專利名稱：處理骨組織的方法以及相應(yīng)的可移植的生物材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種處理骨組織的方法以及相應(yīng)可移植的生物材料。
特別是，這種方法能夠按照將骨組織移植到人體內(nèi)的目的而對骨組織進行處理。這種組織一定要不會引起排斥反應(yīng)(或者至少盡可能少的發(fā)生排斥反應(yīng))，并具有良好的骨傳導(dǎo)能力，即它必須使得受體新長出的骨組織能夠形成和移動。
骨組織移植是世界上大多數(shù)整形外科門診的日用技術(shù)。這種移植可分為三類，即-同種異體移植，-自體移植，-異種移植。
同種異體骨移植的要點在于把骨組織從供體移植到同一物種的不同于該供體的受體上。自體骨移植的要點在于取出骨組織并將其移植在同一個體上。異種骨移植是指將取自動物(通常是豬或牛)的骨組織移植到人體上。
為了進行此類移植，首先要對骨組織進行機械清潔處理并清洗會對其移植造成不利影響的所有物質(zhì)。在做這些工作時我們發(fā)現(xiàn)，采用現(xiàn)有的處理方法有損于骨組織的機械性能。這是因為分離的有機物質(zhì)會影響骨質(zhì)的機械性能。不過，進行骨移植通常是為了在存在著強度問題的部分重建骨骼，其中，機械性能是最為重要的。因此，擁有其機械性能與天然骨頭相當(dāng)甚至優(yōu)于天然骨骼的現(xiàn)成骨頭移植物是非常有利的。
例如，這種移植物可用于整形外科，特別是當(dāng)移植物負載時，即脊髓外科(頸推合并，脊椎盤置換等)，髖臼基的再造，關(guān)節(jié)成形外科，切骨手術(shù)，假關(guān)節(jié)，關(guān)節(jié)固定術(shù)等。
因此，當(dāng)移植物是用于修復(fù)支承移植的人造假體(關(guān)節(jié)假體，牙齒假體等)時，采用其機械強度尤其是在加壓情況下高于原始的損壞骨頭的機械強度的移植物，從假體的壽命和功能來看是一個決定性的有利因素。而且，安插在假體與骨頭之間的移植物可使得機械性能的變化更加平緩，且由于避免了強度的過陡的局部化梯度而改善了應(yīng)力傳送的質(zhì)量。此外，如果移植物從被植入時起其強度就與骨頭的強度相同，就可以消除在移植物被新形成的骨組織吸收期間發(fā)生變質(zhì)的危險。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種可移植的生物材料，其機械性能，特別是加壓條件下的強度至少與天然骨頭的強度相當(dāng)。特別地，本發(fā)明的目的是提供一種在加壓條件下其強度為天然骨頭的一至二倍的可移植的生物材料。
此外，本發(fā)明的目的還在于提供這樣一種生物材料，它可以改善骨移植的機械學(xué)和生物學(xué)功效。
事實上，同種異體移植有很多缺陷。首先，因骨組織從一個個體轉(zhuǎn)移到另一個體中所引起的感染的危險性很大。在AIDSHIV病毒傳播方面尤為如此。隨著這類疾病的大量增加，發(fā)生此類感染的危險性在近年也明顯增加。除了這些感染(它們病毒)還涉及其它的危險以外，與采用同種移植物有關(guān)的主要并發(fā)癥是骨折以及被植入骨組織(移植物)的不成功的移地再發(fā)育和對移植物的排斥。如今，移植物不成功的移地再發(fā)育具有一個突出的問題。這是因為移植物的組織據(jù)認為要被新形成的骨組織吸收、侵入和取代。但是，迄今為止，這種修復(fù)還是不結(jié)實。
因此，本發(fā)明的目的之一是生產(chǎn)一種可移植的骨組織，這種骨組織從感染和免疫系統(tǒng)角度來看是安全的。
本發(fā)明的另一個目的是使得這類骨移植具有良好的骨傳導(dǎo)能力(即有助于成功地移地再發(fā)育的能力)。
自體移植一般比同種異體移植更可取，因為這種移植可更完善地移地再發(fā)育并傾向于促成移植物處的骨細胞生長。其結(jié)果是感染和對免疫系統(tǒng)破壞的可能性明顯減少了，但是，這類方法并不完全令人滿意。這是因為這種方法很疼痛，患者常會做出拒絕的反應(yīng)，并具有在供體位點上發(fā)生并發(fā)癥的危險。此外，在很多手術(shù)中需要大量的骨組織，這與自體移植是相矛盾的。
異種骨移植同樣具有許多缺陷。通常，這些移植物會引起強烈的免疫反應(yīng)(排斥)。為了減輕這一缺陷，做出了各種以減少或消除這種反應(yīng)為目的的努力。他們通常都是基于這樣的原則在移植之前從骨組織中分離蛋白質(zhì)。因為骨組織中所含蛋白質(zhì)是某些排斥反應(yīng)的誘因。這種排斥反應(yīng)也與髓狀組織中細胞碎片的存在和這種組織的其它因子有關(guān)。
用于從骨組織中提取蛋白質(zhì)的有機溶劑是已知的，最常用的溶劑是乙二胺、過氧化氫、各種氯化溶劑如三氯甲烷或二氯甲烷、以及乙醇和丙酮。通過這種方法將蛋白質(zhì)分離之后，大多數(shù)骨組織很少出現(xiàn)或不出現(xiàn)免疫反應(yīng)。通常，他們可以成功地再生血管并被受體的骨細胞侵入。不過，他們本身并沒有骨誘發(fā)性能。其機械強度通常也低于天然骨質(zhì)的強度，或與之相當(dāng)。
然而，應(yīng)當(dāng)指出的是，用于分離蛋白質(zhì)的溶劑通常是劇毒的。因此，必需對骨組織進行仔細漂洗(就其多孔性而言，這一點是難于做到的)以免對受體位點造成任何污染。
法國專利申請FR-A-2，654，625公開了一種將這種有毒溶劑與一種選擇的脲基分離劑配合使用分離蛋白質(zhì)的方法。然而，這種方法會得到極為不同的脂質(zhì)分離結(jié)果，因為根據(jù)該專利，會有0.5-5%的殘留脂質(zhì)。
從動物的組織或器官中分離各種物質(zhì)，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核苷酸和糖類的超臨界狀態(tài)的流體是已知的。但是，這些已知方法在使用時被認為是復(fù)雜的和昂貴的，與其他分離方法相比無任何突出優(yōu)點。
因此，在現(xiàn)有技術(shù)中沒有公開在處理骨組織時分離有機物質(zhì)的可行性，作為這種分離的結(jié)果，骨組織的機械強度得以改進。
本發(fā)明的目的是減少現(xiàn)有技術(shù)中的各種缺陷，特別是提供一種與天然骨質(zhì)相比具有改進的強度的可移植的骨組織，這種骨組織對于感染和免疫系統(tǒng)來說是安全的，具有良好的骨傳導(dǎo)能力且不使用有毒制品。本發(fā)明的特殊目的是提供一種能這樣處理骨組織的方法。
為此，本發(fā)明涉及一種為了得到可植入人體并適于承受機械應(yīng)力的生物材料而處理動物和人的骨組織的方法，在該方法中對骨組織周圍的所有有機物質(zhì)進行機械清理并將其從骨組織上分離，其特征在于它包括至少一個將超臨界狀態(tài)下的一種流體滲透到骨組織里的步驟。
本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在處理過程中可以極方便地將骨組織與超臨界流體接觸，以便在分離有機材料的同時提高其機械強度。
根據(jù)本發(fā)明，在一個步驟中將這種超臨界狀態(tài)下的流體滲透到骨組織里，以使骨組織里可溶于該流體的大部分脂類物質(zhì)被分離。用這種超臨界流體所實現(xiàn)的分離具有特別適用于骨組織的特性。
根據(jù)本發(fā)明，該方法包括(a)對骨組織周圍的所有有機物質(zhì)進行機械清理;
(b)按照預(yù)定形狀切割上述骨組織;
(c)清理骨組織以便將對成功地再植有害的成份與之分離，將適于溶解于該骨組織并適于將存在于該組織中的大部分脂類有機物質(zhì)分離的超臨界狀態(tài)的流體滲透到骨組織里;
(d)對以上述方式清理過的骨組織進行清洗、脫水和消毒。清理步驟(c)中還包括對骨組織進行化學(xué)處理和/或酶處理，以便分離出殘留在其中的特定蛋白質(zhì)。
這種處于超臨界狀態(tài)的流體是一種具有低動態(tài)粘度(接近氣體的動態(tài)粘度)，高擴散系數(shù)、極低的界面張力和高密度(接近液體的)易于擴散到多孔材料里而無任何吸收問題。另外，這種流體的溶解能力很高(接近液體的溶解力，有時能達到氣體溶解力的108倍)，而且能通過改變壓力而加以改進。其結(jié)果是，這種超臨界狀態(tài)的流體可輕易地溶解骨組織中大部分的脂類有機物質(zhì)，實際上是完全溶解。從而顯著減少免疫系統(tǒng)和感染的危險。
本發(fā)明一個優(yōu)點是將二氧化碳(CO2)用作超臨界狀態(tài)的流體，因為這種成分具有很多優(yōu)良特性，即-其臨界溫度較低，為31℃。因此，有可能在大約31℃的溫度和約7.38MPa的壓力下工作時使CO2處于臨界狀態(tài)。根據(jù)所施加的壓力，可以在31～60℃的溫度下工作，在此溫度下可能對骨組織造成的唯一損害是膠原蛋白的變性，這會使其失去其抗原特征。
-其溶解力十分優(yōu)越，尤其是對脂類的溶解。例如，已知許多種脂肪酸和甘油三酯在超臨界狀態(tài)下在CO2中有接近10%的溶解度。然而，這些脂類大量存在于髓狀組織中，這種髓狀組織滲透在海綿狀骨組織里，這些脂類是很強的抗原，并且總是極難除去;另外，由于它們不能被吸收，所以就形成妨礙移植物移地再發(fā)育的物理屏障;
-它能加強骨質(zhì)的生物力學(xué)性能并有助于被植入骨組織的骨整合;
-它是一種天然的、完全無毒的物質(zhì);
-它易于得到并且無論對于被處理的物質(zhì)還是實驗者均無危險。
在骨組織的處理上輔以化學(xué)處理或酶處理是有利的，它尤其適于分離骨組織中的蛋白質(zhì)材料。
本發(fā)明還涉及根據(jù)上述方法所獲得的可移植的生物材料，它由純化的骨組織構(gòu)成，將其在超臨界狀態(tài)下與一種流體接觸，該組織適于移植到人體上骨組織受損的位點。
根據(jù)本發(fā)明，通過采用超臨界狀態(tài)的流體分離將骨組織中的大部分脂類有機物質(zhì)清除。
這種材料的強度與天然骨質(zhì)的強度相當(dāng)或更高，而且對于感染和免疫系統(tǒng)來說是安全的，無毒的，由于分離出了其原先所含的幾乎所有脂類，所以它具有良好的骨傳導(dǎo)能力。
通過以下描述，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點將更為明顯，結(jié)合表示完成本發(fā)明方法的裝置的附圖
給出了非限定性實施例。
圖中所示的裝置包括一個反應(yīng)器1，骨組織2放在其中，并有超臨界狀態(tài)的CO2從中通過。
CO2以液態(tài)儲存于筒3中，通過過濾器4，再由冷凍裝置5冷卻到某一溫度，在該溫度下它總呈液態(tài)，例如0℃左右，然后再送入緩沖槽6中。在槽6的下游安裝一臺限量泵7，由它將液態(tài)CO2壓縮變成超臨界狀態(tài)的壓力。在泵7的下游安裝一個閥8，使泵7與反應(yīng)器隔離，以便對反應(yīng)器1施壓或減壓，CO2由一個加熱器9加熱，以使其在離開加熱器時呈超臨界狀態(tài)。CO2從反應(yīng)器1中通過并從與進入端相反的另一端出來。閥10安裝在反應(yīng)器1的下游，以使其與回路隔離。閥10還使得CO2在被送入第一分離器11之前將壓力減少。在分離器11的出口12處回收溶解于CO2中的物質(zhì)。該裝置還包括第二個分離步驟，它包括一個使壓力進一步降低的閥13和第二個具有用于回收有機物質(zhì)的出口18的分離器14。視需要可設(shè)置兩個以上的分離步驟。CO2在分離步驟的出口12、18處由閥15反饋到該回路中。筒3通過單向閥16和閥17與該密閉的回路連通。
下面將講述本發(fā)明的處理骨組織的方法。
依慣例，首先對骨組織進行機械清理，然后切割成需要的尺寸和預(yù)定的形狀。舉例來說，骨組織的形狀可以是直角平行六面體、柱狀或其它任意適宜形狀。然后將該骨組織放入分離反應(yīng)器1中。在31～60℃的溫度和大約1.5×107～4×107Pa的壓力下可達到最佳工作狀態(tài)。
CO2由限量泵7以流體形態(tài)泵入。該液體在分離反應(yīng)器1的上游被預(yù)熱，以使以超臨界形態(tài)進行反應(yīng)器1。
應(yīng)當(dāng)指出的是，超臨界狀態(tài)的流體可定義為處于這種溫度條件和壓力下使其特性介于氣體與液體之間的氣體。也可稱之為“高密度氣體”或“膨脹的液體”。對于一種特定的化學(xué)物質(zhì)來說，溫度壓力曲線上液相和汽相趨于同一種相的那個點被稱為臨界點。超過該臨界溫度(Tc)和臨界壓力Pc，流體就處于所謂“超臨界”狀態(tài)。
超臨界狀態(tài)的CO2通過反應(yīng)器1可溶解骨質(zhì)中大部分的有機物質(zhì)，主要是脂類物質(zhì)。特別是，它可溶解骨組織中所含髓狀組織里的脂肪。
由于超臨界流體的特性，這種分離是極為有效的。特別是通常不溶于已知方法中所用化學(xué)溶劑里的脂肪可以被超臨界狀態(tài)的CO2所分離。
為了控制由CO2所實現(xiàn)的脂類的分離，分離器11和14里經(jīng)常沒有分離物，而回收脂肪殘余物。骨組織與超臨界的CO2接觸，同時在分離器11、14的出口12、18處回收脂肪殘余物流。處理時間與被處理骨組織的重量和輸入反應(yīng)器1中的超臨界CO2流成比例的變化。因此，該處理過程可以通過控制通過骨組織的CO2量而被中止，CO2量本身是確定的。實際上，我們已經(jīng)知道分離的質(zhì)量產(chǎn)率是恒定的。因此，采用質(zhì)量流量計系列安裝在反應(yīng)器1的出口處，這樣在所用CO2量充足時可以阻斷該過程。
應(yīng)該指出的是，所分離的物質(zhì)包含98%以上的脂肪。在處理之后，骨組織含有不到平均2%的脂，且這一含量是平均分布的。此外，其耐壓強度約為10～20MPa。
值得一提的是，與在化學(xué)反應(yīng)器中常出現(xiàn)的情況相反，不是提取物(主要是脂類物質(zhì))被連續(xù)使用，而是殘余物(骨組織)被連續(xù)使用。
因此，超臨界狀態(tài)下的流體還具有強化骨質(zhì)改善其生物力學(xué)特性和凈化骨質(zhì)的雙重功效。
以這種方式處理過的骨組織還要進行常規(guī)處理，包括化學(xué)處理或酶處理，以提取特定的蛋白質(zhì)。額外的化學(xué)處理可采用過氧化氫進行，而酶處理則由蛋白酶來完成。這些額外的處理可保證更有效地從骨組織上提取蛋白質(zhì)，從而減少了以這種方法處理過的骨組織發(fā)生排異反應(yīng)的危險。
接著，對骨組織進行清洗處理。該清洗過程是通過若干次在30～60℃的連續(xù)的蒸餾水浴實現(xiàn)的。
然后進行一個包括對骨組織脫水和消毒的步驟。這一步驟是通過讓其通過若干個濃度逐漸增高的乙醇浴，例如70%、95%和100%。值得一提的是，由于乙醇是一種優(yōu)良的殺病毒劑，它使得有可能在使骨組織脫水的同時提高該生物材料就感染而言的安全性。在30～60℃溫度下在通風(fēng)爐中干燥結(jié)束該處理。
在包裝之后再對骨組織進行消毒處理。這一消毒處理可通過β-粒子或γ射線(25KGray)輻射來實現(xiàn)。在移植之前對骨組織進行再次切割以使其適應(yīng)受體骨組織是可行的，這是因為這樣處理過的骨組織較堅硬，可以再次切割而不會破碎。
在下表中可看出未經(jīng)處理骨組織的分析結(jié)果(例1)，使用超臨界態(tài)CO2處理的骨組織的分析結(jié)果(例2)，以及除用CO2處理外還經(jīng)過一個化學(xué)處理(例3)或酶處理(例4)步驟的骨組織的分析結(jié)果。
給出了四個例子中有機物質(zhì)OM、有機碳C、N和脂類殘余物(脂質(zhì))的相應(yīng)的比例值和耐壓強度。所列出的值是平均值;括號中給出了允許范圍。
骨組織分析是以牛股骨末端為材料的。
第二組相同的試驗是以不同來源的牛骨為材料進行的。在下表中，例1和例4是38次測量的平均值，例2是39次測得的平均值，例3是28次測得的平均值。
就僅用超臨界狀態(tài)的流體進行處理而言(例2)，可注意到在例3和4中C和N含量的減少，更常見的是有機物質(zhì)的減少。這種減少與髓狀組織中非脂組分的消失有關(guān)，也與骨組織中可溶性蛋白質(zhì)的溶解有關(guān)。這種手術(shù)可明顯減少炎癥反應(yīng)并進一步改善骨傳導(dǎo)性，正如在動物上實驗所證實的。
應(yīng)當(dāng)注意的是，這種移植物的生物力學(xué)性能從統(tǒng)計學(xué)觀點來看優(yōu)于用于制成這種移植物的骨質(zhì)的(例1)生物力學(xué)性能。事實上，處理過的骨組織的耐壓強度優(yōu)于未處理的對照骨組織的耐壓強度。
應(yīng)當(dāng)注意的是，作為上述方法的改型，清理和切割骨組織的步驟可以如下方式進行。
清理步驟可以通過噴砂處理完成，其中，氧化鋁以4×105～106Pa的壓力作用于骨質(zhì)，以除去附著在它上面的所有軟組織，包括骨膜。該項技術(shù)比完全手工的常規(guī)方法更為迅速而有效，而噴砂處理可以由全自動化遙控機器完成。
另一方面，切割步驟可以是噴水切割。這種切割可以精確到10μm，它是由噴純水完成的，因而避免了由切割工具所致的一切污染，且可將其用于大量生產(chǎn)。
當(dāng)然，本發(fā)明并不局限于所選擇的實施例，還包括本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)的各種改進。因此，由超臨界狀態(tài)流體所進行的清理步驟，可輔以在超臨界狀態(tài)的流體中溶解一種流體，在反應(yīng)器本身中可對骨組織發(fā)生特殊作用。
因而有可能在同一地方(反應(yīng)器)和同一時間實現(xiàn)蛋白質(zhì)分離和脫脂反應(yīng)。另外，這樣溶解在超臨界狀態(tài)流體中的流體處于非常有利于此類反應(yīng)的溫度和壓力下。
這樣，如果需要從髓狀組織或胞外骨基質(zhì)或再次從其強抗原作用主要負責(zé)免疫反應(yīng)的髓狀組織的細胞碎片中除去蛋白質(zhì)，則將下列物質(zhì)引入反應(yīng)回路是有利的針對有機物質(zhì)的去污劑、氧化劑，對其它反應(yīng)之一專一的酶類，更普通的是適用于所進行處理的任何物質(zhì)，只要它可被超臨界狀態(tài)下的CO2溶解。
值得一提的是，上述方法和生物材料可以用人或動物骨骼實現(xiàn)和生產(chǎn)?？蓪⑵溆糜谝浦?，特別是用于整形外科，和用于移植物需要承受機械應(yīng)力的情形中，例如脊髓外科(頸推合并，脊椎盤更換等)，髖臼基再造，關(guān)節(jié)成形外科、切骨手術(shù)、假關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)固定術(shù)等。
權(quán)利要求
1.為了獲取可植于人體并適于承受機械應(yīng)力的生物材料而對動物或人體的骨組織進行處理的方法，其中，骨組上的所有附在骨組織周圍的有機物質(zhì)進行機械清理并將這些有機物質(zhì)從骨組織上分離，其特征在于它包括至少一個使超臨界狀態(tài)的流體滲透到骨組織里的步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于骨組織被放置在經(jīng)過它的超臨界流體流中。
3.如上述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于上述步驟是這樣的骨組織中可溶于這種超臨界狀態(tài)流體中的大部分脂類有機物質(zhì)在該步驟中被分離。
4.如上述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于它包括(a)機械清理骨組織周圍的所有有機物質(zhì);(b)按預(yù)定形狀切割該骨組織;(c)清理骨組織以便分離其上對成功的再移植有害的成份，使適于溶解和分離骨組織中大部分脂類有機物質(zhì)的超臨界狀態(tài)的流體滲透到骨組織里;(d)對所清理的骨組織進行清洗、脫水和消毒。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于清理步驟(c)還包括為了分離出殘留于骨組織中的特殊蛋白質(zhì)而對其進行的化學(xué)或酶處理。
6.如上述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于所使用的超臨界狀態(tài)的流體是CO2。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于超臨界流體狀態(tài)下的CO2具有31～60℃左右的溫度和承受1.5×107～4×107Pa的壓力。
8.如上述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于超臨界狀態(tài)下的流體中含有特別溶解的流體，這些特別流體適于從骨組織中分離蛋白質(zhì)或其它特殊物質(zhì)。
9.如權(quán)利要求1～8所述的方法，其特征在于上述適于從骨組織中分離特殊蛋白質(zhì)的特別流體被用于在使用超臨界狀態(tài)流體的步驟之后的清洗步驟中。
10.如上述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于通過機械地噴氧化鋁來清理骨組織。
11.如上述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于骨組織是通過高壓水噴射而被切割的。
12.如上述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于在用超臨界的流體處理骨組織之后，在20～60℃的溫度下使其通過若干個連續(xù)的蒸餾水浴而對它進行清洗。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于骨組織在清洗之后通過經(jīng)過若干個濃度逐漸增大的連續(xù)的乙醇浴而被脫水和消毒，然后在通風(fēng)爐中31～60℃溫度下干燥。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于在脫水之后，將骨組織包裝后輻射消毒。
15.根據(jù)上述權(quán)利要求之一所述方法獲取的可移植的生物材料，其特征在于它由與超臨界狀態(tài)下的流體接觸過的凈化骨組織組成，該組織適于移植到人體內(nèi)有受損骨組織的位置。
16.如權(quán)利要求15所述的生物材料，其特征在于骨組織通過用超臨界狀態(tài)的流體分離的方法清除了大部分的脂類有機物質(zhì)。
17.如上述權(quán)利要求之一所述的生物材料，其特征在于其脂類殘余少于2%，耐壓強度為10～20MPa左右。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種處理取自動物或人體的骨組織的方法，以及相應(yīng)的可移植的生物材料。根據(jù)本發(fā)明，讓一種超臨界狀態(tài)的流體滲入骨組織。如此處理過的骨組織隨后便可實施分離特殊蛋白質(zhì)的步驟。這種組織用來安放在受損的骨組織上且具有起碼與天然骨質(zhì)相當(dāng)?shù)臋C械性能。
文檔編號A61L2/00GK1090206SQ9311999
公開日1994年8月3日 申請日期1993年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月21日
發(fā)明者J·法吉斯, A·馬蒂, D·康比斯, J·-S·康多雷特 申請人:生物園地有限公司