shí)施給藥步驟?？梢越o予單一抑制劑或抑制劑的組合。因此，例如，可以口服、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔(ip)、靜脈、皮下、或鼻腔給予抑制劑。本發(fā)明的抑制劑可以單獨(dú)給予或與適宜的藥物載體一同給予，其可以是固體或液體形式，如使用片劑、膠囊、粉末、溶液、混懸液，或乳劑。因此，在某些實(shí)施方式中，抑制劑以包含在組合物中的形式提供，組合物例如，藥物組合物。在有效抑制自身免疫疾病或炎性疾病的條件下給予抑制劑，在本文所述的治療方法的相關(guān)描述中，涉及的條件，如時(shí)間、抑制劑的量、抑制劑的濃度等，均是普通醫(yī)務(wù)人員根據(jù)優(yōu)化治療和/或抑制所述疾病發(fā)病的需要可以確定和改變的。
一般給予例如有效量(例如，治療有效量)的抑制劑。有效量的抑制劑能夠，例如足以在哺乳動(dòng)物中減輕炎癥、減少脫髓鞘、減少軸突丟失和/或減少神經(jīng)元丟失。在某些實(shí)施方式中，有效量的抑制劑在哺乳動(dòng)物中使此前已活化的巨噬細(xì)胞去活化、抑制巨噬細(xì)胞活性、抑制抗原提呈和/或抑制細(xì)胞外粘附。抑制劑的有效量的例子包括抑制劑的劑量范圍為約O. 005 μ g/kg至約100mg/kg，或范圍為約O. 01 μ g/kg至約60mg/kg。本文所描述的抑制劑所需有效量的另一個(gè)例子為約O. 5 μ g 至約 750mg。還可以在有效治療和/或抑制疾病的間隔內(nèi)給予抑制劑。在某些實(shí)施方式中，抑制劑每日給予若干次(例如，每日兩次或三次)。在其它實(shí)施方式中，抑制劑每日給予一次，隔日給予一次、每周給予兩次或每周給予一次。在另外的實(shí)施方式中，抑制劑每月給予兩次或每月給予一次。抑制劑的給藥間隔根據(jù)抑制劑的半衰期不同而不同。因此，例如，基于抗體的抑制劑的半衰期范圍可以從單結(jié)構(gòu)域抗體和scFv的數(shù)分鐘至多個(gè)IgG分子的數(shù)周。但是，可以對(duì)治療抑制劑，包括治療抗體或抗體片段的半衰期進(jìn)行調(diào)整，以幫助或優(yōu)化其對(duì)疾病的治療和/或抑制。例如，在某些實(shí)施方式中，通過與聚乙二醇(PEG)、IgG或血清白蛋白來調(diào)節(jié)抑制劑(包括抗體或抗體片段抑制劑)的半衰期。采用本領(lǐng)域已知的方法可以很容易地進(jìn)行此類連接。治療或抑制的自身免疫性疾病包括脫髓鞘神經(jīng)病變，如慢性炎性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)病變(CIDP)和格林-巴利綜合癥(GBS);影響腦的自身免疫疾病，如多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎、急性脫髓鞘腦脊髓炎(ADEM);肌肉的自身免疫疾病，如多肌炎和皮肌炎；胃腸道的自身免疫疾病，如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性膽管炎、和慢性活動(dòng)性肝炎；血管系統(tǒng)的自身免疫疾病，如血管炎、顳動(dòng)脈炎、變應(yīng)性肉芽腫血管炎、肉芽腫血管炎和大動(dòng)脈炎；腎臟系統(tǒng)的自身免疫疾病，如IgA腎病、自身免疫性腎炎和肺出血性腎炎綜合癥；關(guān)節(jié)的自身免疫疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎和風(fēng)濕性多肌痛；皮膚的自身免疫疾病，如大皰性類天皰瘡、特應(yīng)性皮炎、斑禿、牛皮癬和天皰瘡；肺部系統(tǒng)的自身免疫疾病，如哮喘、肺纖維化、肺動(dòng)脈高壓、肺泡炎和肉狀瘤；內(nèi)分泌系統(tǒng)的自身免疫疾病，如青少年糖尿病、艾迪生氏病、橋本氏甲狀腺炎，以及造血系統(tǒng)的自身免疫疾病，如再生障礙性貧血和特發(fā)性血小板減少；以及影響若干系統(tǒng)的自身免疫疾病如紅斑狼瘡、修格蘭氏綜合癥和白塞氏病。
本發(fā)明的方法能有效起作用的其它退行性/炎性疾病包括糖尿病神經(jīng)病變、腎病、微血管炎導(dǎo)致的視網(wǎng)膜病、以及中風(fēng)；肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS) ;HIV-1神經(jīng)病變或腦病、以及亨廷頓舞蹈病，已證實(shí)巨噬細(xì)胞參在這些疾病中起作用。此外，下述疾病可能與MSRl抗體增加有關(guān)，表明可以使用本發(fā)明的方法對(duì)其進(jìn)行治療硬皮病、多器官功能障礙綜合癥、急性冠脈綜合癥、阿爾茨海默氏癥、和牙齦卟啉單胞菌。發(fā)明人此前已報(bào)道了在慢性炎性脫髓鞘神經(jīng)病變(CIDP)患者的腓腸神經(jīng)和皮膚中，MSRl和AIF-1(同種異體移植炎性因子I)的表達(dá)量升高(Renaud等，J. Neuroimmunol. 159 :203(2005) ;Lee 等· , J. Neurol. Sci.，290 :115(2010))。CIDP 是一種髓鞘靶向，特別是外周神經(jīng)靶向，的自身免疫疾病，其導(dǎo)致進(jìn)行性無力和感覺喪失。對(duì)于CIDP，腓腸神經(jīng)組織活檢的結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)脫髓鞘(Vital等.，Ultrastruct. Pathol. 24 :363 (2000))、活化的巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞簇?cái)?shù)量增加(Griffin 等，Ann. Neurol. , 27 :SuppI. S64 (1990) ；Sommer 等，Neurology, 65 1924 (2005)),以及巨噬細(xì)胞清道夫受體I (MSR1、SRA 1/11、⑶204) mRNA的表達(dá)增加(Renaud等，J. Neuroimmunol. 159 :203(2005))。巨噬細(xì)胞還表現(xiàn)出通過Fas-配體依賴性機(jī)制，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中引起脫髓鞘神經(jīng)病變(Dace等，PLos One, 22 :4e7121 (2009))。下述非限制性實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明的多個(gè)方面，包括在本發(fā)明研究過程中使用的一些方法。
實(shí)施例在下述說明中，引用了作為本文一部分的附圖，其中舉例說明了可能實(shí)施的實(shí)施方式。對(duì)這些實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述以使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明，并且可以理解的是，可以利用其它實(shí)施方式，在不脫離本發(fā)明范圍的情況下，可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)和邏輯上的改變。因而，下文對(duì)示例性實(shí)施方式的描述并不是為了限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍由本發(fā)明的權(quán)利要求確定。通過下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明說明書進(jìn)行了進(jìn)一步解釋，從任何方面都不應(yīng)該認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。所有引用的參考文獻(xiàn)(包括本申請說明書全文中引用的參考文獻(xiàn)、授權(quán)專利、公開的專利申請)的內(nèi)容清楚地和明確地通過引用并入本文。這些實(shí)施例涉及用抗-MSRl抗體的Fab片段抑制MSR1，但可以容易地想到將其替換為其它MSRl抑制劑。實(shí)施例I抗-MSRl和抗-AIF-I抗體，包括其Fab片段的產(chǎn)生用0. 5mg在完全弗氏佐劑(CFA)(首次注射)或不完全弗氏佐劑(3次加強(qiáng))(Sigma, MO)中偶聯(lián)至KLH(鑰孔戚血藍(lán)素)半抗原的肽，免疫山羊可以生產(chǎn)針對(duì)大鼠MSRl (氨基酸 328-345 RSGFPGPKGQKGEKGRAG ；SEQ ID NO :6)和 AIF-I (氨基酸 127-140 KNKEHQKPTGPPAK ；SEQ ID NO :10) (GenScript,NJ)肽序列的抗體。MSRl 和 AIF-1 肽是人序列的大鼠同源物，其在此前用于生產(chǎn)抗人MSRl和AIF-I抗體。用于體內(nèi)治療時(shí)，使用木瓜蛋白酶對(duì)經(jīng)抗原柱親和純化的IgG抗體進(jìn)行消化，以獲得Fab片段并除去Fe。通過ELISA (酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))在肽包被孔中監(jiān)測免疫血清、純化的IgG和Fab的特異性活性。從正常山羊血清中分離經(jīng)蛋白G-柱親和純化及Fab片段化的天然山羊IgG，其作為同種型對(duì)照。實(shí)施例2通過給予抗-MSRl Fab片段抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(EAN)
用200 μ g 外周髓磷脂 P2 肽(氨基酸 53-78 TESPFKNTEISFKLGQEFEETTADNR ；SEQID NO :11) (Genemed Synthesis, TX)皮下尾根部免疫雌性Lewis大鼠，以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(EAN)，其中外周髓磷脂P2肽在含結(jié)核分支桿菌H37RA (Sigma，MO) (Lonigro等，2009)的CFA中。免疫后第7天，在臨床疾病首次出現(xiàn)前，和免疫后的第12天，腹腔(ip)給予EAN大鼠Img山羊抗-MSRl、抗-AIF-I的IgG Fab片段,或天然山羊抗體,或等體積的PBS0其它對(duì)照組為僅給予完全弗氏佐劑(CFA)的正常大鼠，或未經(jīng)處理的正常大鼠。每日評(píng)估一次動(dòng)物的體重和疾病的嚴(yán)重程度，直至第21天恢復(fù)。疾病的嚴(yán)重程度由兩名觀察者按照下列分值以單盲方式評(píng)估，其中當(dāng)臨床癥狀落在兩個(gè)等級(jí)之間時(shí)以O(shè). 5的方式增加評(píng)分0 =正常，I =尾部顏色變淡，尾尖懸起，2 =尾部無力，3 =尾部麻痹,4 =步態(tài)共濟(jì)失調(diào)，5 =后肢輕度癱瘓，6 =后肢中度癱瘓，7 =后肢嚴(yán)重癱瘓或截癱，8 =中度四肢癱瘓，9 =瀕死，10 =死亡。各組選擇3只代表性動(dòng)物，對(duì)其坐骨神經(jīng)進(jìn)行福爾馬林固定，石蠟包埋切片，切片用蘇木精&伊紅染色，以評(píng)估第17天時(shí)的炎性細(xì)胞浸潤情況，此時(shí)未經(jīng)治療的EAN大鼠的病情接近頂峰。各只動(dòng)物均在IOOX倍放大的縱向切片的8個(gè)視野中，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。
利用Mann-Whitney配對(duì)檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis多重比較、Fisher精確檢驗(yàn)、以及單因素ANOVA (GraphPad軟件，美國)分別確定各治療組之間的臨床評(píng)分、疾病發(fā)生率、組織學(xué)考察的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P < O. 05)。結(jié)果用P2 肽(氨基酸 53-78 :TESPFKNTEISFKLGQEFEETTADNR;SEQ ID NO :12)免疫的九只大鼠中的八只在第11天時(shí)出現(xiàn)了神經(jīng)病變癥狀，持續(xù)4至9天，其平均最大臨床評(píng)分為5. 0±3. O。疾病最嚴(yán)重程度的范圍為后肢無力至嚴(yán)重四肢癱瘓。然而，給予抗-MSRl Fab后，平均臨床評(píng)分降低至O. 2±0. 4(p<0. 05)。經(jīng)抗-MSRl抗體的Fab片段的治療阻止了大多數(shù)大鼠EAN發(fā)病，6只大鼠中只有I只發(fā)病。EAN發(fā)病的這只動(dòng)物僅出現(xiàn)了 2天的輕微神經(jīng)病變臨床癥狀(尾尖跛行)(表I)。因此，抗-MSRl組的發(fā)病率顯著低于未經(jīng)治療的EAN組(P < O. 05)。在抗-MSRl抗體治療組中，臨床疾病的最嚴(yán)重程度(

圖1，表I)顯著降至O. 2±O. 4，而相比之下未經(jīng)治療的EAN大鼠為5. 0±3. 0(p< O. 05)。在癥狀達(dá)到高峰期間，坐骨神經(jīng)的單核細(xì)胞浸潤的降低程度(圖2，表2)在這兩組之間也具有顯著性，在未經(jīng)治療EAN組觀察到的結(jié)果為382 土 34個(gè)細(xì)胞/mm2，而相比之下在抗-MSRl治療組中為6±5個(gè)細(xì)胞/mm2(p < O. 001)?？?AIF-I或正常IgG Fab治療組的臨床評(píng)分分別為3. 2±2· 6和2. 4±3· 1，其與未經(jīng)治療的EAN大鼠之間不存在顯著性差異(圖I)?？?AIF-I或天然IgG Fab治療組的細(xì)胞浸潤情況與未經(jīng)治療的EAN接近。然而，F(xiàn)ab抗-AIF-I抗體和正常IgG Fab使疾病的嚴(yán)重程度有所降低，但其與未經(jīng)治療EAN動(dòng)物組之間的差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(表1，圖I)。
權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動(dòng)物自身免疫疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括在有效抑制自身免疫疾病或炎性疾病的條件下，向所需哺乳動(dòng)物給予MSRl抑制劑，其中所述疾病包括巨曬細(xì)胞浸潤。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述MSRl抑制劑是抗-MSRl抗體、抗-MSRl抗體片段、抗-MSRl抗體的Fab或F (ab)2片段、任意所述抗體或抗體片段的功能等效物，及其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體；或來自單克隆抗體的抗體片段、Fab片段或F (ab)2片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗體是多克隆抗體；或來自多克隆抗體制品的抗體片段、Fab片段或F(ab)2片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗體、抗體片段、Fab片段或F(ab)2片段來自重組抗體文庫。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗體、抗體片段、Fab片段或F(ab)2片段在真核細(xì)胞中表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗體、抗體片段、Fab片段或F(ab)2片段在原核細(xì)胞中表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗體、抗體片段、Fab片段或F(ab)2片段通過體外技術(shù)產(chǎn)生。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述體外技術(shù)包括使用抗體、抗體片段、Fab片段或F(ab)2片段的文庫，其中所述抗體、抗體片段、Fab片段或F(ab)2片段展示于噬菌體、細(xì)胞或核糖體。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗體、抗體片段、Fab片段、F(ab)2片段或其功能等效物與多肽或肽結(jié)合，所述多肽或肽包含SEQ ID NO :1-9任意一項(xiàng)所示序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述疾病是自身免疫疾病。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述疾病是自身免疫性脫髓鞘神經(jīng)病變。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述自身免疫性脫髓鞘神經(jīng)病變是慢性炎性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)病變(CIDP)或格林-巴利綜合癥(GBS)。
15.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述疾病是炎性疾病。
16.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述MSRl抑制劑在哺乳動(dòng)物中使此前已活化的巨噬細(xì)胞去活化、抑制巨噬細(xì)胞活性、抑制巨噬細(xì)胞相互作用、抑制抗原提呈，和/或抑制細(xì)胞外粘附。
17.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述有效抑制自身免疫疾病或炎性疾病的條件包括給予治療有效量的MSRl抑制劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述治療有效量的MSRl抑制劑使此前已活化的巨噬細(xì)胞去活化、抑制巨噬細(xì)胞活性、抑制巨噬細(xì)胞相互作用、抑制抗原提呈或抑制細(xì)胞外粘附。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述治療有效量的MSRl抑制劑在哺乳動(dòng)物中減輕炎癥、減少脫髓鞘、減少軸突丟失和/或減少神經(jīng)元丟失。
20.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述有效抑制自身免疫疾病或炎性疾病的條件包括在有效治療疾病或抑制疾病發(fā)病的給藥間隔內(nèi)給予MSRl抑制劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述抑制劑每日給予一次、兩次或三次。
22.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述抑制劑每周給予一次、兩次或三次，或者每月給予一次、兩次或三次。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防或抑制疾病發(fā)病和/或治療疾病的方法，所述疾病為自身免疫性脫髓鞘神經(jīng)病變和涉及巨噬細(xì)胞浸潤的其它自身免疫疾病或炎性疾病。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102844050SQ201180019657
公開日2012年12月26日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月19日
發(fā)明者N·拉托夫, G·李 申請人:康奈爾大學(xué)