專利名稱：甾醇類化合物及總甾醇提取物在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及甾醇類化合物及總甾醇提取物在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甾醇類化合物，特別是植物中的甾醇類化合物，主要包括谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、以及甾醇糖苷、甾醇酯和?；薮继擒盏?。很多植物中都含有甾醇類化合物，在植物中主要以混合物形式存在。
有關(guān)甾醇類化合物的生物活性也有大量報道。例如，甾醇糖苷具有補(bǔ)體活化和抗炎活性；包括β-谷甾醇葡萄糖苷和其它β-谷甾醇糖苷的甾醇糖苷混合物具有免疫調(diào)節(jié)作用；體內(nèi)試驗表明，他們對Hashimoto氏甲狀腺炎、遺傳性過敏癥的exzema、牛皮癬、哮喘和腫瘤都有作用。甾醇可降低膽固醇。但甾醇類成分對抑郁、焦慮等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用未見報道。
抑郁癥(depression)是情感性精神障礙(mood disorders)的主要類型，是一種以顯著而持久的心境低落為主要特征的綜合征，其主要表現(xiàn)有情緒低落，言語減少，精神、運動遲緩，常自責(zé)自罪，甚至企圖自殺等。隨著社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，生活節(jié)奏日益加快，生活工作壓力不斷加大，抑郁癥已成為現(xiàn)代社會的常見病、高發(fā)病，其發(fā)病率正在迅速攀升。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，全世界抑郁癥患者已經(jīng)達(dá)到2億多。世界上大型流行病學(xué)研究顯示，“抑郁”目前在世界致殘性疾病中排名第四，至少有3％～5％的終身患病率，到2020年將排名第二，僅次于缺血性心臟病。
目前用于治療抑郁癥的化學(xué)合成藥物主要有三環(huán)類抗抑郁劑、單胺氧化酶抑制劑和5-羥色胺重吸收抑制劑，但均有不同程度的不良反應(yīng)，在長期服用后會出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用，大大影響了患者的生存質(zhì)量。因此，迫切需要尋找高效、安全的抗抑郁藥物。
從中草藥中尋找和研制具有良好抗抑郁作用的藥物，具有療效好、副作用小、適合長期服用及安全可靠等許多優(yōu)點，已愈來愈引起人們的重視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于研究設(shè)計天然植物中療效好、副作用小、適合長期服用及安全可靠的抗抑郁藥物。
本發(fā)明以天然植物或中藥材為原料，采用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹脂吸附法或二氧化碳超臨界萃取等工藝中的一種或多種工藝，并結(jié)合濃縮干燥、減壓干燥或冷凍干燥等常用干燥方法，利用包括吸附樹脂柱層析、真空液相柱層析、硅膠柱層析、Sephadex凝膠柱層析、中低壓柱層析以及高壓液相(HPLC)柱層析，和沉淀、結(jié)晶等方法獲得甾醇類化合物或總甾醇提取物。
上述的天然植物或中藥包括百合、白芍、大棗、大豆(或大豆油脫臭餾出物)、牛膝、油菜籽、小麥(或小麥麩)等。
在采用溶劑提取法中，所用溶劑可選用水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚或石油醚等有機(jī)溶劑或兩種或多種互溶的混合溶劑，在室溫下浸漬提取或用超聲提取或加熱狀態(tài)下的回流提取，提取次數(shù)可為一次，也可為多次。
在采用溶劑萃取法中，可將上述得到的提取物懸浮于水中用合適的溶劑丁醇、戊醇、乙酸乙酯、甲酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚或石油醚等直接進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)可為一次，也可為多次。
上述的樹脂法為大孔吸附樹脂法，水、醇或含水醇提取物可用大孔吸附樹脂進(jìn)行處理，棄去水洗脫部分，全部或部分收集醇洗脫部分即得。
所采用的二氧化碳超臨界萃取法可根據(jù)情況加入適當(dāng)?shù)膴A帶劑，如環(huán)己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇或乙醇等。
本發(fā)明所述甾醇類化合物包括甾醇、甾醇衍生物、甾醇酯、甾醇糖苷、?；薮继擒找约八鼈兊难苌铩?br> 所述總甾醇提取物是指由天然植物或中藥中通過上述提取分離方法得到的含有上述一種或一種以上甾醇類化合物的提取物，其總甾醇含量在50～90％。
所述甾醇是谷甾醇(Sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、菜油甾醇(Campesterol)菜籽甾醇(brassicasterol)、膽甾醇(cholesterol)、菠菜甾醇(spinasterol)、巖藻甾醇(fucosterol)、羊毛甾醇(lanosterol)、燕麥甾醇(avenasterol)、禾本甾醇(gramisterol)、多孔甾醇(poriferasterol)、菌甾醇(fungisterol)、扶桑甾醇(rosasterol)、莧菜甾醇(amasterol)、糞甾醇(epicoprosterol)、刺松藻甾醇(codisterol)、鈍葉甾醇(obtusifoliol)、蜆甾醇(corbisterol)、粉苞苣甾醇(chondrilla sterol)、鏈甾醇(desmosterol)、]桐甾醇(clerosterol)、大戟甾醇(euphorbosterol)等來源于植物的甾醇。
所述甾醇衍生物是指甾醇中部分或全部雙鍵加氫氫化或7-位去氫或氧化等的衍生物所述甾醇酯是甾醇與不飽和脂肪酸或阿魏酸形成的甾醇酯。其不飽和脂肪酸具有16～22個碳原子和一個或一個以上不飽和碳碳雙鍵。
所述甾醇糖苷是甾醇與天然五碳糖或六碳糖等一個或一個以上的單糖結(jié)合形成的甾醇糖苷。所述單糖是D-葡萄糖(D-glucose)、D-甘露糖(D-mannose)、D-半乳糖(D-galactose)、D-阿洛糖(D-allose)、L-阿拉伯糖 (L-arabinose)、D-來蘇糖(D-lyxose)、D-木糖(D-xylose)、D-核糖(D-ribose)、D-果糖(D-fructose)、 L-山梨糖(sorbose)、L-鼠李糖(rhamnose)或L-夫糖(L-fucose)等。
所述?；薮继擒帐巧鲜鋈我荤薮继擒蘸筒伙柡椭舅嵝纬傻孽；薮继擒?。其不飽和脂肪酸具有16～22個碳原子和一個或一個以上不飽和碳碳雙鍵。
本發(fā)明所述甾醇類化合物及總甾醇提取物進(jìn)行了下列動物藥效實驗1、甾醇類化合物抗抑郁作用試驗甾醇類化合物選擇β-谷甾醇(I)、β-谷甾醇葡萄糖苷(II)和亞油酰葡萄糖基β-谷甾醇(III)為代表，采用小鼠強(qiáng)迫游泳試驗、拮抗利血平實驗和自發(fā)性活動實驗進(jìn)行抗抑郁作用檢測和驗證。
①小鼠強(qiáng)迫性游泳實驗(FST)用經(jīng)典的小鼠強(qiáng)迫性游泳抑郁模型，觀察了小鼠1次性口服或腹腔注射不同劑量甾醇類化合物后對其強(qiáng)迫性游泳不動時間的影響，以評價該化合物的抗抑郁活性。取雄性ICR小鼠，體重24-28g。給藥1小時后進(jìn)行實驗，將小鼠置于盛有25℃水的玻璃缸(直徑10cm，高20cm)內(nèi)，水深10cm，使小鼠游泳6分鐘，前2分鐘不計，記錄后4分鐘內(nèi)動物累計的不動時間。實驗結(jié)果表明，口服90mg/ml或腹腔注射30mg/kg的β-谷甾醇(I)、30mg/ml的β-谷甾醇葡萄糖苷(II)和30mg/ml的亞油酰葡萄糖基β-谷甾醇(III)均能顯著減少小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間(P＜0.05)(見表2、3、4)。
表2.β-谷甾醇對小鼠游泳不動時間的影響

**P＜0.01，*P＜0.05vs control group表3.β-谷甾醇葡萄糖苷對小鼠游泳不動時間的影響

**p＜0.01，*p＜0.05表4.亞油酰葡萄糖基β-谷甾醇對小鼠游泳不動時間的影響

**p＜0.01，*p＜0.05②拮抗利血平在小鼠引起的眼瞼下垂實驗用經(jīng)典的利血平在小鼠引起的眼瞼下垂模型，觀察了小鼠1次性腹腔注射給予不同劑量甾醇類化合物-β-谷甾醇后對利血平引起的眼瞼下垂的影響，以評價該化合物的抗抑郁活性。取雄性ICR小鼠，體重24-28g。腹腔注射給予不同劑量的β-谷甾醇，并同時皮下注射給予2.5mg/kg的利血平，1小時后測定眼瞼下垂。實驗結(jié)果表明腹腔注射30mg/kg的β-谷甾醇能顯著拮抗利血平在小鼠引起的眼瞼下垂(見表5)。
表5.β-谷甾醇對利血平在小鼠引起眼瞼下垂的影響

③β-谷甾醇對小鼠自發(fā)性活動的影響(LMA)觀測小鼠口服β-谷甾醇，在強(qiáng)迫游泳實驗有效劑量范圍內(nèi)對自發(fā)活動的影響，以檢驗β-谷甾醇是否有中樞興奮或抑制作用。
采用Auto Track運動解析儀(美國Columbus Instruments)觀察小鼠自發(fā)性活動。取雄性ICR小鼠，體重24-28g。腹腔注射30mg/kg或口服90mg/kg的β-谷甾醇1小時后將小鼠放入解析儀的有機(jī)玻璃敞箱中，觀察動物的箱內(nèi)10分鐘的自發(fā)活動，觀察指標(biāo)包括水平運動數(shù)、垂直運動數(shù)和總運動數(shù)。實驗結(jié)果表明強(qiáng)迫游泳有效劑量范圍內(nèi)的β-谷甾醇對小鼠自發(fā)性活動沒有明顯影響(表6)。
表6.β-谷甾醇對小鼠自發(fā)活動的影響

以上實驗表明，小鼠腹腔注射給予β-谷甾醇可拮抗利血平引起的眼瞼下垂，小鼠灌胃給予甾醇類化合物可顯著減少強(qiáng)迫游泳不動時間，并且此作用不是由于中樞興奮作用產(chǎn)生的，說明甾醇類化合物如β-谷甾醇等有抗抑郁作用。
2、百合總甾醇提取物抗抑郁作用試驗①小鼠強(qiáng)迫性游泳實驗(FST)實驗方法同上表7.不同劑量百合總甾醇提取物對小鼠游泳不動時間的影響

②小鼠懸尾實驗雄性小鼠灌胃給藥1h后，將小鼠尾端2cm的部位貼在離臺面35cm高的一根水平棍上，使動物成倒掛狀態(tài)。觀察6min，比較各組小鼠在后4min內(nèi)的累計不動時間。
表8.百合總甾醇提取物小鼠懸尾實驗結(jié)果

③小鼠自發(fā)活動試驗實驗方法同上表9.百合總甾醇提取物對小鼠自發(fā)活動的影響

3、不同植物提取物抗抑郁作用試驗實驗方法同上。
表10.不同植物提取物對小鼠游泳不動時間的影響

表1.β-谷甾醇葡萄糖苷(II)和亞油酰葡萄糖基β-谷甾醇(III)的13C NMR數(shù)據(jù)


本發(fā)明中所述甾醇類化合物作為制備治療抑郁、焦慮等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物的有效成份，可單獨應(yīng)用或者合用或與適宜的賦形劑等結(jié)合，按照常規(guī)方法制成口服劑型或非口服劑型的治療抑郁、焦慮等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物。
實施例實施例1甾醇類化合物?；如薮计咸烟擒?Acylated sitosteryl glucoside)的提取分離。
取百合科植物百合的干燥鱗莖(葉)片1kg，用80％乙醇回流提取，濃縮浸提液得乙醇提取物，提取物混懸于水中，用石油醚萃取，濃縮得石油醚提取物，石油醚提取物上硅膠柱層析，梯度洗脫，其中15～16#部分再經(jīng)硅膠柱層析得到6’-O-亞油?；?-O-葡萄糖基-β-谷甾醇(NMR數(shù)據(jù)見表1)。
實施例2甾醇類化合物β-谷甾醇葡萄糖苷的提取分離取百合科植物百合的干燥鱗莖(葉)片1kg，用80％乙醇回流提取，濃縮浸提液得乙醇提取物，提取物混懸于水中，用乙酸乙酯萃取，濃縮得乙酸乙酯提取物，乙酸乙酯提取物上硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫，再經(jīng)SephadexLH20凝膠柱層析得到β-谷甾醇-3-O-葡萄糖苷(NMR數(shù)據(jù)見表1)。
實施例3甾醇類化合物β-谷甾醇提取分離取百合科植物百合的干燥鱗莖(葉)片1kg，用80％乙醇回流提取，濃縮浸提液得乙醇提取物，提取物混懸于水中，用石油醚萃取，濃縮得石油醚提取物，石油醚提取物上硅膠柱層析，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，氯仿甲醇溶液中結(jié)晶，得到β-谷甾醇。
實施例4大棗中甾醇類化合物的提取分離取干燥大棗用80％乙醇回流提取，濃縮浸提液得乙醇提取物，提取物混懸于水中，用乙酸乙酯萃取，濃縮得乙酸乙酯提取物；將乙酸乙酯提取物混懸于5％氫氧化鈉水溶液中，用乙酸乙酯萃取，萃取物上硅膠柱，正己烷-氯仿-甲醇梯度洗脫，洗脫餾分放置或甲醇重結(jié)晶，得到β-谷甾醇和β-谷甾醇葡萄糖苷。
實施例5白芍中甾醇化合物的提取分離取白芍飲片，用85％乙醇回流提取，濃縮浸提液得乙醇提取物，提取物混懸于水中，用石油醚萃取，濃縮得石油醚提取物，石油醚提取物上硅膠柱層析，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，氯仿甲醇溶液中結(jié)晶，得到β-谷甾醇。
實施例6百合中總甾醇提取物的提取分離取百合科植物百合的干燥鱗莖(葉)片，用80％乙醇回流提取，濃縮浸提液得乙醇提取物，提取物混懸于水中，用氯仿萃取，將氯仿萃取物溶液丙酮中，過濾，丙酮溶液濃縮干燥后，加甲醇熱熔，放置一定時間后，過濾，收集沉淀物，干燥，得百合總甾醇提取物。
實施例7大豆中總甾醇提取物的提取分離將大豆脫臭餾出物溶于乙酸乙酯，用5％氫氧化鈉萃取，水系，濃縮干燥后熱熔于甲醇，放置，濾出沉淀既為總甾醇提取物。
實施例8牛膝中總甾醇提取物的提取分離取干燥牛膝，粉碎，用80％乙醇回流提取，提取物混懸于水中，以乙酸乙酯萃取，萃取液再用5％氫氧化鈉洗滌后，用甲醇熱熔放冷沉淀，反復(fù)多次的牛膝總甾醇提取物。
權(quán)利要求
1.一種甾醇類化合物及總甾醇提取物在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甾醇類化合物及總甾醇提取物在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用，其特征在于其中所述的甾醇類化合物為甾醇、甾醇衍生物、甾醇酯、甾醇糖苷和酰化甾醇糖苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甾醇類化合物及總甾醇提取物在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用，其特征在于其中所述總甾醇提取物是從百合、白芍、大棗、大豆或大豆油脫臭餾出物、牛膝、油菜籽、小麥或小麥麩中提取得到的含有一種或多種甾醇類化合物的提取物，其總甾醇含量為50-90％。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種甾醇類化合物，其特征在于其中所述甾醇為谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、膽甾醇、菠菜甾醇、巖藻甾醇、羊毛甾醇、燕麥甾醇、禾本甾醇、多孔甾醇、菌甾醇、扶桑甾醇、莧菜甾醇、糞甾醇、刺松藻甾醇、鈍葉甾醇、蜆甾醇、粉苞苣甾醇、鏈甾醇、桐甾醇或大戟甾醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種甾醇類化合物，其特征在于其中所述甾醇衍生物為甾醇中部分或全部雙鍵加氫氫化或7-位去氫或氧化的衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種甾醇類化合物，其特征在于其中所述甾醇酯為甾醇與不飽和脂肪酸或阿魏酸形成的甾醇酯，其不飽和脂肪酸具有16-22個碳原子和一個或一個以上不飽和碳碳雙鍵。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種甾醇類化合物，其特征在于其中所述甾醇糖苷為甾醇與天然五碳糖或六碳糖等一個或一個以上的單糖結(jié)合形成的甾醇糖苷；所述單糖是D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-阿洛糖、L-阿拉伯糖、D-來蘇糖、D-木糖、D-核糖、D-果糖、L-山梨糖、L-鼠李糖或L-夫糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種甾醇類化合物，其特征在于其中所述?；薮继擒諡槿我荤薮继擒蘸筒伙柡椭舅嵝纬傻孽；薮继擒?，其不飽和脂肪酸具有16-22個碳原子和一個或一個以上不飽和碳碳雙鍵。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甾醇類化合物及總甾醇提取物在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用，其特征在于用甾醇類化合物或總甾醇提取物作為有效成份，它們可以單獨應(yīng)用或合用與藥用賦形劑組合制備治療抑郁或焦慮中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物，該藥物為口服或非口服劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甾醇類化合物及總甾醇提取物在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述甾醇類化合物主要包括從植物或中藥中提取的谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、甾醇糖苷、甾醇酯和?；薮继擒盏取＝?jīng)動物實驗表明上述物質(zhì)對小鼠具有抗抑郁作用。
文檔編號A61K36/899GK1977848SQ20051011126
公開日2007年6月13日 申請日期2005年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日
發(fā)明者崔溶文, 李光赫, 楊君, 馬寧 申請人:愛思開生物醫(yī)藥科技(上海)有限公司, Sk株式會社