專利名稱：增進(jìn)骨生長(zhǎng)與抑制骨再吸收的方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求在2003年9月3日提出的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/499,696的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。
背景本發(fā)明涉及增進(jìn)骨生長(zhǎng)與抑制骨再吸收的方法，更特別地，本發(fā)明涉及以稠合吡唑基化合物增進(jìn)骨生長(zhǎng)與抑制骨再吸收的方法。
現(xiàn)有技術(shù)骨胳是一種復(fù)雜組織，其持續(xù)性地進(jìn)行更新與修復(fù)，即是所謂的“骨重塑作用(bone remodeling)”。負(fù)責(zé)骨重塑作用的兩種主要細(xì)胞種類為破骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞，前者再吸收骨，后者形成新骨。骨重塑作用是由數(shù)種全身性激素(例如副甲狀腺激素，1，25-二羥基維生素D3，性激素及降鈣素)，以及局部因子(例如一氧化氮，前列腺素，生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子)所調(diào)節(jié)。當(dāng)骨的再吸收與形成不協(xié)調(diào)，且骨分解超過(guò)骨重建，就會(huì)造成骨質(zhì)疏松癥。骨質(zhì)疏松癥也可能由其它病癥造成，例如，激素失調(diào)，疾病，或藥物作用(例如皮質(zhì)類固醇或抗癲癇劑)。
能調(diào)節(jié)骨重塑過(guò)程的化合物，不論是抑制骨再吸收或刺激骨形成，都具有增進(jìn)骨生長(zhǎng)的潛能，而可以用于治療骨質(zhì)疏松癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于以下出乎意料的發(fā)現(xiàn)一種稠合吡唑基化合物可抑制骨再吸收和增進(jìn)骨生長(zhǎng)。
本發(fā)明的一方面涉及一種增進(jìn)骨生長(zhǎng)或抑制骨再吸收的方法。上述方法包括向需要其的受試者施用有效量的下式的稠合吡唑基化合物
其中A為H，R，或 (之后稱為“(CH2)nAr3(R5)(R6)”)；Ar1、Ar2、Ar3各自獨(dú)立地為苯基，噻吩基，呋喃基，或吡咯基；R1，R2，R3，R4，R5，及R6各自獨(dú)立地為H，鹵素，R，C(O)OH，C(O)OR，C(O)SH，C(O)SR，C(O)NH2，C(O)NHR，C(O)NRR’，ROH，ROR’，RSH，RSR’，NHR，NRR’，RNHR’，或RNR’R”；或R1與R2一起，R3與R4一起，或R5與R6一起為ORO；其中R，R’，R”各自獨(dú)立地為C1～C6烷基；以及n為1、2、或3。
參考上式，式(I)化合物的一個(gè)子集其特征在于A是(CH2)nAr3(R5)(R6)。在一個(gè)實(shí)施方案中，Ar1為苯基，且R1與R2分別在苯基的4與5位上取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Ar2為5’-呋喃基，且R3與R4之一在5’-呋喃基的2位上取代。在還有另外的實(shí)施方案中，Ar3為苯基且n為1。
上述化合物的另一子集其特征在于A為H。在一個(gè)實(shí)施方案中，Ar1為苯基，且R1與R2分別在苯基的4與5位上取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Ar2為5’-呋喃基，且R3與R4之一在5’-呋喃基的2位上取代。
上述化合物的另一子集其特征在于Ar1為苯基或Ar2為5’-呋喃基。
術(shù)語(yǔ)“烷基”是指直鏈或支鏈烴，包括1-10個(gè)碳原子。烷基的實(shí)例包括但不限于，甲基，亞甲基，乙基，亞乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，及叔丁基。烷基可被任選地取代。取代基的實(shí)例包括但不限于，鹵素，羥基，氨基，氰基，硝基，巰基，烷氧羰基，酰氨基，羧基(carboxy)，烷磺?；?，烷羰基，脲基，氨基甲?；?，羧基(carboxyl)，硫脲基，硫代氰酸根合，亞磺酰氨基，鏈烯基，炔基，烷氧基，芳基，雜芳基，環(huán)基，和雜環(huán)基，其中鏈烯基，炔基，烷氧基，芳基，雜芳基，環(huán)基，及雜環(huán)基可以再被取代。
上述稠合吡唑基化合物包括，如果適用，其鹽及其前藥。其鹽，例如，可由稠合吡唑基化合物上帶負(fù)電的取代基(如羧酸鹽)與陽(yáng)離子形成。適當(dāng)?shù)年?yáng)離子包括但不限于，鈉離子，鉀離子，鎂離子，鈣離子，及銨離子如四甲基銨離子。類似地，帶正電子的取代基(如氨基)可與帶負(fù)電的抗衡離子形成鹽。適當(dāng)?shù)目购怆x子包括但不限于，氯化物，溴化物，碘化物，硫酸鹽，硝酸鹽，磷酸鹽，或醋酸鹽。前藥的實(shí)例包括酯和其它藥學(xué)上可接受的衍生物，當(dāng)將其施用于受試者時(shí)，可提供上述稠合吡唑基化合物。
本發(fā)明的另一方面涉及一種治療骨質(zhì)疏松癥的方法。上述方法包括向需要其的受試者施用有效量的上述稠合吡唑基化合物。
以下所列為可用于實(shí)施本發(fā)明方法的稠合吡唑化合物的實(shí)例 吲唑1本發(fā)明范圍也包括上述化合物在制備增進(jìn)骨生長(zhǎng)，抑制骨再吸收或治療骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的多種實(shí)施方案將詳述于以下。本發(fā)明的其它特征、目的，及優(yōu)點(diǎn)將經(jīng)由以下的詳細(xì)說(shuō)明與權(quán)利要求中而更為明顯。
發(fā)明詳述用于實(shí)施本發(fā)明方法的稠合吡唑基化合物可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的方法制備(參見(jiàn)例如美國(guó)專利第5,574,168號(hào))。它們包括以下合成路徑首先將芳香基酮經(jīng)由偶合芳香羰基氯化物與另一芳族化合物而制備。其中任一芳族化合物為任選地單或多取代。上述酮接著與芳基烷基肼反應(yīng)，其中的芳基亦為任選地單或多取代，以形成含有三個(gè)芳基的腙。上述腙基團(tuán)經(jīng)由鏈烯烴接頭轉(zhuǎn)化為稠合吡唑核心化合物，另一芳香基稠合至吡唑核心的4-C與5-C，且第三芳基直接連接到吡唑核心的3-C。稠合吡唑基化合物的衍生物可經(jīng)由修飾芳基的任何取代基而得到。
用于上述合成路徑的化合物包括，例如溶劑，反應(yīng)劑，催化劑，保護(hù)基及去保護(hù)基反應(yīng)劑。上述方法可附加地包括其它步驟，不論是在上述特定步驟之前或之后，以增加或除去適當(dāng)保護(hù)基團(tuán)，而得以完成稠合吡唑化合物的合成。此外，也可以采用替換順序進(jìn)行各種合成步驟，以得到所需化合物。用于合成可應(yīng)用的稠合吡唑化合物的合成化學(xué)轉(zhuǎn)化與保護(hù)基團(tuán)方法學(xué)(保護(hù)與去保護(hù))是本領(lǐng)域所熟知的，并且包括，例如R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene及P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，2d.Ed.JohnWiley and Sons(1991)；L.Fieser及M.Fieser，F(xiàn)ieser and Fieser’s Reagentsfor Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)；及L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)及其后續(xù)版本所敘。
如此合成的稠合吡唑化合物可以經(jīng)由例如柱層析法，高壓液相層析，或再結(jié)晶法進(jìn)一步純化。
本發(fā)明的一方面提供一種增進(jìn)骨生長(zhǎng)或抑制骨再吸收的方法。因此，上述方法包括但不限于，治療骨質(zhì)疏松癥，骨折，身材矮小癥，關(guān)節(jié)固定失敗，軟骨發(fā)育障礙(dyschondroplasia)，軟骨發(fā)育不全(achondroplasia)，或先天性假關(guān)節(jié)。“骨質(zhì)疏松癥”的實(shí)例包括但不限于，經(jīng)絕期后骨質(zhì)疏松癥，老年骨質(zhì)疏松癥，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，皮質(zhì)類固醇引發(fā)的骨質(zhì)疏松癥，腎衰竭，高副甲狀腺機(jī)能癥，維生素D缺乏相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥，以及長(zhǎng)期不動(dòng)(immobilization)?！肮钦邸钡膶?shí)例包括但不限于，不愈合，延遲愈合，以及病理性骨折。上述方法包括向需要其的受試者施用有效量的一種或多種稠合吡唑化合物以及藥用載體。如此處所述，術(shù)語(yǔ)“治療”是指治愈，恢復(fù)，減輕，緩和，改變，補(bǔ)救，改善，或預(yù)防與不適當(dāng)骨生長(zhǎng)相關(guān)的疾病，如骨質(zhì)疏松癥。“有效量”定義為稠合吡唑基化合物的量，在施用于所需受試者后，其足以賦予該受試者治療效果。有效量可以改變，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)可，依照給藥途徑，賦形劑的使用，及可能共同使用于增進(jìn)骨生長(zhǎng)，或治療骨質(zhì)疏松癥的其它藥劑而異。
為實(shí)施本發(fā)明的方法，可以將含有稠合吡唑基化合物與藥用載體的組合物經(jīng)由口服，非胃腸道途徑，吸入式噴霧，或經(jīng)由植入式儲(chǔ)囊而施用。術(shù)語(yǔ)“非胃腸道途徑”，如此處所述，包括皮下，皮內(nèi)，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，滑液內(nèi)，胸骨內(nèi)，鞘內(nèi)，傷口內(nèi)及顱內(nèi)注射，或輸注技術(shù)。
口服給藥的組合物可以為任何口服可接受的劑型，其包括但不限于，膠囊，片劑，乳劑及水混懸劑，分散劑及溶液?？诜褂玫钠瑒┲?，常用的載體包括乳糖與玉米淀粉。潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂，也典型地添加。口服使用的膠囊中，有用的稀釋劑包括乳糖與干玉米淀粉。當(dāng)以水混懸劑或分散劑形式口服給藥時(shí)，活性成分可以懸浮于或溶解于油相，并結(jié)合乳化或懸浮劑。若有需要，某些甜味劑，調(diào)味劑，或著色劑亦可添加。吸入式組合物可以依藥學(xué)配方技術(shù)領(lǐng)域所熟知的技術(shù)制備，而可制備為鹽水溶液，采用苯甲基醇或其它適當(dāng)防腐劑，增強(qiáng)生物利用度的吸收促進(jìn)劑，甲醛，和/或其它本領(lǐng)域所熟知的溶解或分散劑。
無(wú)菌注射組合物，例如，無(wú)菌注射水溶性或油狀混懸劑，可以依照本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)，采用適當(dāng)分散或濕潤(rùn)劑(如吐溫80)以及懸浮劑配制。無(wú)菌注射制劑也可以為無(wú)菌注射液或混懸劑，其在無(wú)毒、非胃腸道可接受稀釋劑或溶劑中，例如，溶于1，3-丁二醇的溶液。在可接受載體與溶劑中，可采用甘露醇，水，林格氏液及等滲氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌、固定油也常規(guī)用作溶劑或混懸介質(zhì)(如合成單或雙甘油脂)。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物用于注射劑的制備，其為天然藥用油，如橄欖油或蓖麻油，特別是其多氧乙烷化物。這些油溶液或混懸劑也可以包含長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑，或羧酸甲基纖維素或類似的分散劑。
藥學(xué)組合物的載體必須是“可接受的”，也就是與制劑中的活性成分可相容(優(yōu)選地，能夠使它穩(wěn)定)，且不會(huì)對(duì)治療的受試者有害。例如，加溶劑如環(huán)糊精，可與稠合吡唑基化合物形成特異性的，更可溶性的復(fù)合物，或一種或多種加溶劑，可以用作藥物賦形劑以傳遞稠合吡唑基化合物。其它載體的實(shí)例包括膠狀二氧化硅，硬脂酸鎂，纖維素，十二烷基硫酸鈉，及D&C黃色10號(hào)。
適當(dāng)?shù)捏w外試驗(yàn)可以用于預(yù)先評(píng)估稠合吡唑基化合物增加骨小結(jié)形成的能力。體內(nèi)篩選也可以經(jīng)由本領(lǐng)域所熟知的以下步驟進(jìn)行。參考以下具體實(shí)施例。
不需詳加闡述，相信上述說(shuō)明已提供本發(fā)明實(shí)施的適當(dāng)說(shuō)明。因此，以下特定實(shí)施例僅是用于說(shuō)明本發(fā)明，并非用以限制限定本發(fā)明的范圍。所有此處所引用的出版物，包括專利，皆以其完整內(nèi)容并入本案作為參考。
化學(xué)合成首先制備硼氫化鈣，其經(jīng)由于無(wú)水THF(20mL)中攪拌無(wú)水氯化鈣(88.8mg，0.8mmole)與硼氫化鈉(60mg，1.6mmole)4小時(shí)。將30mL含有88.0mg的1-芐基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)-吲唑(0.27mmole)的THF溶液，于30±2℃滴入上述硼氫化鈣溶液。將混合物于回流下加熱6小時(shí)，冷卻，淬滅至碎冰中，置于減壓狀態(tài)以除去THF，并過(guò)濾以得到固體產(chǎn)物。上述固體再以二氯甲烷萃取。將上述萃取物濃縮至50mL，加入石油醚后沉淀出固體。收集此沉淀物并以柱層析(硅膠-苯)純化以得到70.0mg的1-芐基-3-(5’-羥甲基-2’-呋喃基)-吲唑，產(chǎn)率87％。以下稱此化合物為“吲唑1”。
熔點(diǎn)108-109℃MS(％)，m/z304(M+)IR(KBr)λmax3350cm-1(-OH)1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ4.51(2H，d，J＝5.5Hz，-CH2O-)，5.31(1H，t，J＝5.5Hz，-OH)，5.70(2H，s，＝NCH2-)，6.48(1H，d，J＝3.4Hz，H-4’)，6.97(1H，d，J＝3.4Hz，H-3’)，7.21-7.31(6H，m，H-5，苯基)，7.45(1H，t，J＝8.2Hz，H-6)，7.75(1H，dd，J＝8.2，1.8Hz，H-7)，8.12(1H，dd，J＝8.2.1.0Hz.C4-H)。
生物試驗(yàn)方法原代破骨細(xì)胞培養(yǎng)由18日齡胎兒Sprague-Dawley(簡(jiǎn)稱SD)種大鼠的顱頂制備原代破骨細(xì)胞，依照以下方法采用腹膜內(nèi)注射三氯乙醛(200mg/kg)麻醉懷孕的大鼠。接著以無(wú)菌操作剖開(kāi)大鼠胎兒的顱頂。于解剖顯微鏡下除去軟組織。將顱頂分成小碎片并以0.1％膠原蛋白酶(SigmaChemical，St.Louis，MO)溶液于37℃下處理10分鐘。收集經(jīng)兩次20分鐘連續(xù)膠原蛋白酶消化處理而由顱頂釋出的細(xì)胞，并經(jīng)過(guò)70μm尼龍過(guò)濾器(Falcon，BD BioSciences，San Jose，CA)過(guò)濾。再使細(xì)胞于塑料細(xì)胞培養(yǎng)皿，在95∶5的空氣-二氧化碳下，補(bǔ)加20mM HEPES與10％熱失活的FCS，2mM-谷氨酰胺，青霉素(100U/ml)與鏈霉素(100μg/ml)(將pH調(diào)整至7.6)的度別克氏修正過(guò)的伊葛氏培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，簡(jiǎn)稱DMEM)(Gibco，Grand Island，NY)培養(yǎng)。一周換兩次細(xì)胞培養(yǎng)基。以形態(tài)學(xué)與堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，簡(jiǎn)稱ALP)的表達(dá)確認(rèn)破骨細(xì)胞。為檢驗(yàn)破骨細(xì)胞的成熟度，將細(xì)胞于含有抗壞血酸(50μg/ml)(SigmaChemical，St.Louis，MO)與β-甘油磷酸(10mM)(Sigma Chemical，St.Louis，MO)的生長(zhǎng)培養(yǎng)液培養(yǎng)14天，并每3天換一次培養(yǎng)基。
堿性磷酸酶活性的試驗(yàn)將細(xì)胞培養(yǎng)于存有或不存在吲唑1的6孔平板中，再于1ml的0.2％Nonidet P-40中收集，使細(xì)胞懸浮液經(jīng)超聲波處理破碎。于1500g離心5分鐘后，以Lowry等(1954)J Biol Chem 20719-37的方法測(cè)量上清液中的ALP活性。
von Kossa染色將破骨細(xì)胞培養(yǎng)于含有50μg/ml的維生素C與10mMβ-甘油磷酸的DMEM中2周，且每3天換一次培養(yǎng)基。為檢驗(yàn)骨小結(jié)的形成，將細(xì)胞以4％多聚甲醛固定10分鐘，水清洗后，以1％硝酸銀染色，置于紫外光下30分鐘，再以水清洗后，才以5％硫代硫酸鈉處理2分鐘。將細(xì)胞以水清洗兩次，并以1％Safranin-O對(duì)染以便顯現(xiàn)基質(zhì)。于光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)每孔的骨小結(jié)形成的數(shù)目。經(jīng)由測(cè)量培養(yǎng)的破骨細(xì)胞中4-羥脯氨酸含量確認(rèn)膠原蛋白的合成。將細(xì)胞培養(yǎng)于含有50μg/ml的維生素C與10mM β-甘油磷酸的DMEM中2周后，再于116℃下以6N HCl水解16小時(shí)。冷凍干燥并于蒸餾水重建溶胞產(chǎn)物后，于550nm的分光光度測(cè)定法測(cè)定4-羥脯氨酸的含量，如Berg(1982)的Meth Enzymol.82372-398所述。
細(xì)胞增殖試驗(yàn)將破骨細(xì)胞(2×104細(xì)胞/孔)接種于24-孔平板(Costar，Cambridge，MA)。細(xì)胞在加入吲唑1前先培養(yǎng)于無(wú)血清培養(yǎng)基中24小時(shí)。于吲唑1下溫育24小時(shí)后，加入BrdU成為10μM再溫育24小時(shí)。BrdU的摻入是依照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(Roche MolecularBiochemicals)的步驟進(jìn)行測(cè)試，并采用發(fā)光計(jì)數(shù)器(TopCount；PackardInstruments，Meriden，CT)。每秒計(jì)數(shù)量直接與DNA合成量相關(guān)，由此而推知增生的細(xì)胞量。
破骨細(xì)胞生成(Osteoclastogenesis)骨髓細(xì)胞的制備是經(jīng)由取得6-8周齡SD大鼠的股骨，并以含有20mM HEPES與10％熱失活的FCS，2mM-谷氨酰胺，青霉素(100U/ml)及鏈霉素(100μg/ml)的DMEM沖洗骨髓腔。24小時(shí)后，收集未粘附的細(xì)胞(造血細(xì)胞)作為破骨細(xì)胞前體。將細(xì)胞接種于24孔平板成為1×106細(xì)胞/孔(0.5ml)，并同時(shí)存在人類重組可溶性RANKL(50ng/ml，Peprotech EC Ltd.，London，United Kingdom)以及鼠類M-CSF(20ng/ml，Genzyme，Cambridge，MA)。每3天換一次培養(yǎng)基。在8-10天后，以抗酒石酸鹽酸磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，簡(jiǎn)稱TRAP)試驗(yàn)(Kotake等人，1999)確認(rèn)破骨細(xì)胞形成。簡(jiǎn)言的，附著的細(xì)胞以溶于磷酸鹽緩沖鹽水的10％甲醛固定3分鐘。在以乙醇/丙酮(50∶50v/v)處理1分鐘后，使細(xì)胞表面風(fēng)干并于室溫下溫育于含有0.01％萘酚AS-MX磷酸鹽(Sigma)與0.03％快紅紫LB鹽(fast red violet LB salt)(Sigma)的醋酸緩沖液(0.1M醋酸鈉，pH5.0)，50mM酒石酸鈉存在下10分鐘。每孔的類破骨細(xì)胞TRAP陽(yáng)性細(xì)胞是經(jīng)由計(jì)算TRAP陽(yáng)性與含有超過(guò)三個(gè)核的多核細(xì)胞數(shù)目而評(píng)分。
破骨細(xì)胞的骨再吸收試驗(yàn)破骨細(xì)胞前體由如上述的大鼠長(zhǎng)骨分離。將細(xì)胞重新懸浮于完全DMEM培養(yǎng)基中，并接種至以磷酸鈣磷灰石包被的24孔平板，OAAS(Oscotec，OCT USA Inc.)，細(xì)胞濃度為1×106細(xì)胞/0.5ml/孔。細(xì)胞培養(yǎng)于M-CSF(20ng/ml)加sRANKL(50ng/ml)存在下5天。在M-CSF與sRANKL不存在下另三天每天注入吲唑1。于第8天終止培養(yǎng)，孔中留下的細(xì)胞以1N NaOH裂解。采用倒置顯微鏡(200×)獲得每孔5個(gè)影像，并采用影像分析儀測(cè)量吸收區(qū)域。
局部注射采用雄性SD大鼠，體重介于70-88gm。以戊巴比妥麻醉大鼠的兩肢，由后側(cè)方埋入套管(22G)至近端脛骨干骨后端。套管的外端在皮下組織。吲唑1經(jīng)皮注射，由套管注入近端脛骨一天一次，連續(xù)一周。同樣濃度的生理鹽水稀釋過(guò)的DMSO也注入右側(cè)作為對(duì)照。在第14天，犧牲大鼠并以10％甲醛于4℃下固定48小時(shí)。
骨組織形態(tài)學(xué)分析在甲醛固定脛股完成后，將脛骨于0.5N鹽酸中去鈣，以濃度升高系列乙醇溶液與丙酮進(jìn)行脫水，并包埋于石臘中。系列切片(5μm)是于長(zhǎng)軸方向切割，并以玫爾氏蘇木精-伊紅溶液(Yang等(1993)Calcif Tissue Int 5257-61)染色。生長(zhǎng)盤與近端脛股的影像是采用照相微圖數(shù)字化插入系統(tǒng)(PhotoMicroGraphic Digitize integrate System，簡(jiǎn)稱MGDS；Total-Integra Technology Co.，Ltd.，臺(tái)北，臺(tái)灣)。在整個(gè)次級(jí)松質(zhì)上進(jìn)行骨體積測(cè)量，其位于初級(jí)松質(zhì)下并且特征在于較大的小梁。骨體積是采用影像分析軟件計(jì)算。所有測(cè)量皆以單盲方式進(jìn)行。
卵巢切除術(shù)與坐骨神經(jīng)切除于成年雌性與雄性大鼠(三月齡)分別進(jìn)行卵巢切除術(shù)與坐骨神經(jīng)切除。手術(shù)后，每天對(duì)大鼠注射吲唑1(腹腔注射，1mg/kg)或載體共4周。最后注射的后一天，犧牲大鼠并移除其脛骨與股骨。
脛骨與股骨的制備在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，以斷頭術(shù)犧牲大鼠。移除脛骨，清洗軟組織，并以精確卡尺(±0.05mm)量測(cè)脛骨長(zhǎng)度，如Weinreb等(1991)J Bone Miner Res 6725-731所述。脛骨以10％甲醛于4℃下固定48小時(shí)，以便進(jìn)行骨組織形態(tài)學(xué)分析。移除脛骨與股骨的部分并保存于-20℃以便進(jìn)行礦物質(zhì)分析。
骨礦物質(zhì)密度(bone mineral density，簡(jiǎn)稱BMD)與含量(簡(jiǎn)稱BMC)的分析脛骨與股骨的BMD與BMC是以雙能量X射線吸收儀(DEXA，XR-26；Norland，F(xiàn)ort Atkinson，WI)測(cè)量。采用適用于小個(gè)體的測(cè)量的形式。0.7％的變異系數(shù)是由每日測(cè)量腰部人體模型(phantom)的BMD，超過(guò)1年所計(jì)算得(Yang等人(1998)Calcif Tissue Int 6386-90)。進(jìn)行骨礦物質(zhì)分析前，將脛骨與股骨融解至室溫。掃描整個(gè)脛骨與股骨，并以吸收儀測(cè)量BMD與BMC。
生物力學(xué)三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)骨組織的力學(xué)特性是經(jīng)由三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)測(cè)量，采用MTS-858試驗(yàn)機(jī)(MTS System Inc.，Minneapolis，MN)。兩支持點(diǎn)的跨度為20毫米且變形率為1mm/分鐘。負(fù)重/變形曲線是由Team 490軟件(第4.10版，Nicolet Instrument Technologies Inc.，Madison，WI)獲得。采用SigmaPlot 6.0軟件(SPSS Inc.，Chicago，IL)以計(jì)算骨樣品的外在材料特性，包括最大負(fù)重，極限負(fù)重，最大負(fù)重的能量，極限負(fù)重的能量，及線性強(qiáng)直(Linearstiffness)。最大負(fù)重的能量與極限負(fù)重的能量是由負(fù)重/變形曲線下區(qū)域計(jì)算。強(qiáng)直是由負(fù)重/變形曲線的線性部分的斜率計(jì)算。惰性剖面距是假設(shè)剖面為橢圓形下計(jì)算(Turner等，The effect of fluoridated water on bone strength.Orthop Res(1992)10581-587)。
最大壓力，極限壓力，及彈性系數(shù)(楊氏系數(shù))是采用Turner等人Basicbiomechanical measurements of bonea tutorial，Bone(1993)14595-608所述的方法計(jì)算。
結(jié)果骨生長(zhǎng)將雄性年輕大鼠(SD)，體重介于70-90gm，分為六組。每組大鼠平均體重為73.9±1.1gm。將吲唑1溶解于DMSO并以生理鹽水稀釋至最終濃度為10μM。六組之一為對(duì)照組，而其它組分為僅植入套管針，采用套管針注射載體(第1天，一次)，注射吲唑1(第1天，一次)，采用套管針注射載體(第1-7天，每天)，以及注射吲唑1(第1-7天，每天)。在14天后犧牲大鼠，僅植入套管針(22G)或采用套管針注射載體并不影響骨體積。然而，大鼠注射吲唑1(0.1nmole)7天再喂飼7天后會(huì)顯著地增加次級(jí)骨松質(zhì)的體積。局部注射吲唑17天后，次級(jí)骨松質(zhì)的骨小梁增加至90％。脛骨長(zhǎng)度并未顯著地受局部注射吲唑1影響(脛骨長(zhǎng)度對(duì)照組為3.31±0.01cm，而吲唑1處理組為3.32±0.02cm，n＝9)。
雄性年輕大鼠僅注射吲唑1，或注射吲唑1與NG-硝基-L-精氨酸-甲酯(L-NAME，0.6nmole/天)，NO合成酶(NOS)抑制劑。對(duì)照于僅注射吲唑1者，同時(shí)給予吲唑1與L-NAME顯著地減弱吲唑1對(duì)于次級(jí)骨松質(zhì)中骨形成的增進(jìn)作用。
骨損失的預(yù)防作用卵巢切除術(shù)(簡(jiǎn)稱OVX)是于成年雌性大鼠進(jìn)行(＝28)。在卵巢切除術(shù)后，卵巢切除的大鼠(n＝16)中的一組注射吲唑1(腹腔注射，1mg/kg/天)，其它組(n＝12)未注射。15只未進(jìn)行卵巢切除術(shù)的成年雌性大鼠作為偽處理(sham-operated)對(duì)照組，且并未注射吲唑1。卵巢切除術(shù)并未顯著地影響脛骨與股骨的長(zhǎng)度，但減低兩者的骨礦物質(zhì)密度(BMD)與含量(BMC)。參見(jiàn)以下的表1。意外地，每日注射吲唑1可保護(hù)脛骨與股骨免于發(fā)生卵巢切除術(shù)誘發(fā)BMD與BMC損失。與偽處理組比較，卵巢切除術(shù)會(huì)造成脛骨次級(jí)骨松質(zhì)的骨小梁的減少。在卵巢切除術(shù)后，可在4周觀察到60％的骨體積減少。另一方面，每日注射吲唑1(1mg/kg)連續(xù)4周會(huì)減低骨小梁損失的情形。骨體積達(dá)到偽處理對(duì)照組的76％。
表1吲唑1對(duì)于骨礦物質(zhì)密度與含量的效果

吲唑1是于成年雌性大鼠卵巢切除術(shù)的次日，經(jīng)由腹腔注射(1mg/kg)每日施用連續(xù)1個(gè)月。對(duì)照組是施用載體(3％DMSO，0.3ml)。
ap＜0.05對(duì)照于偽處理組。
bp＜0.05對(duì)照于OVX組。
BMD骨礦物質(zhì)密度BMC骨礦物質(zhì)含量數(shù)據(jù)是以平均值±S.E.表示。
三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)是于股骨進(jìn)行。對(duì)照于偽處理對(duì)照組，OVX大鼠顯示股骨顯著較低的極限壓力與楊氏系數(shù)。意外地，吲唑1處理OVX大鼠僅稍微降低股骨的極限壓力與楊氏系數(shù)。參照以下表2表2股骨的生物力學(xué)特性

吲唑1是于成年雌性大鼠卵巢切除術(shù)的次日，經(jīng)由腹腔注射(1mg/kg)每日施用連續(xù)4周。對(duì)照組是施用載體(3％DMSO，0.3ml)。
*p＜0.05對(duì)照于偽處理對(duì)照組。
§p＜0.05對(duì)照于OVX組。
坐骨神經(jīng)切除是于成年雄性大鼠進(jìn)行。結(jié)果顯示于以下表3。對(duì)照于相對(duì)側(cè)，在坐骨神經(jīng)切除1個(gè)月后，脛骨與股骨兩者于手術(shù)側(cè)的長(zhǎng)度并未顯著地改變。然而，脛骨與股骨兩者的重量，BMD，BMC及骨體積皆對(duì)應(yīng)于坐骨神經(jīng)切除而降低。意外地，在坐骨神經(jīng)切除后立刻每日注射吲唑1(1mg/kg)連續(xù)4周會(huì)拮抗神經(jīng)切除造成的骨損失。參見(jiàn)以下表3表3吲唑1防止坐骨神經(jīng)切除造成的骨損失

吲唑1是于成年雄性大鼠坐骨神經(jīng)切除的次日，經(jīng)由腹腔注射(1mg/kg)每日施用連續(xù)1個(gè)月。對(duì)照組是施用載體(3％DMSO，0.3ml)。數(shù)據(jù)是以平均值±S.E.表示(對(duì)照組n＝14，吲唑1處理組n＝10)。
培養(yǎng)破骨細(xì)胞的效果測(cè)試吲唑1慢性處理對(duì)于堿性磷酸酶活性的效果。依照原代破骨細(xì)胞培養(yǎng)的方法培養(yǎng)破骨細(xì)胞，并以吲唑1(10μM)處理2周。由ALP染色顯示，上述處理顯著地增加ALP活性。吲唑1增加ALP活性是屬濃度依存性，且可被L-NAME(60μM)，ODQ(20μM)或KT5823(2μM)所拮抗。同時(shí)測(cè)試吲唑1在體外對(duì)于骨小結(jié)形成的效果。發(fā)現(xiàn)當(dāng)破骨細(xì)胞培養(yǎng)于含有維生素C與β-甘油磷酸的培養(yǎng)基會(huì)形成礦物化小結(jié)。在電子顯微鏡下，礦物化小結(jié)顯示帶有活性破骨細(xì)胞，陷入的破骨細(xì)胞，胞外膠原蛋白纖維及羥基磷灰石沉積的骨結(jié)構(gòu)，使此系統(tǒng)成為研究體外骨形成的有效模型。意外地，吲唑1處理2周會(huì)以濃度依存性形式增加骨小結(jié)數(shù)目(經(jīng)von Kossa染色觀察的骨小結(jié))。吲唑1在0.1與1μM的濃度下稍增加破骨細(xì)胞的增殖(分別為對(duì)照組的119.3％與126.1％)。
纖連蛋白(Fn)在調(diào)控破骨細(xì)胞的粘附，遷移，及成熟方面扮演重要角色。Fn纖維原生成涉及骨礦物化的過(guò)程。測(cè)試吲唑1對(duì)于培養(yǎng)破骨細(xì)胞中Fn纖維原生成的作用。經(jīng)由單層3～5天的破骨細(xì)胞內(nèi)原性釋放Fn而得到的纖維原生成固定形式是采用免疫細(xì)胞化學(xué)法研究。第3天破骨細(xì)胞與吲唑1(10μM)溫育24小時(shí)增加胞外Fn集合。采用流氏細(xì)胞儀分析吲唑1對(duì)于細(xì)胞表面α5與β1整合蛋白的表達(dá)的效力。意外地發(fā)現(xiàn)吲唑1處理24小時(shí)增加細(xì)胞表面兩種整合蛋白的表達(dá)。另一方面，膠原蛋白合成只有在較高濃度如10μM的吲唑1處理下增加。
對(duì)于破骨細(xì)胞分化與活化的效果破骨細(xì)胞前體培養(yǎng)物于M-CSF(20ng/ml)與sRANKL(50ng/ml)存在下8天會(huì)誘發(fā)大型成熟、帶有多核的破骨細(xì)胞的形成，其特征為獲得成熟表現(xiàn)型標(biāo)記，如TRAP。吲唑1意外地以濃度依存性形式抑制破骨細(xì)胞的分化。
還測(cè)試吲唑1對(duì)于破骨細(xì)胞再吸收活性的效果。破骨細(xì)胞前體培養(yǎng)于M-CSF與sRANKL存在下5天，接著由破骨細(xì)胞活性試驗(yàn)的基質(zhì)平板的培養(yǎng)基中移除M-CSF與sRANKL。將不同濃度的吲唑1加入培養(yǎng)基再培養(yǎng)3天。相對(duì)于對(duì)照組，吲唑1會(huì)顯著地以濃度依存性方式抑制破骨細(xì)胞再吸收活性。
其它實(shí)施例本說(shuō)明書所公開(kāi)的所有特征可組合為任何組合。本說(shuō)明書所公開(kāi)的每一特征可以由用作相同，等同，或類似目的的替代性特征所替換。因此，除非特別指出，此處所公開(kāi)的每一特征僅為等同或類似特征的通用系列中的一例。
由上述說(shuō)明書，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易確認(rèn)本發(fā)明的基本特征，且在不背離本發(fā)明的精神與范圍內(nèi)，可對(duì)于本發(fā)明進(jìn)行各種改變與修飾，以便更適于各種用途與狀況。例如，構(gòu)造上類似于稠合吡唑化合物的化合物亦可以用于實(shí)施本發(fā)明。因此，其它實(shí)施方案亦包括于本發(fā)明的權(quán)利要求利范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種增進(jìn)骨生長(zhǎng)或抑制骨再吸收的方法，其包含向需要其的受試者施用有效量的下式化合物 A為H，R，或Ar1、Ar2、Ar3各自獨(dú)立地為苯基，噻吩基，呋喃基，或吡咯基；R1，R2，R3，R4，R5，及R6各自獨(dú)立地為H，硝基，鹵素，R，OH，OR，C(O)OH，C(O)OR，C(O)SH，C(O)SR，C(O)NH2，C(O)NHR，C(O)NRR’，ROH，ROR’，RSH，RSR’，ROC(O)R’OH，NHR，NRR’，RNHR’，或RNR’R”；或R1與R2一起，R3與R4一起，或R5與R6一起為ORO；其中R，R’，R”各自獨(dú)立地為C1～C6烷基；以及n為1、2、或3。
2.權(quán)利要求1的方法，其中A為
3.權(quán)利要求2的方法，其中Ar1為苯基。
4.權(quán)利要求2的方法，其中Ar2為5’-呋喃基。
5.權(quán)利要求2的方法，其中Ar3為苯基且n為1。
6.權(quán)利要求5的方法，其中Ar1為苯基。
7.權(quán)利要求6的方法，其中Ar2為5’-呋喃基。
8.權(quán)利要求7的方法，其中R3與R4之一在呋喃基的2位上取代。
9.權(quán)利要求8的方法，其中R1，R2，R5與R6各自為H。
10.權(quán)利要求9的方法，其中R3與R4之一為H，另一個(gè)為CH2NHCH3，CH2OCH3，或COOCH3。
11.權(quán)利要求9的方法，其中R3與R4之一為H，另一個(gè)為CH2OH。
12.權(quán)利要求1的方法，其中Ar1為苯基。
13.權(quán)利要求1的方法，其中Ar2為5’-呋喃基。
14.權(quán)利要求1的方法，其中A為H。
15.權(quán)利要求14的方法，其中Ar1為苯基。
16.權(quán)利要求14的方法，其中Ar2為5’-呋喃基。
17.一種治療骨質(zhì)疏松癥的方法，其包含向需要其的受試者施用有效量的下式化合物 其中 A為H，R，或Ar1、Ar2、Ar3各自獨(dú)立地為苯基，噻吩基，呋喃基，或吡咯基；R1，R2，R3，R4，R5，及R6各自獨(dú)立地為H，硝基，鹵素，R，OH，OR，C(O)OH，C(O)OR，C(O)SH，C(O)SR，C(O)NH2，C(O)NHR，C(O)NRR’，ROH，ROR’，RSH，RSR’，ROC(O)R’OH，NHR，NRR’，RNHR’，或RNR’R”；或R1與R2一起，R3與R4一起，或R5與R6一起為ORO；其中R，R’，R”各自獨(dú)立地為C1～C6的烷基；以及n為1、2、或3。
18.權(quán)利要求17的方法，其中A為
19.權(quán)利要求18的方法，其中Ar1為苯基。
20.權(quán)利要求18的方法，其中Ar2為5’-呋喃基。
21.權(quán)利要求18的方法，其中Ar3為苯基且n為1。
22.權(quán)利要求21的方法，其中Ar1為苯基。
23.權(quán)利要求22的方法，其中Ar2為5’-呋喃基。
24.權(quán)利要求23的方法，其中R3與R4之一在呋喃基的2位上取代。
25.權(quán)利要求24的方法，其中R1，R2，R5與R6各自為H。
26.權(quán)利要求25的方法，其中R3與R4之一為H，另一個(gè)為CH2NHCH3，CH2OCH3，或COOCH3。
27.權(quán)利要求25的方法，其中R3與R4之一為H，另一個(gè)為CH2OH。
28.權(quán)利要求17的方法，其中Ar1為苯基。
29.權(quán)利要求17的方法，其中Ar2為5’-呋喃基。
30.權(quán)利要求17的方法，其中A為H。
31.權(quán)利要求30的方法，其中Ar1為苯基。
32.權(quán)利要求31的方法，其中Ar2為5’-呋喃基。
全文摘要
本發(fā)明特征為一種增進(jìn)骨生長(zhǎng)或抑制骨再吸收的方法。該方法包括向需要其的受試者施用(Ⅰ)式化合物A為H，R，或(Ⅱ)式，Ar
文檔編號(hào)A61K31/416GK1615853SQ20041007516
公開(kāi)日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2004年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月3日
發(fā)明者符文美, 湯智昕, 楊榮森, 鄧哲明, 郭盛助, 李芳裕 申請(qǐng)人:永信藥品工業(yè)股份有限公司