專利名稱：來(lái)源于髓鞘堿性蛋白的耐受原性肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)源于髓鞘堿性蛋白的肽。特別的，本發(fā)明涉及包括髓鞘堿性蛋白131-158區(qū)段的一部分的肽及其在治療和/或預(yù)防疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，T淋巴細(xì)胞可以識(shí)別蛋白抗原的內(nèi)在表位?？乖蔬f細(xì)胞(APC)吸收蛋白抗原并將其降解成為短的肽片段。肽可與細(xì)胞內(nèi)主要的組織相容復(fù)合物(MHC)I或II類分子結(jié)合，并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面。當(dāng)與MHC分子結(jié)合被呈遞至細(xì)胞表面時(shí)，該肽可被T細(xì)胞識(shí)別(通過(guò)T細(xì)胞受體(TCR))，在該情況下該肽為T細(xì)胞表位。
T細(xì)胞表位在對(duì)任何抗原，無(wú)論是自身的或是外來(lái)的，的適應(yīng)性免疫應(yīng)答中扮演了重要的角色。通過(guò)使用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停故玖薚細(xì)胞表位在過(guò)敏性疾病(其包括變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病和移植排斥)中扮演著重要角色。通過(guò)注射與佐劑組合的合成肽(基于T細(xì)胞表位的結(jié)構(gòu))可以誘導(dǎo)炎癥或過(guò)敏性疾病。
經(jīng)比較，顯示通過(guò)給藥可溶形式的肽表位有可能誘導(dǎo)針對(duì)特定肽表位的免疫耐受性。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE-一種多發(fā)性硬化癥的模型(MS))(Metzler & Wraith(1993)Int.Immunol.51159-1165；Liu & Wraith(1995)Int.Immunol.71255-1263；Anderton & Wraith(1998)Eur.J.Immunol.281251-1261)；以及關(guān)節(jié)炎，糖尿病和葡萄膜視網(wǎng)膜炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?如上述AndertonWraith(1998)中的評(píng)述)中，給藥可溶性的肽抗原被證實(shí)是一種抑制疾病的有效途徑。這也被證實(shí)是一種治療EAE疾病進(jìn)展的途徑(如上述Anderton & Wraith(1998))。
耐受原性肽在治療或預(yù)防疾病中的應(yīng)用已吸引了相當(dāng)多的注意力。其一方面的原因是某些耐受原性表位可下調(diào)針對(duì)相同組織內(nèi)的不同抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。這種現(xiàn)象，被稱為是“旁觀者抑制”，其意思是采用特定的耐受原性肽(如上述Anderton & Wraith(1998))應(yīng)當(dāng)可以誘導(dǎo)針對(duì)特定抗原內(nèi)的多于一個(gè)表位的和針對(duì)給定疾病的多于一個(gè)抗原的耐受性。這避免了需確定特定疾病中的全部病原性抗原的需要。
由于肽相對(duì)較低的成本以及可生產(chǎn)出具有改變的免疫性狀的肽類似物的事實(shí)，肽也是一種有利的治療選擇。因此，可以對(duì)肽進(jìn)行修飾從而改變其與MHC或TCR的相互作用。采用這種方法的一種可能的問(wèn)題是已經(jīng)證實(shí)不是所有的作為T細(xì)胞表位發(fā)生作用的肽都能誘導(dǎo)耐受性。髓鞘堿性蛋白(MBP)肽89-101是一種致免疫后的免疫優(yōu)勢(shì)性抗原，同時(shí)也是一種在引發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)和誘導(dǎo)EAE方面非常有效的免疫原。然而，當(dāng)以溶液給藥時(shí)，該肽顯示出在誘導(dǎo)耐受性方面無(wú)效(如上述Anderton & Wraith(1998))。
對(duì)于這種觀察到的在T細(xì)胞表位誘導(dǎo)耐受性能力方面的等級(jí)現(xiàn)象提出了多種解釋(如上述Anderton & Wraith(1998)中的評(píng)述)。特別地，有人提出在肽對(duì)MHC的親和力和耐受原性間存在相關(guān)性(如上述Liu & Wraith(1995))，但是這與某些觀察到的現(xiàn)象并不吻合。例如，非耐受原性的MBP[89-101]以相對(duì)高的親和力與I-AS結(jié)合。因此，無(wú)法直接預(yù)測(cè)哪些肽將誘導(dǎo)耐受性。
本發(fā)明人已經(jīng)顯示，如果一種肽表位具有適合于被未成熟APC呈遞的大小且不需要抗原加工，則其可誘導(dǎo)免疫耐受性(國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/GB01/03702)。因此，可以通過(guò)一些表位在其能被MHC分子呈遞前需要進(jìn)一步的加工的事實(shí)來(lái)解釋一些T細(xì)胞表位為耐受原性而另一些無(wú)法誘導(dǎo)耐受性的觀察現(xiàn)象。雖然當(dāng)與佐劑組合注射時(shí)，其有能力誘導(dǎo)疾病，但當(dāng)以溶液形式給藥時(shí)這些需要進(jìn)一步加工的表位無(wú)法誘導(dǎo)耐受性。
不需要進(jìn)一步加工的表位可以誘導(dǎo)耐受性，并被發(fā)明人稱為“apitopes”(不依賴于抗原加工的表位)。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明人研究了MBP的131-158區(qū)段，并發(fā)現(xiàn)許多可被固定抗原呈遞細(xì)胞呈遞至T-細(xì)胞的肽。
由于其不需要進(jìn)一步的加工就可與MHCI或II類分子結(jié)合，因此將這些肽定義為apitopes。
因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種包括髓鞘堿性蛋白131-158區(qū)段的一部分的apitope。
本發(fā)明人還確定了該區(qū)段中可被特定T-細(xì)胞克隆識(shí)別的兩個(gè)最小的表位。所述肽可包括這兩個(gè)表位中的一個(gè)或兩個(gè)，它們是MBP142-152和140-148。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽選自下述髓鞘堿性蛋白肽134-148、135-149、136-150、137-151、138-152、139-153、140-154。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種包括一種或多種如本申請(qǐng)第一個(gè)方面所述的肽的藥物組合物。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種治療和/或預(yù)防需要治療和/或預(yù)防的個(gè)體中的疾病的方法，其包括對(duì)個(gè)體給藥如本發(fā)明第一個(gè)方面所述的肽的步驟。
本發(fā)明還提供了如本發(fā)明第一個(gè)方面所述的肽在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的肽可用于預(yù)防和/或治療多發(fā)性硬化癥。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示了T細(xì)胞克隆MS60D2對(duì)由APC在131-158區(qū)段呈遞嵌合MBP肽的應(yīng)答。
圖2顯示了T細(xì)胞克隆N5對(duì)由APC呈遞MBP肽140-154的應(yīng)答。
圖3顯示了T細(xì)胞克隆N5對(duì)由APC在136-157區(qū)段呈遞嵌合MBP肽的應(yīng)答。
發(fā)明詳述在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種肽。
肽術(shù)語(yǔ)“肽”根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)含義是用來(lái)表示一系列殘基，典型地為典型地通過(guò)α-氨基和相鄰氨基酸的羧基基團(tuán)之間的肽鍵相互連接起來(lái)的L-氨基酸。該術(shù)語(yǔ)包括修飾的肽和合成的肽類似物。
本發(fā)明中的肽可以是不需進(jìn)一步加工就可與MHC I或II類分子結(jié)合的任何長(zhǎng)度。
能與MHC I類分子結(jié)合的肽典型地為7至13，更通常為8至10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。所述肽的結(jié)合通過(guò)在肽的主鏈原子與所有MHC I類分子的肽結(jié)合溝槽的非可變位點(diǎn)之間的接觸來(lái)使其兩個(gè)末端穩(wěn)定。在與肽的氨基和羧基末端結(jié)合的溝槽兩端都有非可變位點(diǎn)。肽鏈長(zhǎng)度的變化通過(guò)肽主鏈卷曲來(lái)調(diào)節(jié)，通常在能提供所要的柔性的脯氨酸或苷氨酸殘基處發(fā)生。
與MHC II類分子結(jié)合的肽典型地為8至20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，更通常地為10至17個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，且可以更長(zhǎng)。這些肽以沿著兩端開(kāi)放的MHC II肽結(jié)合溝槽(與MHC I類肽結(jié)合溝槽不同)伸展的構(gòu)象存在。主要通過(guò)主鏈原子與排列形成肽結(jié)合溝槽的保守殘基接觸，使肽處于合適的位置。
本發(fā)明的肽可以通過(guò)化學(xué)方法制備(肽化學(xué)，實(shí)用教程。MikosBodansky，Springer-Verlag，Berlin.)。例如，可通過(guò)固相技術(shù)來(lái)合成肽(Roberge JY et al(1995)Science 269202-204)，從樹(shù)脂上切下，并且通過(guò)制備性的高壓液相色譜純化(例如，Creighton(1983)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理，WH Freeman & Co，New York NY)。例如，根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書，采用ABI 43 1 A肽合成儀(Perkin Elmer)可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)合成。
所述肽可選擇地可以通過(guò)重組方式，或從一較長(zhǎng)多肽上切除的方式來(lái)制備。例如，所述肽可通過(guò)從髓鞘堿性蛋白上切除來(lái)獲得。肽的組成可通過(guò)氨基酸分析或測(cè)序來(lái)確定(例如，Edman降解法)。
本發(fā)明中的肽來(lái)源于MBP的131-158區(qū)段。優(yōu)選的所述肽來(lái)源于經(jīng)APC對(duì)抗原天然加工而產(chǎn)生的抗原片段。
為了實(shí)用目的，有所述肽應(yīng)當(dāng)顯示的各種其他的特性。例如，所述肽應(yīng)當(dāng)在一允許其在體內(nèi)應(yīng)用的濃度下是可溶的。優(yōu)選的，所述肽應(yīng)當(dāng)在0.5mg/ml的濃度下是可溶的，更優(yōu)選所述肽應(yīng)當(dāng)在1mg/ml的濃度下是可溶的，最優(yōu)選所述肽應(yīng)當(dāng)在5mg/ml的濃度下是可溶的。
為了鼻內(nèi)給藥，采用當(dāng)前操作可以被吸收的劑量的最大體積為每個(gè)鼻孔大約200μl。如果所述肽在1mg/ml時(shí)是可溶的，則每鼻孔雙倍劑量可使向每個(gè)病人給藥800μg。在任何單獨(dú)劑量中給藥多于5mg是不尋常的。
為了治療有效，所述肽在體內(nèi)足夠穩(wěn)定也是十分重要的。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)給藥30分鐘后試驗(yàn)肽的總量降至約50％，在給藥4小時(shí)后總量降至約30％，但經(jīng)5天后所述肽仍然可被檢測(cè)到(約5％)。所述肽在體內(nèi)的半衰期應(yīng)當(dāng)至少為10分鐘，優(yōu)選至少為30分鐘，更優(yōu)選至少為4小時(shí)，最優(yōu)選至少為24小時(shí)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在經(jīng)鼻內(nèi)給藥后，引流淋巴結(jié)中肽的量在給藥約4小時(shí)后達(dá)到峰值，不過(guò)5天后肽仍然可被檢測(cè)到(在最大約5％的水<p>PEC48包括一個(gè)數(shù)據(jù)總線230和一個(gè)低速串行總線232。SDRAM控制器234和DRAM接口單元236都連接到低速串行總線232。PEC控制器228連接到數(shù)據(jù)總線230上。PEC控制器228還經(jīng)低速接口220連接到低速串行總線232。高速接口214、PEC222和行下載裝置/格式化裝置單元也連接到數(shù)據(jù)總線230。
在使用中，因?yàn)镻EC48從DRAM打印頁(yè)帶，給定的帶B在可以開(kāi)始打印以前經(jīng)高速接口214加載進(jìn)DRAM。然后，在PEC48經(jīng)PEU再現(xiàn)帶B的同時(shí)，可以將帶B+1加載到DRAM上，同時(shí)帶B+1被擴(kuò)展和印刷，帶B+2可以被加載，并且可以如此繼續(xù)。
下表中簡(jiǎn)短地說(shuō)明上述的PEC48的各個(gè)部件。
表2.PEC內(nèi)的單元(高層面)
位的。
然而，在對(duì)免疫優(yōu)勢(shì)性肽發(fā)生首次免疫應(yīng)答后，表位“攤開(kāi)”可發(fā)生于亞優(yōu)勢(shì)性決定區(qū)段(Lehmann et al(1992)Nature 358155-157)。亞優(yōu)勢(shì)性表位的呈遞對(duì)引發(fā)自身免疫十分重要。因此，本發(fā)明的apitope可以基于亞優(yōu)勢(shì)性表位。
對(duì)任何特定的抗原，也可能存在隱蔽表位(cryptic epitopes)。隱蔽表位是那些當(dāng)以肽形式給藥時(shí)能刺激T細(xì)胞應(yīng)答，但當(dāng)以完整抗原給藥時(shí)不能產(chǎn)生這種應(yīng)答的表位。這可能是在APC中將抗原加工成肽的過(guò)程中，隱蔽表位被破壞了。
隱蔽表位在體外可作為apitope而起作用，因?yàn)槠洳恍枰M(jìn)一步加工就可與MHC分子結(jié)合，同時(shí)誘導(dǎo)識(shí)別該隱蔽表位的T細(xì)胞發(fā)生無(wú)反應(yīng)性。然而，這種apitope不太可能具有治療效果，因?yàn)槠洳荒苣褪芸勺R(shí)別天然加工的抗原表位的T細(xì)胞。
抗原表位可通過(guò)測(cè)量被APC呈遞時(shí)針對(duì)跨越整個(gè)抗原的重疊肽(參加下文)的T細(xì)胞應(yīng)答來(lái)確定。這種研究通常產(chǎn)生“嵌套組”的肽，同時(shí)特定的T細(xì)胞系/克隆的最小表位可通過(guò)測(cè)量對(duì)截短肽的應(yīng)答來(lái)評(píng)估。
不能假設(shè)抗原的最小表位可作為apitope而發(fā)揮作用。為了與MHC最佳結(jié)合要求最小表位兩側(cè)氨基酸是十分必要的。應(yīng)當(dāng)將Apitope設(shè)計(jì)成能涵蓋不同T細(xì)胞克隆的最小表位間的細(xì)微差別的可能性。
應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，不可能確定一適合所有表位的apitope。有清楚的證據(jù)顯示一些表位以依賴于內(nèi)體中的負(fù)載MHC的方式與MHC結(jié)合，因此其需要加工((Viner et al(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.922214-2218)。這是為什么不能假設(shè)每一最小表位將不可避免地發(fā)揮apitope的作用的另一原因。
含有T細(xì)胞表位的肽的確定本領(lǐng)域有許多已知的方法來(lái)確定給定抗原中的T細(xì)胞表位。
可通過(guò)對(duì)從抗原-負(fù)載的APC上洗脫下的肽進(jìn)行質(zhì)譜分光光度分析來(lái)確定天然加工的表位。這些是被刺激吸收抗原的，或通過(guò)采用適當(dāng)基因轉(zhuǎn)化而被迫產(chǎn)生胞內(nèi)蛋白的APC。典型的APC與可溶形式的或適于靶向APC細(xì)胞表面的蛋白一起培養(yǎng)。經(jīng)在37℃下培養(yǎng)后，細(xì)胞在去垢劑中裂解，同時(shí)通過(guò)，例如親和層析來(lái)純化II類蛋白。采用合適的化學(xué)介質(zhì)(例如酸條件)處理純化的MHC，從而將肽從MHC上洗脫下來(lái)。分離該肽庫(kù)，并將其分布型與來(lái)源于采用相同方式處理的對(duì)照APC的肽相比較。分析特異于蛋白表達(dá)/滋養(yǎng)細(xì)胞的峰值(例如通過(guò)質(zhì)譜法)，并確定肽片段。該操作通常產(chǎn)生有關(guān)通過(guò)抗原加工從特定抗原得到的產(chǎn)生的肽范圍(通常以“嵌套組”的形式發(fā)現(xiàn))的信息。
另一種確定表位的方法是在體外試驗(yàn)中篩選重疊且跨越抗原全長(zhǎng)的合成肽文庫(kù)。例如可采用15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的并且有5或10個(gè)氨基酸重疊的肽。采用包括抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞的抗原呈遞系統(tǒng)來(lái)測(cè)試肽。例如，抗原呈遞系統(tǒng)可以是鼠脾細(xì)胞制備物，和來(lái)源于扁桃體或PBMC的人細(xì)胞制備物。可選的，抗原呈遞系統(tǒng)可包括特定的T細(xì)胞系/克隆和/或特定的呈遞抗原的細(xì)胞類型。
T細(xì)胞活化可通過(guò)T細(xì)胞增殖(例如采用摻入3H-胸腺嘧啶核苷)或細(xì)胞因子生成來(lái)測(cè)量。TH1-型CD4+T細(xì)胞的活化，例如可通過(guò)可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如ELISPOT試驗(yàn)檢測(cè)的IFNγ生成來(lái)檢測(cè)。
重疊肽研究通常顯示表位所處的抗原區(qū)域。一種特定T細(xì)胞的最小表位可通過(guò)測(cè)量對(duì)截短肽的應(yīng)答來(lái)評(píng)估。例如，如獲得一針對(duì)重疊文庫(kù)中的包括1-15個(gè)殘基的肽的應(yīng)答，兩端均被截短的組(例如，1-14，1-13，1-12等和2-15，3-15，4-15等)可被用于確定最小表位。
不依賴于抗原加工的呈遞系統(tǒng)(APIPS)一旦確定了一個(gè)表位，下一步將調(diào)查其是否也起apitope的作用。
一種apitope必須是無(wú)需抗原加工即可呈遞至T細(xì)胞。在確定了含有T細(xì)胞表位的肽后，apitopes可通過(guò)無(wú)加工的系統(tǒng)來(lái)確定?？刹捎锚?dú)立于抗原加工的呈遞系統(tǒng)(APIPS)來(lái)測(cè)試截短的肽和肽類似物。
APIPS的例子包括a)固定的APC(含有或不含CD28抗體)；b)含有MHC I或II類分子的脂質(zhì)膜(含有或不含CD28抗體)；和c)純化的天然或重組的與平板結(jié)合(plate-bound)形式的MHC(含有或不含CD28抗體)。
已知可采用固定的APC來(lái)調(diào)查T細(xì)胞應(yīng)答，例如在研究中，通過(guò)測(cè)量對(duì)截短肽的應(yīng)答來(lái)調(diào)查多肽內(nèi)的最小表位(Fairchild et al(1996)Int.Immunol.81035-1043)?？刹捎茫缂兹?通常為多聚甲醛)或戊二醛來(lái)固定APC。
脂質(zhì)膜(其可為平面膜或脂質(zhì)體)可通過(guò)采用人工脂質(zhì)制備或其可以是來(lái)源于APC的原生質(zhì)膜/微粒體碎片。
在使用中，可將APIPS施用于組織培養(yǎng)皿的孔中。隨后加入肽抗原，并通過(guò)添加挑選的T細(xì)胞系或克隆來(lái)檢測(cè)肽與APIPS的MHC部分的結(jié)合。通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法，例如通過(guò)摻入3H-胸腺嘧啶核苷或細(xì)胞因子分泌都可測(cè)量T細(xì)胞系或克隆的活化。
耐受性本發(fā)明的肽應(yīng)當(dāng)能誘導(dǎo)針對(duì)MBP的耐受性，因?yàn)槠涫窃摽乖腶pitopes。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“耐受原性”是指能誘導(dǎo)耐受性。
耐受性是指對(duì)抗原不應(yīng)答。對(duì)自身抗原的耐受性是免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要特征，當(dāng)其失去時(shí)將產(chǎn)生自身免疫性疾病。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)必須保持對(duì)大量的各種感染抗原的應(yīng)答能力同時(shí)避免其自身組織中含有的自身抗原的免疫攻擊。這在很大程度上受不成熟T淋巴細(xì)胞對(duì)胸腺中細(xì)胞程序性死亡的靈敏度的調(diào)控(中樞耐受)。但是，不是所有的自身抗原都能在胸腺中檢測(cè)到，因此自身反應(yīng)性的胸腺細(xì)胞死亡并不完全。因此，外周組織中也存在通過(guò)成熟的自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞而獲得耐受性的機(jī)制(外周耐受)。Anderton等人在(1999)(Immunological Reviews 169123-137)中給出了對(duì)中樞和外周耐受性機(jī)制的綜述?？赏ㄟ^(guò)誘導(dǎo)在至少一部分CD4+T細(xì)胞中發(fā)生無(wú)反應(yīng)性來(lái)產(chǎn)生或特征描述耐受性。為了活化T細(xì)胞，肽必須與一種能向T細(xì)胞傳遞兩個(gè)信號(hào)的“專業(yè)”APC聯(lián)合。第一信號(hào)(信號(hào)1)被APC細(xì)胞表面上的MHC-肽復(fù)合體傳遞，并通過(guò)TCR被T細(xì)胞接收。第二信號(hào)(信號(hào)2)被APC表面上的共同刺激分子，例如CD80和CD86傳遞，并被T細(xì)胞表面上的CD28接收。認(rèn)為當(dāng)T細(xì)胞在缺乏信號(hào)2的情況下接收信號(hào)1時(shí)，其并未被活化，事實(shí)上，變得無(wú)反應(yīng)性。無(wú)反應(yīng)性的T細(xì)胞對(duì)隨后的抗原刺激也無(wú)反應(yīng)，并且能抑制其他的免疫應(yīng)答。無(wú)反應(yīng)性的T細(xì)胞被認(rèn)為與介導(dǎo)T細(xì)胞的耐受性有關(guān)。
不希望受到理論的束縛，本發(fā)明人預(yù)測(cè)，由于其需要通過(guò)呈遞成熟抗原的細(xì)胞進(jìn)行加工，因此在與MHC分子聯(lián)合被呈遞前，需要加工的肽不能誘導(dǎo)耐受性。呈遞成熟抗原的細(xì)胞能加工抗原，但是也能傳遞信號(hào)1和信號(hào)2二者至T細(xì)胞，導(dǎo)致T細(xì)胞活化。另一方面，apitopes能與不成熟APC表面上的MHC II類分子結(jié)合。因此，其無(wú)需共同刺激就可被呈遞至T細(xì)胞，從而導(dǎo)致T細(xì)胞的無(wú)反應(yīng)性和耐受性。
毫無(wú)疑問(wèn)，apitopes也能與成熟APC細(xì)胞表面上的MHC分子結(jié)合。不過(guò)，免疫系統(tǒng)含有比成熟APC更豐富的不成熟APC(有人提出少于10％的樹(shù)突狀細(xì)胞被活化Summers et al.(2001)Am.J.Pathol.159285-295)。因此，apitope的默認(rèn)狀態(tài)為無(wú)反應(yīng)性/耐受性，而非活化。
已經(jīng)顯示，當(dāng)通過(guò)吸入肽誘導(dǎo)耐受性時(shí)，抗原特異性的CD4+T細(xì)胞的增殖能力下降。同時(shí)由這些細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2，IFN-γ和IL-4的生成量被下調(diào)，但I(xiàn)L-10的生成量增加。對(duì)處于肽誘導(dǎo)耐受性狀態(tài)的小鼠中的IL-10進(jìn)行中和顯示完全恢復(fù)了對(duì)疾病的敏感性。有人提出調(diào)控細(xì)胞的總數(shù)持續(xù)保持在產(chǎn)生IL-10同時(shí)介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)的耐受狀態(tài)(Burkhart et al(1999)Int.Immunol.111625-1634)。
因此可通過(guò)各種技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)耐受性的誘導(dǎo)，其包括(a)降低對(duì)感染其中所述肽為該疾病的體內(nèi)目標(biāo)表位的疾病的敏感性；(b)在CD4+T細(xì)胞中誘導(dǎo)無(wú)反應(yīng)性(可通過(guò)隨后的體外抗原刺激來(lái)檢測(cè))；(c)改變CD4+T細(xì)胞數(shù)量，包括(i)降低增殖；(ii)下調(diào)IL-2、IFN-γ和IL-4的生成量；(iii)增加IL-10的生成量。
目標(biāo)疾病本發(fā)明的肽可用于治療和/或預(yù)防疾病。
本發(fā)明的肽在治療和/或預(yù)防多發(fā)性硬化癥(MS)中十分有效。多發(fā)性硬化癥是一種以多種髓鞘脫失損害為特征的，在整個(gè)CNS白質(zhì)中傳播并在各種位點(diǎn)和各個(gè)時(shí)期發(fā)生的慢性炎癥疾病(McFarlin &McFarland，1982 New England J.Medicine 3071183-1188 &1246-1251)。MS被認(rèn)為通過(guò)自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)。
在動(dòng)物中，MBP具有致免疫性同時(shí)MBP-特異性T淋巴細(xì)胞具有致腦炎活性(Segal et al.，1994 J.Neuroimmunol.517-19；Voskuhletal.，1993 J.Neuroimmunol 42187-192；Zamvil et al.，1985 Nature317355-8)。
藥物組合物在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種包含一種或多種本發(fā)明第一個(gè)方面所述肽的藥物組合物。所述組合物還可包括來(lái)源于MBP另一區(qū)段或來(lái)源于不同抗原的一個(gè)或多個(gè)apitopes。
本發(fā)明人預(yù)測(cè)，盡管存在“旁觀者抑制”，但靶向許多不同的T細(xì)胞克隆從而有效誘導(dǎo)耐受性是十分必要的。從而為了預(yù)防和治療疾病可將較多的肽給藥至個(gè)體。
所述藥物組合物可以，例如包括介于1至50個(gè)apitopes，優(yōu)選地1至15個(gè)apitopes。如果存在多于一個(gè)的apitope，優(yōu)選地，該apitopes為不需進(jìn)一步加工就全部可與MHC I類分子結(jié)合，或全部可與MHC II類分子結(jié)合。
當(dāng)存在兩個(gè)或更多的apitopes時(shí)，所述藥物組合物可以為試劑盒的形式，其中一些或每一種apitopes均分開(kāi)提供，用于同時(shí)的，分開(kāi)的或按順序的給藥。
可選的(或另外)，如果所述藥物組合物(或其任何部分)以多劑量給藥，則每一劑量可獨(dú)立包裝。
所述藥物組合物可包括治療或預(yù)防有效量的特定或每一apitope，同時(shí)可選的包括藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
同樣地，在本發(fā)明的藥物組合物中，特定的或每一apitope可與任何合適的粘合劑、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、包被劑、或助溶劑混合。
給藥所述肽可在無(wú)佐劑的情況下以溶解形式給藥。
優(yōu)選的所述肽通過(guò)粘膜途徑給藥。
研究顯示，當(dāng)以溶解形式經(jīng)腹膜內(nèi)(i.p.)、靜脈內(nèi)(i.v.)或鼻內(nèi)(i.n.)或口服給藥時(shí)，該肽可誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受性(如上述Anderton& Wraith(1998)；Liu & Wraith(1995)如上述；Metzler & Wraith(1999)Immunology 97257-263)。
優(yōu)選的肽經(jīng)鼻內(nèi)給藥。
小鼠研究顯示，誘導(dǎo)耐受性所必需的肽的給藥持續(xù)時(shí)間視受體中的T細(xì)胞前體頻度而定(如上述Burkhart et al(1999))。在許多實(shí)驗(yàn)性研究中顯示，重復(fù)劑量的肽是誘導(dǎo)耐受性所必須的(如上述Burkhart et al(1999))。因此，肽的確切劑量和劑數(shù)將視個(gè)體而定，不過(guò)在一優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了多劑量給藥。
如果同時(shí)給藥多種肽，其可以為適合單劑或多劑給藥的“雞尾酒”形式?？蛇x的，優(yōu)選給予多劑但調(diào)整劑與劑之間肽的相對(duì)濃度。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，可沿用“劑量梯度增加”方案，其中多個(gè)劑量以遞增濃度的方式對(duì)病人給藥。這種方法已被采用，例如，被用于針對(duì)蜜蜂毒變態(tài)反應(yīng)的免疫治療應(yīng)用中的磷脂酶A2(Müller et al(1998)J.Allergy Clin Immunol.101747-754 & Akdis et al(1998)J.Clin.Invest.10298-106)。
實(shí)施例如下實(shí)施例用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，但不能解釋為對(duì)本發(fā)明的限定。本發(fā)明特別的涉及描述于這些實(shí)施例中的特定的
具體實(shí)施方式
。
實(shí)施例1-確定MBP區(qū)段134-154中的apitopes材料和方法抗原如Deibler等人所述，從腦白質(zhì)中制備得到人MBP(Deibler etal.，1972 Preparative Biochemistry 2139)，并通過(guò)SDS-PAGE來(lái)檢測(cè)其純度。MBP和肺結(jié)核分支桿菌純化的蛋白衍生物(PPD)(UK中心獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，Surrey)在預(yù)先設(shè)定的最適濃度下用于增殖實(shí)驗(yàn)；每一抗原的最適濃度為20ug/ml。在Abimed AMS 422多肽合成儀上(Abimed，Langenfeld，Germany)通過(guò)F-moc化學(xué)方法合成了跨越MBP區(qū)段131-158的一組15-鏈節(jié)的重疊肽。每一肽有1個(gè)氨基酸被替換，并有14個(gè)氨基酸重疊。
組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基添加有20mM HEPES(Sigma，Poole，UK)、青霉素(100U/ml)、鏈霉素硫酸鹽(100mg/ml)和4mM L-谷酰胺(均來(lái)源于LifeTechnologies，Paisley，Scotland)的RPMI-1640培養(yǎng)基被作為組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基使用。無(wú)血清培養(yǎng)基被用于漂洗淋巴細(xì)胞和TCL。對(duì)于所有的培養(yǎng)條件和實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基均添加有10％的熱滅活的自體血漿。
T細(xì)胞克隆的產(chǎn)生從8位MS病人和2位健康對(duì)照捐贈(zèng)者中產(chǎn)生MBP-特異性T細(xì)胞系(TCL)。按上述方法分離來(lái)源于每一個(gè)體的PBMC，并以1×106細(xì)胞/ml的密度平鋪至含有MBP(50μg/ml)的6孔板中；來(lái)源于每一個(gè)體的一部分PBMC經(jīng)常規(guī)冷凍并保存用于隨后的再刺激。七天后，采用含有2％IL-2(Lymphocult-HT；Biotest LTD.，Birmingham，UK)的新鮮培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，并在培養(yǎng)第12天，所有的細(xì)胞均采用抗原、IL-2以及作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)來(lái)源的經(jīng)輻射的(2500 Rad)自體PBMC以1T細(xì)胞5 APC的細(xì)胞比例進(jìn)行再刺激。每3-4天在IL-2中擴(kuò)增細(xì)胞，并在第14天采用抗原、IL-2和PBMC按上述方法進(jìn)行再刺激。在首次再刺激的那一天，檢測(cè)細(xì)胞對(duì)MBP的特異性增殖。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將三份2×104個(gè)T細(xì)胞和1×105個(gè)經(jīng)輻射的自體PBMC培養(yǎng)于含有MBP的96孔圓底平板中。培養(yǎng)細(xì)胞兩天，并在培養(yǎng)的最后18小時(shí)采用(3H)-胸腺嘧啶核苷0.4μCi/孔的濃度進(jìn)行脈沖。然后如上文所述收獲細(xì)胞，δcpm＞1000和SI＞3的TCL被認(rèn)為是MBP-特異性的。
經(jīng)3輪再刺激/擴(kuò)增循環(huán)后，在作為APC的自體經(jīng)輻射的PBMC的存在下利用PHA(Sigma，Poole，Dorset，UK)對(duì)TCL進(jìn)行克隆。T細(xì)胞在0.1細(xì)胞/孔，0.3細(xì)胞/孔和1細(xì)胞/孔的限制稀釋條件下平鋪，并在含有1×104個(gè)經(jīng)輻射的PBMC、5μg/ml PHA和2％IL-2的Terasaki平板(Nunc International，Costar)中培養(yǎng)。經(jīng)10-12天后，采用1×105個(gè)經(jīng)輻射的PBMC、5μg/ml PHA和IL-2在96孔圓底長(zhǎng)陽(yáng)性孔進(jìn)行擴(kuò)增。三天后采用含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)這些孔，同時(shí)在第7天，采用1×105個(gè)經(jīng)輻射的PBMC、5μg/ml PHA和IL-2在48-孔板中擴(kuò)增克??；在該時(shí)間點(diǎn)，在增殖實(shí)驗(yàn)中測(cè)量克隆對(duì)MBP的特異性應(yīng)答。一周后，采用1×106經(jīng)輻射的PBMC和PHA或Dynabeads(Dynal，UK)和IL-2，在24-孔板中擴(kuò)增MBP-特異性克隆。采用7-10天的再刺激/擴(kuò)增循環(huán)使克隆保持于24-孔板中。
增殖實(shí)驗(yàn)將活的或p-甲醛固定的Mgar(HLA-DR2+ve)細(xì)胞與肽一起在含有T細(xì)胞的血清中或在單獨(dú)的血清中培養(yǎng)。通過(guò)如下的3H-胸腺嘧啶核苷吸收來(lái)測(cè)量T細(xì)胞增殖應(yīng)答。三等份每份100μl的每一培養(yǎng)物在96-孔圓底微量滴定板中生長(zhǎng)48小時(shí)，隨后采用0.4μCi的[3H]-胸腺嘧啶核苷(Amersham International，Amersham，UK)進(jìn)行脈沖。經(jīng)20小時(shí)后，采用Mach 111收獲器96(Tomtec，Orange，New Jersey，USA)將細(xì)胞收獲至玻璃纖維墊上(LKB-Wallac，Turku，F(xiàn)inland)。采用Microbeta液體閃爍計(jì)數(shù)器(LKB-Wallac)來(lái)確定[3H]-胸腺嘧啶核苷的摻入。當(dāng)δcpm＞1000且刺激指數(shù)SI＞3時(shí)，含有抗原的測(cè)試孔被認(rèn)為呈陽(yáng)性，其中SI＝含有CPM抗原的培養(yǎng)物/不含抗原的CPM培養(yǎng)物。
結(jié)果T細(xì)胞克隆MS60D2對(duì)在131-158區(qū)段的嵌套MBP肽的遞呈的應(yīng)答如圖1所示。由于其不需要進(jìn)一步加工就可被固定的APC呈遞至T細(xì)胞，因此肽134-148，135-149，136-150，137-151，138-152，139-153和140-154被定義為apitopes。
T細(xì)胞克隆N5對(duì)肽140-154的呈遞的應(yīng)答如圖2所示。這進(jìn)一步證實(shí)了肽140-154無(wú)需進(jìn)一步加工即可被固定的APC呈遞。
實(shí)施例2-被T細(xì)胞克隆N5和MS60D2識(shí)別的最小表位的確定將活的Mgar細(xì)胞與來(lái)源于MBP區(qū)段136-157的重疊肽一起在含有N5T細(xì)胞的血清中或在單獨(dú)血清中培養(yǎng)。通過(guò)3H-胸腺嘧啶核苷吸收來(lái)測(cè)量T細(xì)胞增殖。
結(jié)果示于圖3中。被T細(xì)胞克隆N5識(shí)別的最小表位為MBP142-152。
對(duì)T細(xì)胞克隆MS60D2進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)(圖1，未固定的Mgar)。被T細(xì)胞克隆識(shí)別的最小表位是MBP140-148。
對(duì)本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種改進(jìn)和改變，對(duì)于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，其并未背離本發(fā)明的范圍和主旨。雖然結(jié)合特定實(shí)施方案來(lái)描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解，權(quán)利要求書所要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)當(dāng)過(guò)分局限于該特定的實(shí)施方案。事實(shí)上，本發(fā)明意圖包括那些為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明而對(duì)記載的模型的各種改進(jìn)，這些對(duì)于化學(xué)或生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員而言，是顯而易見(jiàn)的。上述說(shuō)明書中提到的所有出版物在此通過(guò)參考文獻(xiàn)并入。
序列表<110>Apitope Technology(Bristol)Limited<120>來(lái)源于髓鞘堿性蛋白的耐受原性肽<130>P013368WO LCH<140>PCT/GB2003/000399<141>2003-01-30<150>GB 0202399.2<151>2002-02-01<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>15<212>PRT<213>人<400>1Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly1 5 10 15<210>2<211>15<212>PRT<213>人<400>2Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr1 5 10 15<210>3<211>15
<212>PRT<213>人<400>3Ser A1a His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu1 5 10 15<210>4<211>15<212>PRT<213>人<400>4Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser1 5 10 15<210>5<211>15<212>PRT<213>人<400>5His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys1 5 10 15<210>6<211>15<212>PRT<213>人<400>6Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile1 5 10 15
<210>7<211>15<212>PRT<213>人<400>7Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe1 5 10 1
權(quán)利要求
1.一種無(wú)需進(jìn)一步加工就可與MHC I或II類分子結(jié)合的肽，其包括髓鞘堿性蛋白區(qū)段131-158的一部分。
2.一種如權(quán)利要求1所述的肽，其包括最小表位142-152和/或最小表位140-148。
3.一種如權(quán)利要求1或2所述的肽，其選自如下的髓鞘堿性蛋白肽134-148、135-149、136-150、137-151、138-152、139-153、140-154。
4.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的肽，其用于治療和/或預(yù)防疾病。
5.如權(quán)利要求4所述的肽，所述的疾病為多發(fā)性硬化癥。
6.一種包含一種或多種如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的肽的藥物組合物。
7.一種用于治療和/或預(yù)防在需要治療和/或預(yù)防的個(gè)體中的疾病的方法，其包括給個(gè)體服用如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的肽的步驟。
8.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的肽在制備用于預(yù)防和/或治療疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種不需要進(jìn)一步加工就能與MHC I或II類分子結(jié)合的肽(也就是一種apitope)，其包括髓鞘堿性蛋白區(qū)段(131－158)的一部分，特別是本發(fā)明提供了一種選自如下髓鞘堿性蛋白肽(134－148，135－149，136－150，137－151，138－152，139－153，140－154)的apitope。本發(fā)明還提供了該肽在制備藥物組合物中的應(yīng)用和一種采用該肽來(lái)治療和/或預(yù)防疾病的方法。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1625564SQ03803077
公開(kāi)日2005年6月8日 申請(qǐng)日期2003年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月1日
發(fā)明者D·C·弗賴思, H·B·斯特雷特, F·M·龐斯福德, G·馬扎 申請(qǐng)人:阿皮托普技術(shù)(布里斯托爾)有限公司