專利名稱：：腦血管痙攣抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生的腦血管痙攣的藥劑。
背景技術(shù)：
：蛛網(wǎng)膜下腔出血主要發(fā)生在4060多歲的壯年層，主要指由于動(dòng)脈瘤的破裂而在包圍腦的蛛網(wǎng)膜與腦之間出血的狀態(tài)。該出血會(huì)使頭蓋骨內(nèi)壓瞬時(shí)上升，給腦造成損傷。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約10%的患者在蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)病后立即死亡，約25%的患者危及生命。據(jù)說即使初次發(fā)病后存活，但約20%患者會(huì)在2周內(nèi)再次出血。作為該蛛網(wǎng)膜下腔出血的治療，有除去血腫、預(yù)防已破裂過的動(dòng)脈瘤再破裂等。如上所述，蛛網(wǎng)膜下腔出血本身就是非?？植赖募膊?，但在蛛網(wǎng)膜下腔出血治療結(jié)束后，半數(shù)以上的患者會(huì)出現(xiàn)腦血管痙攣這一特異的病態(tài)。該腦血管痙攣是在蛛網(wǎng)膜下腔出血后314天發(fā)生并持續(xù)12周的腦主動(dòng)脈可逆性狹窄。其會(huì)導(dǎo)致腦缺血，從而使約40%的患者死亡，約30%的人留下嚴(yán)重的后遺癥，能回歸社會(huì)的最終只有約30%，已成為嚴(yán)重的問題。但是，對(duì)該腦血管痙攣的研究并未充分展開，其預(yù)防方法和治療方法也尚未確立。例如，蛛網(wǎng)膜下腔出血引發(fā)腦血管痙攣的機(jī)制尚不明確，但據(jù)說自由基、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、花生四烯酸級(jí)聯(lián)反應(yīng)、血管周圍神經(jīng)的損傷、內(nèi)皮依賴性舒血管效應(yīng)的損傷、血管壁的結(jié)構(gòu)改變等多種因素復(fù)雜地參與其中。因此認(rèn)為即使阻礙上述因素中的任一個(gè)，也很難預(yù)防或治療腦血管痙攣?，F(xiàn)在，作為針對(duì)腦血管痙攣的全身藥物治療法，有給予鹽酸法舒地爾、奧扎格雷鈉。另外，也在蛛網(wǎng)膜下腔出血的手術(shù)中向腦池內(nèi)給予組織型纖溶酶原激活劑。但它們的效果并不充分。HMGB1是從嚙齒類到人類中存在的95%以上的氨基酸序列相同的蛋白質(zhì)。該HMGB1也雖然存在于正常細(xì)胞中，但在敗血癥(全身性炎癥反應(yīng)癥候群)放出的菌體內(nèi)毒素LPS(脂多糖)的刺激下，血中濃度上升，最終導(dǎo)致組織損傷。因此，在日本專利特表2003-520763號(hào)公報(bào)所述的技術(shù)中，為了治療以炎癥性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)的活化為特征的癥狀，給予HMGB1拮抗劑。但是，雖然在日本專利特表2003-520763號(hào)公報(bào)中例示了許多介以炎癥性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)的疾病或癥狀作為治療對(duì)象，但對(duì)腦血管痙攣未作記載和提示。另外，在日本專利特表2005-537253號(hào)公報(bào)中，作為用于治療由壞死組織誘發(fā)的副作用的組合物，公開了含有HMGB1抗體等的組合物。但是，作為該副作用，僅例示了鄰近活細(xì)胞的活化、骨髓細(xì)胞的動(dòng)員及活化、內(nèi)皮屏障功能的喪失、浮腫，對(duì)腦血管痙攣未作記載和提示。
發(fā)明內(nèi)容如上所述，盡管蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生的腦血管痙攣會(huì)導(dǎo)致死亡或嚴(yán)重的后遺癥，但沒有可靠的抑制方法為此，本發(fā)明應(yīng)解決的技術(shù)問題在于提供對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生的腦血管痙攣有效且副作用少的腦血管痙攣抑制劑。本發(fā)明者為了解決上述技術(shù)問題，對(duì)于對(duì)抑制腦血管痙攣有效的藥劑進(jìn)行了各種研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗HMGB1單克隆抗體具有比過去報(bào)道的任何藥劑均優(yōu)異的效果，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的腦血管痙攣抑制劑的特征在于，以抗HMGB1單克隆抗體為有效成分。在本發(fā)明中，為了制造用于抑制腦血管痙攣的藥劑，使用抗HMGB1單克隆抗體。本發(fā)明的腦血管痙攣抑制方法的特征在于給予抗HMGB1單克隆抗體。圖1是蛛網(wǎng)膜下腔出血模型兔子的無處理組在蛛網(wǎng)膜下腔出血前后的腦基底動(dòng)脈的造影照片。圖中，各組的左側(cè)(前)表示蛛網(wǎng)膜下腔出血前的照片，右側(cè)(后)表示蛛網(wǎng)膜下腔出血前的照片。各組中，蛛網(wǎng)膜下腔出血后(右側(cè))血管徑明顯變細(xì)，可見強(qiáng)烈的腦血管痙攣。圖2是蛛網(wǎng)膜下腔出血模型兔子的IgG給予組在蛛網(wǎng)膜下腔出血前后的腦基底動(dòng)脈的造影照片。圖中，各組的左側(cè)(前)表示蛛網(wǎng)膜下腔出血前的照片，右側(cè)(后)表示蛛網(wǎng)膜下腔出血前的照片。各組中，蛛網(wǎng)膜下腔出血后(右側(cè))血管徑明顯變細(xì)，可見強(qiáng)烈的腦血管痙攣。圖3是蛛網(wǎng)膜下腔出血模型兔子的本發(fā)明抗體給予組在蛛網(wǎng)膜下腔出血前后的腦基底動(dòng)脈的造影照片。圖中，各組的左側(cè)(前)表示蛛網(wǎng)膜下腔出血前的照片，右側(cè)(后)表示蛛網(wǎng)膜下腔出血前的照片。各組中，蛛網(wǎng)膜下腔出血后(右側(cè))腦血管痙攣與圖1的無處理組及圖2的IgG給予組相比得到明顯抑制。圖4是用于比較無處理組、IgG給予組以及本發(fā)明抗HMGBl單克隆抗體組的血管收縮率的圖。本發(fā)明的抗HMGB1單克隆抗體的腦血管痙攣抑制作用與無處理時(shí)和給予IgG時(shí)相比具有顯著性優(yōu)勢(shì)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的腦血管痙攣抑制劑以抗HMGB1單克隆抗體為有效成分。抗HMGB1單克隆抗體只作用于組織損傷因子之一的HMGB1，其作用機(jī)制不明，但能抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生的腦血管痙攣。另一方面，基本上不作用于其他化合物等。因此認(rèn)為產(chǎn)生副作用的可能性為零或極少?？笻MGB1單克隆抗體的制備可采用常規(guī)方法。例如，用市售的HMGB1將小鼠或大鼠等免疫，使其抗體產(chǎn)生細(xì)胞或脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合得到雜交瘤。將該雜交瘤克隆，篩選產(chǎn)生與HMGB1特異性反應(yīng)的抗體的克隆。培養(yǎng)該克隆，將分泌的單克隆抗體精制即可。本發(fā)明使用的抗HMGB1單克隆抗體的種類沒有特殊限制。例如，可使用人型抗體或完全人抗體。本發(fā)明的腦血管痙攣抑制劑的劑型沒有特殊限制，若考慮到有效成分抗HMGB1單克隆抗體為肽，則優(yōu)選以注射劑給藥，制成溶液或乳液制劑等液體制劑。作為液體制劑的溶劑，可使用經(jīng)pH調(diào)節(jié)的生理鹽水、葡萄糖水溶液等血漿等滲液。當(dāng)抗體與鹽類等一起冷凍干燥的情況下，也可以使用純水、蒸餾水、滅菌水等。其濃度可與普通的抗體制劑一樣，通常為0.1lmg/mL左右，用于點(diǎn)滴時(shí)可為0.020.2mg/mL左右。但是，注射劑的滲透壓必須與血漿相等。本發(fā)明中的"抑制"包含抑制腦血管痙攣產(chǎn)生即"預(yù)防"、減輕已產(chǎn)生的腦血管痙攣即"治療"這兩方面的概念。因此，本發(fā)明的腦血管痙攣抑制劑可在蛛網(wǎng)膜下腔出血后到腦血管痙攣發(fā)生前進(jìn)行預(yù)防性給藥，也可以在腦血管痙攣發(fā)生后進(jìn)行治療性給藥。在蛛網(wǎng)膜下腔出血后314天，患者中有半數(shù)以上會(huì)發(fā)生腦血管痙攣。但是關(guān)于蛛網(wǎng)膜下腔出血引發(fā)腦血管痙攣的機(jī)制，有人指出有幾種要素，但認(rèn)為多個(gè)因素復(fù)雜地參與其中，現(xiàn)在并不明確。因此，在蛛網(wǎng)膜下腔出血后或在腦血管痙攣發(fā)生后，應(yīng)該維持本發(fā)明的腦血管痙攣抑制劑在腦血管中的血藥濃度。因此，本發(fā)明的腦血管痙攣抑制劑優(yōu)選在蛛網(wǎng)膜下腔出血后多次給藥或持續(xù)給藥。多次給藥時(shí)的給藥頻率和給藥量可根據(jù)是腦血管痙攣發(fā)生前還是發(fā)生后以及患者的情況等做適當(dāng)調(diào)整。如后述實(shí)施例所示，當(dāng)對(duì)體重約3kg的蛛網(wǎng)膜下腔出血模型兔子以每次2mg的抗HMGB1單克隆抗體給藥2次時(shí)，得到顯著的腦血管痙攣抑制效果。由該結(jié)果可知，對(duì)人的給藥量可為每次0.12mg/kg抗HMGB1單克隆抗體，更優(yōu)選為0.22mg/kg，每日可給藥2次。給藥形態(tài)沒有特殊限制，例如可以靜脈注射，在緊急情況下，也可通過在蛛網(wǎng)膜下腔出血手術(shù)中設(shè)置腦池分流管來給藥。持續(xù)給藥時(shí)的制劑濃度、給藥量等也可做適當(dāng)調(diào)整，例如將濃度0.020.2mg/mL的液體制劑用24小時(shí)、每日2次左右進(jìn)行點(diǎn)滴給藥。當(dāng)腦血管痙攣患者在蛛網(wǎng)膜下腔出血后14天左右之后存活的情況下，通常腦血管痙攣會(huì)自然消失。因此，從蛛網(wǎng)膜下腔出血后經(jīng)過14天左右，可考慮患者的情況等而逐漸減少本發(fā)明的腦血管痙攣抑制劑的給藥量等。本發(fā)明的腦血管痙攣抑制劑能有效地抑制在蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生的遲發(fā)性、會(huì)對(duì)患者造成嚴(yán)重不良影響的腦血管痙攣。另外，考慮到現(xiàn)在使用的抗體藥劑，產(chǎn)生嚴(yán)重副作用的可能性極小。因此，本發(fā)明的腦血管痙攣抑制劑能抑制迄今為止無特效治療方法的腦血管痙攣并防止后遺癥、加速患者回歸社會(huì)，非常有用。[實(shí)施例]以下，列舉實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于下述實(shí)施例，可在符合前述和后述的主旨的范圍內(nèi)做適當(dāng)變更后實(shí)施，它們均屬于本發(fā)明的技術(shù)范圍。實(shí)施例1抗HMGB1單克隆抗體的制備(a)大鼠的免疫取市售的來自牛胸腺的HMGB1和HMGB2的混合物(和光純藥工業(yè)公司制、編號(hào)080-070741)lmg/mL于2mL玻璃制注射筒內(nèi)，借助連接管與置于另一2mL玻璃制注射筒的等容量的弗氏完全佐劑緩慢混合，制成乳液。在被七氟醚麻醉的大鼠的后肢足跖各注射O.lmL所得到的乳液，注射給藥共計(jì)0.2mL。2周后，從頸靜脈采血，證實(shí)抗體效價(jià)上升。然后，在上述注射給藥5周后，無菌取出腫大的腸骨淋巴結(jié)。從得到的2個(gè)淋巴結(jié)可回收約6X1(T個(gè)細(xì)胞。(b)細(xì)胞融合和克隆用聚乙二醇將上述腸骨淋巴結(jié)細(xì)胞和小鼠骨髓瘤SP2/0-Ag14(SP2)細(xì)胞融合，將得到的融合細(xì)胞植入96孔微孔板。l周后，進(jìn)行初次ELISA篩選，對(duì)于陽性孔，通過Western雜交進(jìn)行二次篩選。將顯示陽性的孔細(xì)胞移置24孔微孔板，培養(yǎng)細(xì)胞至幾乎匯合的狀態(tài)(約2X105)，用0.5mL的冷凍培養(yǎng)基(向GIT培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清和10%二甲基亞砜得到的培養(yǎng)基)，在液氮中冷凍保存。將該冷凍保存細(xì)胞解凍后，用96孔微孔板進(jìn)行克隆。(c)抗體的精制用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置(Vivascience公司制)大量培養(yǎng)上述陽性細(xì)胞2周，得到濃度為23mg/mL的抗體液。將該抗體液在中性pH下與親和凝膠(Invitrogen公司制、MEP-HyperCel)混合，使抗HMGB1抗體與凝膠特異性結(jié)合。將特異性結(jié)合于凝膠的抗體用甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH4)洗脫。通過超濾裝置將洗脫液濃縮后，利用SepharoseCL8B凝膠過濾柱(直徑2cmX長(zhǎng)97cm)進(jìn)一步精制。得到的單克隆抗體是以HMGB1蛋白質(zhì)的C末端序列208EEEDDDDE215(E表示谷氨酸、D表示天冬氨酸)為表位特異性識(shí)別的抗體。例如，作為與HMGB1類似的蛋白質(zhì)，有HMGB2，HMGB2中不存在211以下的DDDDE序列，因此本發(fā)明的單克隆抗體不與HMGB2結(jié)合，僅特異性識(shí)別HMGB1并結(jié)合。實(shí)施例2在將12只從日本CharlesRiver公司得到的雄兔(體重約33.5kg)制成蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的前一周，用鹽酸氯胺酮(50mg/kg、肌肉給藥)和戊巴比妥(20mg/kg、靜脈給藥)麻醉后，向從右大腿動(dòng)脈插入至左脊椎骨動(dòng)脈起始部的管中注入造影劑，通過血管造影拍攝其腦基底動(dòng)脈。在制作蛛網(wǎng)膜下腔出血模型當(dāng)天，用鹽酸氯胺酮(50mg/kg、肌肉給藥)和戊巴比妥(20mg/kg、靜脈給藥)麻醉后，采集lmL動(dòng)脈血，將采集的該動(dòng)脈血注射到該兔子的枕大池(小腦延髓池內(nèi))。然后使其低頭并保持30分鐘，由此制成姝網(wǎng)膜下腔出血模型。另外，將實(shí)施例1中精制的大鼠的抗牛HMGB1單克隆抗體2mg溶于lmL磷酸緩沖液，得到抗體溶液。在模擬蛛網(wǎng)膜下腔出血后1小時(shí)和24小時(shí)，向4只蛛網(wǎng)膜下腔出血模型兔子靜脈注射該抗體溶液lmL(抗牛HMGB1單克隆抗體2mg)。在模擬蛛網(wǎng)膜下腔出血后3天，與上述同樣地拍攝腦基底動(dòng)脈。另外，為了比較，對(duì)未給予抗牛HMGB1單克隆抗體的兔子4只(無處理組)和按同樣操作給予了具有多種抗體活性的大鼠正常多克隆免疫球蛋白G(2mg)的兔子4只(IgG給予組)也進(jìn)行了同樣的拍攝。得到的各4例、共12例的照片如圖13所示。圖l是無處理的例子，圖2是給予多克隆免疫球蛋白G的例子，圖3是給予本發(fā)明的抗HMGB1單克隆抗體的例子。另外，用NIHImageJ(美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究所)，從得到的照片測(cè)定9處腦基底動(dòng)脈的內(nèi)徑，求出蛛網(wǎng)膜下腔出血后的內(nèi)徑的收縮率，算出各個(gè)體的平均值。進(jìn)而，由各個(gè)體的平均值算出各組的收縮率平均值。各組間的顯著性差異用t-檢驗(yàn)來測(cè)定。結(jié)果如表1和圖4所示。另外，圖4中，"**"表示與無處理組相比具有顯著性差異，p<0.01，表示與IgG給予組相比有顯著性差異，p<0.01。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>如圖1所示，未給予抗體的兔子的腦基底動(dòng)脈在模擬蛛網(wǎng)膜下腔出血后變細(xì)并發(fā)生強(qiáng)烈的腦血管痙攣。另外，如圖2所示，給予IgG的兔子也同樣發(fā)生強(qiáng)烈的腦血管痙攣。與此相對(duì)，如圖3所示，給予本發(fā)明的抗HMGB1單克隆抗體的兔子的腦基底動(dòng)脈的粗細(xì)在很大程度上得以維持，顯著抑制了腦血管痙攣。此外，本發(fā)明的抗HMGB1單克隆抗體的腦血管痙攣抑制作用與無處理時(shí)和給予IgG時(shí)相比，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性優(yōu)勢(shì)。從而證實(shí)本發(fā)明的腦血管痙攣抑制劑能顯著抑制腦血管痙攣。權(quán)利要求1.一種腦血管痙攣抑制劑，其特征在于，以抗HMGB1單克隆抗體為有效成分。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦血管痙攣抑制劑，其中，在蛛網(wǎng)膜下腔出血后被多次給藥。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腦血管痙攣抑制劑，其中，以每次0.22mg/kg的方式被給予抗HMGB1單克隆抗體。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦血管痙攣抑制劑，其中，在蛛網(wǎng)膜下腔出血后被持續(xù)給藥。5.根據(jù)權(quán)利要求14中任一項(xiàng)所述的腦血管痙攣抑制劑，其為靜脈注射給藥。6.抗HMGB1單克隆抗體的使用，其用于制造抑制腦血管痙攣的藥劑。7.—種腦血管痙攣的抑制方法，其特征在于，給予抗HMGB1單克隆抗體。全文摘要本發(fā)明的技術(shù)問題在于提供對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生的腦血管痙攣有效且副作用少的腦血管痙攣抑制劑。本發(fā)明的腦血管痙攣抑制劑的特征在于以抗HMGB1單克隆抗體為有效成分。文檔編號(hào)A61K39/395GK101448524SQ20078001825公開日2009年6月3日申請(qǐng)日期2007年5月18日優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日發(fā)明者伊達(dá)勛,友野靖子,小野成紀(jì),森秀治,西堀正洋,高橋英夫申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人岡山大學(xué)