專利名稱：一類α－亞甲基－γ－丁內酯化合物、其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種含吲哚環(huán)的新型α-亞甲基-γ-丁內酯類化合物，更具體地說是涉及一種作為磷脂酰肌醇3激酶/人雷帕霉素靶體(PI3K/mTOR)信號通路抑制劑的新型2-苯基吲哚環(huán)α-亞甲基-γ-丁內酯。
背景技術：
癌癥是導致人們死亡的重要疾病之一，每年全球的死亡人數(shù)達到600萬以上，它的治療一直是人們關注的重點之一，化學治療是其主要的治療手段。當前以腫瘤特異性蛋白或信號通道為靶標，來提高抗癌試劑的選擇性已成為研發(fā)的熱點。
PI3K/mTOR信號通路是重要的受體酪氨酸激酶信號轉導途徑，它在腫瘤細胞中有異常的表達，在腫瘤細胞的增殖，分化，凋亡中也起著重要作用.阻斷該通路有可能特異性地抑制腫瘤細胞的生長，PI3K/mTOR信號傳導通路已成為一個有希望的抗腫瘤治療靶點。
PI3K是酪氨酸蛋白激酶的下游信號蛋白分子，它直接位于一系列對細胞生長有著重要影響的基因產物上游。PI3K可以激活蛋白激酶B(PKB/Akt)。Akt對于細胞凋亡有著重要影響。Akt又使mTOR磷酸化并活化。分子量為70kD的核糖體S6蛋白激酶(p70S6K/S6K1)和真核細胞翻譯起始因子4E(eIF-4E)結合蛋白1(4E-BP1)則是mTOR兩個代表性的與蛋白翻譯有關的下游信號蛋白。越來越多的證據表明，mTOR是一個細胞生長和增殖的中心調控者，直接或間接地參與了翻譯起始階段，微絲形成，膜轉運，蛋白降解，蛋白激酶C通路，核蛋白生物合成，tRNA合成及轉錄等多個與細胞增殖和生長密切相關的生物學事件。
目前此信號通路的抑制劑還不多，僅有mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素(Rapamycin，Rap)，PI3K的特異性抑制劑渥曼青霉素(Wortmannin，Wor)等。
Williams等人報道了PI3K γ與Wortmannin相作用的晶體結構，研究顯示PI3K的賴氨酸833的伯胺與Wortmannin的與內酯環(huán)共軛的碳碳雙鍵發(fā)生不可逆麥克爾加成，引起PI3K構象變化而改變活性(Nature 199，402，313-20)。Peng等人認為Wortmannin的作用來自于一個近乎平面的結構和一個高度缺電子中心(Bioorganic & Medicinal Chemistry 2002，10，67-174).
α-亞甲基-γ-丁內酯結構最初在心菊內酯(helenalin)等萜類天然產物中發(fā)現(xiàn)，其細胞毒性和抗腫瘤活性受到了人們的廣泛關注(J.Med.Chem.1971，14，1147-1152；J.Med.Chem.1986，29，595-599.)。研究表明，該類化合物的活性主要來自于α-亞甲基-γ-丁內酯結構，它可以作為烷化試劑與生物親核體，如L-半胱氨酸，谷胱苷肽，或富含巰基的酶，如磷酸果糖激酶，糖原合成酶，脫氧核糖核酸聚合酶等發(fā)生快速的不可逆的邁克類加成反應。
另外，含有含烷氧基或羥基取代基的吲哚環(huán)在許多有抗腫瘤活性的天然產物中出現(xiàn)，它也有著一個近似平面的結構。我們?yōu)榇嗽O計將吲哚環(huán)和α-亞甲基-γ-丁內酯結構連接起來。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是公開一類對PI3K/mTOR信號傳導通路具有抑制作用的含吲哚環(huán)的α-亞甲基-γ-丁內酯類化合物。
本發(fā)明的另一目的提供制備該類化合物的方法。
本發(fā)明再一目的是公開該類化合物的醫(yī)學用途。
含吲哚環(huán)的α-亞甲基-γ-丁內酯類化合物具有如下結構 其中R1、R2為H、烷氧基或羥基R3為H或烷基。
本發(fā)明通過如下步驟實施吲哚1由Fischer吲哚合成法制備。中間體α-溴甲基丙烯酸酯的合成參照Block，P.(Org.Syn th.Coll.Vol.5，381-382.)和Ramarajan，K.(Org.Syn th.Coll.Vol.7，210-212.)報道的方法。
將吲哚1在氫化鈉的作用下和α-溴代羧酸酯反應得2，然后氫化鋁鋰還原羧基成醇3，再Moffat法氧化成醛4(Scheme 1)。吲哚酮6的制備則是將中間體吲哚羧酸酯2在氫氧化鈉水溶液中水解成酸5，再與烷基鋰反應而制備(Scheme 2)。該方法因為α-溴代羧酸酯和烷基鋰的可選擇性而可以生成多種類的吲哚羰基化合物。關于化合物2的制備，隨具體反應物物的不同，反應溫度從冰浴到加熱條件不等，反應時間從1小時到過夜?；衔?的制備，反應溫度從常溫到加熱，反應時間從1小時到過夜，反應溶液可以是四氫呋喃、乙醚等溶液。
α-亞甲基-γ-丁內酯的構建采用hler等人報道的方法(Angew.Chem.Internat.Edit.1970，6，457-458.)，即將各種吲哚羰基結構4a-c或6a-c與α-亞甲基烯丙酸酯在活化鋅的催化下發(fā)生瑞福爾馬斯基類反應而得到(Scheme 3)。反應溫度從常溫到回流，反應溶液可以是四氫呋喃、乙醚等，反應時間從2小時到24小時不等。

吲哚環(huán)上含酚羥基的產物則有相應的甲氧基甲氧基產物在酸性條件下水解脫除保護基而制備。

通過上述制備方法優(yōu)選的化合物結構如下


化合物活性測試1、細胞增殖抑制實驗為了檢驗該系列化合物的對腫瘤細胞增殖的影響，我們選用橫紋肌肉肉瘤細胞株Rh1、Rh30(來自美國St.Jude兒童研究醫(yī)院)，結腸癌細胞株HCT-116(來自日本癌癥研究基金會)來進行細胞增殖抑制實驗。根據預實驗結果按照細胞的生長速率接種一定數(shù)量的細胞于96孔細胞培養(yǎng)板(Rh1 10000個/孔，Rh30 8000個/孔，HCT-116 7500/孔)，待細胞貼壁鋪展后加藥，設5個藥物作用濃度，每個濃度3復孔；藥物作用72小時后傾去培養(yǎng)液，10％預冷的三氯乙酸固定于4攝氏度固定1小時，蒸餾水洗滌5次后空氣中自然干燥，然后加入1％冰醋酸配制的SRB(sigma)4mg/ml溶液100μl/孔，室溫中染色15分鐘，棄去染色液，用1％冰醋酸洗滌5次，空氣干燥，最后加入150μl/孔Tris溶液，充分溶解SRB后用酶標儀于520nm波長讀取吸光度值，利用Softmax 2.6計算半數(shù)抑制濃度IC50值。結果如下

結果表明化合物10，7，8，13的活性優(yōu)于化和物11。
2.Western-blot法檢測化合物對Rh30細胞中AKT，mTOR，p70S6K，4E-BP1磷酸化的影響106個/孔Rh30細胞在無血清RPMI-1640中饑餓24小時，50μM的不同化合物作用90分鐘后用100ng/ml表皮生長因子(EGF)刺激10分鐘使信號通路激活。3000轉/分離心3分鐘收集細胞，冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞兩次后，重懸于100μl細胞裂解緩沖液中，于冰上裂解1小時。結束后于4攝氏度13000轉/分鐘離心15分鐘，棄去沉淀，利用MicroBCA試劑盒定量蛋白濃度并將所有樣品蛋白量均一化。利用10％或者15％SDS-PAGE膠電泳使蛋白按照分子量大小分離，電轉移系統(tǒng)將蛋白轉移至醋酸纖維素膜上，5％脫脂奶粉溶于含0.2％Tris緩沖液中于室溫下封閉膜1小時，在4攝氏度中一抗雜交過夜，洗滌后二抗室溫雜交1小時。最后利用ECL-plus化學發(fā)光檢測。[相應抗體如下phosphorylated-AKT(1∶1,000)，phosphorylated-p70S6K (1∶1,000)，phosphorylated-4EBP1 (1∶1000)，β-actin(1∶1,000)]。


圖1是化合物對四種激酶磷酸化形式的抑制能力。
圖1表明測試化合物對RH30細胞系的AKT，mTOR，p70S6K and 4E-BP1激酶顯示出了不同程度的抑制能力，其中化合物7，8和9顯示了最強的活性，與Wortmannin的活性相當。這表明或許在內酯環(huán)的5-位保持氫原子而不用其它官能團取代更有利于提高活性。同時取代基在2-位苯環(huán)上的化合物(13，14，16)要比在吲哚環(huán)上的(11，12，15)活性相對好。另外，化合物11，12，13在這些化合物中顯示了最差的活性，表明環(huán)上有烷氧取代基并不利于化合物的活性。
圖2是化合物7誘導白血病細胞HL-60周期阻滯于G1期不同濃度的化合物7可以誘導人白血病細胞HL-60細胞周期的阻滯以及細胞凋亡。
圖3是化合物7能夠劑量依賴的(左)和時間依賴的(右)引起HL60 DNA片斷化。
藥理數(shù)據表明本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的化合物在一定程度上均能抑制Rh1，Rh30和HCT-116細胞株的增殖和PI3K/mTOR信號通道中激酶的磷酸化。特別是R3為氫的化合物8，有望發(fā)現(xiàn)可以用來作為抑制該通道的先導藥物。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明的結構和制備方法作進一步闡述，但不限制本發(fā)明。
實施例一化合物7的制備。
(1)原料2-苯基吲哚1a的制備 1.00g苯乙酮(8.3mmol)，0.90g苯肼(8.3mmol)和2.80g多聚磷酸(8.3mmol)加入燒瓶中，快速加熱至170℃，20分鐘后，冷卻，加水，乙醚萃取，無水硫酸鎂干燥，濃縮，硅膠柱分離(乙酸乙酯/石油醚＝1/25)得白色固體，再用乙醇重結晶，得0.93g產物1a，產率57.8％，熔點192-194℃(文獻18187-188℃)。
1H NMR(CDCl3)δ8.37(s，1H，NH)，7.69-7.12(m，9H，Ar)，6.84(s，1H，Indole-3H).
(2)2-(2-苯基吲哚-1-基)乙醇3a在氮氣保護下，將溶解于5mL DMF的2-苯基吲哚1a(470mg，2.4mmol)緩慢加入到氫化鈉(144mg，3.6mmol)的DMF(5mL)懸濁液中。室溫攪拌30分鐘后，再逐滴加入溴乙酸乙酯(600mg，3.6mmol)。攪拌8小時，然加10ml冰水淬滅，并用乙酸乙酯(3×10ml)萃取。合并的有機相再用飽和食鹽水(2×10ml)沖洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮，硅膠柱層析(EtOAc/Petroleum＝1/40)得350mg淺黃色油狀物2a。取165mg該吲哚酯溶解于5mL無水乙醚中，加入0.19g氫化鋁鋰(1.8mmol)，室溫攪拌3小時后，加5mL冰水淬滅，再加入2mL稀鹽酸，并用乙酸乙酯萃取，干燥，柱層析(EtOAc/Petroleum＝1/4)得130mg產物(47.8％)。
1H NMR(CDCl3)δ7.54-7.14(m，9H，ArH)，6.56(s，1H，H-3)，4.34(t，J＝6.0Hz，2H，NCH2)，3.85(t，J＝6.0Hz，2H，CH2O).
(3)(2-苯基)吲哚-1-基乙醛4a的制備將吡啶(43mg，0.55mmol)和三氟乙酸(31mg，0.27mmol)加入到10mL干燥的苯中，然后再加入化合物3a(130mg，0.55mmol)的無水DMSO(4mL)溶液和1，3-雙環(huán)己基碳二亞胺(339mg，1.65mmol)。室溫攪拌30小時后，反應基本反應完全，加入3mL乙醚和3mL的草酸(276mg，2.19mmol)的甲醇溶液，氣體放出完全后，加入10mL水，濾除生成的二環(huán)己基脲，有機相分別用5％的碳酸氫鈉(2×10mL)和水(10mL)沖洗，干燥，硅膠柱層析(EtOAc/Petroleum＝1/5)得90mg白色產物(69.8％)。熔點106-107℃.
1H NMR(CDCl3)δ9.69(s，1H，CHO)，7.70-7.18(m，9H，ArH)，6.67(s，1H，H-3)，4.85(s，2H，CH2)；MSm/z 235(M+)，206(Indole-CH2+)；Anal.Calcd for C16H13NO.0.1C2H5OHC，81.11；H，5.71；N，5.84.FoundC，81.06；H，5.61；N，5.81.
同法可制得化合物4b，4c(4)5′-((2-苯基吲哚-1-基)亞甲基)-2′-氧代-3′-亞甲基四氫呋喃7的制備氮氣保護下，將58mg活化鋅(0.89mmol)，2mg對苯二酚和5mL的化合物4a(190mg，0.81mmol)的四氫呋喃溶液先后加入到5mL無水四氫呋喃中，然后緩慢加入α-溴甲基烯丙酸乙酯(172mg，0.89mmol)的無水四氫呋喃溶液，在50℃引發(fā)反應，然后回流約6小時，此時鋅基本反應完全，停止加熱，等反應液冷卻后傾倒出反應液，并用少量四氫呋喃溶劑沖洗反應瓶，合并有機相，濃縮，加少量稀鹽酸攪拌10分鐘，用乙酸乙酯萃取，干燥，硅膠柱層析得120mg淺黃色油狀物，產率49％。
1H NMR(CDCl3)δ7.65-7.15(m，9H，ArH)，6.58(s，1H，H-3)，6.08(t，J＝2.8Hz，1H，Ha)，5.44(t，J＝2.8Hz，1H，Hb)，4.72-4.33(m，3H，NCH2CH)，2.72-2.33(m，2H，CH2-4′)。
MSm/z 303(17，M+)，206(48，Indole-CH2+)，58(100)。
HRMSm/z calcd for C20H17NO2303.1259 (M)，found 303.1275.
同法還可制得化合物8-17。
實施例二化合物6a的制備。
(1)(2-苯基吲哚)-1-基乙酸5a將165mg化合物2a溶解于4mL乙醇中，滴加1mL 3mol/L的氫氧化鈉溶液1mL，加熱到80℃攪拌30分鐘。冷卻，加入10mL水，用二氯甲烷(2×10mL)沖洗，加稀鹽酸酸化，得140mg白色固體，產率48.6％。熔點172-174℃(文獻181℃).
1H NMR(acetone-d6)δ7.67-7.17(m，9H，ArH)，6.62(s，1H，H-3)，4.86(s，2H，CH2).
(2)(2-苯基吲哚)-1-基丙酮6a氮氣保護下，將100mg化合物5a溶解于5mL的干燥乙醚，冰浴下加入0.5mL的甲基鋰乙醚溶液(1.6mol/L)。室溫攪拌2小時后，加入3mL水和1mL的3mol/L的鹽酸，用乙酸乙酯萃取(2×20mL)，合并有機相，水洗，干燥，濃縮，硅膠柱層析(EtOAc/Petroleum＝1/25)得60mg白色固體，產率60.6％，熔點116-118℃。
產率70.6％，白色固體，熔點116-118℃。
1H NMR(CDCl3)δ7.67-7.14(m，9H，ArH)，6.65(s，1H，H-3)，4.84(s，2H，CH2)，1.96(s，3H，CH3)；MSm/z 249(M+)，206(Indole-CH2+)；Anal.Calcd for C17H15NOC，81.90；H，6.06；N，5.62.FoundC，81.78；H，5.98；N，5.61.
同法可制得化合物6b-6e。
實施例三化合物16的制備。
5′-甲基-5′-((2-(4-羥基苯基)吲哚-1-基)亞甲基)-2′-氧代-3′-亞甲基四氫呋喃16將70mg 14(0.19mmol)溶解于8mL四氫呋喃中，加幾滴2mol/L鹽酸，室溫攪拌24小時，濃縮，加水稀釋，乙酸乙酯萃取，干燥，硅膠柱層析(EtOAc/Petroleum＝1/4)得23mg無色油狀物，產率37.1％。
1H NMR(CDCl3)δ7.58-6.93(m，8H，ArH)，6.48(s，1H，H-3)，5.88(t，J＝2.8Hz，1H，Ha)，5.27(t，J＝2.4Hz，1H，Hb)，4.51-4.40(m，2H，NCH2)，2.63-2.32(m，2H，CH2-4′)，1.23(s，1H，CH3-5′)；MSm/z 333 (24，M+)，222(100)，149(42)，72(80)。
HRMSm/z calcd for C21H19NO3333.1365 (M)，found 333.1357.
同法可制得化合物15和17。
權利要求
1.如下述通式所示的含吲哚環(huán)的α-亞甲基-γ-丁內酯類化合物 其中R1，R2為H，烷氧基或羥基；R3為H、烷基。
2.根據權利要求1所述的吲哚類α-亞甲基-γ-丁內酯類化合物，其特征在于優(yōu)選化合物為 7R1＝H，R2＝H，R3＝H；8R1＝OCH3，R2＝H，R3＝H；9R1＝MOMO，R2＝H，R3＝H；10R1＝H，R2＝H，R3＝CH3；11R1＝OCH3，R2＝H，R3＝CH3；12R1＝MOMO，R2＝H，R3＝CH3；13R1＝H，R2＝OCH3，R3＝CH3；14R1＝H，R2＝MOMO，R3＝CH315R1＝HO，R2＝H，R3＝CH3；16R1＝H，R2＝HO，R3＝CH3；17R1＝HO，R2＝H，R3＝H。
3.如權利要求1所述的吲哚類α-亞甲基-γ-丁內酯類化合物的制備方法如下步驟組成 吲哚環(huán)上含酚羥基的產物則有相應的甲氧基甲氧基產物在酸性條件下水解脫除保護基而制備。 15R1＝HO，R2＝H，R3＝CH3；16R1＝H，R2＝HO，R3＝CH3；17R1＝HO，R2＝H，R3＝H。
4.根據權利要求3所述的吲哚類α-亞甲基-γ-丁內酯類化合物的制備方法，其特征在于將吲哚1在氫化鈉的作用下和α-溴代羧酸酯反應得2，然后氫化鋁鋰還原羧基成醇3，再Moffat法氧化成醛4(Scheme 1)；吲哚酮6的制備則是將中間體吲哚羧酸酯2在氫氧化鈉水溶液中水解成酸5，再與烷基鋰反應而制備(Scheme 2)；該方法因為α-溴代羧酸酯和烷基鋰的可選擇性而可以生成多種類的吲哚羰基化合物。
5.根據權利要求3所述的吲哚類α-亞甲基-γ-丁內酯類化合物的制備方法，其特征在于α-亞甲基-γ-丁內酯的構建采用hler等人報道的方法(Angew.Chem.Internat.Edit.1970，6，457-458.)，即將各種吲哚羰基結構4a-c或6a-c與α-亞甲基烯丙酸酯在活化鋅的催化下發(fā)生瑞福爾馬斯基類反應而得到(Scheme 3)；反應溫度從常溫到回流，反應溶液可以是四氫呋喃、乙醚，反應時間從2小時到24小時。
6.根據權利要求3所述的吲哚類α-亞甲基-γ-丁內酯類化合物的制備方法，其特征在于吲哚環(huán)上含酚羥基的產物則有相應的甲氧基甲氧基產物在酸性條件下水解脫除保護基而制備。
7.如權利要求1所述的吲哚類α-亞甲基-γ-丁內酯類化合物的用途在抑制Rh1，Rh30和HCT-116細胞株和PI3K/mOTR信號通道上應用。
全文摘要
本發(fā)明提供如右圖通式所示的含吲哚環(huán)的α－亞甲基－γ－丁內酯類化合物其中R
文檔編號A61K31/404GK1872851SQ20051002636
公開日2006年12月6日 申請日期2005年6月1日 優(yōu)先權日2005年6月1日
發(fā)明者丁華勝, 張超, 吳希罕, 楊春皓, 章雄文, 丁健, 謝毓元 申請人:中國科學院上海藥物研究所