專利名稱：老鷹茶醇提物在制備抗炎免疫藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及老鷹茶醇提物的用途，尤其涉及老鷹茶醇提物在制備抗炎免疫藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
老鷹茶是我國江南農(nóng)村的一種傳統(tǒng)飲料，千百年來深受飲用者的喜愛和歡迎，原因在于原料豐富，加工簡單，便于保管，飲用方便，而且是一種無毒、無污染的純天然飲料。近年來，由于環(huán)境受到一定程度的污染，人們回歸自然的意識不斷增加，這種純天然飲料越來越受到人們的青睞。
老鷹茶的植物學(xué)分類屬于樟科、木姜子屬、毛豹皮樟，俗稱“白茶”，也叫老鷹茶。學(xué)名Litsea coreana Leve.var.是一種常綠小喬木或喬木。常生長在海拔1000米左右的低山常綠闊葉林中，分布在四川、貴州、安徽、云南、重慶、湖南和江西等地。
當(dāng)年生枝紫褐色或綠色，有卷曲柔毛，皮孔黃褐色或綠色，第二年枝禿凈。芽卵形，鱗片外綠色或黃褐色絹毛。
葉革質(zhì)、互生、橢圓形、狹橢圓形或倒卵狀橢圓形，先端漸尖或突尖，基部楔形，長5-15cm，寬1.5-5.cm，背面灰白色，有卷曲柔毛，有時禿凈，側(cè)脈6-10條，葉柄長0.5-1.5cm，有毛。在自然環(huán)境下，年萌發(fā)新芽2輪，4-5月為春芽，8-9月為秋芽，以春芽產(chǎn)量為高?；?，臘黃色、花序無梗，數(shù)個簇生在葉腋，總苞外有短毛，每序有花4-8朵，花朵直徑4-5mm。果，近球狀(有長橢圓形和倒橢圓形)，直徑約6mm，果梗粗壯，長0.5-0.8mm，有毛，果托扁平膨大，有宿存的花被裂片。花期8-9月，果期次年5-8月。種子，由一層較薄的果皮包裹，種子堅硬，有蠟質(zhì)。種子直徑約6mm。
老鷹茶化學(xué)成分老鷹茶中含有豐富的氨基酸，總含量為0.82％，8種人體必需氨基酸齊全，含量以亮氨酸最高，賴氨酸次之，蛋氨酸最低，這和綠茶相似，其中蛋氨酸含量還略高于綠茶。在非必需氨基酸中，以谷氨酸含量最高，其次是天冬氨酸和精氨酸，與綠茶相比無明顯差異。從氨基酸總量上看，綠茶的氨基酸高于老鷹茶，其主要原因是綠茶中特有茶氨酸的含量高，茶氨酸在一定程度上反映綠茶與老鷹茶的口感差異，另一方面也說明綠茶原植物與老鷹茶植物有不同的氨基酸代謝類型。
老鷹茶富含多種礦物質(zhì)元素，其中鉀(K)、磷(P)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、鈉(Na)、鋅(Zn)、鐵(Fe)、硒(Se)都是人體必需的營養(yǎng)元素，尤其是鋅(Zn)、鐵(Fe)、硒(Se)元素含量高于綠茶，對造血、健腦有較好作用。更值得一提的是有害元素鉛的含量明顯低于綠茶。
老鷹茶含有的水溶性維生素主要是Vc、VB1和VB2，其含量比綠茶稍低，可能與加工過程與代謝途徑等因素有關(guān)。
老鷹茶中總黃酮(TF，total flavonoid)含量遠(yuǎn)高于綠茶，綠茶只有1.22％左右，而老鷹茶可高達(dá)3.45％，已知黃酮有山柰酚(kaempferol)，山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside)，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside)。
老鷹茶經(jīng)過常壓水蒸汽蒸餾提取老鷹茶的揮發(fā)性成分，得到淺黃色油狀液體，香味濃郁，出油率0.1％左右。經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，鑒定出32種成分(其中萜類化合物及其衍生物20種)，占揮發(fā)油組成的95％，主要成分是正癸醛(decanal)含量為71.53％；然后依次為10-烯-十一醛(10-undecenal)，含量為5.02％；壬醛(n-nonaldehyde)，含量3.58％；正十二酸乙烯酯(dodecanoic acid，ethenyl ester)，含量2.63％。香味的主要成分為萜類。
老鷹茶中還含有多糖、皂甙、多酚和天然色素等。
另外，尤其值得一提的是，與綠茶相比，老鷹茶的化學(xué)成分不含咖啡堿物質(zhì)，無興奮作用，不影響睡眠，這對需要控制咖啡堿攝入的人更是一種良好的選擇。
老鷹茶(Litsea coreana Leve.var)在我國江南廣大農(nóng)村飲用由來已久，深受廣大勞動人民的喜愛，但僅僅作為一種飲料。近年來，四川、貴州等地進(jìn)行了一些開發(fā)和利用，但也僅限于粗加工，還沒有充分認(rèn)識到它的藥理功能，它所潛在的藥理作用機(jī)制更無前人探討。根據(jù)文獻(xiàn)報道，長期飲用有防餿、防腐、消暑解渴、消食化積、解毒、消腫利尿，明目、健胃、益思的作用。
本發(fā)明的目的在于提供老鷹茶醇提物的新用途，即在制藥中的新應(yīng)用。
實際上，本發(fā)明涉及老鷹茶醇提物在制備抗炎免疫藥物中的應(yīng)用。
抗炎免疫藥的現(xiàn)狀及分類免疫是機(jī)體接觸抗原性異物或異已成份的一種特異性生理反應(yīng)，其作用是識別、排除抗原性異物，以維持機(jī)體的生理平衡。炎癥是各種傷害的因素引起的機(jī)體常見病理過程。免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)都是機(jī)體保護(hù)性防御反應(yīng)，但過度的免疫和炎癥對人體又都是有害的。免疫和炎癥是機(jī)體對異物的兩種不同反應(yīng)，但細(xì)觀其實質(zhì)，免疫和炎癥是一個問題的兩個側(cè)面，兩者相互重疊，不可分割。目前按照藥物治標(biāo)與治本的目的，并參考化學(xué)結(jié)構(gòu)與藥理學(xué)特點，將抗炎免疫藥分為非甾體抗炎免疫藥、甾體抗炎免疫藥和疾病調(diào)修藥。
1、非甾體抗炎免疫藥這是一類非同質(zhì)且具有不同藥理作用機(jī)制的化合物。藥理學(xué)特點是起效迅速，可減輕炎癥性腫脹、緩解疼痛和改善功能，但不影響炎癥的病程；停藥后不久可出現(xiàn)“反跳”癥狀和再現(xiàn)。本類藥物均無選擇性地抑制前列腺素的合成，但前列腺素在慢性炎癥反應(yīng)中有致炎與抗炎的雙重作用，這就導(dǎo)致很多副作用的發(fā)生。該類藥物對環(huán)氧化酶的非特異性抑制作用可能也是其藥理作用和不良反應(yīng)不一致的原因之一。
2、甾體類抗炎免疫藥這是一類包括天然和合成的糖皮質(zhì)激素，主要有強(qiáng)大的抗炎作用和弱的免疫抑制作用，能從多個環(huán)節(jié)影響炎癥和免疫過程，廣泛用于治療以慢性炎癥為特征的自身免疫病。但因為其嚴(yán)重的不良反應(yīng)，故一般甾體抗炎免疫藥在臨床上不作為相對較輕的炎癥免疫性疾病的常規(guī)治療藥。
3、疾病調(diào)修藥這類藥物包括金鹽、D-青霉胺、羥氯喹、免疫抑制藥和免疫增強(qiáng)藥等。其中不少藥物本身并無抗炎作用，與一般抗炎藥相比，它們更多地影響疾病的基本過程。
老鷹茶醇提物物理性狀為墨綠色粉末，易吸潮，水溶性較差，易溶于親脂性有機(jī)溶劑。具有特殊香味。
老鷹茶醇提物具有抗炎作用，老鷹茶醇提物200mg/kg能明顯抑制二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹，400mg/kg作用尤其明顯(與模型組比較，P＜0.05)；老鷹茶醇提物266mg/kg能明顯減輕角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足爪腫脹(與模型組比較，P＜0.05)；老鷹茶醇提物266mg/kg能明顯抑制棉球誘導(dǎo)的大鼠肉芽腫(與模型組比較，P＜0.05)。
老鷹茶醇提物具有免疫調(diào)節(jié)作用，老鷹茶醇提物100，200，400mg/kg能提高Cy抑制小鼠臟器重量指數(shù)，提高Cy抑制小鼠吞噬指數(shù)K值；應(yīng)用定量溶血分光光度法(QHS)檢測抗體形成細(xì)胞所分泌的抗SRBC抗體，其結(jié)果不僅反映抗體形成細(xì)胞的數(shù)量，也提示合成抗體的能力；可顯著提高Cy抑制小鼠的體液免疫功能。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用老鷹茶醇提物的藥理試驗及結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
(一)老鷹茶醇提物對二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制作用試驗1.材料1.1藥物及試劑 老鷹茶醇提物，安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)系提供；萘普生(naproxen，NAP)，廣東何濟(jì)公藥廠生產(chǎn)，批號19950423。上述藥物使用時均用0.5％CMC-Na制成混懸液。二甲苯，安徽蚌埠新科電化試劑廠產(chǎn)品，批號200008012。
1.2儀器 電子天平FA2004A，上海精天電子儀器廠生產(chǎn)1.3動物昆明種小鼠，♂，體重20±2g，皖醫(yī)實動準(zhǔn)第01號，安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所動物實驗中心提供2.方法昆明種小鼠50只，♂，隨機(jī)分為5組，每組10只，依次為陽性藥組，老鷹茶醇提物組(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)及模型組。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)3天，模型組給予相應(yīng)體積的CMC-Na。末次給藥后1.5h于小鼠左耳前后兩面涂抹二甲苯0.05ml，右耳作對照，1.5h后將小鼠脫頸處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑9mm的打孔器分別在同一部位打下圓耳片，稱重，以左右耳片之差為腫脹度。
3.結(jié)果老鷹茶醇提物對二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制作用(x±s，n＝10)組別 劑量(mg/kg)左右耳重量之差(mg)
模型-18.00±6.71老鷹茶醇提物100 12.86±5.92200 11.40±5.43*400 10.71±6.57*萘普生 30 9.95 ±7.45*注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.014.結(jié)論老鷹茶醇提物(200mg/kg，400mg/kg)能明顯抑制由二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹。
(二)老鷹茶醇提物對角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足爪腫脹的抑制作用試驗1.材料1.1藥物及試劑 老鷹茶醇提物，安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)系提供。萘普生(naproxen，NAP)，廣東何濟(jì)公藥廠生產(chǎn)，批號19950423。上述藥物使用時均用0.5％CMC-Na制成混懸液。角叉菜膠，青島海洋所提供，應(yīng)用前一天以無菌生理鹽水配制成10g·L-1濃度的角叉菜膠，放置4℃冰箱過夜。
1.2儀器MK-500型Volume metert，日本產(chǎn)品。
1.3動物Spague-Dawlay(SD)大鼠，♀♂各半，體重180±20g，河南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。
2.方法取SD大鼠60只，♀♂各半，每組10只，依次為陽性藥組，老鷹茶醇提物組(66.5mg/kg，133mg/kg，266mg/kg)、模型組及假手術(shù)組。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)3天，模型組及假手術(shù)組給予相應(yīng)體積的CMC-Na。然后于每鼠右足趾皮下注射1％角叉菜膠0.1ml致炎，假手術(shù)組給予相應(yīng)體積的生理鹽水。分別在致炎前和致炎后1，3，5，7h，用Volume meter測量致炎側(cè)足容積，以各鼠致炎前，后容積的差值為腫脹度。
3.結(jié)果老鷹茶醇提物對角叉菜誘導(dǎo)大鼠足腫脹的抑制作用(x±s，n＝10)組別劑量 足跖腫脹度(ml)mg/kg 1h 3h 5h 7h
模型 -0.45±0.36 1.19±0.37 1.11±0.33 1.07±0.29老鷹茶醇提物 66.5 0.41±0.19 0.96±0.43 1.14±0.41 0.88±0.28133 0.45±0.17 0.99±0.31 1.11±0.22 0.89±0.24266 0.50±0.13 1.10±0.29 1.04±0.21 0.72±0.29**萘普生 20 0.36±0.19 1.01±0.40 1.04±0.34 0.88±0.20假手術(shù) -0.09±0.08 0.16±0.14 0.32±0.13 0.54±0.27注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.014.結(jié)論老鷹茶醇提物(266mg/kg)對角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足腫脹有一定抑制作用。
(三)老鷹茶醇提物對棉球誘導(dǎo)大鼠肉芽腫的影響試驗1.材料1.1藥物及試劑 老鷹茶醇提物，安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)系提供。萘普生(naproxen，NAP)，廣東何濟(jì)公藥廠生產(chǎn)，批號19950423。上述藥物使用時均用0.5％CMC-Na制成混懸液。
1.2儀器真空干燥箱DZF6021，上海一恒科技有限公司生產(chǎn)1.3動物Spague-Dawlay(SD)大鼠，♀♂各半，體重180±20g，河南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。
2.方法取SD大鼠50只，♀♂各半，依次為模型組、老鷹茶醇提物組(66.5mg/kg，133mg/kg，266mg/kg)及陽性藥組。用10％水合氯醛(350mg/kg)ip注射麻醉，在無菌條件下操作，將棉球(每個50±1mg，高壓滅菌)分別植入大鼠兩側(cè)腹股溝皮下，肌肉注射氨芐青霉素。手術(shù)當(dāng)天開始灌胃給藥，連續(xù)7天，第8天頸椎脫臼致死，取出棉球，置60℃烤箱烤至恒重，減去原棉球凈重，即為肉芽腫凈重，按mg/100g表示。
3.結(jié)果老鷹茶醇提物對棉球誘導(dǎo)大鼠肉芽腫的影響(x±s，n＝10)組別 劑量(mg/kg)肉芽腫重(mg/100g)
模型 -- 63.17±15.31老鷹茶醇提物 66.5 53.64±12.74*133 53.33±6.69*266 37.44±27.98**萘普生20 51.23±9.70*注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.014.結(jié)論老鷹茶醇提物(133，266mg/kg)對棉球誘導(dǎo)的肉芽腫有明顯的抑制作用。
(四)老鷹茶醇提物對免疫低下小鼠體液免疫功能的影響1.材料1.1藥物及試劑 老鷹茶醇提物，安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)系提供。雷公藤多苷片，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號20030402，上述藥物使用時均用0.5％CMC-Na制成混懸液；綿羊紅細(xì)胞，安徽省防疫站提供。
1.2儀器真空干燥箱DZF6021，上海一恒科技有限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，labsystems公司生產(chǎn)。
1.3動物昆明種小鼠60只，♀♂各半，體重18-22g，皖醫(yī)實動準(zhǔn)第01號，安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所動物實驗中心提供2.方法I.抗體形成細(xì)胞的測定昆明種小鼠60只，♀♂各半，體重18-22g，隨機(jī)分6組，每組10只，分別為正常組、環(huán)磷酰胺模型組、老鷹茶醇提物(100，200，400mg/kg)組及陽性藥(雷公藤60mg/kg)組。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)7天，正常組及模型組給予相應(yīng)體積的CMC-Na。d3每鼠腹腔注射10％的SRBC0.2mL致敏。同時除正常組外腹腔注射Cy50mg/kg，連續(xù)3天。致敏后5d，摘除小鼠眼球取血。用冷的Gey’s制成5×106/mL脾細(xì)胞懸液，然后取試管若干只，每管依次加入脾細(xì)胞懸液、0.2％SRBC、1∶10豚鼠血清各0.5mL，另設(shè)不加補(bǔ)體的空白對照。置37℃水浴中溫浴1h，離心(3000r/min)5min，取上清液。用分光光度計在波長413nm處測吸光度。
II.血清中IgM的測定昆明種小鼠60只，♀♂各半，體重18-22g，隨機(jī)分6組，每組10只，分別為正常組、環(huán)磷酰胺模型組、老鷹茶醇提物(100，200，400mg/kg)組及陽性藥(雷公藤60mg/kg)組。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)7天，正常組及模型組給予相應(yīng)體積的CMC-Na。d3每鼠腹腔注射10％的SRBC0.2ml致敏。同時除正常組外腹腔注射Cy50mg/kg，連續(xù)3天。致敏后5d，摘除小鼠眼球取血。把收集的血清作800倍稀釋后，吸取0.5mL稀釋的血清放入另一試管中，依次加入10％SRBC，補(bǔ)體，生理鹽水各0.5mL，空白管用生理鹽水代替血清，混勻，置37℃溫箱溫育1h，然后離心(3000R/min)5min，取上清液，用722分光光度計在540nm處測OD值。
III.血清中IgG的測定分組及致敏同IgM的測定，測定IgG時于第一次致敏后d5同劑量再次致敏，再次免疫后d8眼球取血。放血的試管置室溫中數(shù)小時或放4℃冰箱過夜，離心分離血清。把血清加等量2-巰基乙醇后37℃水浴保溫0.5小時，隨后血清作800倍稀釋。取2-巰基乙醇處理后的血清0.5mL和5％的SRBC0.5mL，充分混勻，再加羊抗小鼠IgG和補(bǔ)體各0.5mL，空白管以0.5mLNS代替血清。置37℃溫箱溫育1h，離心(3000R/min，10min)，取上清液，用722分光光度計在540nm處測OD值。
溶血素含量(hemolysin concentration HC)計算HCIgM＝樣本稀釋血清的OD值×稀釋倍數(shù)HCIgG＝2-巰基乙醇處理樣本血清的OD值×稀釋倍數(shù)3.結(jié)果老鷹茶醇提物對小鼠體液免疫功能的影響(x±s，n＝10)組別 劑量(mg/kg) IgM(10-2) IgG(10-2) 脾(溶血素)(10-2)正常組 -6.60±0.59* 48.80±13.00** 8.92±0.68*模型組 -5.70±0.95 30.60±10.80 6.80±1.90老鷹茶醇提物100 4.60±1.10* 29.30±6.50 5.40±0.47200 3.90±0.51**26.80±6.50 4.60±1.41
400 4.80±0.34* 29.60±7.10 3.60±0.57**雷公藤60 5.00±1.50 22.60±6.60 4.50±0.41*注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.014.結(jié)論老鷹茶醇提物(200，400mg/kg)可顯著降低免疫低下小鼠血清中IgM水平，老鷹茶醇提物(400mg/kg)可顯著降低免疫低下小鼠脾細(xì)胞溶血素的生成，對體液免疫具有一定的抑制作用。
從以上結(jié)果，可以得出本發(fā)明的有益效果在于A、本發(fā)明對老鷹茶醇提物發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新應(yīng)用領(lǐng)域。
B、本發(fā)明的老鷹茶醇提物既能治標(biāo)，又能治本，安全無毒，藥理作用強(qiáng)，預(yù)示著很好的藥用前景。
C、本發(fā)明的老鷹茶醇提物原料來源豐富、價廉工、制備工藝成熟，可制成各種口服劑型，使用方便。
D、本發(fā)明的老鷹茶醇提物具有顯著的抗炎免疫作用，長期服藥無危害。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步地說明。
實施例稱取老鷹茶2800g，依次以95％和65％乙醇超聲提取3次，每次30分鐘，醇提液合并、濃縮得浸膏。醇提后的茶葉1000g再以水煮，反復(fù)三次，所得水層濃縮得粉末(90g)。浸膏加適量水(3400ml)，超聲促溶，用6％HCL調(diào)PH至酸性(PH2)，用乙醚提取酸性成分(148g，5.3％)，水層再用4％NAOH調(diào)PH至9，用正丁醇萃取堿性成分，正丁醇萃取后水層濃縮得粉末(115g)。
以上老鷹茶醇提物臨用前均以0.5％CMC-Na配成混懸液，所用劑量均以浸膏粉末量表示。
老鷹茶醇提物推薦臨床劑量600-2400mg/日，口服，分三次服用。
權(quán)利要求
1.老鷹茶醇提物在制備抗炎免疫藥物中的應(yīng)用，其特征在于老鷹茶醇提物在制備抗炎免疫藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及老鷹茶醇提物的新用途，即在制備抗炎免疫藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明對老鷹茶醇提物發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新應(yīng)用領(lǐng)域。老鷹茶醇提物既能治標(biāo)，又能治本，安全無毒，藥理作用強(qiáng)，預(yù)示著很好的藥用前景；其原料來源豐富、價廉、制備工藝成熟，可制成各種口服劑型，使用方便。
文檔編號A61K31/7048GK1522707SQ03158230
公開日2004年8月25日 申請日期2003年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月11日
發(fā)明者俊 李, 李俊, 金涌, 高署, 程文明, 胡成穆, 李 榮 申請人:安徽醫(yī)科大學(xué)