專利名稱：多組分生物學(xué)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的制作方法
交叉引用相關(guān)的申請(qǐng)本申請(qǐng)是2001年7月20日提交的美國(guó)申請(qǐng)09/910,432的部分繼續(xù)申請(qǐng)案，所述美國(guó)申請(qǐng)09/910,432要求2000年7月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/220,244的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此以其全文引用作參考。
關(guān)于在聯(lián)邦資助建立的研究和開(kāi)發(fā)下進(jìn)行的發(fā)明的權(quán)利的聲明不適用發(fā)明背景基因遞送系統(tǒng)廣泛地可分為兩類病毒和非病毒遞送系統(tǒng)。病毒系統(tǒng)具有較大的毒性風(fēng)險(xiǎn)并在臨床試驗(yàn)中已導(dǎo)致許多并發(fā)癥和死亡。非病毒系統(tǒng)雖然遠(yuǎn)不如病毒途徑有效，但卻提供了使應(yīng)用適合于提高特異性和潛在地減少毒性的可能性。非病毒策略廣義上可分為基于質(zhì)脂體或基于非質(zhì)脂體的兩類。本發(fā)明提供的策略可用于任何已存在的非病毒方法，因此此處將描述所有的非病毒方法。
最簡(jiǎn)單的非病毒系統(tǒng)是直接的DNA的遞送。由于DNA的負(fù)電荷的原因，實(shí)際上只有非常少量的DNA進(jìn)入細(xì)胞并且大部分被降解掉。事實(shí)上，在該策略中無(wú)核靶向性序列的DNA不進(jìn)入細(xì)胞核。常規(guī)地，使用其它因素來(lái)增強(qiáng)基因/產(chǎn)物(DNA、RNA或更近年來(lái)的蛋白治療劑)遞送的效率，通過(guò)機(jī)械作用例如電穿孔、超聲、“基因槍”和直接的顯微注射，或通過(guò)電荷中和作用和使用試劑例如磷酸鈣、聚賴氨酸和脂質(zhì)體制劑的化學(xué)作用來(lái)增強(qiáng)效率。在后面的策略中，電荷中和作用已顯示增加非特異性效率，超過(guò)單獨(dú)的脂質(zhì)體制劑的化學(xué)/機(jī)械作用的效率數(shù)倍?；谶@些和類似的結(jié)果，許多人已斷定，為了有效地被細(xì)胞吸收，需要對(duì)DNA和RNA進(jìn)行電荷中和作用，因?yàn)镈NA的負(fù)電荷基本上阻止了運(yùn)輸，除了通過(guò)隨后的溶酶體融合進(jìn)行胞漿溶解(通過(guò)加入其他試劑逃避降解)外。大多數(shù)轉(zhuǎn)染劑實(shí)際上使用超過(guò)DNA凈負(fù)電荷2至4倍的比例的過(guò)量正電荷。所得的帶正電荷的雜合體通過(guò)離子相互作用結(jié)合帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面蛋白聚糖并且顯著地增強(qiáng)了隨后的吸收作用。一些轉(zhuǎn)染劑似乎具有細(xì)胞向性(cell tropism)，最可能的原因是更有效地靶向特定蛋白聚糖的空間和電荷模式，所述蛋白聚糖在細(xì)胞型特異性模式方面是不同的。即使使用合適的試劑(即，正確的向性)，相對(duì)于病毒策略，單獨(dú)的或和脂質(zhì)體組合的電荷中和作用的效率仍然十分低下。因此，人們已鑒定了許多有助于復(fù)合物有效地進(jìn)入細(xì)胞和通過(guò)任何內(nèi)溶酶體(endolysosome)階段的肽和肽片段。幾種這樣的轉(zhuǎn)運(yùn)因子甚至使得能夠有效地進(jìn)入細(xì)胞核。在一個(gè)方法中，將轉(zhuǎn)運(yùn)因子直接連接至目的治療物(小藥物、基因、蛋白等)。該方法要求產(chǎn)生、純化和檢測(cè)附著至轉(zhuǎn)運(yùn)因子的新藥。在許多情況下，這些雜合體構(gòu)成了新藥，從而需要完全的檢測(cè)。這樣的方法導(dǎo)致顯著增加的風(fēng)險(xiǎn)和花費(fèi)?？蛇x擇地，許多策略僅僅將試劑非特異性地(或甚至在表面上特異性地)混合入作為藥物/DNA/因子的載體的脂質(zhì)體制劑。盡管在效率方面改進(jìn)了直接或更簡(jiǎn)單的用藥方案(modality)，但這些方法仍然效率低下(相對(duì)于病毒)并且遠(yuǎn)比簡(jiǎn)單的非病毒策略更有毒性。該低效率的部分原因是由于較弱的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)作用。因此，策略已逐漸發(fā)展成向上述復(fù)合物中加入作為治療因子雜交體的部分或脂質(zhì)體混合物的部分的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)。其他改進(jìn)已包括試圖降低DNA/RNA/因子的降解。
上面提出的基本策略中的最重要的改進(jìn)已包括和治療因子一起的特異性配體或其他靶向試劑。這些策略提供了大大降低非特異性毒性和顯著提高效率的可能性，特別是當(dāng)和上述的效能試劑組合時(shí)。然而，目前的策略基于和單個(gè)載體的共價(jià)連接，從而必需特異性的合成(以確保在替代方案的量度上的空間考量不會(huì)使單個(gè)因子比其他因子占優(yōu)--即，確保各效能因子和各成像部分和各靶向部分存在于主鏈上)。這事實(shí)上使得許多特異性的結(jié)構(gòu)不可能發(fā)生(例如，唾液酸基-lewis X和針對(duì)表面抗原的Fab片段，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)方案中，空間限制阻止一種結(jié)構(gòu)或另一種結(jié)構(gòu)的有效結(jié)合，從而反過(guò)來(lái)干擾了效能因子)。盡管在概念上很有前景，但這些方法代表了花費(fèi)昂貴、產(chǎn)量極低(通過(guò)合成的話)的方法，并且還未證實(shí)能解決該問(wèn)題。
很明顯的是，對(duì)于非病毒基因和因子遞送的發(fā)展中的每一個(gè)階段，已經(jīng)遇到了問(wèn)題，在下一階段，通過(guò)增加復(fù)雜度來(lái)解決。每一次的改進(jìn)代表了超越前面標(biāo)準(zhǔn)的增加的步驟。然而，從患者護(hù)理的角度來(lái)看所述增加的復(fù)雜性帶來(lái)了風(fēng)險(xiǎn)，從生產(chǎn)的角度來(lái)看帶來(lái)了低效率和高成本。這些障礙已大大地降低了對(duì)這些在另外的情況下很有前景的潛在的治療法的熱情。
需要的是可廣泛地用于各種這樣的治療劑或藥妝劑(cosmeceutical agent)的組合物的新方法和組合物，所述治療劑或藥妝劑的組合物可被靶向或成像，從而使遞送最大限度地到達(dá)特定位置。令人驚奇的是，本發(fā)明提供了這樣的組合物和方法。
本發(fā)明還涉及這樣的制劑，所述制劑用于蛋白例如胰島素的透皮遞送，還有用于更大的治療和診斷物質(zhì)的透皮遞送，所述物質(zhì)是例如具有50,000和更高的分子量的物質(zhì)，其包括蛋白例如肉毒毒素(botulinum toxin)或其他具有生物活性的試劑例如，胰島素、肉毒毒素、不會(huì)治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地用于免疫的試劑。當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“治療劑”或“具有生物活性的蛋白”時(shí)，本發(fā)明明確地排除這樣的抗體片段，即所述抗體片段除了只結(jié)合特異性的抗原外不具有生物活性。然而，因?yàn)檫m合于免疫的抗原具有其他生物活性例如產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因此這些仍包括在本發(fā)明的合適的方面。此外，本發(fā)明也包括這樣的試劑，即該試劑通過(guò)結(jié)合特異性的抗原，從而阻斷配體的結(jié)合或改變抗原的構(gòu)象而具有生物活性或治療功效。
肉毒毒素(也稱作肉毒桿菌毒素或肉毒神經(jīng)毒素)是由革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)產(chǎn)生的神經(jīng)毒素。其通過(guò)阻止synoptic傳遞或穿過(guò)神經(jīng)肌肉接頭的乙酰膽堿的釋放來(lái)使肌肉產(chǎn)生麻痹，其也被認(rèn)為以其他的方式作用。其作用基本上阻斷了通常導(dǎo)致肌肉痙攣或收縮的信號(hào)，導(dǎo)致麻痹或?qū)е孪袤w的分泌或過(guò)量分泌例如多汗癥(hyperhidrosis)或痤瘡。
肉毒毒素被分為八種血清學(xué)上相關(guān)但不同的神經(jīng)毒素。其中，七種可導(dǎo)致麻痹，即肉毒神經(jīng)毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。通過(guò)和類型特異性抗體的中和作用來(lái)區(qū)分這些類型中的每一類型。各類型可以是天然發(fā)生的，可以是生產(chǎn)的重組體或通過(guò)基因工程產(chǎn)生的變體例如蛋白融合體。但是，對(duì)于所有這七種天然發(fā)生的活性肉毒毒素血清型或其重組體形式，肉毒毒素蛋白分子的分子量大約為150kD。因?yàn)橥ㄟ^(guò)細(xì)菌釋放，所以肉毒毒素是包含和相關(guān)非毒素蛋白在一起的150kD肉毒毒素蛋白分子的復(fù)合物。肉毒梭菌可產(chǎn)生900kD、500kD和300kD形式的A型肉毒毒素復(fù)合物。B型和C型肉毒毒毒只有表觀700kD或500kD的復(fù)合物產(chǎn)生。D型肉毒毒素可以300kD和500kD的復(fù)合物形式產(chǎn)生。E型和F型肉毒毒素只以大約300kD復(fù)合物的形式產(chǎn)生。據(jù)認(rèn)為復(fù)合物(即，分子量大于大約150kD)含有非毒素血凝素蛋白以及非毒素和非毒性非血凝素蛋白。這兩種非毒素蛋白(其和肉毒毒素分子一起組成相關(guān)的神經(jīng)毒素復(fù)合物)用于為肉毒毒素分子提供對(duì)抗變性的穩(wěn)定性和當(dāng)毒素被攝入時(shí)提供抗消化酸的保護(hù)性。此外，更大的(大于大約150kD分子量)的肉毒毒素復(fù)合物可能導(dǎo)致減緩肉毒毒素從肉毒毒素復(fù)合物的肌肉注射位點(diǎn)的擴(kuò)散速度。
肉毒毒素的不同血清型在其作用的動(dòng)物種類和在其引起的麻痹嚴(yán)重度和持續(xù)時(shí)間上是不同的。例如，如以在大鼠中產(chǎn)生的麻痹率估量，已確定A型肉毒毒素比B型肉毒毒素強(qiáng)500倍。此外，已確定B型肉毒毒素在480U/kg的劑量(大約是靈長(zhǎng)類動(dòng)物對(duì)于A型的LD50的12倍)下在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中是無(wú)毒的。由于肉毒毒素的分子大小和分子結(jié)構(gòu)的原因，其不能穿過(guò)角質(zhì)層和多層底層皮膚結(jié)構(gòu)。
A型肉毒毒素?fù)?jù)認(rèn)為是已知的對(duì)人致死性最強(qiáng)的天然的生物學(xué)試劑。在土壤中可發(fā)現(xiàn)肉毒梭菌的孢子，其可在未恰當(dāng)滅菌的和封閉的食物容器中生長(zhǎng)。細(xì)菌的攝入可導(dǎo)致肉毒中毒，其可以是致命的。但同時(shí)，肉毒毒素的肌肉麻痹性作用已被用于治療作用。肉毒毒素的受控施用已用于提供肌肉麻痹來(lái)治療病癥，例如，特征在于過(guò)度興奮的骨骼肌的神經(jīng)肌肉病癥。已用肉毒毒素治療的病癥包括偏側(cè)面肌痙攣、成人發(fā)生的痙攣性斜頸(adult onset spasmodic torticollis)、肛裂、眼瞼痙攣、腦癱、cervical dystonia、偏頭痛、斜視、temperomandibular joint disorder和各種類型的肌肉痙攣和抽搐。更近以來(lái)，肉毒毒素的肌肉麻痹性作用已被用于治療性應(yīng)用和化妝品面部應(yīng)用例如皺紋、眉間紋(frown lines)和面部肌肉痙攣或抽搐造成的其他結(jié)果的治療。
肉毒中毒，由于系統(tǒng)性肉毒毒素暴露產(chǎn)生的特征性綜合癥狀，自古以來(lái)就在歐洲存在。在1895年，Emile P.van Ermengem第一次從生腌豬肉中分離出厭氧性產(chǎn)孢子桿菌，該生腌豬肉獲自在比利時(shí)死于肉毒中毒的豬的死后的組織。Van Ermengem發(fā)現(xiàn)所述疾病是由他稱為肉毒芽孢桿菌(Bacillus botulinus)產(chǎn)生的細(xì)胞外毒素引起的(VanErmengem，Z Hyyg Infektionskr，261-56；Rev Infect(1897))。1922年該名稱改為肉毒梭菌。名稱梭菌用于反映微生物的厭氧特性，也反映其形態(tài)學(xué)特征(Carruthers和Carruthers，Can JOphthalmol，31389-400(1996))。在1920年代，在其他食物中毒暴發(fā)后分離了A型肉毒毒素的粗提物形式。University of California，San Francisco的Dr.Herman Sommer進(jìn)行了第一次純化神經(jīng)毒素的嘗試(Borodic等，Ophthalmic Plast Recostr Surg，754-60(1991))。1946年，Dr.Edward J.Schantz和其同事分離了以晶體形式存在的神經(jīng)毒素(Schantz等人，InJankovi J，Hallet M(Eds)Therapy with Botulinum Toxin，New York，NYMarcel Dekker，41-49(1994))。到了1949年，Burgen和其同事能夠證明肉毒毒素阻斷通過(guò)神經(jīng)肌肉接點(diǎn)的沖動(dòng)(Burgen等人，J Physiol，10910-24(1949))。Allan B.Scott在1973第一次在猴子中使用肉毒毒素A(BTX-A)。Scott證實(shí)持續(xù)3個(gè)月的可逆的眼肌麻痹(Lamanna，Science，130763-772(1959))。此后很快地，報(bào)導(dǎo)了BTX-A成功地在人中治療了斜視、眼瞼痙攣、和痙攣性斜頸(Baron等人，InBaron EJ，Peterson LR，F(xiàn)inegold SM(Eds)，Bailey&ScottsDiagnostic Microbiology，St.Louis，MOMosby Year Book，504-523(1994)；Carruthers和Carruthers，Adv Dermatol，12325-348(1997)；Markowitz，InStrickland GT(Eds)HuntersTropical Medicine，第7版，PhiladelphiaW.B.Saunders，441-444(1991))。在1986年，Jean和Alastair Carruthers，由眼外科醫(yī)生和皮膚科醫(yī)生組成的夫妻團(tuán)隊(duì)，開(kāi)始發(fā)展肉毒毒素-A(BTX-A)的化妝品用途，用于眉間區(qū)域中和運(yùn)動(dòng)相關(guān)的皺紋的治療(Schantz和Scott，In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum，NewYorkAcademic Press，143-150(1981))。Carruthers使用BTX-A治療皺紋在1992年導(dǎo)致其的關(guān)于該方法的開(kāi)創(chuàng)性出版物問(wèn)世(Schantz和Scott，In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects ofBotulinum，New YorkAcademic Press，143-150(1981))。到了1994年，相同的組報(bào)導(dǎo)了關(guān)于治療臉上其他運(yùn)動(dòng)相關(guān)的皺紋的經(jīng)驗(yàn)(Scott，Ophthalmol，871044-1049(1980))。這導(dǎo)致化妝用的BTX-A治療法的問(wèn)世。
皮膚保護(hù)身體的器官免受外界環(huán)境的威脅并充當(dāng)恒溫器以維持身體的溫度。其由幾個(gè)不同的層構(gòu)成，各層具有特化的功能。主要的層包括表皮、真皮和皮下組織。表皮是覆在真皮上面的上皮細(xì)胞的層化層，真皮由結(jié)締組織構(gòu)成。表皮和真皮都進(jìn)一步由皮下組織(脂肪組織內(nèi)層)支持。
表皮，皮膚的最上層，只有0.1至1.5毫米厚(Inlander，Skin，New York，NYPeople′s Medical Society，1-7(1998))。其由角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成并且基于其分化的狀態(tài)分為幾層。表皮可進(jìn)一步分為角質(zhì)層和由粒狀melphigian以及基底細(xì)胞組成的活表皮層。角質(zhì)層是吸濕的并且按重量計(jì)算需要至少10％的水分以維持其彈性和柔軟性。吸濕性部分歸因于角蛋白的保持水分的能力。角質(zhì)層失去其柔軟性和彈性時(shí)，其變得粗糙易碎，導(dǎo)致干性膚質(zhì)。
正好位于表皮下面的真皮為1.5至4毫米厚。其是皮膚的三層中最厚的一層。此外，真皮也包含大多數(shù)皮膚的結(jié)構(gòu)，包括汗腺和脂腺(其通過(guò)在皮膚稱為毛孔或粉刺的開(kāi)口分泌物質(zhì))、毛囊、神經(jīng)末梢和血管及淋巴管(Inlander，Skin，New York，NYPeople′s MedicalSociety，1-7(1998))。然而，真皮的主要成分是膠原和彈性蛋白。
皮下組織是皮膚的最深層。其充當(dāng)保持體溫的絕熱器和保護(hù)器官的減震器(Inlander，Skin，New York，NYPeople′s Medical Society，1-7(1998))。另外，皮下組織也貯存作為能源蘊(yùn)藏的脂肪。皮膚的pH一般在5和6之間。該酸性是由于存在來(lái)自皮脂腺分泌物的兩性氨基酸、乳酸和脂肪酸酸造成的。術(shù)語(yǔ)“酸性保護(hù)膜”是指皮膚的大多數(shù)區(qū)域上存在可溶于水的物質(zhì)。皮膚的緩沖能力部分歸因于貯藏在皮膚角質(zhì)層中的這些分泌物。
皺紋，老化證據(jù)標(biāo)志中的一個(gè)標(biāo)志，可以是由生物化學(xué)、組織學(xué)和生理學(xué)變化造成的，所述變化是從環(huán)境的破壞中積累的(Benedetto，International Journal of Dermatology，38641-655(1999))。此外，存在可導(dǎo)致面部皺紋的特征性折痕、折皺和摺痕的其他次要因素(Stegman等人，The Skin of the Aging Face CosmeticDermatological Surgery，第2版，St.Louis，MOMosby Year Book5-15(1990))。這些次要因素包括重力的恒定拉力、對(duì)皮膚的經(jīng)常性和恒定性定位壓力(即，在睡眠期間)，和由面部肌肉的收縮產(chǎn)生的反復(fù)的面部活動(dòng)(Stegman等人，The Skin of the Aging FaceCosmetic Dermatological Surgery，第2版，St.Louis，MOMosbyYear Book5-15(1990))。為了潛在地減緩一些老化的跡象，使用了不同的技術(shù)。這些技術(shù)從含有α羥酸和維生素A的面部保濕液到手術(shù)方法和神經(jīng)毒素的注射。
皮膚的一個(gè)基本功能是為潛在地對(duì)正常內(nèi)穩(wěn)態(tài)有害的水分和物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)提供屏障。沒(méi)有堅(jiān)韌的、半透性的皮膚，身體將很快脫水。皮膚幫助防止有害物質(zhì)進(jìn)入身體。盡管大多數(shù)物質(zhì)不能滲透過(guò)屏障，但已發(fā)展了許多策略來(lái)選擇性地增加皮膚的透性并獲得不同程度的成功。
因?yàn)锽TX不能有效地透過(guò)皮膚，為了提供治療有效量的BTX，目前必需將毒素注射入皮膚。美國(guó)食品和藥品管理局已批準(zhǔn)了用于這樣的治療皺紋的方法，現(xiàn)在市售用于該治療的BTX產(chǎn)品。在這些治療中，通過(guò)受到謹(jǐn)慎控制或監(jiān)控的注射來(lái)施用肉毒毒素，在治療部位上產(chǎn)生大的毒素源。然而，這樣的治療可能是不舒適的并且一般伴隨有一些疼痛。
因?yàn)槿舛径舅氐木植渴┯玫臒o(wú)痛性質(zhì)、更大的可覆蓋的治療表面積、配制具有更高比活性的純毒素的能力、減少的對(duì)應(yīng)用肉毒桿菌治療劑的培訓(xùn)、更少的起作用所必需的劑量和不需要大量的毒素來(lái)達(dá)到治療性臨床結(jié)果，所以其提供了更安全和更想要的可選擇的治療法。
由于例如減少患者的不適感的潛能，治療劑至血液中的直接施用和便于監(jiān)控遞送(通過(guò)使用特殊建造的設(shè)備和/或使用控釋制劑和技術(shù)進(jìn)行監(jiān)控)的有利因素的原因，其他治療劑的透皮施用也是極其吸引人的領(lǐng)域。想要舒適地施用的一種物質(zhì)是胰島素，其在許多情況下仍然必需通過(guò)注射(包括自我注射)施用。施用的簡(jiǎn)易性對(duì)更大的蛋白例如肉毒毒素也是有利的。不容易穿過(guò)皮膚但顯著小于胰島素或具有不同的物理化學(xué)性質(zhì)的其他藥劑從而在具有或不具有其他材料幫助該轉(zhuǎn)移的情況下具有不同的穿過(guò)皮膚的速率和能力。各藥劑和協(xié)助轉(zhuǎn)移的材料的其他相互作用對(duì)于各藥劑來(lái)說(shuō)是獨(dú)特的。
發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了這樣的組合物，其包含下列物質(zhì)的非共價(jià)復(fù)合物a)帶正電荷的主鏈；和b)至少兩個(gè)選自下列的成員i)具有數(shù)個(gè)附著的成像部分，或可選擇地?cái)?shù)個(gè)帶負(fù)電荷的成像部分的第一帶負(fù)電荷的主鏈；ii)具有數(shù)個(gè)附著的靶向部分，或可選擇地?cái)?shù)個(gè)帶負(fù)電荷的靶向部分的第二帶負(fù)電荷的主鏈；iii)至少一個(gè)選自RNA、DNA、核酶、經(jīng)修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉(zhuǎn)基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個(gè)駐留因子(persistence factor)的DNA；和v)具有數(shù)個(gè)附著的生物學(xué)試劑或帶負(fù)電荷的生物學(xué)試劑的第三帶負(fù)電荷的主鏈。
其中復(fù)合物攜帶凈正電荷和選自i)、ii)、iii)或v)的成員中的至少一個(gè)成員。
生物學(xué)試劑，在本發(fā)明的該方面，可以是治療劑或藥妝劑。當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“治療劑”或“生物活性蛋白”時(shí)，本發(fā)明明確地排除了只結(jié)合特異性的抗原但不具有其它生物活性的抗體片段。然而，因?yàn)檫m合于免疫的抗原具有其他生物活性例如產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因此這些仍屬于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)姆矫妗４送?，本發(fā)明包含通過(guò)結(jié)合特異性的抗原，從而阻斷配體結(jié)合或改變抗原的構(gòu)象而具有生物活性或治療效果的試劑。可選擇地，候選試劑可用于在體內(nèi)確定在這些非共價(jià)復(fù)合物中的效率。
在另一方面，本發(fā)明提供了這樣的組合物，該組合物包含帶正電荷的主鏈和至少一個(gè)選自RNA、DNA、核酶、經(jīng)修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉(zhuǎn)基因的cDNA的核酸成員的非共價(jià)復(fù)合物，所述主鏈具有至少一個(gè)附著的效能基團(tuán)。
在另一方面，本發(fā)明提供了在受試者中將生物學(xué)試劑遞送至細(xì)胞表面的方法，所述方法包括給所述受試者施用上述組合物。
在另一方面，本發(fā)明提供了用于制備藥物或藥妝組合物(cosmeceutical composition)的方法，所述方法包括將帶正電荷的主鏈成分和至少兩個(gè)選自下列的成員與藥物或藥妝可接受的載體組合形成具有凈正電荷的非共價(jià)復(fù)合物，前提是所述成員中的至少一個(gè)選自i)、ii)、iii)或v)
i)具有數(shù)個(gè)附著的成像部分，或可選擇地?cái)?shù)個(gè)帶負(fù)電荷的成像部分的第一帶負(fù)電荷的主鏈；ii)具有數(shù)個(gè)附著的靶向部分，或可選擇地?cái)?shù)個(gè)帶負(fù)電荷的靶向部分的第二帶負(fù)電荷的主鏈；iiii)至少一個(gè)選自RNA、DNA、核酶、經(jīng)修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉(zhuǎn)基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個(gè)駐留因子的DNA；和v)具有數(shù)個(gè)附著的生物學(xué)試劑或藥妝試劑，或帶負(fù)電荷的生物學(xué)藥劑或藥妝試劑的第三帶負(fù)電荷的主鏈；在另一方面，本發(fā)明提供了用于配制藥物或藥妝遞送組合物的試劑盒，所述試劑盒包括帶正電荷的主鏈成分和至少兩種選自上述i)組至v)組的成分，以及制備所述遞送組合物的說(shuō)明書。
在另一方面，本發(fā)明涉及這樣的組合物，該組合物包含具有生物活性的試劑例如胰島素、肉毒毒素、不會(huì)治療性地改變血糖水平的其他蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地用于免疫的試劑，以及這樣的載體，即所述載體包括具有此處描述的附著的帶正電荷的分支或“效能”基團(tuán)的主鏈的帶正電荷的載體。當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“治療劑”或“生物活性蛋白”時(shí)，本發(fā)明明確地排除了只結(jié)合特異性的抗原但不具有其它生物活性的抗體片段。然而，因?yàn)檫m合用于免疫的抗原具有其他生物活性例如產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因此這些仍屬于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)姆矫妗４送?，本發(fā)明包含通過(guò)結(jié)合特異性的抗原，從而阻斷配體結(jié)合或改變抗原的構(gòu)象而具有生物活性或治療效果的試劑。所述具有生物活性的試劑優(yōu)選地是胰島素、肉毒毒素(BTX)、用于免疫的抗原或某些抗真菌劑。合適的抗真菌劑包括，例如，兩性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶、依曲康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、灰黃霉素、咪康唑、制霉菌素、環(huán)吡酮等。最優(yōu)選的帶正電荷的載體是鏈較短的或鏈長(zhǎng)度中等的帶正電荷的多肽或帶正電荷的非肽聚合物，例如，聚烯化亞胺。當(dāng)具有生物活性的試劑是肉毒毒素時(shí)，本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的方法例如通過(guò)局部使用(優(yōu)選地對(duì)需要該治療的受試者或患者的皮膚使用)含有有效量的肉毒毒素的組合物來(lái)進(jìn)行肌肉麻痹、減少分泌過(guò)多或出汗、治療神經(jīng)疼痛或偏頭痛、減輕肌肉痙攣、預(yù)防或減輕痤瘡、或減輕或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。本發(fā)明也涉及用于產(chǎn)生美容和/或化妝效果的方法，例如通過(guò)給臉部局部使用肉毒毒素而不是通過(guò)注射入臉部肌肉來(lái)發(fā)揮作用。當(dāng)具有生物活性的試劑是胰島素時(shí)，本發(fā)明涉及通過(guò)對(duì)受試者的皮膚或上皮施用有效量的這樣的組合物來(lái)將胰島素透皮遞送入受試者的方法，所述組合物包含胰島素或胰島素和帶正電荷的主鏈的組合物。下面的蛋白具有廣泛不同的表面和物理化學(xué)性質(zhì)，所述蛋白與該相同試劑和本發(fā)明的載體的復(fù)合物相比，明顯地一般不能穿過(guò)皮膚或上皮從而是使該蛋白在降低血糖上不具有治療效果，這通常使得不能確定提供胰島素的透皮遞送的技術(shù)是否對(duì)任何其他蛋白具有陽(yáng)性結(jié)果。然而，本發(fā)明的載體令人相當(dāng)吃驚地能夠提供這樣的其他蛋白(包括，例如肉毒毒素)的透皮遞送，如此處所描述的，所述載體具有這樣的帶正電荷的主鏈，所述主鏈具有帶正電荷的分支基團(tuán)。使用檢測(cè)法例如實(shí)施例描述的檢測(cè)法可容易鑒定適合特定蛋白的透皮遞送的特定載體。這樣的蛋白可以，例如，是具有分子量超過(guò)50,000kD或低于20,000kD的大蛋白。如此處所用的，詞“治療”在血糖的意義上是指血糖水平上的降低，該降低足以在例如糖尿病患者中減輕高血糖癥的急性癥狀或體征。在本發(fā)明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結(jié)合是通過(guò)非共價(jià)相互作用結(jié)合的，其可包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力或其組合。在本發(fā)明的某些方面，明確地排除能夠獲得血糖的治療性改變的治療性蛋白的透皮遞送。如此處所用的，適合用于免疫的抗原性試劑可以是不會(huì)治療性地改變血糖水平的基于蛋白的抗原、非蛋白非核酸試劑或其雜合體。然而，編碼抗原的核酸明確地不適合用于本發(fā)明的組合物。因此，所包括的試劑是適合用于免疫的抗原自身。合適的抗原包括，例如，環(huán)境試劑、病原體或生物危害物質(zhì)(biohazard)的抗原。合適的試劑優(yōu)選地包括，例如，和肉毒中毒、瘧疾、狂犬病、炭疽、結(jié)核病相關(guān)的抗原，或和兒童免疫例如B型肝炎、白喉、百日咳、破傷風(fēng)、b型嗜血桿菌流行性感冒、滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹、水痘、肺炎球菌屬、A型肝炎和流感的免疫相關(guān)的抗原。
帶正電荷的載體或具有其帶正電荷的分支基團(tuán)的主鏈，如此處所描述的，其自身為新的化合物，并形成本發(fā)明的另一方面。
本發(fā)明也提供了制備藥物或藥妝組合物的方法，該方法包括組合載體和具有生物活性的試劑，所述載體包含帶正電荷的多肽或帶正電荷的非肽聚合物例如長(zhǎng)鏈聚烯化亞胺、所述多肽或非肽聚合物具有此處描述的帶正電荷的分支基團(tuán)或“效能”基團(tuán)，所述具有生物活性的試劑是例如，胰島素、肉毒毒素、不會(huì)治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地用于免疫的試劑。本發(fā)明也提供了用于制備或配制包含載體和治療性物質(zhì)的此等組合物的試劑盒、和生產(chǎn)可用的制劑所需的其它產(chǎn)品或可用于生產(chǎn)這樣的制劑的預(yù)混劑。這樣的試劑盒可由施藥器(applicator)或用于使用本發(fā)明的組合物或其組分以及方法的其他設(shè)備組成。如此處所用的，“設(shè)備”可以是指例如用于遞送或混合的儀器或施藥器或形成或使用本發(fā)明的組合物和方法的其他制備技術(shù)。
本發(fā)明也包括用于透皮施用具有生物活性的試劑的設(shè)備，所述試劑是例如胰島素、肉毒毒素、不會(huì)治療性改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地組合物中所包含的用于免疫的試劑，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含這樣的載體和剛剛提到的治療劑，所述載體包括優(yōu)選地從短鏈至中等鏈長(zhǎng)度的帶正電荷的多肽或更長(zhǎng)鏈的具有此處所定義的帶正電荷的分支基團(tuán)或“效能”基團(tuán)的非肽聚合載體。這些設(shè)備在結(jié)構(gòu)上可以如皮膚貼劑一樣簡(jiǎn)單，或可以是更復(fù)雜的設(shè)備，包括用于分配和監(jiān)控組合物分配的工具和任選地用于在一個(gè)或多個(gè)方面監(jiān)控受試者的狀況的工具，包括監(jiān)控受試者和正被分配的物質(zhì)的反應(yīng)。在本發(fā)明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結(jié)合是通過(guò)非共價(jià)相互作用結(jié)合的，該相互作用可包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力或其組合。
可選擇地，所述設(shè)備可只包含治療性的具有生物活性的試劑例如，胰島素、肉毒毒素、不會(huì)治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地用于免疫的試劑，可以分開(kāi)的方式將所述載體用于皮膚。因此，本發(fā)明也包含這樣的試劑盒，其包含通過(guò)皮膚分配藥物的設(shè)備和含有帶正電荷的載體或主鏈并適合用于受試者的皮膚或上皮的材料。
一般地，本發(fā)明也包含用于給需要其的受試者或患者施用具有生物活性的試劑的方法，所述試劑是例如，胰島素、肉毒毒素、不會(huì)治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地用于免疫的試劑，該方法一般包括施用和帶正電荷的多肽或非多肽聚合物例如聚烯化亞胺一起的有效量的所述具有生物活性的試劑，所述聚烯化亞胺具有此處描述的帶正電荷的分支基團(tuán)?！昂汀黄稹笔侵敢越M合方式將兩種成分-具有生物活性的試劑和帶正電荷的載體-一起施用，該方法可包括將其在組合物中混合，然后再將組合物給受試者施用，或?qū)⑵浞珠_(kāi)施用，但以使其一起作用，從而提供有效量的具有生物活性的試劑的必需遞送的方式分開(kāi)施用。例如，可首先將含有帶正電荷的載體的組合物用于受試者的皮膚，然后使用含有具有生物活性的試劑的皮膚貼劑或其他裝置。
本發(fā)明也涉及給上皮細(xì)胞施用具有生物活性的試劑的方法，所述試劑是例如，胰島素、肉毒毒素、不會(huì)治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地如此處所定義的用于免疫的試劑，所述上皮細(xì)胞包括除了皮膚上皮細(xì)胞外的上皮細(xì)胞，例如，眼上皮細(xì)胞或腸胃系統(tǒng)的細(xì)胞。
附圖概述

圖1表示用于本發(fā)明的組分的示意圖。
圖2表示本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方案的示意圖。
圖3-4表示含有如實(shí)施例2中所描述的大腸桿菌β半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒的透皮遞送的結(jié)果。
圖5表示含有如實(shí)施例3中所描述的大腸桿菌β半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒的透皮遞送的結(jié)果。
圖6表示含有如實(shí)施例4中所描述的大腸桿菌β半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒的透皮遞送的結(jié)果。
圖7表示含有如實(shí)施例5中所描述的肉毒毒素的透皮遞送的結(jié)果。
圖8是實(shí)施例6中所描述的肉毒毒素的透皮遞送的結(jié)果的照片。
圖9是這樣的兩種不同視野和不同放大倍數(shù)(圖框a和b 10X對(duì)圖框c和d 40X的放大倍數(shù))的照片描述，其描述了實(shí)施例9的成像復(fù)合物遵從具有熒光光學(xué)成像試劑(圖框b和d)的黑色素瘤色素細(xì)胞的明視野分布(圖框a和c)而分布。
發(fā)明描述總述本發(fā)明提供了成像試劑、基因或其他治療劑的選擇性、持久性的遞送的基于組分的系統(tǒng)?？赏ㄟ^(guò)在bedside制劑中設(shè)計(jì)想要的組分來(lái)選擇組合物的單個(gè)性狀。此外，在一個(gè)方面，在分開(kāi)的帶負(fù)電荷的主鏈上提供成像部分和特異性靶向部分，所述主鏈可與帶正電的主鏈形成非共價(jià)離子復(fù)合物。通過(guò)將這些組分置于帶負(fù)電荷的主鏈上，本發(fā)明避免了如其他策略(所述策略增加了復(fù)雜性和成本，以及將效能降低至這樣的水平，即由于空間限制的原因還沒(méi)有報(bào)導(dǎo)過(guò)成功的組合)所采用的將組分附著至帶正電的主鏈上的精確位置上。
在另一方面，通過(guò)單獨(dú)地使用某些帶正電荷的載體可透皮遞送某些物質(zhì)，而無(wú)需帶負(fù)電的主鏈的參與。在這些情況下，所述物質(zhì)和其衍生物具有足夠的負(fù)電荷和本發(fā)明的帶正電荷的載體非共價(jià)結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“足夠的”該意義上是指可通過(guò)例如顆粒尺寸或功能性分光光度學(xué)上的變化(和單獨(dú)的組分相比)來(lái)確定的結(jié)合。
圖1提供了對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解。在該圖中，組分顯示為(1)具有附著的帶正電荷的基團(tuán)(也稱作效能基團(tuán)，如附著至加黑的條塊的加黑的環(huán)所示)的固體主鏈，例如(Gly)n1-(Arg)n2(其中下標(biāo)n1是從3至大約5的整數(shù)，下標(biāo)n2是從大約7至大約17的奇整數(shù))或TAT結(jié)構(gòu)域；(2)具有附著的成像部分(附著至淺色的條塊的空心三角形)的短的帶負(fù)電荷的主鏈；(3)具有附著的靶向試劑和/或治療劑(附著至淺色的條塊的空心圓)的短的帶負(fù)電荷的主鏈；(4)寡核苷酸、RNA、DNA或cDNA(淺色的交叉影線的條塊)；和(5)編碼駐留因子的DNA(暗交叉影線條塊)。圖2舉例說(shuō)明多組分組合物的各種示例，其中所述基團(tuán)描述于圖1中。例如，在圖2中，舉例說(shuō)明第一多組分組合物，其中帶正電荷的主鏈和成像組分、靶向組分、寡核苷酸以及駐留因子結(jié)合。
舉例說(shuō)明被設(shè)計(jì)用于診斷/預(yù)后成像的第二多組分組合物。在該組合物中，帶正電荷的主鏈和成像組分以及靶向組分結(jié)合在一起。最后，舉例說(shuō)明用于基因遞送的第三多組分系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，在帶正電荷的主鏈、靶向組分、目的基因和編碼駐留因子的DNA之間形成復(fù)合物。本發(fā)明，在下面將更全面地描述，提供了許多用于治療和診斷程序的額外的組合物。
實(shí)施方案的描述組合物基于上述內(nèi)容，本發(fā)明在一個(gè)方面提供了包含下列物質(zhì)的非共價(jià)復(fù)合物的組合物a)帶正電荷的主鏈；和b)至少兩個(gè)選自下列的成員i)具有數(shù)個(gè)附著的成像部分或可選擇地?cái)?shù)個(gè)帶負(fù)電荷的成像部分的第一帶負(fù)電荷的主鏈；ii)具有數(shù)個(gè)附著的靶向試劑或可選擇地?cái)?shù)個(gè)帶負(fù)電荷的靶向部分的第二帶負(fù)電荷的主鏈；
iii)至少一個(gè)選自RNA、DNA、核酶、經(jīng)修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉(zhuǎn)基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個(gè)駐留因子的DNA；和v)具有數(shù)個(gè)附著的生物學(xué)試劑或帶負(fù)電荷的生物學(xué)試劑的第三帶負(fù)電荷的主鏈；其中所述復(fù)合物攜帶凈正電荷和至少一個(gè)選自i)、ii)、iii)或v)的成員。
在一組實(shí)施方案中，所述組合物包含至少三個(gè)選自組i)至v)的成員。在另一組實(shí)施方案中，所述組合物包含來(lái)自i)、ii)、iii)和iv)組的每一個(gè)組中的至少一個(gè)成員。在另一組實(shí)施方案中，所述組合物包含來(lái)自i)和ii)組的每一個(gè)組中的至少一個(gè)成員。在另一組實(shí)施方案中，所述組合物包含來(lái)自ii)、iii)和iv)組的每一組中的至少一個(gè)成員。
優(yōu)選地，帶正電荷的主鏈的長(zhǎng)度是來(lái)自b)組的成員的組合長(zhǎng)度的大約1至4倍?？蛇x擇地，所述帶正荷的主鏈的電荷是b)組的成員的組合電荷的大約1至4倍。在一些實(shí)施方案中，電荷密度是均勻的并且長(zhǎng)度和電荷比率近似相等?？苫诮M分的分子研究或可從組分的質(zhì)量來(lái)確定大小對(duì)大小(長(zhǎng)度)的比率。
“帶正電荷的”是指載體在至少一些溶液相條件下，更優(yōu)選地在一些生理可相容的條件下具有正電荷。更確切地，此處所用的“帶正電荷的”是指所述基團(tuán)含有在所有pH條件都帶電荷的官能團(tuán)，例如季胺，或含有可在某些溶液相條件下例如pH發(fā)生變化的條件下獲得正電荷的官能團(tuán)，在該情況下是伯胺。優(yōu)選地，此處所用的“帶正電荷的”是指具有在生理可相容條件下和陰離子結(jié)合的形為的基團(tuán)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言很明顯的是具有多個(gè)帶正電荷的部分的聚合物不必是同聚物。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，帶正電荷的部分的其他示例在現(xiàn)有技術(shù)中是熟知的并且可容易地使用。本發(fā)明中描述的其自身不具有治療活性的帶正電荷的載體是已在例如此處描述的組合物和方法中使用的新的化合物。因此，在本發(fā)明的另一方面，我們?cè)敿?xì)描述了這些新的化合物，其包括包含這樣的帶正電荷的主鏈和其自身不具治療性生物活性的任何載體，所述主鏈具有此處描述的附著的帶正電荷的分支基團(tuán)。當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“治療劑”或“具有生物活性的蛋白”時(shí)，本發(fā)明明確地排除了只結(jié)合特異性的抗原但不具有其它生物活性的抗體片段。然而，因?yàn)檫m合于免疫的抗原具有其他生物活性例如產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因此這些仍屬于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)姆矫妗４送?，本發(fā)明包含通過(guò)結(jié)合特異性的抗原，從而阻斷配體結(jié)合或改變抗原的構(gòu)象而具有生物活性或治療效果的試劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明在一個(gè)方面提供了這樣的組合物，該組合物包含具有生物活性的試劑，例如，胰島素、肉毒毒素、不會(huì)治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地用于免疫的試劑，以及包含帶正電荷的主鏈例如帶正電荷的多肽或非肽聚合物的載體，所述聚合物可以是異聚物或同聚物，例如，聚烯化亞胺、具有此處描述的帶正電荷的分支基團(tuán)或“效能”基團(tuán)的多肽或非肽聚合物。各基于蛋白的治療劑和非核酸非蛋白治療劑具有獨(dú)特的改變總的復(fù)合物特性的物理化學(xué)特性。這些帶正電荷的載體是下面被描述為帶正電荷的主鏈的材料中的一些材料。本發(fā)明也提供了施用治療有效量的此處提到的具有生物活性的試劑的方法，其包括給受試者(其可以是人或其他哺乳動(dòng)物)的皮膚或上皮施用具有生物活性的試劑和這樣的量的具有分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，所述量足以將具有生物活性的試劑透皮遞送給所述受試者。在該方法中，具有生物活性的試劑和帶正電荷的載體可用作預(yù)先混合的組合物，或可以分開(kāi)的方式給皮膚或上皮施用(例如，所述試劑可存在于皮膚貼劑中或其他裝置中，所述載體可含于液體或其他類型的組合物中，所述組合物在皮膚貼劑使用之前用于皮膚)。如此處所用的，詞“治療”在血糖的情況下是指血糖水平的降低，該降低足以在例如糖尿病患者中減輕高血糖癥的急性癥狀或體征。在本發(fā)明的某些方面，明確地排除能夠獲得血糖的治療性改變的治療性蛋白的透皮遞送。當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“治療劑”或“具有生物活性的蛋白”時(shí)，本發(fā)明明確地排除了只結(jié)合特異性的抗原但不具有其它生物活性的抗體片段。然而，因?yàn)檫m合于免疫的抗原具有其他生物活性例如產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因此這些仍屬于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)姆矫?。此外，本發(fā)明包含通過(guò)結(jié)合特異性的抗原，從而阻斷配體結(jié)合或改變抗原的構(gòu)象而具有生物活性或治療效果的試劑。如此處所用的，適合用于免疫的抗原性試劑可以是不會(huì)治療性地改變血糖水平的基于蛋白的抗原、非蛋白非核酸試劑或其雜合體。然而，編碼抗原的核酸明確地不適合用于本發(fā)明的組合物。因此，所包括的試劑是適合用于免疫的抗原自身。合適的抗原包括，例如，環(huán)境試劑、病原體或生物危害物的抗原。合適的試劑優(yōu)選地包括，例如，和肉毒中毒、瘧疾、狂犬病、炭疽、結(jié)核病相關(guān)的抗原，或和兒童免疫例如B型肝炎、白喉、百日咳、破傷風(fēng)、b型嗜血桿菌流行性感冒、滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒、麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、水痘、肺炎球菌屬、A型肝炎和流感的免疫相關(guān)的抗原。
帶正電荷的主鏈帶正電荷的主鏈(也稱作帶正電荷的“載體”)一般是線性的原子鏈，其在鏈上具有在生理pH下攜帶正電荷的基團(tuán)，或具有附著至從主鏈延伸出來(lái)的側(cè)鏈上的攜帶正電荷的基團(tuán)。優(yōu)選地，帶正電荷的主鏈自身不具有明確的酶促或生物活性。線性主鏈?zhǔn)翘細(xì)渲麈?，在一些?shí)施方案中，其被選自氮、氧、硫、硅和磷的雜原子間插。大多數(shù)主鏈原子通常是碳。此外，所述主鏈通常是重復(fù)單位(例如，氨基酸、聚(乙烯氧基)、聚(丙烯胺)、聚烯化亞胺等)的聚合物。在一組實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)蔷郾┌罚渲性S多胺的氮原子以攜帶正電荷的銨基(四取代的)形式存在。在另一實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)欠请木酆衔?，其可以是異聚合物或同聚合物，例如聚烯化亞胺，例如聚乙烯亞胺或聚丙烯亞胺，具有從大約10,000至大約2,500,000、優(yōu)選地從大約100,000至大約1,800,000，和最優(yōu)選地從大約500,000至大約1,400,000的分子量。在另一組實(shí)施方案中，所述主鏈已附著多個(gè)含有帶正電荷基團(tuán)(例如，銨基、吡啶基、基、锍基、胍基或amidinium基)的側(cè)鏈部分。該組實(shí)施方案中的側(cè)鏈部分可以在間隔上是一致的或可變的間距沿主鏈放置。此外，側(cè)鏈的長(zhǎng)度可以相似或不同。例如，在一組實(shí)施方案中，側(cè)鏈可以是具有從1至20個(gè)碳原子并在遠(yuǎn)端(遠(yuǎn)離主鏈)以上面提到的帶正電荷的基團(tuán)中的一個(gè)結(jié)束的線性的或分支的烴鏈。在本發(fā)明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結(jié)合是通過(guò)非共價(jià)相互作用結(jié)合的，所述相互作用可包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力或其組合。
在一組實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)蔷哂卸鄠€(gè)帶正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)(例如，賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、高精氨酸等)的多肽。優(yōu)選地，所述多肽具有從大約10,000至大約1,500,000，更優(yōu)選地從大約25,000至大約1,200,000，最優(yōu)選地從大約100,000至大約1,000,000的分子量。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，當(dāng)氨基酸用于本發(fā)明的該部分時(shí)，所述側(cè)鏈在附著的中心可具有D型或L型(R或S構(gòu)型)。
可選擇地，所述主鏈可以是多肽的類似物，例如類肽(peptoid)。參見(jiàn)，例如，Kessler，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32543(1993)；Zuckermann等人Chemtracts-Macromol.Chem.480(1992)；和Simon等人Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 899367(1992))。簡(jiǎn)而言之，類肽是多聚甘氨酸，其中側(cè)鏈附著至主鏈的氮原子而不是附著至α碳原子。如上所述，側(cè)鏈的部分通常以帶正電荷的基團(tuán)結(jié)尾以提供帶正電荷的主鏈組分。在例如美國(guó)專利號(hào)5,877,278中描述了類肽的合成。如此處所用的術(shù)語(yǔ)，具有類肽主鏈結(jié)構(gòu)的帶正電荷的主鏈被認(rèn)為是“非肽”，因?yàn)槠洳皇怯稍讦撂荚游恢蒙暇哂刑烊话l(fā)生的側(cè)鏈的氨基酸構(gòu)成的。
可應(yīng)用例如多肽的空間或電子模擬物來(lái)使用多種其他主鏈，其中肽的酰胺鍵由替代物取代，所述替代物是例如酯鍵、硫代酰胺(-CSNH-)、反向硫代酰胺(-NHCS-)、氨基亞甲基(-NHCH2-)或反向亞甲基氨基(-CH2NH-)、酮亞甲基(-COCH2-)、次膦酸(-PO2RCH2-)、磷酸酰胺和磷酸酰胺酯(-PO2RNH-)、反向肽(-NHCO-)、反式烯烴(-CR＝CH-)、氟代烯烴(-CF＝CH-)、二亞甲基(-CH2CH2-)、硫醚(-CH2S-)、羥亞乙基(-CH(OH)CH2-)、亞甲氧基(-CH2O-)、四唑(CN4)、亞磺酰胺基(-SO2NH-)、亞甲亞磺酰胺基(-CHRSO2NH-)、反向亞磺酰胺基(-NHS2-)，以及具丙二酸和/或gem-二氨基-烷基亞單位的主鏈，例如，由Fletcher等人((1998)Chem.Rev.98763)綜述的，和由其中引用的參考資料所詳細(xì)描述的。許多前述的替代物產(chǎn)生近似電子等排的(和形成于α氨基酸的主鏈相比)聚合物主鏈。
在上面提供的各主鏈中，可懸掛攜帶帶正電荷的基團(tuán)的側(cè)鏈基團(tuán)。例如，亞磺酰胺連接的主鏈(-SO2NH-和-NHSO2-)可具有附著至氮原子上的側(cè)鏈基團(tuán)。類似地，羥亞乙基(-CH(OH)CH2-)連接可攜帶附著至羥基取代基的側(cè)鏈基團(tuán)。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的合成方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地改造其他鍵合化學(xué)物質(zhì)以使其提供帶正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)沁@樣的多肽，所述多肽具有獨(dú)立地選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT或其片段、或觸角足(Antennapedia)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域、或其片段或組合的分支基團(tuán)(也稱為效能基團(tuán))，其中下標(biāo)n1是從0至20的整數(shù)，更優(yōu)選地是0至8的整數(shù)，更優(yōu)選地是2至5的整數(shù)，下標(biāo)n2獨(dú)立地是從大約5至大約25、更優(yōu)選地大約7至大約17、最優(yōu)選地大約7至大約13的奇整數(shù)。其他優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的實(shí)施方案，在所述實(shí)施方案中，HIV-TAT片段具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q，其中下標(biāo)p和q各獨(dú)立地是從0至20的整數(shù)，所述片段通過(guò)片段的C端或N端附著至主鏈。優(yōu)選的HIV-TAT片段是其中下標(biāo)p和q各自獨(dú)立地是0至8、更優(yōu)選地2至5的整數(shù)的片段。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，帶正電荷的側(cè)鏈或分支基團(tuán)是觸角足(Antp)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)、或其保持活性的片段。優(yōu)選地帶正電荷的載體以至少大約0.05％(總載體重量的百分比)、優(yōu)選地從大約0.05％至大約45％、最優(yōu)選地從大約0.1至大約30％重量的量的包含帶正電荷的側(cè)鏈分支基團(tuán)。對(duì)于具有式-(gly)n1-(arg)n2的帶正電荷的分支基團(tuán)，最優(yōu)選的量是從大約0.1至大約25％。
在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述主鏈部分是多聚賴氨酸，帶正電荷的分支基團(tuán)附著至所述賴氨酸側(cè)鏈氨基。用于該特別優(yōu)選的實(shí)施方案的多聚賴氨酸具有從大約10,000至大約1,500,000、優(yōu)選地從大約25,000至大約1,200,000，和最優(yōu)選的大約100,000至大約1,000,000的分子量。其可以是可商購(gòu)獲得(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)的多聚賴氨酸中的任一種，例如，具有MW＞70,000的多聚賴氨酸、具有70,000至150,000的MW的多聚賴氨酸、具有MW 150,000至300,000的多聚賴氨酸和具有MW＞300,000的多聚賴氨酸。多聚賴氨酸的恰當(dāng)選擇依賴于組合物的其余組分，要足以為組合物提供總的凈正電荷和提供這樣的長(zhǎng)度，該長(zhǎng)度優(yōu)選地是帶負(fù)電荷的組分的組合長(zhǎng)度的1至4倍。優(yōu)選的帶正電荷的分支基團(tuán)或效能基團(tuán)包括，例如，-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)或HIV-TAT。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)情L(zhǎng)鏈聚烯化亞胺例如聚乙烯亞胺，例如，具有大約1,000,000的分子量的聚乙烯亞胺。
這樣的帶正電荷的主鏈或載體分子是新的化合物并形成本發(fā)明的方面，所述主鏈或載體包含具有上述分支基團(tuán)的多肽或非肽聚合物例如聚烯化亞胺和上面提到的其他帶正電荷的主鏈。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，只有具有帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的載體是活性物質(zhì)的透皮遞送所必需的。在該情況的一個(gè)實(shí)施方案中，所述帶正電荷的載體是具有多個(gè)上述的帶正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)的多肽(例如，賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、高精氨酸等)。優(yōu)選地，所述多肽具有至少大約10,000的分子量。在該情況的另一個(gè)實(shí)施方案中，帶正電荷的載體是非肽聚合物例如具有至少大約100,000分子量的具有多個(gè)帶正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)的聚烯化亞胺。這些聚烯化亞胺包括聚乙烯亞胺和聚丙烯亞胺。在任一示例中，作為單獨(dú)的透皮遞送所唯一必需的試劑，所述帶正電荷的載體分子包含帶正電荷的分支或效能基團(tuán)、HIV-TAT或其片段、或觸角足PTD或其片段，所述分支或效能基團(tuán)包含-(gly)n1-(arg)n2，其中下標(biāo)n1是從0至20，更優(yōu)選地從0至8，更優(yōu)選地2至5的整數(shù)，下標(biāo)n2獨(dú)立地是從大約5至大約25，更優(yōu)選地從大約7至大約17和最優(yōu)選地從大約7至大約13的奇整數(shù)。優(yōu)選地，所述側(cè)鏈或分支基團(tuán)具有上述通式-(gly)n1-(arg)n2。其他優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的方案，在所述方案中，分支或效能基團(tuán)是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下標(biāo)p和q各自獨(dú)立地是從0至20的整數(shù)，所述片段通過(guò)該片段的C端或N端附著至載體分子。所述側(cè)鏈分支基團(tuán)可在附著的中心具有D型或L型(R或S構(gòu)型)。優(yōu)選的HIV-TAT片段是這樣的片段，在所述片段中，下標(biāo)p和q各自獨(dú)立地是從0至8、優(yōu)選地2至5的整數(shù)。其他優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的實(shí)施方案，在所述實(shí)施方案中，分支基團(tuán)是保持基團(tuán)活性的觸角足PTD基團(tuán)或其片段。這些在本領(lǐng)域中是已知的，例如根據(jù)Console等人，J.Biol.Chem.27835109(2003)。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體是具有附著至賴氨酸側(cè)鏈氨基的帶正電荷的分支基團(tuán)的多聚賴氨酸。用于該特別優(yōu)選的實(shí)施方案的多聚賴氨酸可以是可商購(gòu)(例如Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)獲得的多聚賴氨酸中的任一種，例如，具有MW＞70,000的多聚賴氨酸、具有70,000至150,000的MW的多聚賴氨酸、具有MW 150,000至300,000的多聚賴氨酸和具有MW＞300,000的多聚賴氨酸。然而，優(yōu)選的多聚賴氨酸具有至少大約10,000的MW。優(yōu)選的帶正電荷的分支基團(tuán)或效能基團(tuán)包括，例如，-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)、HIV-TAT或其片段、和觸角足PTD或其片段。
其他組分除了帶正電荷的主鏈組分外，本發(fā)明的多組分組合物還包含至少兩種選自下列的組分
i)具有數(shù)個(gè)附著的成像部分或可選擇地?cái)?shù)個(gè)帶負(fù)電荷的成像部分的第一帶負(fù)電荷的主鏈；ii)具有數(shù)個(gè)附著的靶向試劑或可選擇地?cái)?shù)個(gè)帶負(fù)電荷的靶向部分的第二帶負(fù)電荷的主鏈；iii)至少一個(gè)選自RNA、DNA、核酶、經(jīng)修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉(zhuǎn)基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個(gè)駐留因子的DNA；和v)具有數(shù)個(gè)附著的生物學(xué)試劑或帶負(fù)電荷的生物學(xué)試劑的第三帶負(fù)電荷的主鏈。
在此處描述的相關(guān)方面，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案或組合物中，帶正電荷的主鏈或載體可單獨(dú)地用于提供某些類型的物質(zhì)的透皮遞送。此處描述的具有生物活性的試劑的組合，例如，胰島素、肉毒毒素、不會(huì)治療性地改變血糖水平的蛋白、適合用于免疫的抗原、非蛋白非核酸試劑的組合，也可用于這些組合物。
帶負(fù)電荷的主鏈，當(dāng)用于攜帶成像部分、靶向部分和治療劑時(shí)，可以是具有多個(gè)在生理?xiàng)l件下攜帶負(fù)電荷的基團(tuán)的各種主鏈(類似于上述的主鏈)?？蛇x擇地，具有足夠表面負(fù)電荷的成像部分、靶向部分和治療劑不需要額外的主鏈的附著來(lái)和帶正電荷的主鏈通過(guò)離子相互作用結(jié)合，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。在該上下文中，足夠包含有這樣的意思，即成像部分、靶向部分或治療劑的表面存在合適密度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)，從而提供和上述的帶正電荷的主鏈的離子鍵。在這些情況下，所述物質(zhì)或其衍生物具有足夠的負(fù)電荷和本發(fā)明的帶正電荷的載體非共價(jià)地結(jié)合。可通過(guò)例如顆粒大小或功能分光光度學(xué)上的變化(和單獨(dú)的組分相比)來(lái)確定該上下文中的術(shù)語(yǔ)“足夠”。合適的帶負(fù)電荷的基團(tuán)是羧酸、次膦酸、膦酸或磷酸、亞磺酸或磺酸等。在一些實(shí)施方案中，帶負(fù)電荷的主鏈?zhǔn)枪押塑账帷Ｔ诹硪粚?shí)施方案中，帶負(fù)電荷的主鏈?zhǔn)枪烟?例如，葡聚糖)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，帶負(fù)電荷的主鏈?zhǔn)嵌嚯?例如，聚谷氨酸、聚天冬氨酸或這樣的多肽，即在所述多肽中，谷氨酸或天冬氨酸殘基被不帶電荷的氨基酸間插)。一般通過(guò)酯鍵將下面更詳細(xì)地描述的部分(成像部分、靶向部分和治療劑)附著至具有這些懸掛基團(tuán)的主鏈。可選擇地，打斷帶負(fù)電荷的氨基酸或懸掛在帶負(fù)電荷的主鏈的末端的氨基酸可用于附著成像部分和靶向部分，通過(guò)例如二硫鍵(通過(guò)半胱氨酸殘基)、酰胺鍵、醚鍵(通過(guò)絲氨酸或蘇氨酸羥基)等進(jìn)行附著?？蛇x擇地，在帶負(fù)電荷的聚合物不存在的情況下，所述成像部分和靶向部分自身可以是小陰離子?？蛇x擇地，所述成像部分、靶向部分和治療劑自身可通過(guò)共價(jià)修飾以提供足夠的表面帶負(fù)電荷的部分以和帶正電荷的主鏈通過(guò)離子相互作用結(jié)合，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。在這兩種情況下，所述物質(zhì)或其衍生物具有足夠的負(fù)電荷以和本發(fā)明的帶正電荷的載體非共價(jià)結(jié)合。在該上下文中，術(shù)語(yǔ)“足夠”是指可通過(guò)例如顆粒大小或功能性分光光度學(xué)上的變化(和單獨(dú)的組分相比)來(lái)確定的結(jié)合。
成像部分許多診斷或成像部分可用于本發(fā)明并以有效的量存在，該有效量依賴于進(jìn)行診斷或成像的病癥、施用的途徑、試劑和用于所述試劑的檢測(cè)的設(shè)備的靈敏性等。
合適的成像或診斷劑的示例包括不透射線的照影劑、順磁性照影劑、超順磁性照影劑、光學(xué)成像部分、CT造影劑和其他造影劑。例如，不透射線的照影劑(用于X射線成像)可包括無(wú)機(jī)和有機(jī)碘化合物(例如，泛影酸鹽)、不透射線的金屬和其鹽(例如，銀、金、鉑等)和其他不透射線的化合物(例如，鈣鹽、鋇鹽例如硫酸鋇、鉭和氧化鉭)。合適的順磁性照影劑(用于MR成像)包括二乙三胺五乙酸釓(Gd-DTPA)和其衍生物，和其他釓、錳、鐵、鏑、銅、銪、鉺、鉻、鎳和鈷復(fù)合物，包括和1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷基-N，N′，N″，N-四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷基-N，N′，N″-三乙酸(D03A)、1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷基-N，N′，N″-三乙酸(NOTA)、1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷基-N，N′，N″，N-四乙酸(TETA)、羥基芐基乙烯基-二胺二乙酸(HBED)等的復(fù)合物。合適的超順磁照影劑(用于MR成像)包括磁鐵礦、超順磁性氧化鐵、單晶氧化鐵，特別是可被附著至帶負(fù)電荷的主鏈的這些試劑中的各試劑的復(fù)合形式。其他合適的成像試劑是CT照影劑，包括碘化和非碘化以及離子化和非離子化的CT照影劑，以及照影劑例如自旋標(biāo)記物(spin-labels)或其他診斷上有效的試劑。合適的光學(xué)成像試劑包括例如選自Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Oregon green 488、Oregon green500、Oregon green 514、綠色熒光蛋白、6-FAM、Texas Red、Hex、TET和HAMRA的基團(tuán)。
診斷劑的其他示例包括編碼這樣的蛋白的標(biāo)記基因，當(dāng)所述蛋白在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，其可被容易地檢測(cè)到，其包括，但不限于，β-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、熒光素酶等。可使用各種標(biāo)記物，例如放射性核素、fluors、酶、酶底物、酶輔助因子、酶抑制劑、配體(特別是半抗原)等。其他有用的物質(zhì)是用放射性物質(zhì)或成分標(biāo)記的物質(zhì)，例如葡庚糖酸99mTc。
將成像部分附著至帶負(fù)電荷的主鏈的選擇依賴于許多條件。某些成像試劑在生理pH下是中性的，從而優(yōu)選地附著至帶負(fù)電荷的主鏈或經(jīng)共價(jià)修飾以包含足夠的上述帶負(fù)電荷的部分，從而保持和帶正電荷的載體的復(fù)合。其他成像試劑攜帶足夠的負(fù)電荷以使即使在缺少帶負(fù)電荷的主鏈的情況下仍保持和帶正電荷的載體的復(fù)合。在這些情況下，所述物質(zhì)或其衍生物具有足夠的負(fù)電荷以與本發(fā)明帶正電荷的載體非共價(jià)結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“足夠”在本上下文中是指這樣的結(jié)合，即該結(jié)合可通過(guò)例如顆粒尺寸或功能性分光光度學(xué)上的變化(和單獨(dú)的組分相比)來(lái)確定。這些帶負(fù)電荷的成像部分的示例包括磷酸鹽離子(用于磁共振成像)。
靶向試劑許多靶向試劑用于此處描述的組合物。一般地，如上面關(guān)于成像部分所述的，將靶向試劑附著至帶負(fù)電荷的主鏈。在某些實(shí)施方案中，靶向試劑和成像部分在結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)上是截然不同的。例如，成像部分和靶向試劑兩者不都是磷酸鹽。一般地，靶向試劑可以是任何這樣的成分，即該成分使得可能指導(dǎo)核酸、治療劑或組合物的其它組分轉(zhuǎn)移至特定位點(diǎn)或改變復(fù)合物的向性(和不具有靶向試劑的復(fù)合物的向性相比)。靶向試劑可以是細(xì)胞外靶向試劑，其可以使例如核酸轉(zhuǎn)移朝向某些類型的細(xì)胞或某些想要的組織(腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞、造血細(xì)胞等)。這樣的試劑也可以是細(xì)胞內(nèi)靶向試劑，其可使治療劑指向特定的細(xì)胞區(qū)室(例如，線粒體、細(xì)胞核等)。所述試劑最簡(jiǎn)單地也可以是小陰離子，其可憑借凈電荷的分布或改變凈電荷的分布來(lái)改變復(fù)合物的向性，使其從帶更高負(fù)電的細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)組分轉(zhuǎn)向更多的細(xì)胞種類或甚至特異性地離開(kāi)帶有最多負(fù)電的表面。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地將靶向試劑共價(jià)地或非共價(jià)地和本發(fā)明的帶負(fù)電荷的主鏈連接。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的模式，優(yōu)選地通過(guò)連接基團(tuán)將靶向試劑共價(jià)地附著至用作帶負(fù)電荷的主鏈成分的寡核苷酸、聚天冬氨酸、硫酸化或磷酸化的葡聚糖等。通過(guò)使用例如異雙功能連接性基團(tuán)(參見(jiàn)Pierce Chemical Catalog)將靶向試劑(以及其他生物學(xué)試劑)附著至核酸的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。在一組實(shí)施方案中，所述靶向試劑是用于提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染的融合肽，更確切地說(shuō)用于促進(jìn)組合物或其各種成分跨膜遷移，或者用于幫助從內(nèi)體外出或穿過(guò)核膜。所述靶向試劑也可以是存在于細(xì)胞類型的表面上的受體的細(xì)胞受體的配體，例如糖、運(yùn)鐵蛋白、胰島素或去唾液酸-血清類粘蛋白。這樣的配體也可以是細(xì)胞內(nèi)類型中的一種，例如促進(jìn)轉(zhuǎn)染的DNA在細(xì)胞核內(nèi)的積累的核定位信號(hào)(nls)序列。
用于本發(fā)明的內(nèi)容中的其他靶向試劑包括糖、肽、激素、維生素、細(xì)胞因子、寡核苷酸、小陰離子、脂質(zhì)或來(lái)源于這些成分的序列或片段并且該序列或片段使得能夠和其對(duì)應(yīng)的受體特異性結(jié)合。優(yōu)選地，所述靶向試劑是糖和/或肽，例如抗體或抗體片段、細(xì)胞受體的配體或其片段、受體或受體片段等。更優(yōu)選地，所述靶向試劑是生長(zhǎng)因子受體、細(xì)胞因子受體或細(xì)胞凝集素受體或粘著蛋白的受體的配體。靶向試劑也可以是使得可能靶向凝集素例如去唾液酸糖蛋白受體的糖，或可選擇地是使得可能靶向免疫球蛋白的Fc片段受體的抗體Fab片段。
在其他實(shí)施方案中，在缺少帶負(fù)電荷的主鏈的情況下使用靶向試劑。在該組實(shí)施方案中，靶向試劑攜帶足夠的帶負(fù)電荷的部分以保持和上述的帶正電荷的載體通過(guò)離子相互作用結(jié)合。在這些情況下，所述物質(zhì)或其衍生物具有足夠的負(fù)電荷以和本發(fā)明的帶正電荷的載體非共價(jià)結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“足夠”在本上下文中是指可通過(guò)例如顆粒尺寸或功能性分光光度學(xué)上的變化(和單獨(dú)的組分相比)來(lái)確定的結(jié)合。用于該組實(shí)施方案的合適的帶負(fù)電荷的靶向試劑是在生理學(xué)pH下具有凈負(fù)電荷的基于蛋白的靶向試劑和可促進(jìn)附著特定細(xì)胞表面的靶向試劑，例如小的聚陰離子，包括例如可以基于被靶向的細(xì)胞的凈表面電荷而改變靶向的磷酸、天冬氨酸和檸檬酸。
在本發(fā)明的組合物中，核酸可以是脫氧核糖核酸或核糖核酸，可包含天然的或人工來(lái)源的序列。更特別地，此處所用的核酸可包括基因組DNA、cDNA、mRNA、tRNA、rRNA、雜合序列或合成的或半合成的序列。這些核酸可以是人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒等來(lái)源的核酸。此外，所述核酸可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)獲得，特別是通過(guò)基因庫(kù)的篩選獲得，通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)混合的方法獲得，該混合方法包括對(duì)通過(guò)基因庫(kù)的篩選獲得的序列的化學(xué)或酶修飾。此外，可將核酸整合入載體，例如質(zhì)粒載體。
用于本發(fā)明的脫氧核糖核酸可以是單鏈或雙鏈的。這些脫氧核糖核酸也可編碼治療性基因、用于調(diào)控轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的序列、反義序列、結(jié)合其他細(xì)胞成分的區(qū)域等。合適的治療性基因基本上是編碼具有治療效果的蛋白產(chǎn)物的任何基因。如此被編碼的蛋白產(chǎn)物可以是蛋白、多肽、肽等。在某些情況下，所述蛋白產(chǎn)物可以是和靶細(xì)胞同源的(即其是當(dāng)靶細(xì)胞未表現(xiàn)病原性時(shí)，一般在靶細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物)。通過(guò)該方式，使用合適的核酸可增加蛋白的表達(dá)，使得可能例如在細(xì)胞中克服不充足的表達(dá)?？蛇x擇地，本發(fā)明提供了用于表達(dá)或可選擇地過(guò)量表達(dá)蛋白的組合物和方法，所述蛋白由于修飾的原因而失活或活性很低。因此治療性基因可以編碼細(xì)胞蛋白的突變體，該突變體具有增加的穩(wěn)定性、經(jīng)修飾的活性等。相對(duì)于靶細(xì)胞，所述蛋白產(chǎn)物也可以是異源的。在該情況下，表達(dá)的蛋白可以，例如，產(chǎn)生或提供細(xì)胞中缺少的活性，使其能夠抵抗病原或刺激免疫應(yīng)答。
更特別地，用于本發(fā)明的核酸是這樣的核酸，所述核酸編碼酶、血液衍生物、激素、淋巴因子、白細(xì)胞介素、干擾素、TNF、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)或其前體或合成的酶、或營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、VEGF、NT3、NT5、HARP/多效蛋白(pleiotrophin)；參與脂、選自載脂蛋白A-I、A-II、A-IV、B，C-I，C-II，C-III、D、E、F、G、H、J和apo(a)的載脂蛋白類型的代謝的蛋白、代謝酶，例如脂蛋白脂酶、肝脂酶、卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶、7-α-膽固醇羥化酶、磷脂酸磷酸酶或脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白例如膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、結(jié)合HDLs或選自例如LDL受體、乳糜微粒殘留物受體(chylomicron-remnant receptors)和清除受體(scavengerreceptors)相關(guān)的蛋白、肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白或minidystrophin、GAX蛋白、和粘液粘稠病相關(guān)的CFTR蛋白、腫瘤抑制基因p53、Rb、RaplA、DCC、k-rev；參與凝血的蛋白因子因子VII、VIII、IX；或所述核酸可以是參與DNA修復(fù)的基因、自殺基因(胸苷激酶、胞苷脫氨酶)、編碼血栓調(diào)節(jié)蛋白的基因、α1-抗胰蛋白酶、組織型纖溶酶原激活物、超氧化物歧化酶、彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等的基因。
用于本發(fā)明的治療性基因也可以是反義序列或這樣的基因，所述這樣的基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)使得可能控制基因的表達(dá)或細(xì)胞mRNA的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)專利EP140,308中描述的技術(shù)，這些序列可以例如在靶細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄成細(xì)胞mRNA的互補(bǔ)RNA，從而阻止其翻譯成蛋白。反義序列也包含編碼能夠選擇性地破壞靶RNA的核酶的序列(參見(jiàn)EP321,201)。
如上面所表明的，具有生物活性的試劑也可以包含一種或多種能夠在人或動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原性肽。在該特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明因此可能產(chǎn)生用于人或動(dòng)物的疫苗或免疫治療法，特別是抗微生物、病毒或癌癥的疫苗或免疫治療法。特別地，其可以是特異性針對(duì)EB病毒、HIV病毒、B型肝炎病毒(參見(jiàn)EP 185,573)、假狂犬病病毒或特異性針對(duì)腫瘤(參見(jiàn)EP 259,212)的抗原性肽。
優(yōu)選地，所述核酸也包含這樣的序列，所述序列使得治療性基因或編碼抗原性肽的基因在想要的細(xì)胞或器官中表達(dá)。這些序列可以是這樣的序列，當(dāng)所述序列能夠在被感染的細(xì)胞中發(fā)揮功能時(shí)，其天然地負(fù)責(zé)被考慮的基因的表達(dá)。所述核酸序列也可以是不同來(lái)源的序列(負(fù)責(zé)其他蛋白或甚至是合成的蛋白的表達(dá))。特別地，所述核酸可包含用于真核或病毒基因的啟動(dòng)子序列。例如，所述啟動(dòng)子序列可以是來(lái)源于想要被感染的細(xì)胞的基因組的啟動(dòng)子序列。類似地，所述啟動(dòng)子序列可以來(lái)源于病毒的基因組，例如，基因E1A、MLP、CMV、RSV等的啟動(dòng)子。此外，這些表達(dá)序列可通過(guò)加入激活序列、調(diào)控序列等來(lái)進(jìn)行修飾。
除此之外，所述核酸也可包含(特別是在治療性基因的上游)指導(dǎo)合成的治療性產(chǎn)物進(jìn)入靶細(xì)胞的分泌途徑的信號(hào)序列。該信號(hào)序列可以是治療性產(chǎn)物的天然信號(hào)序列，也可以是任何其他功能性信號(hào)序列或人工信號(hào)序列。
編碼至少一種駐留因子的DNA在一些實(shí)施方案中，組合物也包含編碼至少一種駐留因子的DNA。這樣的DNA的示例是編碼腺病毒終端前蛋白1(Adenoviralpreterminal protein 1)的DNA(參見(jiàn)，Lieber，等人NatureBiotechnology 15(13)1383-1387(1997))。腺病毒終端前蛋白1或編碼其的核酸可以順式或反式的方式提供給編碼想要的治療性轉(zhuǎn)基因的核酸序列。當(dāng)以這種方式提供時(shí)，終端前蛋白1或序列以穩(wěn)定的核附加體形式保存治療性核酸，從而防止了治療性核酸的丟失，從而防止以后治療性蛋白表達(dá)的減少。
生物學(xué)試劑許多生物學(xué)試劑，包括治療劑和藥妝劑，可用于本發(fā)明并且以有效的量存在，所述有效的量依賴于正被治療的病癥、預(yù)防的病癥或施藥的途徑、試劑的功效以及患者的大小和對(duì)治療方案的易感性。
可附著至帶負(fù)電荷的主鏈的合適的治療劑基本上可在任何種類的試劑中找到，包括，例如，止痛藥、鎮(zhèn)喘藥、抗生素、抗抑郁藥、抗糖尿病藥、抗真菌劑、止吐藥、抗高血壓藥、抗性無(wú)能藥、抗炎藥、抗腫瘤藥、抗HIV藥、抗病毒藥、anxiolytic agents、避孕藥、致育因子、抗血栓藥、prothrombotic agents、激素、疫苗、免疫抑制劑、維生素等?？蛇x擇地，可將足夠的帶負(fù)電荷的基團(tuán)引入治療劑以提供和上述帶正電荷的主鏈通過(guò)離子相用作用的復(fù)合。存在許多合適的方法例如磷酸化法或硫酸鹽化法，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
此外，某些試劑自身?yè)碛凶銐虻暮蜕鲜鰩д姾傻妮d體結(jié)合的帶負(fù)電荷的部分而不需要附著至帶負(fù)電荷的主鏈。在這些情況下，所述物質(zhì)或其衍生物具有足夠的負(fù)電荷以和本發(fā)明的帶正電荷的載體非共價(jià)地結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“足夠”在本上下文中是指可通過(guò)例如顆粒尺寸或功能性分光光度學(xué)上的變化(和單獨(dú)的組分相比)來(lái)確定的結(jié)合。
合適的藥妝劑包括，例如，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)以及人生長(zhǎng)激素、抗氧化劑和肉毒毒素。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“肉毒毒素”不僅包括肉毒桿菌血清型A、B、C、D、E、F和G，還包括其具有肉毒毒素輕鏈活性的片段。
更特別地，用于本發(fā)明的治療劑包括鎮(zhèn)痛藥如利多卡因、奴佛卡因、布比卡因、普魯卡因、丁卡因、苯佐卡因、可卡因、甲哌卡因、依替卡因、丙美卡因、羅哌卡因、丙胺卡因等；抗哮喘藥例如氮卓斯汀、酮替芬、曲撤諾、皮質(zhì)激素、色甘酸鈉、萘多羅米、沙丁胺醇、雙甲苯喘定甲磺酸鹽、吡布特羅、沙美特羅、terbutyline、膽茶堿等；抗生素藥例如新霉素、鏈霉素、氯胺苯醇、氟哌酸、環(huán)丙沙星、甲氧芐氨嘧啶、sulfamethyloxazole、β-內(nèi)酰胺類抗生素、四環(huán)素等；抗抑郁藥例如奈福泮、奧昔哌汀、米帕明、曲唑酮等；抗糖尿病藥例如雙胍、磺脲類藥等；止吐藥和抗精神病藥例如氯丙嗪、氟奮乃靜、奮乃靜、丙氯拉嗪、普魯本近、甲哌硫丙嗪、三氟丙嗪、氟派啶醇、東莨菪堿、地芬尼多曲美芐胺、曲美芐胺等；神經(jīng)肌肉因子例如阿曲庫(kù)、氯化米哇庫(kù)銨、羅庫(kù)溴銨、氯化琥珀膽堿、多沙氯銨、筒箭毒堿、和肉毒毒素(BTX)；抗真菌劑例如兩性霉素B、制霉素、殺念珠菌素、依曲康唑、酮康唑、咪康唑、克霉唑、氟康唑、環(huán)吡酮、益康唑、萘替芳、特比萘芬、灰黃霉素、環(huán)吡酮等；抗高血壓藥例如萘心安、普羅帕酮、氧烯洛爾(oxyprenolol)、尼非地平、利血平等；抗性無(wú)能藥例如一氧化氮供體等；抗炎藥包括固醇類抗炎藥例如可的松、氫化可的松、地塞米松、去氫氫化可的松、潑尼松、氟扎可等，和非固醇抗炎藥例如吲哚美辛、布洛芬、雷米那酮、prioxicam等；抗腫瘤藥例如阿霉素、環(huán)磷酰胺、放線菌素、博來(lái)霉素、duanorubicin、多柔比星、表柔比星、密吐霉素、雷帕霉素、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、卡鉑、卡莫司汀(BCNU)、順鉑、鬼臼乙叉甙、干擾素、苯芥膽甾醇、紫杉酚(包括類似物和衍生物)、喜樹堿和其衍生物、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿等；抗HIV藥(例如，antiproteolytics)；抗病毒藥例如金剛烷胺、甲吲噻蹤、碘苷、阿糖胞苷、阿昔洛維、泛西洛維、羥甲基無(wú)環(huán)鳥苷、膦甲酸、索利夫定、三氟尿苷、伐昔洛韋、西多福韋、地達(dá)諾新、司他夫定、扎西他賓、疊氮胸苷、三氮唑核苷、金剛乙胺等；抗焦慮藥(anxiolytic agents)例如硝苯呋海因、地西泮等；COX-2抑制劑；避孕藥例如孕激素等；抗血栓藥例如GPIIb/IIIa抑制劑、組織型纖溶酶原活化劑、鏈激酶、尿激酶、肝素等；prothrombotic劑例如凝血酶、因子V、VII、VIII等；激素例如胰島素、生長(zhǎng)激素、催乳素、EGF(表皮生長(zhǎng)因子)等；免疫抑制劑例如環(huán)孢霉素、硫唑嘌呤、咪唑立賓、FK506、潑尼松等；血管生成因子例如VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)；維生素例如A，D，E，K等；和其他治療性或藥物活性試劑。參見(jiàn)，例如，GOODMAN& GILMAN′S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OFTHERAPEUTICS，第9版，Hardman，等人，eds.McGraw-Hill，(1996)。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物學(xué)試劑選自胰島素、肉毒毒素、VEGF、用于免疫的抗原和抗真菌劑。
如上面對(duì)于靶向試劑和成像試劑所指出的，可在缺少帶負(fù)電荷的主鏈的情況下使用某些生物學(xué)試劑或藥妝劑。這些生物學(xué)試劑或藥妝劑是這樣的試劑，該試劑在生理pH下一般攜帶凈負(fù)電荷以保持和帶正電荷的載體的結(jié)合。示例包括肉毒毒素(大MW蛋白)、胰島素(小MW蛋白)、用于免疫的抗原，其可以在從非常小至非常大的范圍內(nèi)變化并且通常包括蛋白或糖蛋白和許多抗真菌劑。在這些情況下，所述物質(zhì)或其衍生物具有足夠的負(fù)電荷以和本發(fā)明的帶正電荷的載體非共價(jià)地結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“足夠”在本上下文中是指可通過(guò)例如顆粒尺寸或功能性分光光度學(xué)上的變化(和單獨(dú)的組分相比)來(lái)確定的結(jié)合。
具有附著的成像部分、靶向試劑或治療劑的帶負(fù)電荷的主鏈對(duì)于上面的三組組分，包括成像部分、靶向試劑和治療劑，單個(gè)的化合物可附著至帶負(fù)電荷的主鏈，通過(guò)共價(jià)修飾以引入帶負(fù)電荷的部分，或者可直接使用，如果該化合物含有足夠的帶負(fù)電荷的部分以提供和上述的帶正電荷的主鏈的通過(guò)離子作用的結(jié)合。必要時(shí)，一般地，通過(guò)用于將特定的試劑共價(jià)地附著(通過(guò)存在于所述試劑和主鏈上的官能團(tuán))至主鏈的連接性基團(tuán)進(jìn)行附著。許多連接性基團(tuán)可用于本發(fā)明的該方面。參見(jiàn)，例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，CA(1996)；Wong，S.S.，Ed.，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking，CRC Press，Inc.，Boca Raton，F(xiàn)L(1991)；Senter，等人，J.Org.Chem.552975-78(1990)；和Koneko，等人，Bioconjugate Chem.2133-141(1991)。
在一些實(shí)施方案中，治療劑、診斷劑或靶向試劑不具有可獲得的用于附著連接性基團(tuán)的官能團(tuán)，從而可首先經(jīng)修飾以引入例如羥基、氨基或硫醇取代基。優(yōu)選地，在試劑的非干擾部分提供所述取代基，所述取代基可用于附著連接性基團(tuán)，并且不會(huì)不利地影響試劑的功能。
在另一方面，本發(fā)明提供了這樣的組合物，該組合物包含具有至少一個(gè)附著的效能基團(tuán)的帶正電荷的主鏈和至少一個(gè)選自RNA、DNA、核酶、經(jīng)修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉(zhuǎn)基因的核酸的成員的非共價(jià)復(fù)合物。在本發(fā)明的該方面，帶正電荷的主鏈基本上可以是上述帶正電荷的主鏈中的任何一種，并且也包含(和上面選擇的主鏈一樣)至少一個(gè)附著的效能基團(tuán)。合適的效能基團(tuán)包括，例如，(Gly)n1-(Arg)n2，或TAT結(jié)構(gòu)域，其中下標(biāo)n1是從3至大約5的整數(shù)，下標(biāo)n2獨(dú)立地是從大約7至大約17的奇整數(shù)。此外，用于本發(fā)明的該方面的核酸和上面已描述的核酸相同。
胰島素和某些更大的分子的透皮遞送已發(fā)現(xiàn)上述帶正電荷的載體可用于胰島素和某些其他具有生物活性的試劑的透皮遞送，所述具有生物活性的試劑不會(huì)治療性地改變血糖水平，所述具有生物活性的試劑是例如具有大約50,000和以上的分子量的蛋白，例如，肉毒毒素(BTX)，或其他具有生物活性的試劑例如基于核酸的治療劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或用于免疫的試劑。帶正電荷的載體的使用可使蛋白或標(biāo)記基因都能運(yùn)入皮膚細(xì)胞或運(yùn)出皮膚細(xì)胞，和以有效量和活性形式將其遞送入深層組織。例如，可將胰島素通過(guò)皮膚遞送入深層毛細(xì)管，從而運(yùn)送遍布全身而無(wú)需注射?？蓪⑷舛径舅匾援a(chǎn)生麻痹、產(chǎn)生松弛、減緩收縮、預(yù)防或減輕痙攣、減少腺體分泌或提供其他想要的效果的有效量遞送至深層肌肉或皮膚內(nèi)的腺體。與可注射的或可移植的材料相比，特別是在肉毒毒素的情況下，以這種方式進(jìn)行的局部遞送可減少劑量、降低毒性和使得可以為想要的效果提供更精確的劑量最優(yōu)化。該實(shí)施方案可包含一些小的優(yōu)選多價(jià)的陰離子，例如，磷酸鹽、天冬氨酸鹽或檸檬酸鹽，或可在基本上缺少這樣的聚陰離子的情況下進(jìn)行該實(shí)施方案。在本發(fā)明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結(jié)合是通過(guò)非共價(jià)相互作用結(jié)合的，所述非共價(jià)相互作用可包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力，或其組合。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“肉毒毒素”是指任何已知的肉毒毒素的血清型，無(wú)論是通過(guò)細(xì)菌產(chǎn)生的還是通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的，以及以后可被發(fā)現(xiàn)的任何這樣的類型，包括基因工程產(chǎn)生的變體或融合蛋白。如上面所提到的，目前，已表征了七種免疫學(xué)上不同的肉毒神經(jīng)毒素，即A、B、C、D、E、F和G型肉毒神經(jīng)毒素血清型，其各自通過(guò)用類型特異性抗體進(jìn)行中和來(lái)區(qū)別。肉毒毒素血清型可從Sigma-Aldrich和從Metabiologics，Inc.(Madison，Wisconsin)以及從其他來(lái)源商購(gòu)獲得。肉毒毒素的不同血清型在其作用的動(dòng)物種類和在其引起的麻痹的嚴(yán)重度和持續(xù)時(shí)間上是不同的。目前，至少兩種類型的肉毒毒素，A型和B型，可以治療某些病癥的制劑形式商購(gòu)獲得。例如，在商標(biāo)為BOTOXO的Allergan的制劑中和商標(biāo)為DYSPORT的Ipsen的制劑中含有A型，而在商標(biāo)為MYOBLOC的Elan的制劑中含有B型。
用于本發(fā)明的肉毒毒素可以是肉毒毒素的衍生物，即其是這樣的化合物，所述化合物具有肉毒毒素活性，但和天然發(fā)生的或重組的天然的肉毒毒素相比，在任何部分或任何鏈上包含一種或多種化學(xué)或功能性改變。例如，肉毒毒素可以是經(jīng)修飾的神經(jīng)毒素，即其和天然的神經(jīng)毒素相比，至少具有一個(gè)氨基酸被刪除、被修飾或被替代，或經(jīng)修飾的神經(jīng)毒素可以是通過(guò)重組產(chǎn)生的神經(jīng)毒素或其衍生物或片段。例如，所述肉毒毒素可以是以這樣的方式修飾的肉毒毒素，所述方式是例如增強(qiáng)其特性或減少不想要的副作用，但仍保持想要的肉毒毒素活性的方式。如上所述，肉毒毒素可以是由細(xì)菌產(chǎn)生的肉毒毒素復(fù)合物中的任一種。可選擇地，肉毒毒素可以是使用重組或化學(xué)合成技術(shù)制備的毒素，例如，重組肽、融合蛋白或雜合的神經(jīng)毒素，例如從不同的肉毒毒素血清型的亞基或結(jié)構(gòu)域制備而來(lái)的(例如，參見(jiàn)美國(guó)專利6,444,209)。肉毒毒素也可以是完整的分子的部分，該部分經(jīng)顯示具有必需的肉毒毒素活性，在該情況下其自身可被使用或用作重組分子或復(fù)合分子例如融合蛋白的部分?？蛇x擇地，毒素的部分可直接地和此處描述的帶正電荷的主鏈在具有或不具有靶向部分的情況下一起使用，因?yàn)閹д姾傻闹麈溕踔猎谔烊坏腂TX結(jié)合、靶向或內(nèi)化結(jié)構(gòu)域不存在的情況下允許細(xì)胞內(nèi)化。可選擇地，肉毒毒素可以肉毒毒素前體(該前體自身可以是無(wú)毒的)的形式存在，例如無(wú)毒的鋅蛋白酶，其在蛋白水解斷裂后變得有毒。
本發(fā)明也涉及肉毒毒素的組合物和混合物的一般用途，不過(guò)由于其不同的性質(zhì)和特性，目前一般不施用肉毒毒素血清型的混合物。
類似地，術(shù)語(yǔ)“胰島素”包括從天然來(lái)源中提取的胰島素和可通過(guò)化學(xué)或重組的方法通過(guò)合成獲得的胰島素。胰島素也可以以經(jīng)修飾的形式存在，或者以例如重組肽、融合蛋白或雜合分子的形式存在，或在特定的情況下，胰島素可以是具有必需的活性的胰島素分子的部分。這對(duì)于可用于這些特定的透皮組合物和方法的其他蛋白，特別是用于免疫的在物理化學(xué)性質(zhì)上可發(fā)生很大變化的抗原同樣如此。同樣，可從天然來(lái)源獲得或可合成非蛋白非核酸治療劑，包括抗真菌劑。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選地以這樣的產(chǎn)品形式存在，該產(chǎn)品被用于受試者或患者即需要特定治療的人或其他哺乳動(dòng)物的皮膚或上皮。術(shù)語(yǔ)“需要”是指包括藥物和健康相關(guān)的需要以及想要更加美觀、更具美感或主觀的需要。肉毒毒素組合物也可用于例如改變或改善面部組織的外觀。
通過(guò)使用本發(fā)明的帶正電荷的載體，可將肉毒毒素給受試者透皮施用以治療病癥，所述病癥是例如不想要的面部肌肉或其他肌肉痙攣、多汗癥、痤瘡或身體中其他想要減輕肌肉疼痛或痙攣的部位的病癥。局部施用肉毒毒素以透皮遞送至肌肉或其他與皮膚相關(guān)的結(jié)構(gòu)中。可給例如腿、肩、背(包括下背部(lower back))、腋、掌、足、頸、腹股溝、手或足的背部、肘、上臂、膝蓋、大腿、臀部、軀干、骨盆或想要施用肉毒毒素的身體的其他部分。
也可進(jìn)行肉毒毒素的施用以治療其他病癥，包括治療神經(jīng)痛、預(yù)防或減輕偏頭痛或其他頭痛、預(yù)防或減輕痤瘡、預(yù)防或減輕無(wú)論是主觀性的還是臨床性的肌張力障礙(dystonia)或肌張力障礙收縮(dystonic contractions)、預(yù)防或減輕和主觀或臨床多汗癥相關(guān)的癥狀、減少分泌過(guò)多或出汗、降低或加強(qiáng)免疫應(yīng)答、或治療其他疾病(其是建議或進(jìn)行通過(guò)注射的肉毒毒素的施用來(lái)治療的病癥)。為了免疫相關(guān)的目的，也可施用肉毒毒素、對(duì)血糖水平不具治療性效果的其他治療性蛋白、此處描述的用于免疫的其他抗原或其他非核酸非蛋白治療劑，例如復(fù)合的肉毒毒素。可選擇地，可制備復(fù)合物并進(jìn)行局部施用以增強(qiáng)免疫應(yīng)答，例如提供有關(guān)各種蛋白的免疫，例如，無(wú)需注射的兒童免疫或抗各種環(huán)境危害物的免疫。令人驚奇的是，也可施用此處描述的肉毒毒素或其他治療性蛋白以降低免疫應(yīng)答。本發(fā)明可使BTX和其他蛋白通過(guò)改變了的施用途徑被遞送并改變所述試劑的復(fù)合抗原呈遞，從而可以用于減少對(duì)抗該蛋白的抗原的免疫應(yīng)答，從而有助于反復(fù)施用而不會(huì)產(chǎn)生與免疫相關(guān)的活性上的降低。
一般地，通過(guò)將待施用的胰島素、肉毒毒素或其他具有生物活性的試劑和帶正電荷的載體和通常地一種或多種額外的藥物可接受的載體或賦形劑混合來(lái)制備組合物，所述具有生物活性的試劑是例如不會(huì)治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的治療劑、非蛋白非核酸治療劑或用于免疫的試劑。在其最簡(jiǎn)單的形式中，其可包含可被緩沖的簡(jiǎn)單的水性藥物可接受的載體或稀釋劑，例如鹽水。然而，組合物可包含一般存在于局部藥物組合物或藥妝組合物中的其他成分，即皮膚或藥物可接受的載體、賦形劑或介質(zhì)，即和其施用的組織相容的載體、賦形劑或介質(zhì)。此處使用的術(shù)語(yǔ)“皮膚或藥物可接受的”是指此處描述的組合物或其組分適合用于和這些組織接觸，或用于患者而通常無(wú)過(guò)度的毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、過(guò)敏反應(yīng)等。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的組合物可包含常規(guī)地用于所述領(lǐng)域特別是藥妝和皮膚學(xué)領(lǐng)域中的任何組分。在本發(fā)明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結(jié)合是通過(guò)非共價(jià)相互作用結(jié)合的，所述相互作用包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力或其組合。
可預(yù)先配制組合物或在施用時(shí)制備組合物，例如，通過(guò)提供在施用時(shí)或施用前進(jìn)行組裝的試劑盒來(lái)進(jìn)行制備?？蛇x擇地，如上面所提到的，可以分開(kāi)的方式例如通過(guò)提供這樣的試劑盒來(lái)給患者施用肉毒毒素或其他治療性蛋白和帶正電荷的主鏈或載體，所述試劑盒包含含有治療性蛋白的皮膚貼劑或其他分配裝置和含有帶正電荷的載體(和任選地其他成分)的液體、凝膠、乳膏劑等。在該特定的實(shí)施方案中，通過(guò)給皮膚使用含有載體的液體或其他組合物，然后使用皮膚貼劑或其他裝置來(lái)施用組合物。
如此施用本發(fā)明的組合物，以使能夠施用有效量的胰島素、肉毒毒素或其他有益物質(zhì)。對(duì)于透皮遞送，術(shù)語(yǔ)“有效量”是指提供更多的具有生物活性的試劑的透皮遞送(和在缺少載體的情況下的試劑的透皮遞送相比)的任何組合物或方法。對(duì)于肉毒毒素，此處使用的術(shù)語(yǔ)“有效量”是指如上面所定義的這樣的量的肉毒毒素，該量的肉毒毒素足以產(chǎn)生想要的肌肉麻痹或其他效應(yīng)，但該量絕對(duì)是安全的量，即低至足以避免嚴(yán)重的副作用的量。想要的效果包括使某些肌肉松弛，其目的在于例如減少細(xì)紋和/或皺紋(特別是在臉部的)的出現(xiàn)、或以其他方式例如加寬眼睛、抬高嘴角、或使從上唇散開(kāi)的細(xì)紋平滑來(lái)調(diào)整面貌，或總體減緩肌肉緊張。最后提到的效果，即總體減緩肌肉緊張，可在臉部或其他部位例如在背部或腿部實(shí)現(xiàn)。對(duì)于胰島素，術(shù)語(yǔ)“有效量”類似地是指足以產(chǎn)生想要的效果即在患者或受試者的血液中降低葡萄糖的胰島素的量。對(duì)于抗原，“有效量”是指足以使受試者能夠在使用或系列使用抗原后產(chǎn)生對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的量。對(duì)于抗真菌劑，“有效量”是指足以減少真菌感染引起的癥狀或體征的量。對(duì)于不會(huì)治療性地改變血糖水平的其他具有生物活性的試劑而言，“有效量”是指這樣的量，即該量足以產(chǎn)生表征該試劑(例如Physicians′Desk Reference等中的試劑)的經(jīng)定義的生物學(xué)效果或治療效果而不引起明顯的毒性。當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“治療劑”或“具有生物活性的蛋白”時(shí)，本發(fā)明明確地排除了只結(jié)合特異性的抗原但不具有其它生物活性的抗體片段。然而，因?yàn)檫m合用于免疫的抗原具有其他生物活性例如產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因此這些仍屬于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)姆矫?。此外，本發(fā)明包含通過(guò)結(jié)合特異性的抗原，從而阻斷配體結(jié)合或改變抗原的構(gòu)象而具有生物活性或治療效果的試劑。
組合物可包含合適的有效量的胰島素、肉毒毒素或其他具有生物活性的試劑(例如，不會(huì)治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的治療劑、非蛋白非核酸治療劑或用于免疫的試劑)以單劑治療的方式進(jìn)行使用，或其可以是更濃縮的，以在施用的部位進(jìn)行稀釋的方式或以多次施用的方式進(jìn)行使用。一般地，含有肉毒毒素或其他具有生物活性的試劑(例如，不會(huì)治療性地改變血糖水平的治療性蛋白或基于核酸的治療劑)的組合物可含有按重量計(jì)算從大約1×10-20至大約25％的具有生物活性的試劑和從大約1×10-19至30％的帶正電荷的載體。一般地，含有非蛋白非核酸治療劑或用于免疫的試劑的組合物可含有按重量計(jì)算從大約1×10-1至大約49.9％的抗原和從大約1×10-9至大約50％的帶正電荷的載體。一般地，本發(fā)明的組合物以適合于給受試者施用的形式含有從大約0.001至大約10,000，優(yōu)選地從大約0.01至大約1,000IU/g的組合物(其是包含此處描述的肉毒毒素和帶正電荷的載體分子的組合物)。載體肉毒毒素的比例優(yōu)選地分別地在大約10∶1至大約1.01∶1范圍內(nèi)和更優(yōu)選地在大約6∶1至大約1.5∶1的范圍內(nèi)變動(dòng)。載體分子的量或其對(duì)肉毒毒素的比例依賴于所述組合物中選擇使用的載體。通過(guò)，例如進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)例如下面描述的實(shí)驗(yàn)可容易地確定在給定的情況下載體分子的合適的量或比例。
本發(fā)明的組合物使得可以遞送更純的具有更高比活、潛在地提高的藥物動(dòng)力學(xué)的肉毒毒素。此外，帶正電荷的載體減少了對(duì)外源輔助蛋白(例如，在400-600mg范圍內(nèi)變化的人血清白蛋白或在250-500mg范圍內(nèi)變化的重組血清白蛋白)和多糖穩(wěn)定劑的需要并且可有益地降低對(duì)BTX的免疫應(yīng)答。此外，所述組合物適合用于pH在4.5至6.3范圍內(nèi)變化的生理環(huán)境，因此其可具有這樣的pH。所述組合物優(yōu)選地可在室溫下或在冷藏的條件下貯存。
一般地如此使用包含肉毒毒素的組合物或裝置，以使其以這樣的劑量提供肉毒毒素，即每次使用每cm2的皮膚大約1U至大約20,000U、優(yōu)選地大約1U至大約10,000U的肉毒毒素。例如，優(yōu)選地可將這些范圍內(nèi)的較高劑量和例如控釋材料一起使用，或使得能夠在除去前在皮膚上停留更短的時(shí)間。
在胰島素的情況下，本發(fā)明的組合物含有從大約0.011U至大約5000U/克，優(yōu)選地從大約0.1U至大約500U/克的胰島素。包含此處描述的胰島素和帶正電荷的載體分子的形式的組合物優(yōu)選地分別具有從大約30∶1至大約1.01∶1范圍內(nèi)和更優(yōu)選地從大約6∶1至大約1.25∶1范圍內(nèi)變化的胰島素載體。同樣，載體分子的量或其對(duì)胰島素的比例依賴于所述組合物中選擇使用的載體。
根據(jù)其形式，本發(fā)明的組合物可包括溶液、乳液(包括微乳液)、懸浮液、乳膏劑、洗劑、凝膠、粉劑或其他類型的固體或液體組合物(用于可使用所述組合物的皮膚或其他組織)。除了肉毒毒素、胰島素或其他具有生物活性的試劑、和載體分子外，這些組合物可包含一般用于該產(chǎn)品的其他成分，例如抗微生物劑、增濕劑和水合劑、滲透劑、防腐劑、乳化劑、天然的或合成的油、溶劑、表面活性劑、去垢劑、膠凝劑、潤(rùn)滑藥劑、抗氧化劑、芳香劑、充填劑、增稠劑、石蠟、氣味吸收劑(odor absorbers)、染料、著色劑、粉劑、粘性控制劑和水，和任選地包含麻醉劑、止癢活性劑、植物萃取物、調(diào)節(jié)劑、暗化劑(darkening agent)或亮化劑(lightening agent)、吉洛特、濕潤(rùn)劑、云母、礦物質(zhì)、多酚、硅酮或其衍生物、防曬劑(sunblocks)、維生素和植物藥(phytomedicinals)。在本發(fā)明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結(jié)合是通過(guò)非共價(jià)相互作用結(jié)合的，其可包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力或其組合。
本發(fā)明的組合物可以控釋組合物或緩釋組合物的形式存在，其中將要遞送的胰島素、肉毒毒素或其他物質(zhì)和載體包囊化或裝入材料中，以使其在一段時(shí)間內(nèi)以受控的方式釋放至皮膚上?？蓪⒁f送的物質(zhì)和載體裝入基質(zhì)、脂質(zhì)體、小泡、微囊、微球體等，或裝入固體顆粒材料，所有這些材料都是被選擇和/或構(gòu)建來(lái)在一段時(shí)間內(nèi)釋放所述物質(zhì)的?？蓪⒅委熜晕镔|(zhì)和載體一起包囊化(例如，在相同的包囊中)或分開(kāi)包囊化(在分開(kāi)的膠囊中)。
當(dāng)然，給受試者施用本發(fā)明的組合物是本發(fā)明的另一方面。在肉毒毒素的情況下，最優(yōu)選地，或在醫(yī)生的指導(dǎo)下或在其他專業(yè)護(hù)理人員(health professional)的指導(dǎo)下施用或由所述人員施用所述組合物?？梢詥蝿┲委煹姆绞交蛞砸欢螘r(shí)間內(nèi)系列周期治療的方式施用其。對(duì)于為了上述目的的肉毒毒素的透皮遞送，在想要得到效果的部位上的皮膚局部施用上述組合物。因?yàn)槠湫再|(zhì)，最優(yōu)選地，應(yīng)當(dāng)非常小心地，以可產(chǎn)生想要的結(jié)果但不產(chǎn)生任何不利的或不想要的結(jié)果的施用速率和施用頻率施用所用的肉毒毒素的量。
在胰島素的情況下，對(duì)于住院治療的患者或門診患者(in-officetreatments)，按照專業(yè)護(hù)理人員(health care professional)的指導(dǎo)進(jìn)行施用或由專業(yè)護(hù)理人員進(jìn)行施用，然而在其他情況下可能由患者進(jìn)行施用。通過(guò)具有受控釋放和/或監(jiān)控的皮膚貼劑等方式的施用可能是普便的方法，因此本發(fā)明的含有胰島素的組合物通常以包含在皮膚貼劑或其他裝置中的形式提供。在適合用于免疫的抗原的情況下，最優(yōu)選地，通過(guò)或在醫(yī)生或其他專業(yè)護(hù)理人員的指導(dǎo)下施用所述組合物。其可以單次治療的方式或以在一段時(shí)間內(nèi)系列周期治療的方式進(jìn)行施用。因此，本發(fā)明也涉及緩釋組合物。對(duì)于為了上述目的適合用于免疫的抗原的透皮遞送，將上述的組合物局部地用于皮膚或甲板(nail plate)以及鄰近的皮膚。在非蛋白、非核酸治療劑例如抗真菌劑的情況下，優(yōu)選地，在醫(yī)生或其他專業(yè)護(hù)理人員的指導(dǎo)下施用所述組合物。其可以單次治療或以在一段時(shí)間內(nèi)系列周期治療的方式進(jìn)行施用。也涉及非蛋白、非核酸治療劑的緩釋組合物?？赏ㄟ^(guò)使用例如人造甲板、甲油(lacquer)、具有著色劑的指甲油、凝膠或這些材料中的任何一些材料或所有材料的組合來(lái)給指甲或腳趾指板或周圍的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)施用抗真菌劑。對(duì)于為了上述目的肉毒毒素的透皮遞送，將上述的組合物局部地給皮膚施用。
用于在專業(yè)護(hù)理人員指導(dǎo)下施用或由患者或受試者施用的本發(fā)明組合物的試劑盒也可包含適合于該目的定制的施藥器。術(shù)語(yǔ)“定制的施藥器”是指包括剛提到的用于施用抗真菌劑的手段。
在另一方面，一般地，本發(fā)明涉及用于上述的帶正電荷的載體和有效量的胰島素、肉毒毒素、適合用于免疫的抗原、抗真菌劑或其他具有生物活性的試劑的組合的局部施用的方法，所述其他具有生物活性的試劑是例如，不會(huì)治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的治療劑或非蛋白非核酸治療劑。如上所述，可通過(guò)使用包含適當(dāng)?shù)念愋秃土康倪@兩種物質(zhì)(確切地說(shuō)是載體和具有生物活性的試劑)的本發(fā)明的組合物來(lái)進(jìn)行施用。然而，本發(fā)明也包括以組合的方式施用這兩類物質(zhì)，盡管不一定以同一組合物的形式施用。例如，可將治療劑或具有生物活性的物質(zhì)以無(wú)水的形式整合入皮膚貼劑或其他分配裝置中，可在使用皮膚貼劑之前將帶正電荷的載體給皮膚表面施用，這樣可使所述兩類物質(zhì)共同作用，產(chǎn)生想要的透皮遞送。因此，在該意義上，所述兩類物質(zhì)，確切地說(shuō)是載體和具有生物活性的試劑，以組合的方式或結(jié)合的方式起作用，或可能相互作用以在原位形成組合物或組合。
制備組合物的方法在另一方面，本發(fā)明提供了用于制備藥物組合物的方法，該方法包括將帶正電荷的主鏈組分和至少兩種選自下列的成員與藥物可接受的載體組合以形成帶凈正電荷的非共價(jià)復(fù)合物，條件是所述成員中的至少一個(gè)選自i)、ii)、iii)或v)i)具有數(shù)個(gè)附著的成像部分或可選擇地?cái)?shù)個(gè)帶負(fù)電荷的成像部分的第一帶負(fù)電荷的主鏈；ii)具有數(shù)個(gè)附著的靶向部分或可選擇地?cái)?shù)個(gè)帶負(fù)電荷的靶向部分的第二帶負(fù)電荷的主鏈；iii)至少一個(gè)選自RNA、DNA、核酶、經(jīng)修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉(zhuǎn)基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個(gè)駐留因子的DNA；和v)具有數(shù)個(gè)附著的生物學(xué)試劑或帶負(fù)電荷的生物學(xué)試劑的第三帶負(fù)電荷的主鏈；在相關(guān)方面，如上所述，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案或組合物中，可單獨(dú)地使用帶正電荷的主鏈或載體以提供某些類型的物質(zhì)的透皮遞送。包含具有生物活性的試劑例如肉毒毒素或不降低血糖的其他治療性蛋白、包含按重量計(jì)算大約1×10-2至大約25％的所述具有生物活性的試劑和大約1×10-19至大約30％的帶正電荷的載體的組合物和方法在此處是優(yōu)選的。包含非核酸非蛋白的治療劑例如抗真菌劑或適合用于免疫的抗原、包含按重量計(jì)算大約1×10-10至大約49.9％的所述抗原和大約1×10-9至大約50％的帶正電荷的載體的組合物和方法也是優(yōu)選的。在本發(fā)明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結(jié)合是通過(guò)非共價(jià)相互作用結(jié)合的，該相互作用可包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力或其組合。
可容易地配制各種藥物組合物的這一易配性說(shuō)明了本發(fā)明的廣泛的可應(yīng)用性。一般地，通過(guò)將帶正電荷的主鏈組分和想要的目的組分(例如，DNA、靶向組分、成像組分或治療組分)按比例和順序混合以獲得具有可變的凈正電荷的組合物來(lái)制備組合物。在許多實(shí)施方案中，可通過(guò)例如在bedside使用用于組合物施用的藥物可接受的載體和稀釋劑來(lái)配制組合物?？蛇x擇地，可通過(guò)混合合適的組分來(lái)配制組合物，然后將其凍干和貯存(通常在室溫下或更低溫度下)直至使用或?qū)⑵渑渲迫牒线m的遞送載體中。
可配制組合物以提供適合于局部、皮膚、口、直腸、陰道、腸胃外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、透皮等途徑施用的混合物。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選地包含這樣的載體，所述載體對(duì)于可注射特別是用于直接注射入想要的器官或用于局部施用(至皮膚和/或粘膜)的制劑是藥物可接受的。特別地其可以是無(wú)菌的、等滲溶液或無(wú)水組合物，特別是冷凍干燥的組合物，依賴于具體情況，其通過(guò)加入無(wú)菌水或生理鹽水，可使所述冷凍干燥的組合物產(chǎn)生可注射的溶液。例如，可根據(jù)各種參數(shù)，特別是根據(jù)使用的施用模式、涉及的病癥、要表達(dá)的基因或想要的治療持續(xù)時(shí)間，來(lái)調(diào)整用于注射的核酸的劑數(shù)和施用的次數(shù)。
可選擇地，當(dāng)局部施用組合物時(shí)，例如，當(dāng)想要透皮遞送時(shí)，可將目的組分以無(wú)水的形式給皮膚施用，例如，通過(guò)使用皮膚貼劑施用，其中以分開(kāi)的方式用帶正電荷的主鏈或載體處理皮膚。通過(guò)該方式，所述完全的組合物基本上在原位形成并被施用給了患者或受試者。
使用組合物的方法遞送方法可使用各種方法在體內(nèi)或離體將本發(fā)明的組合物遞送至受試者、細(xì)胞或靶位點(diǎn)。事實(shí)上，可使用一般用于將組合物導(dǎo)入并使其最終和要治療的組織接觸的途徑中的任一途徑。優(yōu)選地，將組合物和藥物可接受的載體一起施用?？色@得施用這些化合物的合適的方法，所述方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的，并且，盡管可使用超過(guò)一條的途徑來(lái)施用特定的組合物，但和其他的途徑相比，特定的途徑通常可提供更直接或更有效的反應(yīng)。通過(guò)特定的要被施用的組合物和通過(guò)用于施用組合物的方法部分地確定藥物可接受的載體。因此，存在許多合適的本發(fā)明的藥物組合物的制劑(參見(jiàn)，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，第17版，1985)。
可通過(guò)例如靜脈內(nèi)、局部、腹膜內(nèi)、subdermal、皮下、透皮、肌內(nèi)、經(jīng)口、關(guān)節(jié)內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)或通過(guò)吸入進(jìn)行施用。因此合適的施用位點(diǎn)包括，但不限于皮膚、小支氣管、胃腸道、眼睛和耳朵。組合物一般包含常規(guī)的藥物載體或賦形劑，并且可額外地包含其他藥劑、載體、佐劑等。優(yōu)選地，按重量計(jì)算，本發(fā)明的制劑占組合物的大約5％至75％，剩余部分由合適的藥物賦形劑組成?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知的方法(參見(jiàn)，例如，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990))使合適的賦形劑與特定的組合物和施用途徑相適應(yīng)。
制劑可采用固體、半固體、冷凍干燥的粉劑、或液體劑型的形式例如片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、溶液、懸浮液、乳劑、栓劑、滯留型灌腸劑、乳膏劑、軟膏、洗劑、凝膠、氣霧劑等。在藥物組合物采用丸劑、片劑或膠囊劑的形式的實(shí)施方案中，制劑可包含具有生物活性的組合物和任何一種下列物質(zhì)稀釋劑例如乳糖、蔗糖、磷酸二鈣等；崩解劑例如淀粉或其衍生物；潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂等；和粘合劑例如淀粉、阿拉伯膠、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、纖維素和其衍生物。組合物可存在于單位劑量或多次劑量封閉的容器例如安瓿或小瓶中。給患者施用的劑量應(yīng)當(dāng)足以在一段時(shí)間內(nèi)在患者中達(dá)到有益的治療性反應(yīng)。當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“治療劑”或“生物活性蛋白”時(shí)，本發(fā)明明確地排除了只結(jié)合特異性的抗原但不具有其它生物活性的抗體片段。然而，因?yàn)檫m合用于免疫的抗原具有其他生物活性例如產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因此這些仍屬于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)姆矫?。此外，本發(fā)明包含通過(guò)結(jié)合特異性的抗原，從而阻斷配體結(jié)合或改變抗原的構(gòu)象而具有生物活性或治療效果的試劑。
在一些實(shí)施方案中，可給器官或培養(yǎng)細(xì)胞施用緩釋制劑或控釋制劑，所述制劑可攜帶想要的組合物?？赏ㄟ^(guò)例如注射給生物體的組織施用緩釋組合物?！熬忈尅?，其是指使組合物(優(yōu)選地編碼目的轉(zhuǎn)基因的核酸或生物學(xué)試劑或治療劑)能夠被周圍的組織或細(xì)胞吸收更長(zhǎng)的時(shí)間，該時(shí)間比通過(guò)施用粘性更低的介質(zhì)例如鹽溶液中的所述組合物所達(dá)到的時(shí)間更長(zhǎng)。
可將組合物單獨(dú)地或與其他合適的組分一起制成氣霧劑制劑(即，其可被“霧化”)，從而通過(guò)吸入法進(jìn)行施用。可將氣霧劑制劑置于加壓的可接受的推進(jìn)劑例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾戎小榱送ㄟ^(guò)吸入法進(jìn)行遞送，也可將組合物作為干粉遞送(例如，NektarTherapeutics，San Carlos，CA)。
適合腸胃外施用例如通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)和皮下途徑施用的制劑包括水性和非水性的、等滲無(wú)菌注射溶液和水性或非水性的無(wú)菌懸浮液，所述溶液可包含抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑、和使制劑和想要的患者的血液等滲的溶質(zhì)，所述懸浮液可包含懸浮劑、助溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。
施藥的其他方法包括，但不限于，使用血管成形氣囊、導(dǎo)管、凝膠制劑的施用。用于血管成形氣囊、導(dǎo)管和凝膠制劑遞送的方法在本領(lǐng)域是熟知的。
成像方法本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可使本發(fā)明的組合物適應(yīng)各種成像應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)使用基于組分的成像系統(tǒng)進(jìn)行虛擬結(jié)腸鏡術(shù)(Virtual Colonoscopy)。目前，虛擬結(jié)腸鏡術(shù)包括將造影劑注入結(jié)腸并在CT上顯現(xiàn)圖象，然后重構(gòu)3-D圖象。類似的技術(shù)可用于MR。然而，糞便、粘液和空氣都可充當(dāng)照影劑屏障，從而可給結(jié)腸壁的重建圖產(chǎn)生人為的表面。細(xì)胞靶向照影劑的加入可幫助克服這些障礙，從而提供真實(shí)的壁重建圖和幫助避免假陽(yáng)性以及假陰性。存在幾種可在此使用基于組分的系統(tǒng)的方法。最簡(jiǎn)單地，可將陽(yáng)離子功效主鏈和單一的照影劑一起使用，例如用于CT、MR或光學(xué)方法。從而可顯現(xiàn)出細(xì)胞表面層，任何不規(guī)則物或障礙物都詳盡地顯示于圖象重建圖中。然而，基于組分的系統(tǒng)提供了加入特定的第二試劑的額外選擇。該試劑由陽(yáng)離子功效主鏈、不同的成像部分和靶向組分(例如靶向兩個(gè)結(jié)腸癌的特征性抗原)組成。可這樣選擇成像部分(從簡(jiǎn)單的成像部分至診斷劑)以使一種為CT照影劑而另一種為MR照影劑，或使兩種都為MR照影劑，其中一種為T2試劑而另一種為T1試劑。以這種方式，可按照前面所述的方法重建表面，對(duì)于腫瘤抗原是特異性的任何區(qū)域可被顯現(xiàn)和覆蓋在原始的重建圖上。此外，也可將治療劑整合入靶向診斷系統(tǒng)中?？蓪㈩愃频牟呗杂糜诰窒扌阅c炎和潰瘍性結(jié)腸炎(與治療組合)?？蛇x擇地，可在例如黑色素瘤診斷或治療的情況下，使用優(yōu)選地和熒光成像部分組合的光學(xué)成像部分和檢測(cè)方法。所述光學(xué)成像劑可選自例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Oregon green 488、Oregon green 500、Oregon green 514、綠色熒光蛋白、6-FAM、TexasRed、Hex、TET和HAMRA。
實(shí)施例實(shí)施例1本實(shí)施例舉例說(shuō)明這樣的組合物，通過(guò)使用本發(fā)明的帶正電荷的主鏈或載體，所述組合物適合用于非常大的復(fù)合物，即包含藍(lán)色熒光蛋白(BFP)轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒，的透皮遞送。
主鏈的選擇通過(guò)將-Gly3Arg7共價(jià)地附著至多聚賴氨酸MW 150,000來(lái)裝配帶正電荷的主鏈，通過(guò)以18％的飽和度(即每100個(gè)賴氨酸殘基中有18個(gè)賴氨酸殘基共價(jià)附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側(cè)鏈的游離胺基來(lái)進(jìn)行該附著。將所述經(jīng)修飾的主鏈稱為“KNR2”以表示肽基載體的第二大小。對(duì)照聚陽(yáng)離子是相同大小的來(lái)自相同批次的未經(jīng)修飾的多聚賴氨酸(稱為“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。選擇另外的對(duì)照聚陽(yáng)離子Superfect(Qiagen)作為體外高轉(zhuǎn)染率的參照(即體外現(xiàn)有技術(shù)功效對(duì)毒性的同時(shí)的正對(duì)照和參照)，該聚陽(yáng)離子是被活化的基于樹枝狀高分子(dendrimer)的試劑。
治療劑的選擇使用包含由巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的藍(lán)色熒光蛋白(BFP)的完整的轉(zhuǎn)基因和部分側(cè)翼序列的8kb的質(zhì)粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。BFP用作已轉(zhuǎn)染細(xì)胞的可鑒定標(biāo)記，然后轉(zhuǎn)錄和翻譯該基因從而可在熒光顯微鏡下直接被觀察到(即無(wú)需另外的染色)。因此，只有這樣的細(xì)胞(即其中在有效載荷遞送(payloaddelivery)前所述復(fù)合物已穿過(guò)質(zhì)膜和核膜的細(xì)胞)可具有轉(zhuǎn)基因表達(dá)。該特定的質(zhì)粒具有大約2.64×106的分子量，從而被選擇用于估計(jì)通過(guò)這些復(fù)合物進(jìn)行的非常大的治療劑的遞送。
樣品的制備在各情況下，使用過(guò)量的聚陽(yáng)離子裝配具有過(guò)量正電荷的終復(fù)合物。盡管增加電荷密度增加了大小(即每個(gè)復(fù)合物上存在更多的主鏈)，但每個(gè)復(fù)合物的效能因子密度上的增加可抵消這些改變。因此，最優(yōu)選擇可在低比率(即基于大小)或高比率(即基于效能因子的密度)時(shí)發(fā)生，此處對(duì)KNR2的這兩個(gè)方面進(jìn)行了估計(jì)?；趶S商的推薦和以前對(duì)最大功效的報(bào)導(dǎo)來(lái)選擇K2的功效和Superfect的功效的最佳比率。將所有組的核酸治療劑的劑量標(biāo)準(zhǔn)化，也對(duì)在細(xì)胞培養(yǎng)物中待測(cè)的組合物的總體積和終pH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
制備下列混合物1)K2對(duì)0.5mg/mL表達(dá)由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的藍(lán)色熒光蛋白的質(zhì)粒的溶液，比率為4∶1。
2)KNR2對(duì)0.5mg/mL表達(dá)由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的藍(lán)色熒光蛋白的質(zhì)粒的溶液，比率為15∶1。
3)KNR2對(duì)0.5mg/mL表達(dá)由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的藍(lán)色熒光蛋白的質(zhì)粒的溶液，比率為10∶1。
4)KNR2對(duì)0.5mg/mL表達(dá)由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的藍(lán)色熒光蛋白的質(zhì)粒的溶液，比率為4∶1。
5)KNR2對(duì)0.5mg/mL表達(dá)由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的藍(lán)色熒光蛋白的質(zhì)粒的溶液，比率為1.25∶1。
6)廠商推薦的Superfect對(duì)0.5mg/mL表達(dá)由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的藍(lán)色熒光蛋白的質(zhì)粒的溶液，比率為5∶1。
細(xì)胞培養(yǎng)方案由對(duì)治療組不知情的觀測(cè)者進(jìn)行所有細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。在6孔板上，向70％匯合的HA-VSMC原代人大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(第21代；ATCC，Rockville，MD)中加入1.0mL的各溶液并在含有10％血清的M-199中在37℃和10％的CO2下培養(yǎng)48小時(shí)。也對(duì)未處理的對(duì)照小孔進(jìn)行估計(jì)，以每組n＝5個(gè)小孔對(duì)各組進(jìn)行估計(jì)。
效率分析由盲測(cè)者(blinded observer)在60度、180度和200度下使用帶有BFP濾鏡和平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡(plan apochromat lense)的NikonE600落射熒光顯微鏡從各小孔的上部獲得完整細(xì)胞板的低放大倍數(shù)照片(總計(jì)10X)。使用Image Pro Plus 3.0成像套件(image analysissuite)(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)確定總的呈陽(yáng)性的細(xì)胞面積的百分比。將該結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為各組的總的細(xì)胞面積，并記錄為基因遞送的效率(以可檢測(cè)水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因的總細(xì)胞的百分比)。
毒性分析隨后盲測(cè)者在染料排斥試驗(yàn)(可存活的細(xì)胞排斥染料，而不能存活的細(xì)胞不能排斥染料)中對(duì)小孔進(jìn)行估計(jì)，然后將小孔中的樣品溶解在0.4％的磷酸緩沖鹽溶液中的SDS中。在Spectronic Genesys 5UV/VIS分光光度計(jì)中在595nm波長(zhǎng)(藍(lán)色)處對(duì)樣品進(jìn)行估計(jì)以定量估計(jì)不能存活的細(xì)胞(作為轉(zhuǎn)染劑毒性的直接估量)。通過(guò)在OD595測(cè)量之前將濃度調(diào)整至與OD280值相匹配來(lái)將樣品標(biāo)準(zhǔn)化成同樣的細(xì)胞數(shù)目。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析盲測(cè)者通過(guò)使用Image Pro Plus軟件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)進(jìn)行分批圖象分析(batch image analysis)來(lái)確定總的陽(yáng)性染色并將其標(biāo)準(zhǔn)化為總的橫切面面積以確定各組的陽(yáng)性染色的百分比。隨后在單向ANOVA重復(fù)測(cè)量(one way ANOVA repeatedmeasures)中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進(jìn)行顯著性分析來(lái)確定各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
結(jié)果效率效率的結(jié)果如下(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)1)0.163±0.106％2)10.642±2.195％3)8.797±3.839％4)15.035±1.098％5)17.574±6.807％6)1.199±0.573％和單獨(dú)的多聚賴氨酸和Superfect相比，Runs #4和#5表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(P＜0.05，使用Fisher PLSD和TUKEY-A事后檢測(cè)法進(jìn)行單因子ANOVA重復(fù)測(cè)量)的基因遞送效率的增加。
毒性平均毒性數(shù)據(jù)如下(在OD595下以AU記錄的；低值，例如和單獨(dú)的鹽水一起存在，與低毒性關(guān)聯(lián)，而更高的值，例如在條件1下的，表明高細(xì)胞毒性)鹽水-0.057A；1)3.460A；2)0.251A；3)0.291A；4)0.243A；5)0.297A；6)0.337A。
結(jié)論用1.25至4.0的KNR2對(duì)DNA的比例可實(shí)現(xiàn)比對(duì)照(甚至目前的金標(biāo)準(zhǔn)Superfect的對(duì)照)毒性更小、效率更高的基因遞送。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了使用該載體將相當(dāng)大的治療性復(fù)合物遞送過(guò)膜的能力。
實(shí)施例2該實(shí)施例舉例說(shuō)明在一次施用后大的核酸通過(guò)本發(fā)明的載體穿過(guò)皮膚的運(yùn)輸。
主鏈選擇通過(guò)將-Gly3Arg7共價(jià)地附著至多聚賴氨酸MW 150,000來(lái)裝配帶正電荷的主鏈，通過(guò)以18％的飽和度(即每100個(gè)賴氨酸殘基中有18個(gè)賴氨酸殘基共價(jià)附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側(cè)鏈的游離胺基來(lái)進(jìn)行該附著。和前面一樣，所述經(jīng)修飾的主鏈被命名為“KNR2”。對(duì)照聚陽(yáng)離子是相同大小的和來(lái)自相同批次的未經(jīng)修飾的多聚賴氨酸(稱為“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。選擇另外的對(duì)照聚陽(yáng)離子Superfect(Qiagen)作為高轉(zhuǎn)染率的參照(即體外現(xiàn)有技術(shù)功效對(duì)毒性的同時(shí)的正對(duì)照和參照)，該聚陽(yáng)離子是被活化的基于樹枝狀高分子的試劑。
治療劑的選擇對(duì)于本實(shí)驗(yàn)，使用包含由巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的大腸桿菌β半乳糖苷酶(βgal)的完整轉(zhuǎn)基因和部分側(cè)翼序列的8.5kb的質(zhì)粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。此處βgal用作已轉(zhuǎn)染細(xì)胞的可鑒定標(biāo)記，然后轉(zhuǎn)錄和翻譯所述基因，在對(duì)所述外源酶進(jìn)行特異性染色后可直接觀察。因此，只有這樣的細(xì)胞(即其中在有效載荷遞送前所述復(fù)合物已穿過(guò)皮膚，然后到達(dá)靶細(xì)胞，并轉(zhuǎn)位通過(guò)質(zhì)膜和核膜的細(xì)胞)可具有轉(zhuǎn)基因表達(dá)。該特定的質(zhì)粒具有大約2,805,000的分子量。
樣品的制備在各情況下，使用過(guò)量的聚陽(yáng)離子裝配具有過(guò)量正電荷的終復(fù)合物。基于廠商的推薦和以前確定最大效率的體外實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)于K2的效率、KNR2的效率和Superfect的效率的最佳比率。將所有組的核酸治療劑的劑量標(biāo)準(zhǔn)化，也對(duì)要局部施用的組合物的總體積和終pH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如下制備樣品標(biāo)記為AK1的組將每個(gè)終等分(即總共80微克)8微克的βgal質(zhì)粒(p/CMV-sport-βgal)和肽基載體KNR2以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。為進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將所得的組合物和1.8ml Cetaphil增濕劑混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
標(biāo)記為AL1的組將每個(gè)終等分(即總共80微克)8微克的βgal質(zhì)粒(p/CMV-sport-βgal)和K2以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。為進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將所得的組合物和1.8mlCetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
標(biāo)記為AM1的組將每個(gè)終等分(即總共80微克)8微克的βgal質(zhì)粒(p/CMV-sport-βgal)和Superfect以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽稀釋至200微升。為進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將所得的組合物和1.8mlCetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
在用肽基載體和核酸治療劑進(jìn)行一次處理后確定透皮遞送效率的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在處理期間通過(guò)吸入異氟烷麻痹動(dòng)物。在被麻痹后，對(duì)C57 black6小鼠(每組n＝4)的背部皮膚的顱部分(之所以選擇該部分是因?yàn)樾∈蟛荒苡米旎蛩闹_(dá)到該區(qū)域)施用200微升劑量的適當(dāng)處理物。動(dòng)物不進(jìn)行脫毛處理。動(dòng)物在受控的加熱環(huán)境中恢復(fù)以預(yù)防體溫過(guò)低，在有所反應(yīng)后，任意提供食物和水過(guò)夜。處理后24小時(shí)，通過(guò)吸入CO2對(duì)小鼠實(shí)行安樂(lè)死，由盲測(cè)者收獲完整厚度的經(jīng)處理的皮膚部分。將經(jīng)處理的部分分成三個(gè)等分，用10％的中性緩沖的福爾馬林固定顱部分12-16小時(shí)，然后貯存在70％的乙醇中直至石蠟包埋。如先前所描述的，對(duì)中心部分進(jìn)行快速冷凍并將其直接用于在37℃下在切片上進(jìn)行β半乳糖苷酶染色(Waugh，J.M.，M.Kattash，J.Li，E.Yuksel，M.D.Kuo，M.Lussier，A.B.Weinfeld，R.Saxena，E.D.Rabinovsky，S.Thung，S.L.C.Woo，和S.M.Shenaq.LocalOverexpression of Tissue Plasminogen Activator to PreventArterial Thrombosis in an in vivo Rabbit Model.Proc Natl AcadSci USA.199996(3)1065-1070.還有Elkins CJ，Waugh JM，Amabile PG，Minamiguchi H，Uy M，Sugimoto K，Do YS，Ganaha F，Razavi MK，Dake MD.Development of aplatform to evaluate andlimit in-stent restenosis Tissue Engineering 2002.Jun；8(3)395-407)。將經(jīng)處理的尾部節(jié)段進(jìn)行快速冷凍以進(jìn)行溶解研究。
毒性通過(guò)在成對(duì)的切片上進(jìn)行染料排斥實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)上述接受功效分析的組進(jìn)行毒性估計(jì)。切片只進(jìn)行針對(duì)效率的染色或針對(duì)毒性的染色，因?yàn)樵摲椒▽?duì)同時(shí)進(jìn)行兩種染色是不可靠的。對(duì)于毒性分析，將切片浸沒(méi)在排斥染料中5分鐘，然后在37℃下在10％的CO2下溫育30分鐘。在該時(shí)間期間不排斥染料的任何細(xì)胞被認(rèn)為是不能存活的細(xì)胞。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析由盲測(cè)者進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和圖象分析。在具有平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡的Nikon E600顯微鏡上對(duì)整個(gè)如上染色的切片照相。使用前述的ImagePro Plus軟件對(duì)所得的圖象進(jìn)行分批圖象分析處理，用手工確認(rèn)法確定β半乳糖苷酶活性(藍(lán)色，使用此處使用的底物法)或細(xì)胞毒性的陽(yáng)性數(shù)。通過(guò)核固紅染色法將這些結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為各組的細(xì)胞的總的橫切面數(shù)目，將所述結(jié)果以呈陽(yáng)性染色的橫切面的百分比列表。然后，在單向ANOVA重復(fù)測(cè)量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進(jìn)行顯著性分析來(lái)確定各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。
結(jié)果結(jié)果歸納在下面的表中并在圖3中進(jìn)行說(shuō)明。和K2(基本上為陰性對(duì)照)以及用作功效的基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的Superfect相比，帶正電荷的肽基透皮遞送載體在遞送效率和轉(zhuǎn)基因表達(dá)上獲得了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加。盡管相對(duì)于K2，Superfect確實(shí)獲得了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的提高，但在該模型系統(tǒng)中，和Superfect相比，KNR2在遞送效率上獲得了超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)的提高。
實(shí)施例2處理組的以總數(shù)目的百分比表示的β半乳糖苷酶呈陽(yáng)性的細(xì)胞的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
P＝0.0001(置信度99％時(shí)是顯著的)毒性的結(jié)果示于圖4，該圖描述了處理后24小時(shí)不能存活的總面積的百分比。此處，和KNR2或Superfect相比，K2表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的細(xì)胞毒性，即使是在這樣的劑量上亦如此，在該劑量上，前人報(bào)道K2具有較低的轉(zhuǎn)運(yùn)效率(Amabile，P.G.，J.M.Waugh，T.Lewis，C.J.Elkins，T.Janus，M.D.Kuo，和M.D.Dake.IntravascularUltrasound Enhances in vivo Vascular Gene Delivery.J.Am.Col.Cardiol.2001 June；37(7)1975-80)。
結(jié)論肽基透皮載體可高效地將大的復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)皮膚，特別是在以前所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和總的復(fù)合物的大小受到限制的情況下。此處使用陽(yáng)性面積而非陽(yáng)性數(shù)目進(jìn)行分析是因?yàn)?1)所述方法被大大簡(jiǎn)化并且在圖象分析中具有大的精確性，(2)已在II.B中結(jié)論性地提供了效率的點(diǎn)證明，(3)面積測(cè)量值為理解體內(nèi)結(jié)果提供了更廣的范圍，因?yàn)榉羌?xì)胞組分占據(jù)了橫切面的相當(dāng)部分，和(4)有助于和更大的非肽基載體復(fù)合物的比較。
實(shí)施例3本實(shí)施例舉例說(shuō)明在連續(xù)七天的應(yīng)用中使用本發(fā)明的帶正電荷的肽基載體將大的基于核酸的治療劑穿過(guò)皮膚的透皮遞送。
主鏈的選擇通過(guò)將-Gly3Arg7共價(jià)地附著至多聚賴氨酸MW 150,000來(lái)裝配帶正電荷的主鏈，通過(guò)以18％的飽和度(即每100個(gè)賴氨酸殘基中有18個(gè)賴氨酸殘基共價(jià)附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側(cè)鏈的游離胺基來(lái)進(jìn)行該附著。所述經(jīng)修飾的主鏈被命名為“KNR2”。對(duì)照聚陽(yáng)離子是相同大小的和來(lái)自相同批次的未經(jīng)修飾的多聚賴氨酸(稱為“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
治療劑的選擇對(duì)于本實(shí)驗(yàn)，使用包含由巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的大腸桿菌β半乳糖苷酶(βgal)的完整轉(zhuǎn)基因和部分側(cè)翼序列的8.5kb的質(zhì)粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。該特定的質(zhì)粒具有大約2,805,000的分子量，從而被選擇用來(lái)估計(jì)通過(guò)肽基載體進(jìn)行的非常大的治療劑穿過(guò)皮膚的遞送。
樣品的制備在各情況下，使用過(guò)量的聚陽(yáng)離子裝配具有過(guò)量正電荷的終復(fù)合物。選擇實(shí)驗(yàn)比例以比較前面的實(shí)驗(yàn)中提出的單劑實(shí)驗(yàn)。將所有組的核酸治療劑的劑量標(biāo)準(zhǔn)化，也對(duì)要局部施用的組合物的總體積和終pH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如下制備樣品標(biāo)記為AK1的組將每個(gè)終等分(即總共240微克)8微克的βgal質(zhì)粒(p/CMV-sport-βgal)和肽基載體KNR2以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽稀釋至600微升。為進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
標(biāo)記為AL1的組將每個(gè)終等分(即總共240微克)8微克的βgal質(zhì)粒(p/CMV-sport-βgal)和K2以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。為進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
在用肽基載體和核酸治療劑進(jìn)行7次每天一次的處理后確定累積的透皮遞送效率的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在處理期間通過(guò)吸入異氟烷麻痹動(dòng)物。在被麻痹后，對(duì)C57 black6小鼠(每組n＝4)的背部皮膚的顱部分(之所以選擇該部分是因?yàn)樾∈蟛荒苡米旎蛩闹_(dá)到該區(qū)域)施用200微升劑量的適當(dāng)處理物。動(dòng)物不進(jìn)行脫毛處理。將動(dòng)物在受控的加熱環(huán)境中恢復(fù)以預(yù)防體溫過(guò)低，在有反應(yīng)后，任意提供食物和水過(guò)夜。在每天大致相同的時(shí)刻每天一次地重復(fù)該處理7天。在7天的處理后，通過(guò)吸入CO2對(duì)小鼠實(shí)行安樂(lè)死，由盲測(cè)者收獲完整厚度的經(jīng)處理的皮膚部分。將經(jīng)處理的部分分成三個(gè)等分，在10％的中性緩沖的福爾馬林中固定顱部分12-16小時(shí)，然后貯存在70％的乙醇中直至石蠟包埋。如前所述，對(duì)中心部分進(jìn)行快速冷凍并將其直接用于在37℃下在切片上進(jìn)行β半乳糖苷酶染色。將經(jīng)處理的尾部節(jié)段進(jìn)行快速冷凍以進(jìn)行溶解研究。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析由盲測(cè)者進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和圖象分析。在具有平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡的Nikon E600顯微鏡上對(duì)整個(gè)如上染色的切片照相。和前面一樣，使用Image Pro Plus軟件對(duì)所得的圖象進(jìn)行分批圖象分析處理，用手工確認(rèn)法確定對(duì)于β半乳糖苷酶活性是陽(yáng)性的面積。將這些結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為各組的總的橫切面面積，將所述結(jié)果以呈陽(yáng)性染色的橫切面的百分比列表。然后，在單向ANOVA重復(fù)測(cè)量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進(jìn)行顯著性分析來(lái)確定各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
結(jié)果將結(jié)果歸納于下面的表中并在圖5中進(jìn)行說(shuō)明。和K2相比，肽基透皮遞送載體在遞送效率和轉(zhuǎn)基因表達(dá)上獲得了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加。
實(shí)施例3在7次每天一次的施用后各處理組的以總面積的百分比表示的累積的β半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
P＝0.0012(置信度為99％時(shí)是顯著的)實(shí)施例4(非肽基載體)本實(shí)施例舉例說(shuō)明在連續(xù)七天的應(yīng)用中使用本發(fā)明的帶正電荷的非肽基載體將大的基于核酸的治療劑穿過(guò)皮膚的透皮遞送。
主鏈選擇通過(guò)將-Gly3Arg7共價(jià)地附著至聚乙烯亞胺(PEI)MW 1,000,000來(lái)裝配帶正電荷的主鏈，通過(guò)以30％的飽和度(即每100個(gè)賴氨酸殘基中有30個(gè)賴氨酸殘基共價(jià)附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至PEI側(cè)鏈的游離胺基來(lái)進(jìn)行該附著。所述經(jīng)修飾的主鏈被命名為“PEIR”以表示大的非肽基載體。對(duì)照聚陽(yáng)離子是相同大小的和來(lái)自相同批次的未經(jīng)修飾的PEI(稱為“PEI”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
治療劑的選擇對(duì)于本實(shí)驗(yàn)，使用包含由巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的大腸桿菌β半乳糖苷酶(βgal)的完整轉(zhuǎn)基因和部分側(cè)翼序列的8.5kb的質(zhì)粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。該特定的質(zhì)粒具有大約2,805,000的分子量。
樣品的制備在各情況下，使用過(guò)量的聚陽(yáng)離子裝配具有過(guò)量正電荷的終復(fù)合物。將所有組的核酸治療劑的劑量標(biāo)準(zhǔn)化，也對(duì)要局部施用的組合物的總體積和終pH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如下制備樣品標(biāo)記為AS的組將每個(gè)終等分(即總共240微克)8微克的βgal質(zhì)粒(p/CMV-sport-βgal)和對(duì)照PEI以5∶1的比混合均勻并用Tris-EDTA緩沖液稀釋至600微升。為進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
標(biāo)記為AT的組將每個(gè)終等分(即總共240微克)8微克的βgal質(zhì)粒(p/CMV-sport-βgal)和組合物非肽基載體PEIR(“PEIR”)以5∶1的比混合均勻并用Tris-EDTA緩沖液稀釋至600微升。為進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
標(biāo)記為AU的組將每個(gè)終等分(即總共240微克)8微克的βgal質(zhì)粒(p/CMV-sport-βgal)和高度純化的Essentia非肽基載體PEIR(“純的PEIR”)以5∶1的比混合均勻并用Tris-EDTA緩沖液稀釋至600微升。為進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
在用非肽基載體和核酸治療劑進(jìn)行7次每天一次的處理后確定累積的透皮遞送效率的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在處理期間通過(guò)吸入異氟烷麻痹動(dòng)物。在被麻痹后，對(duì)C57 black6小鼠(每組n＝3)的背部皮膚的顱部分(之所以選擇該部分是因?yàn)樾∈蟛荒苡米旎蛩闹_(dá)到該區(qū)域)施用200微升劑量的適當(dāng)處理物。動(dòng)物不進(jìn)行脫毛處理。將動(dòng)物在受控的加熱環(huán)境中恢復(fù)以預(yù)防體溫過(guò)低，在有反應(yīng)后，任意提供食物和水過(guò)夜。在每天大致相同的時(shí)刻每天一次地重復(fù)該處理7天。在7天的處理后，通過(guò)吸入CO2對(duì)小鼠實(shí)行安樂(lè)死，由盲測(cè)者收獲完整厚度的經(jīng)處理的皮膚部分。將經(jīng)處理的部分分成三個(gè)等分，在10％的中性緩沖的福爾馬林中固定顱部分12-16小時(shí)，然后貯存在70％的乙醇中直至石蠟包埋。如前所述，對(duì)中心部分進(jìn)行快速冷凍并將其直接用于在37℃下在切片上進(jìn)行β半乳糖苷酶染色。將經(jīng)處理的尾部節(jié)段進(jìn)行快速冷凍以進(jìn)行溶解研究。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析由盲測(cè)者進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和圖象分析。在具有平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡的Nikon E600顯微鏡上對(duì)整個(gè)如上染色的切片照相。使用Image Pro Plus軟件對(duì)所得的圖象進(jìn)行分批圖象分析處理，用手工確認(rèn)法確定對(duì)于β半乳糖苷酶活性是陽(yáng)性的面積。將這些結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為各組的總的橫切面面積，將所述結(jié)果以呈陽(yáng)性染色的橫切面的百分比列表。然后，在單向ANOVA重復(fù)測(cè)量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進(jìn)行顯著性分析來(lái)確定各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
結(jié)果將結(jié)果歸納于下面的表中并在圖6中進(jìn)行說(shuō)明。和PEI相比，以組合物形式存在的和以超純形式存在的非肽基透皮遞送載體在遞送效率和轉(zhuǎn)基因表達(dá)上獲得了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加。PEIR的超純形式表現(xiàn)出比標(biāo)準(zhǔn)的PEIR具有更高的效率的傾向，這與計(jì)算得出的該試劑的更高的比活性一致。
實(shí)施例4在7次每天一次的施用后各處理組的以總面積百分比表示的累積的β半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
P＝0.0058(置信度為99％時(shí)是顯著的)結(jié)論非肽基透皮載體可高效地將大的復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)皮膚，特別是在前述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)物和總復(fù)合物大小受到限制的情況下。盡管效率不如用更小的肽基載體的復(fù)合物獲得的效率高，但也獲得了顯著的增加。值得注意的是，使用大的非肽基復(fù)合物的基因表達(dá)產(chǎn)物的分布幾乎只位于毛囊，而肽基載體的分布結(jié)果是在整個(gè)截面上彌散。因此，大小和主鏈的向性可用于納米機(jī)制的靶向遞送。
實(shí)施例5本實(shí)施例顯示在一次施用后，和對(duì)照相比，肽基載體將含有完整的標(biāo)記蛋白肉毒毒素的大復(fù)合物運(yùn)輸穿過(guò)完整皮膚的用途。
主鏈的選擇通過(guò)將-Gly3Arg7共價(jià)地附著至多聚賴氨酸MW 112,000來(lái)裝配帶正電荷的主鏈，通過(guò)以18％的飽和度(即每100個(gè)賴氨酸殘基中有18個(gè)賴氨酸殘基共價(jià)地附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側(cè)鏈的游離胺基來(lái)進(jìn)行該附著。所述經(jīng)修飾的主鏈被命名為“KNR”。對(duì)照聚陽(yáng)離子是相同大小的和來(lái)自相同批次的未經(jīng)修飾的多聚賴氨酸(稱為“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
治療劑選擇Boxtox商標(biāo)的肉毒毒素A(Allergan)進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。其具有大約150,000的分子量。
樣品的制備根據(jù)廠商說(shuō)明書重構(gòu)肉毒毒素。用經(jīng)計(jì)算超過(guò)12倍摩爾量的硫代NHS-LC生物素(Pierce Chemical)對(duì)蛋白等分進(jìn)行生物素化。被標(biāo)記的產(chǎn)物稱作“Btox-b”。
在各情況下，與遞送高度帶負(fù)電荷的大核酸復(fù)合物一樣，使用過(guò)量的聚陽(yáng)離子裝配具有過(guò)量正電荷的終復(fù)合物。凈中性或凈正電荷防止了來(lái)自高度負(fù)電的細(xì)胞表面蛋白聚糖和細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)蛋白復(fù)合物的排斥。對(duì)所有組的Btox-b劑量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，也對(duì)要局部施用的組合物的總體積和終pH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如下制備樣品標(biāo)記為“JMW-7”的組將每等分(即總共20U)2.0U的Btox-b和肽基載體KNR以經(jīng)計(jì)算為4∶1的MW比率混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。將所得的組合物和1.8ml Cetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
標(biāo)記為“JMW-8”的組將每等分(即總共20U)2.0U的Btox-b和K以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。將所得的組合物和1.8ml Cetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
在用肽基載體和經(jīng)標(biāo)記的肉毒毒素進(jìn)行一次處理后確定透皮遞送效率的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在處理期間通過(guò)吸入異氟烷麻痹動(dòng)物。在被麻痹后，C57 black 6小鼠(每組n＝4)接受局部敷藥，將200微升劑量的適當(dāng)處理物施用于背部皮膚的顱部分(之所以選擇該部分是因?yàn)樾∈蟛荒苡米旎蛩闹_(dá)到該區(qū)域)。動(dòng)物不進(jìn)行脫毛。在最初的處理之后30分鐘，通過(guò)吸入CO2對(duì)小鼠實(shí)行安樂(lè)死，由盲測(cè)者收獲完整厚度的經(jīng)處理的皮膚部分。將經(jīng)處理的部分分成三等分，在10％的中性緩沖的福爾馬林中固定顱部分12-16小時(shí)，然后貯存在70％的乙醇中直至石蠟包埋。如下面所概述的，由盲測(cè)者將中心部分進(jìn)行快速冷凍并將其直接用于生物素顯示。為進(jìn)行溶解研究，快速冷凍經(jīng)處理的尾部節(jié)段。
如下進(jìn)行生物素顯示。簡(jiǎn)而言之，將各切片浸沒(méi)在NeutrAvidin緩沖液中1小時(shí)。為觀察堿性磷酸酶的活性，在鹽水中洗滌橫切面4次，然后浸沒(méi)在NBT/BCIP(Pierce Scientific)中1小時(shí)。然后在鹽水中漂洗切片，在具有平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡的Nikon E600顯微鏡上對(duì)整個(gè)切片照相。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析由盲測(cè)者使用Image Pro Plus軟件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)通過(guò)分批圖象分析確定總的陽(yáng)性染色，并將其標(biāo)準(zhǔn)化為總的橫切面面積以確定各組的陽(yáng)性染色百分比。然后，在單向ANOVA重復(fù)測(cè)量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進(jìn)行顯著性分析來(lái)確定各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
結(jié)論在將Btox-b與KNR(“EB-Btox”)或K(“n1”)一起進(jìn)行一次局部施用后，用總面積的百分比來(lái)表示對(duì)于生物素化的肉毒毒素呈陽(yáng)性的平均橫切面面積。將所述結(jié)果列于下列的表中并在圖7中進(jìn)行說(shuō)明。在圖7中，在用“EB-Btox”和“n1”進(jìn)行三天每天一次的處理后，將對(duì)于標(biāo)記是陽(yáng)性的面積測(cè)定為總面積的百分比，其中所述“EB-Btox”包含Btox-b和肽基載體KNR，而“n1”包含Btoxb和聚陽(yáng)離子K作為對(duì)照。描述各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
實(shí)施例5.在將Btox-b與KNR(JMW-7)或K(JMW-8)一起進(jìn)行一次局部施用30分鐘后，以總橫切面的百分比表示被標(biāo)記的肉毒毒素面積的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
P＝0.0001(置信度為99％時(shí)是顯著的)實(shí)施例6實(shí)施例5表明在鼠類模型的完整皮膚中局部施用后，肽基透皮載體可使肉毒毒素有效地轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，該實(shí)驗(yàn)沒(méi)有表明復(fù)合蛋白肉毒毒素在轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)皮膚后是否以功能性形式釋放。因此建立下列的實(shí)驗(yàn)來(lái)估計(jì)使用該肽基載體(同樣，無(wú)蛋白的共價(jià)修飾)是否可將肉毒毒素作為局部試劑遞送穿過(guò)完整的皮膚仍具治療效果。
通過(guò)將-Gly3Arg7共價(jià)地附著至多聚賴氨酸MW 112,000來(lái)裝配帶正電荷的主鏈，以18％的飽和度(即每100個(gè)賴氨酸殘基中有18個(gè)賴氨酸殘基共價(jià)附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側(cè)鏈的游離胺基來(lái)進(jìn)行該附著。所述經(jīng)修飾的主鏈被命名為“KNR”。對(duì)照聚陽(yáng)離子是相同大小的和來(lái)自相同批次的未經(jīng)修飾的多聚賴氨酸(稱為“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。和在實(shí)施例5中一樣使用相同的肉毒毒素治療劑，和以相同的方式制備其。如下制備樣品標(biāo)記為“JMW-9”的組將每等分(即總共60U)2.0單位的肉毒毒素和肽基載體KNR以經(jīng)計(jì)算為4∶1的MW比率混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
標(biāo)記為“JMW-10”的組將每等分(即總共60U)2.0單位的肉毒毒素和K以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
標(biāo)記為“JMW-11”的組用磷酸緩沖鹽溶液將每等分(即總共60U)2.0單位的無(wú)聚陽(yáng)離子的肉毒毒素稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
在用肽基載體和肉毒毒素進(jìn)行一次處理后確定透皮遞送效率的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在處理期間通過(guò)吸入異氟烷麻痹動(dòng)物。在被麻痹后，C57 black 6小鼠(每組n＝4)接受局部敷藥，將400微升劑量的適當(dāng)處理物均一地施用于腳趾至大腿中部(mid-thigh)。兩只腿都進(jìn)行處理，對(duì)腿的任一側(cè)，處理都是隨機(jī)的。動(dòng)物不進(jìn)行脫毛。在最初的處理之后30分鐘，根據(jù)公開(kāi)的足趾外展(digital abduction)分值(用于評(píng)價(jià)足的靈活性)(Aoki，KR.A comparison of the safety margins of botulinumneurotoxin serotypes A，B，and F in mice.Toxicon.2001 Dec；39(12)1815-20)就在施用肉毒毒素后足趾外展的能力對(duì)小鼠進(jìn)行估計(jì)。小鼠的靈活性也通過(guò)主觀估計(jì)。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析由兩個(gè)盲測(cè)者獨(dú)立地將足趾外展分值列表。然后，在單向ANOVA重復(fù)測(cè)量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進(jìn)行顯著性分析來(lái)確定各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
結(jié)果將平均足趾外展分值(在肉毒毒素與KNR(“JMW-9”)、K(“JMW-10”)或無(wú)聚陽(yáng)離子的稀釋劑一起進(jìn)行一次局部施用后獲得的)示于下列的表中并在圖8的代表性顯微照片中進(jìn)行說(shuō)明。和兩個(gè)對(duì)照(其相互之間是相當(dāng)?shù)?相比，肽基載體KNR提供了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的肉毒毒素穿過(guò)皮膚的功能性遞送。本發(fā)明的另外的獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)(總共三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)具有相同的結(jié)論具有KNR的局部肉毒毒素而不是對(duì)照具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的麻痹作用)進(jìn)一步確認(rèn)了本發(fā)現(xiàn)和揭示了在具有K或不具有K的局部肉毒毒素(即兩個(gè)對(duì)照)之間沒(méi)有顯著的不同。有趣的是，小鼠始終朝向被麻痹的肢體方向走動(dòng)(在100％的接受處理的動(dòng)物中發(fā)生該現(xiàn)象，在來(lái)自任一對(duì)照組的對(duì)照中發(fā)生率為0％)。如圖8所示，用肉毒毒素和對(duì)照聚陽(yáng)離子多聚賴氨酸或用肉毒毒素而無(wú)聚陽(yáng)離子(“單獨(dú)的Btox”)處理的肢體可活動(dòng)足趾(當(dāng)被提起時(shí)，作為防御機(jī)制)，但用肉毒毒素和肽基載體KNR(“Essentia Btoxlotion”)處理的肢體則不能活動(dòng)。
實(shí)施例6.在一次局部施用肉毒毒素和肽基載體KNR(“JMW-9”)、肉毒毒素和對(duì)照聚陽(yáng)離子K(“JMW-10”)、和單獨(dú)的肉毒毒素(“JMW-11”)后30分鐘的足趾外展分值。
P＝0.0351(置信度為95％時(shí)是顯著的)結(jié)論本實(shí)驗(yàn)表明肽基透皮載體可將治療有效量的肉毒毒素治療劑轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)皮膚而無(wú)需治療劑的共價(jià)修飾。本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步確認(rèn)當(dāng)在對(duì)照中局部施用時(shí)肉毒毒素不起作用。
實(shí)施例7本實(shí)驗(yàn)展示非肽基載體在本發(fā)明中的表現(xiàn)。
主鏈的選擇通過(guò)將-Gly3Arg7共價(jià)地附著至聚乙烯亞胺(PEI)MW 1,000,000來(lái)裝配帶正電荷的主鏈，通過(guò)以30％的飽和度(即每100個(gè)賴氨酸殘基中有30個(gè)賴氨酸殘基共價(jià)附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至PEI側(cè)鏈的游離胺基來(lái)進(jìn)行該附著。經(jīng)修飾的主鏈被命名為“PEIR”以表示大的非肽基載體。對(duì)照聚陽(yáng)離子是相同大小的和來(lái)自相同批次的未經(jīng)修飾的PEI(稱為“PEI”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。如實(shí)施例5中那樣使用相同的肉毒毒素治療劑。
根據(jù)廠商說(shuō)明書從BOTOX產(chǎn)品重構(gòu)肉毒毒素。在各情況下，與遞送高度帶負(fù)電荷的大核酸復(fù)合物一樣，使用過(guò)量的聚陽(yáng)離子裝配具有過(guò)量正電荷的終復(fù)合物。凈中性或凈正電荷防止了來(lái)自高度負(fù)電的細(xì)胞表面蛋白聚糖和細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)蛋白復(fù)合物的排斥。對(duì)所有組的肉毒毒素劑量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，也對(duì)要局部施用的組合物的總體積和終pH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如下制備樣品標(biāo)記為“AZ”的組將每等分(即總共60U)2.0單位的肉毒毒素和超純形式的非肽基載體PEIR以經(jīng)計(jì)算為5∶1的MW混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
標(biāo)記為“BA”的組將每等分(即總共60U)2.0單位的肉毒毒素和PEI以5∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進(jìn)行等分。
在一次處理后確定透皮遞送效率的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在處理期間通過(guò)吸入異氟烷麻痹動(dòng)物。在被麻痹后，C57 black 6小鼠(每組n＝3)接受局部敷藥，將400微升劑量的適當(dāng)處理物均一地施用于腳趾至大腿中部。對(duì)兩只腿都進(jìn)行處理，對(duì)兩側(cè)中的任一側(cè)來(lái)說(shuō)，處理都是隨機(jī)的。動(dòng)物不進(jìn)行脫毛處理。在最初的處理之后30分鐘，根據(jù)公開(kāi)的足趾外展分值(用于評(píng)價(jià)足的靈活性)(Aoki，KR.Acomparison of the safety margins of botulinum neurotoxinserotypes A，B，and F in mice.Toxicon.2001 Dec；39(12)1815-20)在施用肉毒毒素后就足趾外展的能力對(duì)小鼠進(jìn)行估計(jì)。小鼠的靈活性也通過(guò)主觀估計(jì)。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析由兩個(gè)盲測(cè)者獨(dú)立地將足趾外展分值列表。然后，在單向ANOVA重復(fù)測(cè)量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進(jìn)行顯著性分析來(lái)確定各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
結(jié)果將在一次局部施用肉毒毒素和超純PEIR(“AZ”)、或肉毒毒素和對(duì)照聚陽(yáng)離子PEI(“BA”)、和重復(fù)實(shí)驗(yàn)(本試驗(yàn)的單一獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn))后獲得的平均足趾外展分值示于下列的表中。和對(duì)照相比，非肽基載體PEIR提供了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的肉毒毒素穿過(guò)皮膚的功能性遞送。和前面一樣，觀察到動(dòng)物朝向被麻痹的肢體作圓周走動(dòng)。
實(shí)施例7.重復(fù)實(shí)驗(yàn)1.在一次局部施用肉毒毒素和超純PEIR(“AZ”)、或肉毒毒素和對(duì)照聚陽(yáng)離子PEI(“BA”)后30分鐘的足趾外展分值。顯示平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
P＝0.0002(置信度為99％時(shí)是顯著的)實(shí)施例7.重復(fù)實(shí)驗(yàn)2.在一次局部施用肉毒毒素和超純PEIR(“AZ1”)、或肉毒毒素和對(duì)照聚陽(yáng)離子PEI(“BA1”)后30分鐘的足趾外展分值。顯示平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
P＝0.0001(置信度為99％時(shí)是顯著的)
結(jié)論本實(shí)驗(yàn)表明非肽基透皮載體可將治療劑量的肉毒毒素轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)皮膚而無(wú)需在之前共價(jià)修飾肉毒毒素。這些發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充了用肽基轉(zhuǎn)移試劑進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。使用非肽基或肽基載體獲得治療效果的選擇可使施用適合特定的情況、環(huán)境和方法，加寬了本發(fā)明的透皮遞送平臺(tái)的范圍。
在這些實(shí)施例中，使用肽基或非肽基載體的肉毒毒素滲透對(duì)不使用所述載體的局部肉毒毒素進(jìn)一步產(chǎn)生了透皮滲透抗原以進(jìn)行免疫的用途，特別是在使用不易穿過(guò)皮膚的抗原例如肉毒桿菌進(jìn)行免疫的情況下。功能性肉毒毒素的遞送確保至少4個(gè)不同的抗原表位以完整的狀態(tài)被透皮遞送；在兩個(gè)實(shí)施例中的任何一個(gè)中在缺少所述載體的情況下都不能遞送功能性肉毒毒素的事實(shí)進(jìn)一步證實(shí)相對(duì)于缺少載體的試劑，所述載體提供了顯著的免疫潛能。因?yàn)槊庖咭罂乖宰阋援a(chǎn)生免疫應(yīng)答的量穿過(guò)皮膚，該方法使得能夠遞送用于免疫的抗原。因?yàn)樵摲椒ú灰罂乖墓矁r(jià)修飾和不需要涉及病毒的基因轉(zhuǎn)移，因此在安全穩(wěn)定性和效率方面產(chǎn)生了許多有利方面。
實(shí)施例8本發(fā)明詳述了具有TAT效能因子的肽基和非肽基載體的產(chǎn)生以及這些載體和肉毒毒素的裝配。
聚乙烯亞胺(PEI)和TAT片段GGGRKKRRQRRR的偶聯(lián)將缺少所有側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的TAT片段GGGRKKRRQRRR(6mg，0.004mmol，Sigma Genosys，Houston，TX)溶解在1ml 0.1M MES緩沖液中。向其中加入EDC(3mg，0.016mmol)，然后加入50％(w∶v)的水中的PEI 400k(分子量)溶液(～0.02ml，～2.5×10-5mmol)。通過(guò)試紙測(cè)定pH為7.5。再加入1ml的0.1M MES，加入HCl將pH調(diào)整至大約為5。再加入一部分EDC(5mg，0.026mmol)，攪拌pH～5的反應(yīng)物過(guò)夜。第二天早上，冷凍和凍干反應(yīng)混合物。
用無(wú)菌1xPBS將Sephadex G-25柱子(直徑1cm×高14cm)(Amersham Biosciences Corp.，Piscataway，NJ)調(diào)成漿。通過(guò)具有19kD分子量的FITC葡聚糖(Sigma，St Louis，MO)的洗脫標(biāo)準(zhǔn)化柱子。標(biāo)準(zhǔn)物最初在5ml PBS處洗脫，在6ml處具有中間峰，在7ml處結(jié)束。將來(lái)自上面的凍干的反應(yīng)混合物溶解在小體積的PBS中并加到柱上。通過(guò)連續(xù)加入1ml PBS來(lái)洗脫其。收集級(jí)分，第一級(jí)分由首先洗脫的3ml組成，包括反應(yīng)物體積。隨后的級(jí)分為1ml。
在280nm處測(cè)定被洗脫的級(jí)分的UV吸光率。對(duì)應(yīng)于5-7ml的級(jí)分3、4和5顯示出中等吸收峰。將所有級(jí)分凍干并獲取紅外光譜。在級(jí)分4-6中觀察到TAT片段的特征性胍三重峰(2800-3000cm-1)。這些級(jí)分也顯示在1700cm-1處的酰胺片段，從而進(jìn)一步確定TAT片段和PEI的偶聯(lián)。
使用TAT片段GGGRKKRRQRRR(11.6mg，0.007mmol)進(jìn)行另一重復(fù)實(shí)驗(yàn)。計(jì)算該量以使30個(gè)PEI胺基中有一個(gè)預(yù)期和TAT片段反應(yīng)。這非常接近上述的原始的多聚賴氨酸-寡聚精氨酸(KNR)功效因子的組成。如上所述通過(guò)IR進(jìn)一步確定TAT片段與PEI胺基的成功的共價(jià)附著。
多聚賴氨酸與TAT片段的偶聯(lián)向1ml 0.1M MES，pH～4.5中的多聚賴氨酸(10mg 1.1×10-4mmol；Sigma)溶液中加入TAT片段(4mg，0.003mmol)，然后再加入EDC(3.5mg，0.0183mmol)。在室溫下攪拌所得的反應(yīng)混合物(pH～4.5)。將反應(yīng)物在-78℃下冷凍過(guò)夜。第二天將反應(yīng)混合物融解至室溫，通過(guò)加入飽和碳酸氫鈉將pH調(diào)整至～8。將反應(yīng)混合物直接用于如上所述構(gòu)建和標(biāo)準(zhǔn)化的Sephadex G-25柱。其洗脫于7個(gè)始于5ml后的1ml級(jí)分中。測(cè)出UV280的吸光率，在級(jí)分2、3和4中顯示出相關(guān)的峰。凍干的級(jí)分的IR顯示級(jí)分1-7中的特征性胍峰(2800-3000cm-1)。級(jí)分1在1730cm-1處具有很強(qiáng)的峰而在1600cm-1處無(wú)峰，對(duì)于級(jí)分2-6，情況正好相反。因此，進(jìn)一步確定了TAT片段至肽基載體多聚賴氨酸的成功的共價(jià)附著。
隨后將共價(jià)附著的TAT片段和PEI(PEIT)以及共價(jià)附著的TAT片段和多聚賴氨酸(KNT)與肉毒毒素混合以形成如下的非共價(jià)復(fù)合物標(biāo)記為“JL-1”的組將每等分(即總共20U)2.0單位的Btox-b和PEIT以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。
標(biāo)記為“JL-2”的組將每等分(即總共20U)2.0單位的Btox-b和KNT以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。
在非共價(jià)復(fù)合物形成后，將顆粒在12,000xg下在旋轉(zhuǎn)微量離心管中離心5分鐘，然后在20微升去離子水中重懸乳并在Germanium衰減全反射小室中進(jìn)行蒸發(fā)以進(jìn)行IR。從而進(jìn)一步確認(rèn)復(fù)合物中Btox-b的存在?？傮w而言，該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定合成方案可用于其他效能因子，如在前面的實(shí)施例中一樣，通過(guò)使用具有帶正電荷的分支基團(tuán)的寡聚精氨酸或效能基團(tuán)的載體可將所得的載體和具有生物活性的試劑(在該情況下是肉毒毒素)結(jié)合。
實(shí)例9本實(shí)驗(yàn)展示用于特定抗原成像的肽基載體的性能。在本實(shí)驗(yàn)中，光學(xué)成像部分、經(jīng)修飾的靶向黑色素瘤的抗體和一種Essentia肽基載體KNR2的復(fù)合物適合用于黑色素瘤的局部檢測(cè)。
主鏈的選擇通過(guò)將-Gly3Arg7共價(jià)地附著至多聚賴氨酸MW 150,000來(lái)裝配帶正電荷的肽基主鏈，通過(guò)以18％的飽和度(即每100個(gè)賴氨酸殘基中有18個(gè)賴氨酸殘基共價(jià)附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側(cè)鏈的游離胺基來(lái)進(jìn)行該附著。經(jīng)修飾的主鏈被命名為“KNR2”。對(duì)照聚陽(yáng)離子是相同大小的來(lái)自相同批次的未經(jīng)修飾的多聚賴氨酸(稱為“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
通過(guò)上述的EDC偶聯(lián)將針對(duì)保守的人黑色素瘤結(jié)構(gòu)域神經(jīng)節(jié)苷脂2的鼠類單克隆抗體(IgG3，US Biologicals，Swampscott，MA)共價(jià)地附著至短的多聚天冬氨酸陰離子鏈(MW 3,000)以產(chǎn)生稱為“Gang2Asp”的衍生抗體。此外，通過(guò)使用寡核酸作為聚陰離子設(shè)計(jì)陰離子成像試劑，其中序列是ATGC-J(此后稱作“ATGC-J”)，“J”代表共價(jià)附著的Texas Red熒光團(tuán)，(Sigma Genosys，Woodlands，TX)。為進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，將6.35微克Gang2Asp和0.1712微克ATGC-J混合，然后再和17.5微克KNR2在總體積為200微升的去離子水中復(fù)合以獲得5∶1∶1KNR2∶ATGC-J∶Gang2Asp的比例。將混合物渦旋2分鐘。將所得的復(fù)合物施加于水合CellTek Human Melanoma切片和對(duì)照CellTek Cytokeratin切片(SDL，Des Plaines，IL)上，并在對(duì)相同視野中的黑色素瘤色素的熒光分布對(duì)亮視野分布進(jìn)行照相測(cè)定前溫育5分鐘。也使用不具有ATGC-J或不具有Gang2Asp的額外的對(duì)照。
結(jié)果非共價(jià)復(fù)合物提供了遵從抗體衍生物的向性的光學(xué)成像試劑的分布，而不是在缺少抗體的情況下的復(fù)合物的分布。更值得注目的是，如圖9中描述的，所述復(fù)合物的分布與黑色素瘤細(xì)胞的分布相一致。
結(jié)論本實(shí)驗(yàn)展示了使用適合用于局部遞送的載體產(chǎn)生用于穿過(guò)皮膚的轉(zhuǎn)運(yùn)和通過(guò)光學(xué)技術(shù)顯現(xiàn)黑色素瘤的可行復(fù)合物?？蓪⑦@樣的方法和例如手術(shù)邊界確定法(surgical margin-setting)結(jié)合使用或可將其用于常規(guī)的黑色素瘤監(jiān)視。也可容易地將類似的策略用于其他和皮膚相關(guān)的病癥的局部診斷，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。假定光學(xué)成像部分具有非常高的靈敏度，那么通過(guò)這些非共價(jià)復(fù)合物可在提高對(duì)這些疾病的檢測(cè)上提供遠(yuǎn)大的前景。
要理解此處描述的實(shí)施例和實(shí)施方案只是用于說(shuō)明目的，要理解本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)聯(lián)想到其各種修飾或改變，所述修飾或改變?cè)诒旧暾?qǐng)的精神和范圍內(nèi)和在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。此處引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)以其全文在此引用作為所有目的的參考。
權(quán)利要求
1.包含具有生物活性的蛋白和載體的組合物，所述具有生物活性的蛋白不會(huì)治療性地改變血糖水平，所述載體包含附著有帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈并且該載體以對(duì)透皮遞送有效的量存在，其中所述載體和所述具有生物活性的蛋白之間的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中和缺少所述載體的具有生物活性的蛋白相比，所述組合物提供更多的所述具有生物活性的蛋白的透皮遞送。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述具有生物活性的蛋白具有治療活性。
4.包含非蛋白非核酸的具有生物活性的試劑和載體的組合物，所述載體包含附著有帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈并且其以對(duì)透皮遞送有效的量存在，其中所述載體和所述具有生物活性的試劑之間的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中和缺少所述載體的具有生物活性的試劑相比，所述組合物提供更多的所述具有生物活性的試劑的透皮遞送。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述具有生物活性的試劑具有治療性活性。
7.權(quán)利要求3的組合物，其中所述治療性蛋白具有至少50,000kD的分子量。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多肽。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多肽。
10.權(quán)利要求8的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多肽。
11.權(quán)利要求8的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多肽。
12.權(quán)利要求8的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多聚賴氨酸。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
14.權(quán)利要求12的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
15.權(quán)利要求12的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
16.權(quán)利要求1的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的非肽基聚合物。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述非肽基聚合物主鏈包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
19.權(quán)利要求18的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約10,000至大約2,500,000的分子量。
20.權(quán)利要求18的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約100,000至大約1,800,000的分子量。
21.權(quán)利要求18的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約500,000至大約1,400,000的分子量。
22.權(quán)利要求1的組合物，其中所述載體包含帶正電荷的聚合物，所述聚合物具有附著的獨(dú)立選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段或混合物的帶正電荷的分支基團(tuán)，其中下標(biāo)n1是從0至大約20的整數(shù)，下標(biāo)n2獨(dú)立地是從大約5至大約25的奇整數(shù)。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中帶正電荷的分支基團(tuán)獨(dú)立地選自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基團(tuán)。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中下標(biāo)n1是從大約1至大約8的整數(shù)。
25.權(quán)利要求23的組合物，其中下標(biāo)n1是從大約2至大約5的整數(shù)。
26.權(quán)利要求23的組合物，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約17的奇數(shù)。
27.權(quán)利要求23的組合物，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約13的奇數(shù)。
28.權(quán)利要求22的組合物，其中所述分支基團(tuán)選自HIV-TAT和其片段。
29.權(quán)利要求28的組合物，其中所述附著的帶正電荷的分支基團(tuán)是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下標(biāo)p和q各自獨(dú)立地是從0至20的整數(shù)。
30.權(quán)利要求22的組合物，其中所述分支基團(tuán)是觸角足PTD基團(tuán)或其片段。
31.權(quán)利要求22的組合物，其中所述帶正荷的聚合物包含多肽。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述多肽選自多聚賴氨酸、多聚精氨酸和多聚鳥氨酸。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中所述多肽是多聚賴氨酸。
34.權(quán)利要求22的組合物，其中所述聚合物包含帶正電荷的非肽基聚合物。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述非肽基聚合物包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
36.權(quán)利要求35的組合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
37.權(quán)利要求4的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多肽。
38.權(quán)利要求37的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多肽。
39.權(quán)利要求37的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多肽。
40.權(quán)利要求37的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多肽。
41.權(quán)利要求37的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多聚賴氨酸。
42.權(quán)利要求41的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
43.權(quán)利要求41的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
44.權(quán)利要求41的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
45.權(quán)利要求4的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的非肽基聚合物。
46.權(quán)利要求45的組合物，其中所述非肽基聚合物主鏈包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
47.權(quán)利要求46的組合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
48.權(quán)利要求47的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約10,000至大約2,500,000的分子量。
49.權(quán)利要求47的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約100,000至大約1,800,000的分子量。
50.權(quán)利要求47的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約500,000至大約1,400,000的分子量。
51.權(quán)利要求4的組合物，其中所述載體包含帶正電荷的聚合物，該聚合物具有附著的獨(dú)立地選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段或混合物的帶正電荷的分支基團(tuán)，其中下標(biāo)n1是從0至大約20的整數(shù)，下標(biāo)n2獨(dú)立地是從大約5至大約25的奇整數(shù)。
52.權(quán)利要求51的組合物，其中所述帶正電荷的分支基團(tuán)獨(dú)立地選自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基團(tuán)。
53.權(quán)利要求52的組合物，其中下標(biāo)n1是從大約1至大約8的整數(shù)。
54.權(quán)利要求52的組合物，其中下標(biāo)n1是從大約2至大約5的整數(shù)。
55.權(quán)利要求52的組合物，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約17的奇數(shù)。
56.權(quán)利要求52的組合物，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約13的奇數(shù)。
57.權(quán)利要求51的組合物，其中所述分支基團(tuán)選自HIV-TAT和其片段。
58.權(quán)利要求57的組合物，其中所述附著的帶正電荷的分支基團(tuán)是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下標(biāo)p和q各自獨(dú)立地是從0至20的整數(shù)。
59.權(quán)利要求51的組合物，其中所述分支基團(tuán)是觸角足PTD基團(tuán)或其片段。
60.權(quán)利要求51的組合物，其中所述帶正電荷的聚合物包含多肽。
61.權(quán)利要求60的組合物，其中所述多肽選自多聚賴氨酸、多聚精氨酸、多聚鳥氨酸和多聚高精氨酸。
62.權(quán)利要求61的組合物，其中所述多肽是多聚賴氨酸。
63.權(quán)利要求51的組合物，其中所述聚合物包含帶正電荷的非肽基聚合物。
64.權(quán)利要求63的組合物，其中所述非肽基聚合物包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
65.權(quán)利要求64的組合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
66.權(quán)利要求4的組合物，其包含按重量計(jì)算從大約1×10-20至大約25％的具有生物活性的試劑和從大約1×10-19至大約30％的帶正電荷的載體。
67.權(quán)利要求4的控釋組合物。
68.權(quán)利要求1的組合物，其中所述具有生物活性的蛋白是肉毒毒素。
69.權(quán)利要求68的組合物，其中所述肉毒毒素選自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
70.權(quán)利要求68的組合物，其中所述肉毒毒素包括肉毒毒素衍生物。
71.權(quán)利要求68的組合物，其中所述肉毒毒素包括重組肉毒毒素。
72.用于將權(quán)利要求1的組合物給受試者施用的試劑盒，其包含用于遞送具有生物活性的試劑和載體的裝置，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，該載體以對(duì)透皮遞送有效的量存在。
73.權(quán)利要求72的試劑盒，其中所述具有生物活性的試劑是肉毒毒素。
74.權(quán)利要求72的試劑盒，其中所述組合物含于用于通過(guò)皮膚或上皮將具有生物活性的蛋白施用給受試者的裝置中。
75.權(quán)利要求74的試劑盒，其中所述裝置是皮膚貼劑。
76.用于將具有生物活性的蛋白給受試者施用的試劑盒，其包含用于將具有生物活性的蛋白遞送給皮膚或上皮的裝置和組合物，所述組合物包含帶正電荷的載體，所述載體具有附著的獨(dú)立地選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段或混合物的帶正電荷的分支基團(tuán)，其中下標(biāo)n1是從0至大約20的整數(shù)，下標(biāo)n2獨(dú)立地是從大約5至大約25的奇整數(shù)，其中所述載體和具有生物活性的蛋白之間的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合。
77.權(quán)利要求76的試劑盒，其中所述裝置是皮膚貼劑。
78.給受試者施用具有生物活性的蛋白的方法，所述具有生物活性的蛋白不會(huì)治療性地改變血糖水平，該方法包括將所述蛋白和有效量的帶電荷的載體一起給受試者的皮膚或上皮局部地施用，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，其中所述載體和具有生物活性的蛋白之間的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合。
79.權(quán)利要求78的方法，其中和缺少所述載體的具有生物活性的蛋白相比，所述組合物提供更多的具有生物活性的蛋白的透皮遞送。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述具有生物活性的蛋白具有治療活性。
81.給受試者施用非蛋白非核酸的具有生物活性的試劑的方法，該方法包括將所述具有生物活性的試劑和有效量的帶電荷的載體給受試者的皮膚或上皮局部地施用，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，其中所述載體和具有生物活性的試劑之間的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合。
82.權(quán)利要求81的方法，其中和缺少所述載體的試劑相比，所述組合物提供更多的具有生物活性的試劑的透皮遞送。
83.權(quán)利要求82的方法，其中所述具有生物活性的試劑具有治療活性。
84.權(quán)利要求80的方法，其中將所述具有生物活性的蛋白和載體以含有兩種成分的組合物形式給受試者施用。
85.權(quán)利要求80的方法，其中將所述具有生物活性的蛋白和載體以分開(kāi)的方式給受試者施用。
86.權(quán)利要求83的方法，其中將所述具有生物活性的蛋白和載體以包含兩種成分的組合物的方式給受試者施用。
87.權(quán)利要求83的方法，其中將所述具有生物活性的試劑和載體以分開(kāi)的方式給受試者施用。
88.權(quán)利要求80的方法，其中所述組合物是控釋組合物或緩釋組合物。
89.權(quán)利要求83的方法，其中所述組合物是控釋組合物或緩釋組合物。
90.權(quán)利要求80的方法，其中所述治療性蛋白是肉毒毒素。
91.權(quán)利要求90的方法，其中所述肉毒毒素選自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
92.權(quán)利要求90的方法，其中所述肉毒毒素包括肉毒毒素衍生物。
93.權(quán)利要求90的方法，其中所述肉毒毒素包括重組肉毒毒素。
94.權(quán)利要求90的方法，其中給受試者施用所述肉毒毒素以提供美學(xué)和/或美容益處。
95.權(quán)利要求90的方法，其中給受試者施用肉毒毒素以預(yù)防或減輕和肌肉痙攣或抽搐相關(guān)的癥狀。
96.權(quán)利要求90的方法，其中將肉毒毒素和所述帶正電荷的載體給受試者臉上位置局部施用。
97.權(quán)利要求90的方法，其中將肉毒毒素和所述帶正電荷的載體給受試者的除了臉部以外的位置局部施用。
98.包含適合用于免疫的抗原和載體的組合物，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，并且該載體以對(duì)透皮遞送有效的量存在，其中所述載體和所述抗原之間的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合。
99.權(quán)利要求98的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多肽。
100.權(quán)利要求99的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多肽。
101.權(quán)利要求99的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多肽。
102.權(quán)利要求99的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多肽。
103.權(quán)利要求99的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多聚賴氨酸。
104.權(quán)利要求103的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
105.權(quán)利要求103的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
106.權(quán)利要求103的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
107.權(quán)利要求98的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的非肽基聚合物。
108.權(quán)利要求107的組合物，其中所述非肽基聚合物主鏈包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
109.權(quán)利要求108的組合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
110.權(quán)利要求109的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約10,000至2,500,000的分子量。
111.權(quán)利要求109的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約100,000至大約1,800,000的分子量。
112.權(quán)利要求109的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約500,000至大約1,400,000的分子量。
113.權(quán)利要求98的組合物，其中所述載體包含帶正電荷的聚合物，該聚合物具有附著的獨(dú)立地選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段或混合物的帶正電荷的分支基團(tuán)，其中下標(biāo)n1是從0至大約20的整數(shù)，下標(biāo)n2獨(dú)立地是從大約5至大約25的奇整數(shù)。
114.權(quán)利要求113的組合物，其中所述帶正電荷的分支基團(tuán)獨(dú)立地選自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基團(tuán)。
115.權(quán)利要求114的組合物，其中下標(biāo)n1是從大約1至大約8的整數(shù)。
116.權(quán)利要求114的組合物，其中下標(biāo)n1是從大約2至大約5的整數(shù)。
117.權(quán)利要求114的組合物，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約17的奇數(shù)。
118.權(quán)利要求114的組合物，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約13的奇數(shù)。
119.權(quán)利要求113的組合物，其中所述分支基團(tuán)選自HIV-TAT和其片段。
120.權(quán)利要求119的組合物，其中所述附著的帶正電荷的分支基團(tuán)是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下標(biāo)p和q各自獨(dú)立地是從0至20的整數(shù)。
121.權(quán)利要求113的組合物，其中所述分支基團(tuán)是觸角足PTD基團(tuán)。
122.權(quán)利要求113的組合物，其中所述帶正電荷的聚合物包含多肽。
123.權(quán)利要求122的組合物，其中所述多肽選自多聚賴氨酸、多聚精氨酸和多聚鳥氨酸。
124.權(quán)利要求123的組合物，其中所述多肽是多聚賴氨酸。
125.權(quán)利要求113的組合物，其中所述聚合物包含帶正電荷的非肽基聚合物。
126.權(quán)利要求125的組合物，其中所述非肽基聚合物包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
127.權(quán)利要求126的組合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
128.權(quán)利要求98的組合物，其包含按重量計(jì)算從大約1×10-10至大約49.9％的抗原和從大約1×10-9至大約50％的帶正電荷的載體。
129.權(quán)利要求98的控釋組合物。
130.權(quán)利要求98的組合物，其中所述抗原是肉毒毒素。
131.權(quán)利要求130的組合物，其中所述肉毒毒素選自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
132.權(quán)利要求130的組合物，其中所述肉毒毒素包括肉毒毒素衍生物。
133.權(quán)利要求130的組合物，其中所述肉毒毒素包括重組肉毒毒素。
134.權(quán)利要求98的組合物，其中所述抗原適合進(jìn)行兒童免疫。
135.用于將適合用于免疫的抗原給受試者施用的試劑盒，其包含將所述抗原遞送至皮膚或上皮的裝置和權(quán)利要求98的組合物。
136.權(quán)利要求135的試劑盒，其還包含定制的施藥器。
137.權(quán)利要求135的試劑盒，其中所述組合物包含于用于通過(guò)皮膚或上皮將適合用于免疫的抗原施用給受試者的裝置中。
138.權(quán)利要求137的試劑盒，其中所述裝置是皮膚貼劑。
139.用于將適合用于免疫的抗原給受試者施用的試劑盒，其包含用于將適合用于免疫的抗原遞送給皮膚或上皮的裝置和組合物，所述組合物包含帶正電荷的載體，所述載體具有附著的獨(dú)立地選自(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段或混合物的帶正電荷的分支基團(tuán)，其中下標(biāo)n1是從0至大約20的整數(shù)，下標(biāo)n2獨(dú)立地是從大約5至大約25的奇整數(shù)，其中所述載體和所述抗原之間的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合。
140.權(quán)利要求139的試劑盒，其中所述裝置是皮膚貼劑。
141.給受試者施用適合用于免疫的抗原的方法，該方法包括將適合用于免疫的抗原和有效量的帶正電荷的載體一起給受試者的皮膚或上皮局部施用，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，其中所述載體和所述抗原之間的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合。
142.權(quán)利要求141的方法，其中將適合用于免疫的抗原和載體以包含兩種組分的組合物的形式給受試者施用。
143.權(quán)利要求141的方法，其中將所述適合用于免疫的抗原和載體以分開(kāi)的方式給受試者施用。
144.權(quán)利要求141的方法，其中所述主鏈包含帶正電荷的多肽。
145.權(quán)利要求144的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多肽。
146.權(quán)利要求144的方法，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多肽。
147.權(quán)利要求144的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多肽。
148.權(quán)利要求144的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多聚賴氨酸。
149.權(quán)利要求148的方法，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
150.權(quán)利要求148的方法，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
151.權(quán)利要求148的方法，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
152.權(quán)利要求141的方法，其中所述主鏈包含帶正電荷的非肽基聚合物。
153.權(quán)利要求152的方法，其中所述非肽基聚合物主鏈包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
154.權(quán)利要求153的方法，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
155.權(quán)利要求154的方法，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約10,000至大約2,500,000的分子量。
156.權(quán)利要求154的方法，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約100,000至大約1,800,000的分子量。
157.權(quán)利要求154的方法，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約500,000至大約1,400,000的分子量。
158.權(quán)利要求141的方法，其中所述載體包含帶正電荷的聚合物，該聚合物具有附著的獨(dú)立地選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段或混合物的帶正電荷的分支基團(tuán)，其中下標(biāo)n1是從0至大約20的整數(shù)，下標(biāo)n2獨(dú)立地是從大約5至大約25的奇整數(shù)。
159.權(quán)利要求158的方法，其中所述帶正電荷的分支基團(tuán)獨(dú)立地選自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基團(tuán)。
160.權(quán)利要求159的方法，其中下標(biāo)n1是從大約1至大約8的整數(shù)。
161.權(quán)利要求159的方法，其中下標(biāo)n1是從大約2至大約5的整數(shù)。
162.權(quán)利要求159的方法，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約17的奇數(shù)。
163.權(quán)利要求159的方法，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約13的奇數(shù)。
164.權(quán)利要求158的方法，其中所述分支基團(tuán)選自HIV-TAT和其片段。
165.權(quán)利要求164的方法，其中所述附著的帶正電荷的分支基團(tuán)是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下標(biāo)p和q各自獨(dú)立地是從0至20的整數(shù)。
166.權(quán)利要求158的方法，其中所述分支基團(tuán)是觸角足PTD基團(tuán)。
167.權(quán)利要求158的方法，其中所述帶正電荷的聚合物包含多肽。
168.權(quán)利要求167的方法，其中所述多肽選自多聚賴氨酸、多聚精氨酸和多聚鳥氨酸。
169.權(quán)利要求168的方法，其中所述多肽是多聚賴氨酸。
170.權(quán)利要求158的方法，其中所述聚合物包含帶正電荷的非肽基聚合物。
171.權(quán)利要求170的方法，其中所述非肽基聚合物包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
172.權(quán)利要求171的方法，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
173.權(quán)利要求141的方法，其中所述組合物是控釋組合物。
174.權(quán)利要求141的方法，其中所述適合用于免疫的抗原是肉毒毒素。
175.權(quán)利要求174的方法，其中所述肉毒毒素選自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
176.權(quán)利要求174的方法，其中所述肉毒毒素包括肉毒毒素衍生物。
177.權(quán)利要求174的方法，其中所述肉毒毒素包括重組肉毒毒素。
178.權(quán)利要求141的方法，其中所述抗原適合進(jìn)行兒童免疫。
179.權(quán)利要求141的方法，其中施用所述適合用于免疫的抗原以提供對(duì)環(huán)境抗原的抗性。
180.權(quán)利要求141的方法，其中施用所述適合用于免疫的抗原以提供對(duì)潛在病原體的抗性。
181.權(quán)利要求141的方法，其中施用所述適合用于免疫的抗原以提供對(duì)潛在的生物危害物的抗性。
182.權(quán)利要求4的組合物，其中所述具有生物活性的試劑是抗真菌劑。
183.權(quán)利要求182的組合物，其包含按重量計(jì)算從大約1×10-10至大約49.9％的具有生物活性的試劑和從大約1×10-9至大約50％的帶正電荷的載體。
184.權(quán)利要求182的控釋組合物。
185.權(quán)利要求182的組合物，其中所述抗真菌劑選自兩性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶、依曲康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、灰黃霉素、咪康唑、制霉菌素和環(huán)吡酮。
186.用于將抗真菌劑給受試者施用的試劑盒，其包含將所述抗真菌劑遞送至受試者的皮膚或上皮的裝置和權(quán)利要求182的組合物。
187.權(quán)利要求186的試劑盒，其還包含定制的施藥器。
188.權(quán)利要求186的試劑盒，其中所述組合物包含于用于通過(guò)甲板或鄰近解剖結(jié)構(gòu)將抗真菌劑施用給受試者的裝置中。
189.權(quán)利要求186的試劑盒，其中所述裝置是修復(fù)用甲板(prosthetic nail plate)或甲油。
190.權(quán)利要求81的方法，其中所述具有生物活性的試劑是抗真菌劑。
191.權(quán)利要求190的方法，其中將所述抗真菌劑和載體以包含兩種組分的組合物的形式給受試者施用。
192.權(quán)利要求190的方法，其中將所述抗真菌劑和載體以分開(kāi)的方式給受試者施用。
193.權(quán)利要求190的方法，其中所述組合物是控釋組合物。
194.權(quán)利要求190的方法，其中所述抗真菌劑選自兩性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶、依曲康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、灰黃霉素、咪康唑、制霉菌素和環(huán)吡酮。
195.權(quán)利要求190的方法，其中施用所述抗真菌劑以治療真菌感染的癥狀和體征。
196.權(quán)利要求190的方法，其中施用抗真菌劑以改變甲板或甲床的真菌感染的癥狀或體征。
197.帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其具有附著的獨(dú)立地選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段和混合物的帶正電荷的分支基團(tuán)，其中下標(biāo)n1是從0至大約20的整數(shù)，下標(biāo)n2獨(dú)立地是從大約5至大約25的奇整數(shù)。
198.權(quán)利要求197的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中所述帶正電荷的分支基團(tuán)獨(dú)立地選自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基團(tuán)。
199.權(quán)利要求198的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中下標(biāo)n1是從大約1至大約8的整數(shù)。
200.權(quán)利要求198的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中下標(biāo)n1是從大約2至大約5的整數(shù)。
201.權(quán)利要求198的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約17的奇數(shù)。
202.權(quán)利要求198的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約13的奇數(shù)。
203.權(quán)利要求197的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中所述分支基團(tuán)選自HIV-TAT和其片段。
204.權(quán)利要求203的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中所述附著的帶正電荷的分支基團(tuán)是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下標(biāo)p和q各自獨(dú)立地是從0至20的整數(shù)。
205.權(quán)利要求197的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中所述分支基團(tuán)是觸角足PTD基團(tuán)或其片段。
206.權(quán)利要求197的帶正電荷的聚合物，其中所述帶正電荷的載體包含多肽。
207.權(quán)利要求206的帶正電荷的聚合物，其中所述多肽選自多聚賴氨酸、多聚精氨酸、多聚鳥氨酸和多聚高精氨酸。
208.權(quán)利要求207的帶正電荷的聚合物，其中所述多肽是多聚賴氨酸。
209.權(quán)利要求197的帶正電荷的聚合物，其中所述帶正電荷的載體包含帶正電荷的非肽基聚合物。
210.權(quán)利要求209的帶正電荷的聚合物，其中所述非肽基聚合物包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
211.權(quán)利要求210的帶正電荷的聚合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
212.一種組合物，其包含下列物質(zhì)的非共價(jià)復(fù)合物a)帶正電荷的主鏈；和b)至少兩個(gè)選自下列的成員i)具有數(shù)個(gè)附著的成像部分的帶負(fù)電荷的主鏈或數(shù)個(gè)帶負(fù)電荷的成像部分；ii)具有數(shù)個(gè)附著的靶向部分的帶負(fù)電荷的主鏈或數(shù)個(gè)帶負(fù)電荷的靶向部分；iii)至少一個(gè)選自RNA、DNA、核酶、經(jīng)修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉(zhuǎn)基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個(gè)駐留因子的DNA；和v)具有數(shù)個(gè)附著的生物學(xué)試劑的帶負(fù)電荷的主鏈或帶負(fù)電荷的生物學(xué)試劑；其中所述復(fù)合物攜帶凈正電荷且至少一個(gè)所述成員選自i)、ii)、iii)或v)。
213.制備藥物或藥妝組合物的方法，所述方法包括將帶正荷的主鏈組分和至少兩個(gè)選自下列的成員與藥物或藥妝可接受的載體組合以形成具有凈正電荷的非共價(jià)復(fù)合物，并且其中至少一個(gè)所述成員選自i)、ii)、iii)或v)i)具有數(shù)個(gè)附著的成像部分的帶負(fù)電荷的主鏈；或數(shù)個(gè)帶負(fù)電荷的成像部分；ii)具有數(shù)個(gè)附著的靶向部分的帶負(fù)電荷的主鏈；或數(shù)個(gè)帶負(fù)電荷的靶向部分；iii)至少一個(gè)選自RNA、DNA、核酶、經(jīng)修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉(zhuǎn)基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個(gè)駐留因子的DNA；和v)具有數(shù)個(gè)附著的生物學(xué)試劑或藥妝試劑的帶負(fù)電荷的主鏈，或帶負(fù)電荷的生物學(xué)試劑或藥妝試劑。
214.包含胰島素和對(duì)胰島素的透皮遞送有效的量的載體的組合物，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，其中所述載體和胰島素之間的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合。
215.權(quán)利要求214的組合物，其包含從大約30∶1至大約1.01∶1的重量比的胰島素和帶正電荷的載體。
216.權(quán)利要求214的控釋組合物。
217.用于將胰島素給受試者施用的試劑盒，其包含胰島素和載體，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，所述載體以對(duì)透皮遞送有效的量存在，其中所述載體和胰島素之間的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合。
218.權(quán)利要求217的試劑盒，其中所述組合物包含于用于將胰島素通過(guò)皮膚或上皮給受試者施用的裝置中。
219.將胰島素給受試者施用的方法，其包括將胰島素和有效量的帶正電荷的載體一起給受試者的皮膚或上皮局部施用，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，其中所述載體和胰島素之間的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合。
220.權(quán)利要求219的方法，其中所述組合物是控釋組合物。
221.包含成像部分和靶向試劑以及載體的組合物，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，所述載體以對(duì)透皮遞送有效的量存在，其中所述載體和具有生物活性的蛋白之間的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合。
222.權(quán)利要求221的組合物，其中所述成像部分和靶向試劑在物理或化學(xué)上是不同的。
223.權(quán)利要求221的組合物，其中所述成像部分和靶向試劑不都是磷酸鹽。
224.權(quán)利要求221的組合物，其中所述成像試劑是光學(xué)成像試劑。
225.權(quán)利要求224的組合物，其中所述成像試劑選自Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Oregon green 488、Oregon green 500、Oregongreen 514、綠色熒光蛋白、6-FAM、Texas Red、Hex、TET和HAMRA。
226.權(quán)利要求221的組合物，其中所述成像試劑適合用于磁共振成像。
227.權(quán)利要求221的組合物，其中所述靶向試劑識(shí)別黑色素瘤。
228.用于將權(quán)利要求221的組合物給受試者施用的試劑盒，其包含用于遞送所述成像和靶向部分以及載體的裝置，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，并且其以對(duì)透皮遞送有效的量存在。
229.用于將成像部分和靶向試劑給受試者施用的方法，其包括將所述成像部分和靶向試劑與有效量的帶正電荷的載體一起給受試者的皮膚或上皮局部施用，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，其中所述載體和所述具有生物活性的蛋白之間的結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合。
230.權(quán)利要求229的方法，其中所述成像部分和靶向試劑在物理或化學(xué)上不同。
231.權(quán)利要求229的方法，其中所述成像部分和靶向試劑不都是磷酸鹽。
232.權(quán)利要求229的方法，其中所述成像試劑是光學(xué)成像試劑。
233.權(quán)利要求232的方法，其中所述成像試劑選自Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Oregon green 488、Oregon green 500、Oregongreen 514、綠色熒光蛋白、6-FAM、Texas Red、Hex、TET和HAMRA。
234.權(quán)利要求229的方法，其中所述成像試劑適合用于磁共振成像。
235.權(quán)利要求229的方法，其中所述靶向試劑識(shí)別黑色素瘤。
236.權(quán)利要求229的方法，其中將所述組合物用于篩查有患黑色素瘤風(fēng)險(xiǎn)的患者。
237.權(quán)利要求229的方法，其中將所述組合物用于幫助手術(shù)切除黑色素瘤。
238.權(quán)利要求229的方法，其中將所述組合物和照相技術(shù)或圖象分析技術(shù)結(jié)合使用。
239.一種組合物，其包含下列物質(zhì)的非共價(jià)復(fù)合物a)帶正電荷的主鏈；和b)至少兩個(gè)選自下列的成員i)具有數(shù)個(gè)附著的成像部分的帶負(fù)電荷的主鏈；或數(shù)個(gè)帶負(fù)電荷的成像部分；ii)具有數(shù)個(gè)附著的靶向試劑的帶負(fù)電荷的主鏈；或數(shù)個(gè)帶負(fù)電荷的靶向部分；和iii)具有數(shù)個(gè)附著的生物學(xué)試劑的帶負(fù)電荷的主鏈，或帶負(fù)電荷的生物學(xué)試劑；其中所述復(fù)合物攜帶凈正電荷且所述成員中的至少一個(gè)選自i)、ii)、iii)或v)。
240.制備藥物或藥妝組合物的方法，所述方法包括將帶正電荷的主鏈組分和至少兩個(gè)選自下列的成員與藥物或藥妝可接受的載體組合以形成具有凈正電荷的非共價(jià)復(fù)合物，條件是其中至少一個(gè)所述成員選自i)、ii)、iii)或v)i)具有數(shù)個(gè)附著的成像部分的帶負(fù)電荷的主鏈或數(shù)個(gè)帶負(fù)電荷的成像部分；ii)具有數(shù)個(gè)附著的靶向試劑的帶負(fù)電荷的主鏈或數(shù)個(gè)帶負(fù)電荷的靶向部分；和iii)具有數(shù)個(gè)附著的生物學(xué)試劑或藥妝試劑的帶負(fù)電荷的主鏈，或帶負(fù)電荷的生物學(xué)試劑或藥妝試劑。
全文摘要
提供了用于遞送，包括透皮遞送具有生物活性的試劑的組合物和方法，所述具有生物活性的試劑是例如除了胰島素、肉毒毒素、抗體片段和VEGF外的非蛋白非核酸治療劑和基于蛋白的治療劑。所述組合物和方法特別地適用于抗真菌劑和適合用于免疫的抗原試劑的局部遞送?？蛇x擇地，可用用于組合物靶向遞送的組分和成像組分制備所述組合物。
文檔編號(hào)A61K49/14GK1950100SQ200580014006
公開(kāi)日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月3日
發(fā)明者J·M·沃, M·D·戴克 申請(qǐng)人:雷文斯治療公司