本發(fā)明屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用亞甲基藍(lán)與G-四鏈體的結(jié)合進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)端粒酶活性的方法。

背景技術(shù)：

近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，肺癌的發(fā)病率及死亡率均在逐年增加。世界衛(wèi)生組織定期公布的資料顯示，肺癌的發(fā)病率和死亡率在世界各國(guó)均呈明顯上升的趨勢(shì)，發(fā)達(dá)國(guó)家更為明顯。世界各國(guó)都投入大量的人力物力研究肺癌的早期檢測(cè)和治療。端粒酶與人類(lèi)惡性腫瘤之間的緊密聯(lián)系使它成為目前已知的最為廣泛的腫瘤分子標(biāo)記物之一，端粒酶的檢測(cè)對(duì)癌癥的早期發(fā)現(xiàn)、發(fā)展和預(yù)后有重大意義。

端粒酶是合成染色體末端的端粒的酶。端粒(telomere)是真核細(xì)胞染色體的天然末端，由上千個(gè)6堿基重復(fù)序列(TTAGGG)組成，是細(xì)胞必需的遺傳組分。它的作用是維持端粒有足夠的長(zhǎng)度，保證基因信息在復(fù)制過(guò)程中的準(zhǔn)確性，以防止染色體末端遺傳信息的丟失。在正常情況下，每個(gè)細(xì)胞分裂周期都會(huì)使端粒變的越來(lái)越短，當(dāng)端粒短到一定程度時(shí)就會(huì)發(fā)出信號(hào)，細(xì)胞停止分裂。端粒酶由RNA和蛋白質(zhì)亞基組成，是基本的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，在細(xì)胞染色體復(fù)制過(guò)程中，能夠以自身RNA為模板，在染色體3’末端合成重復(fù)序列，維持端粒的長(zhǎng)度。端粒酶在正常體細(xì)胞中的活性被抑制，但是大量的資料表明在一些惡性腫瘤中的表達(dá)高達(dá)85％。由于端粒酶特異地表達(dá)于各種腫瘤細(xì)胞，并且是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞持續(xù)分裂所必需的。因此，端粒酶活性是診斷多數(shù)惡性腫瘤、判斷愈后的良好指標(biāo)。

傳統(tǒng)的端粒酶活性檢測(cè)方法主要有端粒重復(fù)序列延伸法、端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP)、熒光實(shí)時(shí)定量法(RT-PCR)。此方法系最早建立的方法，穩(wěn)定性好，特異性高；缺點(diǎn)是需要樣品量較大，靈敏性差，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不適合臨床標(biāo)本的大量檢測(cè)，另外在實(shí)驗(yàn)中同位素的用量較大，對(duì)試驗(yàn)人員的身體有危害。TRAP分析法能夠?qū)崿F(xiàn)高通量高靈敏度的檢測(cè)，無(wú)疑是一個(gè)功能強(qiáng)大的測(cè)定方法，但保留著PCR放大技術(shù)帶來(lái)的缺點(diǎn)。此外，TRAP法需要使用昂貴的設(shè)備和試劑，相當(dāng)耗時(shí)。再加上抑制端粒酶活性已被提議作為人類(lèi)癌癥治療的潛在方法，而TRAP在篩選有效的端粒酶抑制劑如G-四聯(lián)體配體時(shí)易受PCR派生產(chǎn)物的影響，因此，該方法存在很多局限性。熒光實(shí)時(shí)定量法(RT-PCR)測(cè)定端粒酶催化亞單位(hTERT)mRNA，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)，但由于檢測(cè)手段繁瑣，需要精密儀器，成本較高，限制了其在臨床上的應(yīng)用。近年來(lái)，為替代傳統(tǒng)的TRAP分析法，研究者們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多PCR-free分析方法并將之應(yīng)用到端粒酶活性的檢測(cè)中，例如光學(xué)傳感器、表面等離子共振、電致化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)檢測(cè)和指數(shù)等溫?cái)U(kuò)增分析等，然而，上述大多數(shù)策略因?yàn)槎肆Ｃ敢锏墓潭ɑ?、成本高、靈敏度低和操作復(fù)雜等問(wèn)題在應(yīng)用時(shí)或多或少受到了限制。此外，當(dāng)前的大多數(shù)檢測(cè)方法都使用細(xì)胞提取物來(lái)分析端粒酶活性，于臨床應(yīng)用較為不符，而能夠?qū)崿F(xiàn)原位分析和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的檢測(cè)方法則鳳毛麟角。端粒酶活性的檢測(cè)對(duì)癌癥的早期診斷具有重要的生物學(xué)意義，對(duì)臨床上癌癥的預(yù)警和治療這一復(fù)雜科學(xué)問(wèn)題的研究起到促進(jìn)作用。因此，對(duì)端粒酶活性分析的簡(jiǎn)單、靈敏、低成本的原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和抑制劑篩查技術(shù)仍然是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種利用亞甲基藍(lán)與G-四鏈體的結(jié)合進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)端粒酶活性的方法。本發(fā)明中針對(duì)端粒酶作用于端粒酶引物產(chǎn)生G-四鏈體，G-四鏈體與亞甲基藍(lán)的結(jié)合降低了溶液中自由存在的亞甲基藍(lán)的濃度，通過(guò)由此引發(fā)的電化學(xué)信號(hào)的變化測(cè)定端粒酶活性，它具有方便快捷、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、無(wú)標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種利用亞甲基藍(lán)與G-四鏈體的結(jié)合進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)端粒酶活性的方法，包括以下步驟：

1)細(xì)胞的培養(yǎng)以及端粒酶的提取得到裂解后的細(xì)胞溶液；

2)在含有端粒酶引物的緩沖溶液中加入裂解后的細(xì)胞溶液進(jìn)行擴(kuò)增得到重復(fù)的富G序列，在鉀離子的存在下得到含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液；

3)在含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液中加入亞甲基藍(lán)使其與G-四鏈體結(jié)合得到溶液；

4)利用差分脈沖伏安法(DPV)對(duì)溶液中的亞甲基藍(lán)進(jìn)行檢測(cè)。

其中，上述步驟1)的細(xì)胞為HeLa細(xì)胞。

其中，上述步驟2)的具體步驟如下：在45μL含有0.1～2μM端粒酶引物的端粒酶緩沖溶液中加入5μL裂解后的HeLa細(xì)胞，在30～37℃下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)1～4小時(shí)，并在鉀離子的存在下形成G-四鏈體的擴(kuò)增溶液。

其中，上述步驟2)的緩沖溶液為含有MgCl₂、KCl、Tween 20、EGTA和dNTPs的pH＝8.3的20mM Tris-HCl溶液，所述MgCl₂初始濃度為1.5mM，KCl初始濃度為63mM，Tween 20初始濃度為0.005％(v/v)，EGTA初始濃度為1mM，dNTPs初始濃度為1～2mM。

其中，上述步驟2)中所述的端粒酶引物序列為5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’，此為端粒酶進(jìn)行擴(kuò)增的特異性識(shí)別序列。

其中，上述步驟3)的亞甲基藍(lán)的加入量為50μL，濃度為1～10mM。

其中，上述步驟4)的差分脈沖伏安法的步驟是通過(guò)三電極體系進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下：首先，將ITO電極依次浸泡在丙酮，乙醇和超純水中，并分別超聲15～20分鐘進(jìn)行清洗；之后，將清洗后的ITO電極浸泡在1mM NaOH中進(jìn)行修飾；4～6小時(shí)后，將完成修飾的ITO電極放入超純水中超聲清洗15～20分鐘，得到了表面帶有負(fù)電荷的ITO工作電極；然后將表面帶有負(fù)電荷的ITO工作電極放入電解池下半部分的凹槽內(nèi)，之后，將帶有直徑為6mm孔的電解池上半部分固定在工作電極上方，在他們之間放入O型密封圈防止漏液，在直徑為6mm的孔中加入步驟3)得到的溶液，將一根鉑絲作為對(duì)電極，銀/氯化銀電極作為參比電極插入溶液中，與工作電極形成三電極體系并通過(guò)DPV法進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。

其中，上述HeLa細(xì)胞在端粒酶緩沖溶液中的數(shù)量為10～10000個(gè)細(xì)胞。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的特色及優(yōu)點(diǎn)：

1)本發(fā)明沒(méi)有復(fù)雜的電極修飾過(guò)程，操作簡(jiǎn)單，避免了因電極修飾而來(lái)帶的繁瑣以及耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)。

(2)本發(fā)明無(wú)需標(biāo)記DNA，可避免現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)DNA進(jìn)行標(biāo)記而導(dǎo)致檢測(cè)成本高的缺點(diǎn)。

(3)本發(fā)明利用端粒酶對(duì)其引物的特異性識(shí)別進(jìn)行擴(kuò)增延伸，可以提高該方法的特異性。

(4)電化學(xué)生物傳感器具有高靈敏度、高兼容性和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，降低了實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)限。

(5)該方法可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，具有一定的臨床意義。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了利用亞甲基藍(lán)與G-四鏈體的結(jié)合進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)端粒酶活性的方法的流程圖。

圖2顯示了端粒酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證圖。a：只存在亞甲基藍(lán)時(shí)的DPV曲線；b：加入了端粒酶引物并與亞甲基藍(lán)結(jié)合產(chǎn)生的DPV曲線；c：端粒酶引物與端粒酶進(jìn)行擴(kuò)增并形成G-四鏈體后與亞甲基藍(lán)結(jié)合產(chǎn)生的DPV曲線。

圖3顯示了定量檢測(cè)端粒酶活性的DPV曲線。圖3A：在不同量的HeLa細(xì)胞作用下，得到的DPV曲線(HeLa細(xì)胞的個(gè)數(shù)：(a)0、(b)10、(c)50、(d)100、(e)200、(f)500、(g)1000、(h)2000、(i)5000、(j)10000)；圖3B：DPV電流峰值降低值與細(xì)胞個(gè)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；插圖：DPV電流峰值降低值與細(xì)胞個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù)的線性關(guān)系。

圖4為不同細(xì)胞中的端粒酶活性，端粒酶的特異性檢測(cè)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖4A顯示了從不同細(xì)胞中(HeLa細(xì)胞，加熱后的HeLa細(xì)胞，A549細(xì)胞，MCF-7細(xì)胞)提取出的端粒酶的活性；圖4B顯示了不同的酶(端粒酶，葡萄糖氧化酶，牛血清蛋白，辣根過(guò)氧化物酶)與端粒酶引物作用后DPV電流峰值降低值。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干變型和改進(jìn)，這些也應(yīng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本實(shí)驗(yàn)中用到的試劑和儀器：

HeLa細(xì)胞，A549細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞等其他細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于上海復(fù)祥生物科技有限公司，ITO電極，端粒酶(telomerase)，亞甲基藍(lán)、牛血清蛋白(BSA)，葡萄糖氧化酶(GOD)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，電化學(xué)工作站(CHI660)等均為市面上購(gòu)買(mǎi)。

端粒酶引物序列：5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3′

端粒酶引物來(lái)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；

實(shí)施例1：

利用亞甲基藍(lán)與G-四鏈體的結(jié)合進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)端粒酶活性的分析方法，檢測(cè)步驟是：

1)細(xì)胞培養(yǎng)和端粒酶提?。篐eLa細(xì)胞接種在含有10％胎牛血清，青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，并在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有細(xì)胞都是收集于指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期。將100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞分裝于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.4)洗滌兩次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解緩沖液(10mM Tris-HCl,pH 7.5，1mM MgCl₂，1mM EGTA(乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)CHAPS(3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)中。將細(xì)胞在冰上孵育30分鐘，然后在4℃，12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘。離心后將澄清的裂解液小心地轉(zhuǎn)移到新的EP管中，得到裂解后的HeLa細(xì)胞，快速冷凍并儲(chǔ)存在-80℃的冰箱中；

2)在含有端粒酶引物的緩沖溶液中加入裂解后的HeLa細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增得到重復(fù)的富G序列，在鉀離子的存在下得到含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液：在45μL含有2μM端粒酶引物的端粒酶緩沖溶液中加入5μL稀釋后的裂解后的HeLa細(xì)胞，約100個(gè)，在37℃下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)2小時(shí)，并在鉀離子的存在下形成G-四鏈體的擴(kuò)增溶液；其中，所述端粒酶緩沖溶液為含有MgCl₂、KCl、Tween 20、EGTA和dNTPs的pH＝8.3的20mM Tris-HCl溶液，所述MgCl₂初始濃度為1.5mM，KCl初始濃度為63mM，Tween 20初始濃度為0.005％(v/v)，EGTA初始濃度為1mM，dNTPs初始濃度為1mM。

3)在含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液加入亞甲基藍(lán)使其與G-四鏈體結(jié)合得到溶液：含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液中加入亞甲基藍(lán)使其與G-四鏈體結(jié)合：將得到的含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液與50μL濃度為4μM的亞甲基藍(lán)混合，使亞甲基藍(lán)與G-四鏈體進(jìn)行結(jié)合得到溶液。

4)修飾工作電極使其表面帶有負(fù)電荷：首先，將ITO電極依次浸泡在丙酮，乙醇和超純水中，并分別超聲15分鐘進(jìn)行清洗。之后，將清洗好的ITO電極浸泡在1mM NaOH中進(jìn)行修飾。4小時(shí)后，將完成修飾的ITO電極放入超純水中超聲清洗15分鐘，得到了表面帶有負(fù)電荷的ITO工作電極。

5)所述利用差分脈沖伏安法(DPV)對(duì)溶液中的亞甲基藍(lán)進(jìn)行檢測(cè)的具體步驟如下：自制一個(gè)電解池作為檢測(cè)元件。將表面帶有負(fù)電荷的ITO工作電極放入電解池下半部分的凹槽內(nèi)，之后，將帶有直徑為6mm孔的電解池上半部分固定在ITO工作電極上方，在他們之間放入O型密封圈防止漏液。在直徑為6mm的孔中加入擴(kuò)增后的溶液，將一根鉑絲作為對(duì)電極，銀/氯化銀電極作為參比電極插入溶液中，與ITO工作電極形成三電極體系并通過(guò)DPV法進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。設(shè)置參數(shù)：掃描電壓-0.5～0V，脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s，脈沖增量0.004V，脈沖周期0.5s。檢測(cè)結(jié)束后，得到了圖3A中的d曲線。

實(shí)施例2

利用亞甲基藍(lán)與G-四鏈體的結(jié)合進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)端粒酶活性的分析方法，檢測(cè)步驟是：

1)細(xì)胞培養(yǎng)和端粒酶提取：HeLa細(xì)胞接種在含有10％胎牛血清，青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，并在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有細(xì)胞都是收集于指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期。將100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞分裝于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.4)洗滌兩次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl₂，1mM EGTA，0.5％(w/v)CHAPS，10％(v/v)glycerol，0.1mM PMSF)中。將細(xì)胞在冰上孵育30分鐘，然后在4℃，12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘。離心后將澄清的裂解液小心地轉(zhuǎn)移到新的EP管中，得到裂解后的HeLa細(xì)胞，快速冷凍并儲(chǔ)存在-80℃的冰箱中；

2)在含有端粒酶引物的緩沖溶液中加入裂解后的HeLa細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增得到重復(fù)的富G序列，在鉀離子的存在下得到含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液：在45μL含有2μM端粒酶引物的端粒酶緩沖溶液中加入5μL稀釋后的裂解后的HeLa細(xì)胞，約1000個(gè)，在30℃下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)2小時(shí)，并在鉀離子的存在下形成G-四鏈體。其中，所述端粒酶緩沖溶液為含有MgCl₂、KCl、Tween 20、EGTA和dNTPs的pH＝8.3的20mM Tris-HCl溶液，所述MgCl₂初始濃度為1.5mM，KCl初始濃度為63mM，Tween 20初始濃度為0.005％(v/v)，EGTA初始濃度為1mM，dNTPs初始濃度為1mM。

3)在擴(kuò)增后的溶液中加入亞甲基藍(lán)使其與G-四鏈體結(jié)合：將得到的擴(kuò)增后的溶液與50μL濃度為4μM的亞甲基藍(lán)混合，使亞甲基藍(lán)與G-四鏈體進(jìn)行結(jié)合。

4)修飾工作電極使其表面帶有負(fù)電荷：首先，將ITO電極依次浸泡在丙酮，乙醇和超純水中，并分別超聲20分鐘進(jìn)行清洗。之后，將清洗好的ITO電極浸泡在1mM NaOH中進(jìn)行修飾。6小時(shí)后，將完成修飾的ITO電極放入超純水中超聲清洗20分鐘，得到了表面帶有負(fù)電荷的ITO工作電極。

5)利用差分脈沖伏安法(DPV)對(duì)溶液中的亞甲基藍(lán)進(jìn)行檢測(cè)的具體步驟如下：自制一個(gè)電解池作為檢測(cè)元件。將表面帶有負(fù)電荷的ITO工作電極放入電解池下半部分的凹槽內(nèi)，之后，將帶有直徑為6mm孔的電解池上半部分固定在ITO工作電極上方，在他們之間放入O型密封圈防止漏液。在直徑為6mm的孔中加入擴(kuò)增后的溶液，將一根鉑絲作為對(duì)電極，銀/氯化銀電極作為參比電極插入溶液中，與ITO工作電極形成三電極體系并通過(guò)DPV法進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。設(shè)置參數(shù)：掃描電壓-0.5～0V，脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s，脈沖增量0.004V，脈沖周期0.5s。檢測(cè)結(jié)束后，得到了圖3A中的g曲線。

實(shí)施例3

利用亞甲基藍(lán)與G-四鏈體的結(jié)合進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)端粒酶活性的分析方法，檢測(cè)步驟是：

1)細(xì)胞培養(yǎng)和端粒酶提?。篐eLa細(xì)胞接種在含有10％胎牛血清，青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，并在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有細(xì)胞都是收集于指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期。將100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞分裝于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.4)洗滌兩次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解緩沖液(10mM Tris-HCl,pH 7.5,1mM MgCl₂,1mM EGTA，0.5％(w/v)CHAPS，10％(v/v)glycerol，0.1mM PMSF)中。將細(xì)胞在冰上孵育30分鐘，然后在4℃，12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘。離心后將澄清的裂解液小心地轉(zhuǎn)移到新的EP管中，得到裂解后的HeLa細(xì)胞，快速冷凍并儲(chǔ)存在-80℃的冰箱中；

2)在含有端粒酶引物的緩沖溶液中加入裂解后的HeLa細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增得到重復(fù)的富G序列，在鉀離子的存在下得到含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液：在45μL含有2μM端粒酶引物的端粒酶緩沖溶液中加入5μL稀釋后的裂解后的HeLa細(xì)胞，約5000個(gè)，在37℃下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)2小時(shí)，并在鉀離子的存在下形成G-四鏈體。其中，所述端粒酶緩沖溶液為含有MgCl₂、KCl、Tween 20、EGTA和dNTPs的pH＝8.3的20mM Tris-HCl溶液，所述MgCl₂初始濃度為1.5mM，KCl初始濃度為63mM，Tween 20初始濃度為0.005％(v/v)，EGTA初始濃度為1mM，dNTPs初始濃度為1mM。

3)在擴(kuò)增后的溶液中加入亞甲基藍(lán)使其與G-四鏈體結(jié)合：將得到的擴(kuò)增后的溶液與50μL濃度為4μM的亞甲基藍(lán)混合，使亞甲基藍(lán)與G-四鏈體進(jìn)行結(jié)合。

4)修飾工作電極使其表面帶有負(fù)電荷：首先，將ITO電極依次浸泡在丙酮，乙醇和超純水中，并分別超聲17分鐘進(jìn)行清洗。之后，將清洗好的ITO電極浸泡在1mM NaOH中進(jìn)行修飾。5小時(shí)后，將完成修飾的ITO電極放入超純水中超聲清洗17分鐘，得到了表面帶有負(fù)電荷的ITO工作電極。

5)所述利用差分脈沖伏安法(DPV)對(duì)溶液中的亞甲基藍(lán)進(jìn)行檢測(cè)的具體步驟如下：自制一個(gè)電解池作為檢測(cè)元件。將表面帶有負(fù)電荷的ITO工作電極放入電解池下半部分的凹槽內(nèi)，之后，將帶有直徑為6mm孔的電解池上半部分固定在ITO工作電極上方，在他們之間放入O型密封圈防止漏液。在直徑為6mm的孔中加入擴(kuò)增后的溶液，將一根鉑絲作為對(duì)電極，銀/氯化銀電極作為參比電極插入溶液中，與ITO工作電極形成三電極體系并通過(guò)DPV法進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。設(shè)置參數(shù)：掃描電壓-0.5～0V，脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s，脈沖增量0.004V，脈沖周期0.5s。檢測(cè)結(jié)束后，得到了圖3A中的i曲線。

將DPV電流峰值降低值定義為-Δi_p，則最終得到了DPV電流峰值降低值與細(xì)胞個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù)之間的線性關(guān)系，即-Δi_p＝0.1276-0.0517log N。線性范圍為10～10000個(gè)細(xì)胞，相關(guān)系數(shù)為0.9904。計(jì)算得到最低檢測(cè)限為3個(gè)細(xì)胞。

實(shí)施例4：

利用亞甲基藍(lán)與G-四鏈體的結(jié)合進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)端粒酶活性的分析方法，檢測(cè)步驟是：

1)細(xì)胞培養(yǎng)和端粒酶提?。篐eLa細(xì)胞，A549細(xì)胞，和MCF-7細(xì)胞分別接種在含有10％胎牛血清，青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，并在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有細(xì)胞都是收集于指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期。將100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞分裝于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.4)洗滌兩次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解緩沖液(10mM Tris-HCl,pH 7.5，1mM MgCl₂，1mM EGTA(乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)CHAPS(3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)中。將細(xì)胞在冰上孵育30分鐘，然后在4℃，12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘。離心后將澄清的裂解液小心地轉(zhuǎn)移到新的EP管中，分別得到各自裂解后的細(xì)胞，快速冷凍并儲(chǔ)存在-80℃的冰箱中；

2)在含有端粒酶引物的緩沖溶液中加入裂解后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增得到重復(fù)的富G序列，在鉀離子的存在下得到含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液：在45μL含有2μM端粒酶引物的端粒酶緩沖溶液中分別加入5μL稀釋后的裂解后的細(xì)胞，加熱失活后的HeLa細(xì)胞，A549細(xì)胞，MCF-7細(xì)胞，約1000個(gè)，在37℃下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)2小時(shí)，并在鉀離子的存在下形成G-四鏈體的擴(kuò)增溶液；其中，所述端粒酶緩沖溶液為含有MgCl₂、KCl、Tween20、EGTA和dNTPs的pH＝8.3的20mM Tris-HCl溶液，所述MgCl₂初始濃度為1.5mM，KCl初始濃度為63mM，Tween 20初始濃度為0.005％(v/v)，EGTA初始濃度為1mM，dNTPs初始濃度為1mM。

3)在含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液加入亞甲基藍(lán)使其與G-四鏈體結(jié)合得到溶液：含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液中加入亞甲基藍(lán)使其與G-四鏈體結(jié)合：將得到的含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液與50μL濃度為4μM的亞甲基藍(lán)混合，使亞甲基藍(lán)與G-四鏈體進(jìn)行結(jié)合得到溶液。

4)修飾工作電極使其表面帶有負(fù)電荷：首先，將ITO電極依次浸泡在丙酮，乙醇和超純水中，并分別超聲15分鐘進(jìn)行清洗。之后，將清洗好的ITO電極浸泡在1mM NaOH中進(jìn)行修飾。4小時(shí)后，將完成修飾的ITO電極放入超純水中超聲清洗15分鐘，得到了表面帶有負(fù)電荷的ITO工作電極。

5)所述利用差分脈沖伏安法(DPV)對(duì)溶液中的亞甲基藍(lán)進(jìn)行檢測(cè)的具體步驟如下：自制一個(gè)電解池作為檢測(cè)元件。將表面帶有負(fù)電荷的ITO工作電極放入電解池下半部分的凹槽內(nèi)，之后，將帶有直徑為6mm孔的電解池上半部分固定在ITO工作電極上方，在他們之間放入O型密封圈防止漏液。在直徑為6mm的孔中加入擴(kuò)增后的溶液，將一根鉑絲作為對(duì)電極，銀/氯化銀電極作為參比電極插入溶液中，與ITO工作電極形成三電極體系并通過(guò)DPV法進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。設(shè)置參數(shù)：掃描電壓-0.5～0V，脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s，脈沖增量0.004V，脈沖周期0.5s。檢測(cè)結(jié)束后，得到了圖4A。

從圖中可以看出，利用A549和HeLa細(xì)胞檢測(cè)出的電流變化較大，這說(shuō)明A549和HeLa細(xì)胞中的端粒酶活性較高，MCF-7中的端粒酶活性與這兩種細(xì)胞中的端粒酶活性相比偏低，而加熱的HeLa細(xì)胞由于加熱導(dǎo)致酶失活，電流信號(hào)的降低非常微弱。

實(shí)施例5：

利用亞甲基藍(lán)與G-四鏈體的結(jié)合進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)端粒酶活性的分析方法，檢測(cè)步驟是：

1)細(xì)胞培養(yǎng)和端粒酶提?。篐eLa細(xì)胞，A549細(xì)胞，和MCF-7細(xì)胞分別接種在含有10％胎牛血清，青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，并在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有細(xì)胞都是收集于指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期。將100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞分裝于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.4)洗滌兩次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解緩沖液(10mM Tris-HCl,pH 7.5，1mM MgCl₂，1mM EGTA(乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)CHAPS(3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)中。將細(xì)胞在冰上孵育30分鐘，然后在4℃，12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘。離心后將澄清的裂解液小心地轉(zhuǎn)移到新的EP管中，分別得到裂解后的細(xì)胞，快速冷凍并儲(chǔ)存在-80℃的冰箱中；

2)在含有端粒酶引物的緩沖溶液中加入裂解后的HeLa細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增得到重復(fù)的富G序列，在鉀離子的存在下得到含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液：在45μL含有2μM端粒酶引物的端粒酶緩沖溶液中分別加入5μL稀釋后的裂解后的HeLa細(xì)胞，約1000個(gè)，5μL GOD，5μL BSA，和5μL HRP，約100μg，在37℃下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)2小時(shí)，并在鉀離子的存在下形成G-四鏈體的擴(kuò)增溶液；其中，所述端粒酶緩沖溶液為含有MgCl₂、KCl、Tween 20、EGTA和dNTPs的pH＝8.3的20mM Tris-HCl溶液，所述MgCl₂初始濃度為1.5mM，KCl初始濃度為63mM，Tween 20初始濃度為0.005％(v/v)，EGTA初始濃度為1mM，dNTPs初始濃度為1mM。

3)在含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液加入亞甲基藍(lán)使其與G-四鏈體結(jié)合得到溶液：含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液中加入亞甲基藍(lán)使其與G-四鏈體結(jié)合：將得到的含有G-四鏈體的擴(kuò)增溶液與50μL濃度為4μM的亞甲基藍(lán)混合，使亞甲基藍(lán)與G-四鏈體進(jìn)行結(jié)合得到溶液。

4)修飾工作電極使其表面帶有負(fù)電荷：首先，將ITO電極依次浸泡在丙酮，乙醇和超純水中，并分別超聲15分鐘進(jìn)行清洗。之后，將清洗好的ITO電極浸泡在1mM NaOH中進(jìn)行修飾。4小時(shí)后，將完成修飾的ITO電極放入超純水中超聲清洗15分鐘，得到了表面帶有負(fù)電荷的ITO工作電極。

5)所述利用差分脈沖伏安法(DPV)對(duì)溶液中的亞甲基藍(lán)進(jìn)行檢測(cè)的具體步驟如下：自制一個(gè)電解池作為檢測(cè)元件。將表面帶有負(fù)電荷的ITO工作電極放入電解池下半部分的凹槽內(nèi)，之后，將帶有直徑為6mm孔的電解池上半部分固定在ITO工作電極上方，在他們之間放入O型密封圈防止漏液。在直徑為6mm的孔中加入擴(kuò)增后的溶液，將一根鉑絲作為對(duì)電極，銀/氯化銀電極作為參比電極插入溶液中，與ITO工作電極形成三電極體系并通過(guò)DPV法進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。設(shè)置參數(shù)：掃描電壓-0.5～0V，脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s，脈沖增量0.004V，脈沖周期0.5s。檢測(cè)結(jié)束后，得到了圖4B。

從圖4B中可以看出，只有加入了HeLa細(xì)胞后電流才有了明顯的降低，而加入葡萄糖氧化酶，牛血清蛋白，和辣根過(guò)氧化物酶的樣品，由于其中沒(méi)有端粒酶的存在而導(dǎo)致電流的降低非常微弱。由此說(shuō)明，該檢測(cè)方法具有較好的特異性。

與目前現(xiàn)有檢測(cè)方法相比，該方法的檢測(cè)限具有明顯優(yōu)勢(shì)。例如，武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院利用有限延伸法檢測(cè)端粒酶活性的方案，檢測(cè)限達(dá)到250個(gè)細(xì)胞；河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)信號(hào)放大和磁分離技術(shù)進(jìn)行熒光檢測(cè)端粒酶活性的方法，檢測(cè)限為1×10⁵個(gè)細(xì)胞；河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院基于恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)高靈敏度檢測(cè)端粒酶活性的方法，檢測(cè)限為50個(gè)細(xì)胞。

上述僅為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例，并不限制于本發(fā)明。對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其他不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施例來(lái)舉例說(shuō)明。而由此方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。