專利名稱：治療用抗血管生成的組合物和方法
技術領域：
本申請涉及用于治療與血管生成有關疾病(如依賴于血管生成癌)的新型血管生成抑制劑。本發(fā)明還涉及治療依賴于血管生成癌的新型組合物和方法。此外，本發(fā)明還涉及用于內抑制素測定的診斷分析方法和試劑盒、定位內抑制素的組織化學試劑盒、檢測內抑制素生物合成的分子探針、內抑制素特異性抗體、內抑制素受體的肽興奮劑和拮抗劑的產生以及與內抑制素肽有關的細胞毒性劑。
背景技術：
幾種直接證據已經表明血管生成對固體腫瘤生長和存在及它們的轉移是十分重要的(Folkman，1989；Hori等，1991；Kim等，1993；Millauer等，1994)。為了刺激血管生成，腫瘤對各種血管生成因子(包括成纖維細胞生長因子(FGF和BFGF)(Kandel等，1991)、血管內皮細胞生長因子/血管透過性因子VEGF/VPF)的產生具有正調節(jié)作用。然而，許多惡性腫瘤也產生血管生成的抑制劑，包括血管抑制素和凝血酶致敏蛋白(Chen等，1995；Good等，1990；O′Reilly等，1994)。一般認為血管生成表型是這些新血管生成的正調節(jié)物和負調節(jié)物之間的凈平衡所至(Good等，1990；O′Reilly等，1994；Parangi等，1996；Rastinejad等，1989)。已經鑒定了幾種血管生成的其它內源抑制劑，盡管這些抑制劑不都與腫瘤的存在有關。這些抑制劑包括血小板因子4(Gupta等，1995；Maione等，1990)、干擾素-α、干擾素誘導的蛋白質10(Angiolillo等，1995；Strieter等，1995)，所說的蛋白質由白細胞介素-12和/或干擾素-γ(Voest等，1995)、gro-β(Cao等，1995)和促乳素的16kDa N-末端片段(Clapp等，1993)誘導。已知的唯一特異性地抑制內皮細胞增殖的血管生成抑制劑為血管抑制素(O′Reilly等，1994)。
血管抑制素是分子量大約為38千道爾頓(kDa)的內皮細胞增殖的特異性抑制劑。血管抑制素是纖溶酶原的內部片段，這種片段包含纖溶酶原的5個kringles中的至少三個。已經證明血管抑制素在某些腫瘤上能夠減少腫瘤的重量，并抑制腫瘤的轉移(O’Reilly等，1994)。下文所使用的術語＂血管抑制素＂是指上文描述的血管抑制素、具有抑制內皮細胞增殖能力的血管抑制素肽片段、與血管抑制素的氨基酸序列實質上具有同源性的血管抑制素類似物(這種類似物具有抑制內皮細胞增殖能力)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及新的蛋白質抑制劑和它的使用方法。此蛋白質是內皮增殖和血管生成的潛在的和特異性的抑制劑。使用此抑制劑進行全身治療幾乎可以完全抑制腫瘤誘導的血管生成，并且其顯示出強大的抗腫瘤活性。
抑制蛋白的分子量大約為18,000-20,000道爾頓(18-20kDa)，并且在培養(yǎng)的細胞中能夠抑制內皮細胞增殖。此蛋白的特征還在于其優(yōu)選的N-末端氨基酸序列，這種蛋白質的頭二十個氨基酸如下His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu1 2 3 4 5 6 7 8 9 10His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser11 12 13 14 15 16 17 18 19 20(SEQ ID NO1)本發(fā)明優(yōu)選的內皮細胞增殖抑制劑是具有上述特征的蛋白質，這種蛋白質是從鼠血管內皮瘤細胞系EOMA中分離和純化的。將這種抑制蛋白命名為內抑制素(endostatin)。
本發(fā)明提供了通過向患有不需要的血管生成類疾病的人或者動物以足以抑制血管生成的量施用包含實質上純化的內抑制素或者內抑制素衍生物的組合物，來治療由不需要的和無法控制的血管生成介導的疾病和過程的方法和組合物。本發(fā)明對治療或抑制腫瘤的生長特別有用。向患有預先形成血管的轉移性腫瘤的人或動物施用內抑制素可以抑制這些腫瘤的生長或擴展。
本發(fā)明也包括檢測和測量生物液體和組織中的內抑制素的診斷方法和試劑盒、定位組織中內抑制素的試劑盒。所說的診斷方法和試劑盒可以是本領域普通技術人員公知的任何形式。本發(fā)明也包括內抑制素的特異性的抗體和抑制內抑制素特異性抗體結合的抗體。這些抗體可以是多克隆抗體或者單克隆抗體。內抑制素特異性抗體可以用于診斷試劑盒以便檢測內抑制素的存在和數量，這種內抑制素可以診斷或者預測由血管生成介導的癌癥和其它疾病的發(fā)生和復發(fā)。也可以向人或動物施用內抑制素特異性的抗體以便使人或動物針對內抑制素進行被動免疫，從而降低血管生成的抑制作用。
本發(fā)明也包括用于檢測抗體的存在和數量的診斷方法和試劑盒，所說的抗體在體液中與內抑制素結合。所說的診斷方法和試劑盒可以是本領域普通技術人員公知的任何形式。
本發(fā)明還包括用同位素或其它分子或蛋白質標記的內抑制素肽片段，所說的標記用分子或蛋白質在現有技術(包括但不限于正電子發(fā)射斷層攝影術、放射自顯影術、流動細胞計量術、放射受體結合測定和免疫組織化學)中用于檢測和顯示內抑制素結合位點。
這些內抑制素肽也可以作為內抑制素受體的興奮劑和拮抗劑，由此促進或阻止內抑制素的生物活性。這些肽用于分離內抑制素受體。
本發(fā)明也包括內抑制素、內抑制素片段、內抑制素抗血清、或者與用于治療和研究的細胞毒性劑有關的內抑制素受體興奮劑和拮抗劑。
本發(fā)明包括與內抑制素的轉錄和翻譯有關的核糖核酸與脫氧核糖核酸的分子探針。這些分子探針在組織和細胞中提供了檢測和測量內抑制素生物合成的手段。
令人驚奇的發(fā)現是在各種形式的重組內抑制素蛋白施用給患有腫瘤的動物時，都可以持續(xù)釋放抗血管生成的化合物。持續(xù)釋放的化合物的優(yōu)選形式是未折疊的重組產生的內抑制素。
另外，本發(fā)明包括核酸序列，這種核酸序列包含編碼上述公開的氨基酸序列和編碼內抑制素及其內皮細胞增殖抑制肽片段的核苷酸密碼子。
本發(fā)明還涉及使用內抑制素蛋白質和肽片段、相應的核酸的序列、與抑制劑及其肽特異結合的和抗體診斷與內皮細胞有關的疾病和紊亂的方法。
本發(fā)明還包括鑒定內抑制素特異性受體的方法和由此鑒定和分離的受體分子。
本發(fā)明也涉及鑒定能夠由XVIII型膠原釋放內抑制素的新型酶的方法、包含內抑制素氨基酸序列的其它分子及其肽。這種產生內抑制素的酶也是本發(fā)明的一部分。
重要的醫(yī)學方法是產生了一種避孕的新形式，其中向女性施用有效量的內抑制素以便抑制子宮內膜血管的形成，因此胚胎無法植入或繼續(xù)生存。
本發(fā)明特別重要的方面是發(fā)現了治療患者的與血管生成有關的疾病(特別是依賴于血管生成癌)的新型而有效的方法和治療患者的依賴于血管生成癌的方法。出人意料地，本方法提供了抑制腫瘤生長和減少腫瘤量重要醫(yī)療結果。本方法還涉及共同使用本發(fā)明的內抑制素和另一種抗血管生成化合物(優(yōu)選的是血管抑制素)。因此，本發(fā)明也包括包含內抑制素、可以包含也可以不包含血管抑制素的制劑，其量對于治療依賴于血管生成的癌是有效的。
因此，本發(fā)明的目的是提供包含內抑制素蛋白質的組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療由血管生成介導的疾病和過程的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測體液或組織中內抑制素的存在和存在量的診斷或預測方法及試劑盒。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于治療由血管生成介導的疾病和過程的方法和組合物，這些疾病包括(但不限于)血管瘤、固形腫瘤、白血病、轉移腫瘤、毛細管擴張性硬皮馬勃屬牛皮癬、生膿肉芽瘤、心肌血管生成、噬斑新血管生成、冠狀(corornay)側突、小腦側突、動靜脈畸形、局部缺血的分支血管生成、角膜疾病、潮紅、新血管性青光眼、糖尿病性視網膜病、特里氏綜合征、風濕性關節(jié)炎、糖尿病性新血管生成、視網膜黃斑變性、創(chuàng)傷愈合、消化潰瘍、骨折瘢痕瘤、血管生成、血細胞生成、排卵、月經和胎盤形成。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于治療或者抑制癌發(fā)展的組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測和定量體液中存在的內抑制素特異性抗體的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供包含對內抑制素分子的特異性區(qū)域具有選擇性的內抑制素抗體的組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測或預測癌的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于在體內和體外目測檢驗和定量內抑制素結合位點的組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測和定量內抑制素生物合成的組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供具有最小副作用的癌癥治療方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于治療或抑制癌的生長的包含內抑制素或者與細胞毒性劑結合的內抑制素肽的組合物。
通過閱讀下面公開的實施方案的詳細描述和附加的權利要求后，本發(fā)明的這些目的和其它目的以及特性和優(yōu)點就會變得明顯了。
附圖的簡要描述

圖1EOMA細胞的條件培養(yǎng)基對毛細管內皮細胞增殖的抑制作用。
將從鋪滿的EOMA細胞收集的條件培養(yǎng)基或基本培養(yǎng)基以1ng/mlbFGF用于牛毛細管內皮細胞上，進行72小時增殖測定。EOMA條件培養(yǎng)基抑制內皮細胞增殖。每一個條代表平均值±SEM。
圖2從EOMA條件培養(yǎng)基純化內皮增殖抑制劑。
將從鋪滿的EOMA細胞收集的條件培養(yǎng)基在肝素瓊脂糖凝膠柱上分級分離。在大約0.8M NaCl下洗脫出內皮增殖抑制活性。
圖3通過凝膠過濾純化內皮增殖抑制劑。
將用肝素瓊脂糖凝膠柱層析純化的抑制劑加入到凝膠過濾柱中，并以單峰洗脫下來。
圖4通過反相柱層析純化內皮細胞增殖抑制劑。
把通過瓊脂糖凝膠和凝膠過濾層析所純化的抑制劑加入到反相柱中。在大約45％乙腈下從柱中以單帶洗脫出所說的抑制劑。
圖5內皮細胞增殖抑制劑的N-末端氨基酸序列。
圖中顯示了純化的內皮細胞增殖抑制劑的N-末端氨基酸序列和相關的膠原類型18的示意圖。公開的抑制劑的N-末端序列和XV型膠原II的大約20kDa C-末端片段(實線所示)具有等同性?？瞻追娇虼鞽VIII型膠原的膠原酶區(qū)域。
圖6.用重組小鼠內抑制素抑制劑處理路易士肺癌。
把在大腸桿菌中產生的重組抑制劑施用給用路易士肺癌接種的小鼠，得到大約150mm3大的腫瘤。以20mg/Kg/天施用抑制劑。在處理大約12天后，腫瘤物消退到不能檢測的水平。
圖7用重組內抑制素消退路易士肺癌初期腫瘤的全身治療。
(A)在小鼠的背上皮下移植路易士肺癌細胞。當腫瘤大約有200mm3(體重的1％)時用重組鼠內抑制素以20mg/Kg/天進行全身治療。用內抑制素抑制劑治療的小鼠的腫瘤迅速消退，和用鹽水治療的對照相比，抑制達99％以上。每一點代表5只小鼠的平均值±SEM。重復進行實驗，結果具有可比性。
(B)用內抑制素進行全身治療11天后，治療和未治療的患有腫瘤的小鼠。鹽水治療的小鼠(右邊)很快長出了表面潰爛的紅色腫瘤。內抑制素治療的小鼠(左邊)只有小的白色殘余的腫瘤(箭頭)。
(C)用內抑制素治療的小鼠的殘余的腫瘤。在進行16天治療后，五只用內抑制素治療的小鼠中有三只死亡。尸體解剖顯示在原來初期接種位置的小白色殘余腫瘤(箭頭)。
圖8在大腸桿菌產生的重組鼠內抑制素治療鼠T241纖維肉瘤。
用T241纖維肉瘤細胞接種小鼠。用鹽水處理對照小鼠。用來源于大腸桿菌的重組鼠內抑制素以20mg/kg/天治療試驗小鼠。
圖9用大腸桿菌產生的重組鼠內抑制素治療鼠B16F10黑素瘤。
用鼠B16F10黑素瘤細胞接種小鼠。用鹽水處理對照小鼠。用來源于大腸桿菌的重組鼠內抑制素以20mg/kg/天治療試驗小鼠。
圖10用大腸桿菌產生的重組鼠內抑制素治療EOMA血管內皮瘤。
用EOMA血管內皮瘤細胞接種小鼠。用鹽水處理對照小鼠。用來源于大腸桿菌的重組鼠內抑制素以20mg/kg/天治療試驗小鼠。
圖11用大腸桿菌培養(yǎng)的重組鼠或人內抑制素治療路易士肺癌。
用路易士肺癌細胞接種小鼠。用鹽水處理對照小鼠。用來源于鼠序列的重組內抑制素或者來源于人序列的重組內抑制素治療試驗小鼠，其中兩種內抑制素都是在大腸桿菌中重組產生的。以20mg/kg/天或2.5mg/kg/天的量施用鼠內抑制素，以20mg/kg/天施用人內抑制素。
圖12內抑制素產生血管生成抑制作用和增加路易士肺癌初期腫瘤的編程性細胞死亡。
將用鹽水治療和用內抑制素治療的小鼠(已用路易士肺癌腫瘤接種)的腫瘤組織學切片進行增殖(PCNA)、編程性細胞死亡(TUNEL)、血管生成(vWF)等分析。治療和未治療的腫瘤相比，腫瘤細胞(A)增殖指數沒有顯著差異。相反，用內抑制素治療的小鼠的腫瘤細胞(B)的編程性細胞死亡指數增加了8倍(P＜0.001)。通過用vWF抗體染色計算切片中高倍視野(HPF)中的毛細血管的數量來確定血管密度。在顯微鏡下用內抑制素治療的小鼠殘余腫瘤的血管生成幾乎完全受到抑制(P＜0.001)。
圖13用大腸桿菌產生的重組鼠內抑制素對路易士肺癌進行循環(huán)休眠治療將路易士肺癌細胞皮下接種在小鼠背上。在腫瘤大約200mm3(體重的1％)時，開始以20mg/kg/天的劑量施用重組小鼠抑制劑(內抑制素)，進行全身治療。治療大約15天后，用內抑制素抑制劑治療的小鼠的腫瘤迅速消退到實質上不能檢測到的水平。當停止治療時，腫瘤的量迅速增加，隨后再用內抑制素抑制劑治療，腫瘤又恢復的到原來的不能檢測的水平。圖中的峰和谷表明內抑制素抑制作用的循環(huán)效果。
圖14用大腸桿菌產生的重組鼠血管抑制素和內抑制素的組合治療。
將路易士肺癌細胞皮下接種在小鼠背上。在腫瘤大約300mm3時，開始用重組鼠內抑制素(20mg/kg/天)和鼠血管抑制素(20mg/kg/天)進行全身治療。治療大約15天后，用組合方法治療的小鼠的腫瘤迅速消退到實質上不能檢測到的水平。很重要的是消退的腫瘤還在背上，并且在治療停止時大小或質量上不再增加。這是意想不到的具有重要醫(yī)學價值的結果。
本發(fā)明的詳細描述本申請申請人發(fā)現了一種新類型的蛋白質分子，當在體外將這種蛋白質分子加入到增殖的內皮細胞上時，其具有抑制增殖的能力。因此，將這些蛋白質分子在功能上定義為內抑制素。然而，應該理解這種功能性的定義無意于限制內抑制素在體外或體內對內皮細胞生長的抑制作用的生物學活性。內抑制素可能具有許多其它功能。
術語＂內抑制素＂是指一種優(yōu)選的18kDa-20kDa(分別通過非還原和還原凝膠電泳測定的)的蛋白質。術語內抑制素也包括18kDa-20kDa蛋白質的前體形式。術語內抑制素也包括具有實質上與所說的蛋白質相同的氨基酸序列并且能夠抑制內皮細胞增殖的18kDa-20kDa蛋白質的片段、修飾的蛋白質和肽。例如，氨基酸的沉默取代，其中所說的用結構上或化學上類似的氨基酸進行取代沒有明顯地改變蛋白質的結構、構象或活性，這是本領域公知的。這種沉默取代是在附加的權利要求的范圍之內。
術語＂內抑制素＂包括截短的蛋白質或者肽，其中從內抑制素的一端或兩端或蛋白質的內部區(qū)域除去一個或多個氨基酸，而產生的分子仍然保持抑制內皮增殖的活性，這一點也是可以理解的。術語＂內抑制素＂也包括加長了的蛋白質或者肽，其中在內抑制素蛋白質的一端或兩端或中間位置加入一個或多個氨基酸，而產生的分子仍然保持抑制內皮增殖的活性。在分析測定中，將這樣的分子(例如在開始的位置上加入酪氨酸的蛋白質)用作標記(例如用125I的放射性碘標記)對測定非常有用的。其它的放射性同位素標記在提供破壞靶細胞的分子工具方面是有用的。使用分子(如篦麻毒素)的其它標記可以提供用內抑制素受體破壞細胞的機制。
＂實質上的序列同源性＂是指在內抑制素類似物序列中的氨基酸殘基序列和內抑制素序列中的氨基酸殘基序列之間具有至少大約70％的同源性，優(yōu)選的至少大約80％同源性，更優(yōu)選的至少大約90％同源性。
內抑制素蛋白質、它的亞基和肽片段的修飾也包含在術語內抑制素的定義中。這樣的修飾包括其它分子(包括(但不限于)天然和非天然存在的氨基酸)在特異性位點天然發(fā)生的氨基酸的取代。這樣的取代可以改變內抑制素的生物活性和產生生物或者藥理上的興奮劑或者拮抗劑。術語內抑制素也包括內抑制素的N末端片段，其中所說的內抑制素包含在SEQ ID NO1和表1所示的頭20個N末端氨基酸序列的序列。所說的頭20個N末端氨基酸序列和新近鑒定的XVIII型膠原的C-末端片段相對應。
表1顯示出三字母和單字母氨基酸名稱的對應關系。
表1氨基酸 殘基 縮寫1 HISH2 THRT3 HISH4 GLNQ5 ASPD6 PHEF7 GLNQ8 PROP9 VALV10LEUL11HISH12LEUL13VALV14ALAA15LEUL16ASNN17THRT18PROP19LEUL20SERS內抑制素的N-末端氨基酸序列和在小鼠膠原α1類型XVIII中發(fā)現的開始于第1105氨基酸結束于第1124氨基酸的20個內部氨基酸的肽片段相對應。抑制劑的N-末端氨基酸序列和在人α1 XVIII型膠原中發(fā)現的開始于第1132氨基酸結束于第1151氨基酸的20個內部氨基酸的肽片段相對應。
可以從鼠血管內皮瘤EOMA中分離內抑制素?？梢詮闹亟M來說、從植入到動物中的遺傳上改變的細胞、腫瘤、細胞培養(yǎng)物和其它途徑產生內抑制素。在神經系統(tǒng)的細胞中產生內抑制素是優(yōu)選的?？梢詮捏w液(包括(但不限于)血清、尿和腹水)中分離內抑制素，或者通過化學或者生物合成方法(例如細胞培養(yǎng)、重組基因表達、肽合成和體外酶催化前體分子以產生具有活性的內抑制素)產生內抑制素。重組技術包括利用聚合酶鏈式反應(PCR)由DNA進行基因擴增和利用反轉錄酶/PCR的RNA基因擴增。
內抑制素能夠特異地和可逆地抑制內皮細胞增殖。本發(fā)明的蛋白質分子抑制劑作為避孕藥物、治療與血管生成有關的疾病(特別是依賴于血管生成癌和腫瘤)是有用的。所說的蛋白質分子對治療依賴于血管生成癌和腫瘤也是有用的。這些新型化合物治療和治愈依賴于血管生成癌和腫瘤的意想不到的令人驚奇的能力回答了困擾醫(yī)學界很長時間的問題，其給人類提供了非常大的益處。
本文所使用的重要術語定義如下。＂癌＂是指依賴于血管生成癌和腫瘤，即需要增加血管的數量和密度以從血液中獲得營養(yǎng)來生長(在體積和/或質量上的擴展)的腫瘤。＂消退＂是指腫瘤質量和大小的的減少。
可以通過本領域技術人員公知的自動蛋白質合成方法產生本發(fā)明的內皮增殖抑制蛋白質。另外可以從較大的已知蛋白質(例如人類α1XVIII型膠原和鼠α1 XVIII型膠原、具有一般或類似N-末端氨基酸序列的蛋白質)分離本發(fā)明的內皮增殖抑制蛋白質或者內抑制素。其它具有相似的N-末端氨基酸序列的潛在的內抑制素源材料的例子包括牛胃酯酶、人α115型膠原、來源于Pseudomanas sp.依賴NAD的甲酸脫氫酶(EC 1.2.1.2)、牛腺病毒類型3的s11459六鄰體蛋白質、CELF21D12 2 F21d12.3 Caenorhabditis elegans基因產物、來源于蕃茄金黃花葉病毒的VALl TGMV ALl蛋白質、來源于人腺病毒12和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的s01730六鄰體蛋白質等。例如，可以從BOVMPE 1前胃酯酶(BOS TAURUS)基因序列相應的502-521氨基酸、人α115型膠原(起始于316氨基酸結束于335氨基酸)獲得與內抑制素密切相關的肽。
使用生物活性測定分析方法(例如牛毛細管內皮細胞增殖測定)可以快速而且方便地檢測來源于以上物質和其它來源的蛋白質和肽(包括手動或者自動蛋白質合成)的內皮增殖抑制活性。其它的抑制活性的生物測定方法包括雞CAM測定、鼠角膜測定和施用分離的或合成的蛋白質對接種的腫瘤的作用。O′Reilly等在＂轉移性生長的血管生成調節(jié)＂(細胞vol.79(2)，10月21日1994，pp.315-328)中描述的雞CAM測定，本文一并參考。簡言之，從雞蛋中分離出3天大的完整的雞胚，并放入培養(yǎng)血中。在包含將要檢驗蛋白質的甲基纖維素陪替氏培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3天之后，將其加入單個胚的CAM。在培養(yǎng)48小時之后觀察胚和CAM以確定內皮生長是否受到抑制。小鼠角膜測定包括將包含生長因子的小藥丸以及另一個包含可能的內皮生長抑制劑的小藥丸植入到小鼠角膜中，并觀察在角膜中形成的毛細管的模式。
本發(fā)明也包括對應于(編碼)本發(fā)明的抑制內皮增殖的蛋白質分子的核酸序列和編碼與這種蛋白質分子特異結合的單克隆和多克隆抗體的核酸序列。在體內調節(jié)內皮過程、診斷和治療與內皮細胞有關的疾病(例如基因治療)方面，本發(fā)明的生物活性蛋白質分子、對應于此蛋白質的核酸序列、與此蛋白質特異結合的抗體是有用的。
可以根據已知的氨基酸序列、密碼子(三個核酸堿基的序列)與氨基酸的對應關系知識制備對應于(編碼)內抑制素和內抑制素類似物核酸序列。由于遺傳密碼的簡并性，在密碼子中的三個堿基發(fā)生變化仍可以編碼同一氨基酸，對于任何特殊的蛋白質或者肽片段都可以得到多種不同的可能編碼核酸的序列。
使用本領域公知的自動系統(tǒng)合成核酸序列?？梢院铣烧麄€序列，或者合成一系列較短寡核苷酸，然后將這些寡核苷酸連接到一起產生全長序列。此外，可以使用以N-末端氨基酸序列為基礎設計的寡核苷酸探針和公知的用于克隆基因物質的技術從基因庫得到所說的核酸序列。
本發(fā)明也包括檢測體液和組織中的內抑制素，以便診斷和預防和血管生成有關的疾病(例如癌癥)。本發(fā)明也包括在細胞和組織中檢測內抑制素結合位點和受體。本發(fā)明也包括治療或者抑制血管生成疾病和過程的方法，包括(但不限于)通過刺激內抑制素的產生；和/或向患者施用實質上純化的內抑制素、或者內抑制素興奮劑或拮抗劑、和/或內抑制素抗血清或者直接針對于內抑制素抗血清的抗血清來治療關節(jié)炎和腫瘤。另外的治療方法包括施用內抑制素、內抑制素片段、內抑制素抗血清或與細胞毒性劑結合的內抑制素受體興奮劑和拮抗劑。應該理解所說的內抑制素可以來源于動物或人。內抑制素可以是經化學反應或與表達系統(tǒng)結合的重組技術通過合成的方法產生的。也可以通過酶促切割不同的分子(包括包含內抑制素片段同源或者等同性序列的內抑制素前體，以便產生具有抗血管生成活性的肽)。
可以使用被動抗體療法(使用與內抑制素特異結合的抗體)調節(jié)依賴于內皮的過程(如繁殖、發(fā)育、創(chuàng)傷愈合和組織修復)。此外，可以施用針對于內抑制素抗體Fab區(qū)的抗血清來阻斷內源內抑制素抗血清與內抑制素結合的能力。
按照本領域公知的技術產生內抑制素和內抑制素類似物的特異抗體。所說的抗體可以是多克隆抗體或者單克隆抗體。在公知的免疫測定格式(如競爭和非競爭免疫測定，包括的ELISA、夾層免疫測定和放射免疫測定(RIAs))中使用所說的抗體以便確定體液中是否存在本發(fā)明的內皮增殖抑制劑。體液的例子(但不限于)包括血液、血清、腹膜液、胸膜液、腦脊液、子宮液、唾液和粘液。
本發(fā)明的蛋白質、核酸序列和抗體對診斷和治療與內皮細胞有關的疾病和紊亂是有用的。特別重要的內皮細胞過程是血管生成(血管的形成)。可以使用本發(fā)明的內皮細胞增殖抑制蛋白質診斷和治療與血管生成有關的疾病。與血管生成有關的疾病包括(但不限于)依賴于血管生成的癌(例如包括固形腫瘤、blood born腫瘤(如白血病)、腫瘤轉移)；良性腫瘤(如血管瘤、神經瘤、神經纖維瘤、沙眼、生膿肉芽瘤)；風濕性關節(jié)炎；牛皮癬；眼睛血管生成疾病(例如糖尿病性視網膜病、早熟視網膜病、視網膜黃斑變性、角膜移植排斥、新血管性青光眼、特里氏綜合征、潮紅)；Osler-Webber綜合征；心肌血管生成；噬斑新血管生成；毛細管擴張；血友病性關節(jié)；血管纖維瘤和創(chuàng)傷肉芽。本發(fā)明的內皮細胞增殖抑制蛋白質在治療內皮細胞過量或反常刺激的疾病是有用的。這些疾病包括(但不限于)腸粘連、粥樣硬化、硬皮病和肥厚性疤痕(即瘢痕瘤)。它們在治療以血管生成為病理后果的疾病(如貓抓疾病(Rochele minalia quifltosa)、潰瘍(Helobacter pylori))方面也是有用的。
內皮細胞增殖抑制蛋白質也可以作為避孕劑，通過減少或者抑制胚胎植入所需要的子宮血管的形成而起作用。這樣當將一定量的足以阻止胚胎植入的抑制蛋白質施用給女性，本發(fā)明提供了有效的避孕方法。在此避孕方法的一個方面，將一定量的足以阻止胚胎植入的抑制蛋白質在性交和受精前后使用，這樣就提供了有效的避孕方法(即“早晨后”方法)。換句話說，也可以是子宮內膜血管形成的抑制作用干擾了囊胚泡的植入。同樣輸卵管粘膜血管形成的抑制作用也干擾囊胚泡的植入，結果阻止了輸卵管妊娠的發(fā)生。給藥方法包括(但不限于)丸劑、注射(靜脈、皮下、肌內)、栓劑、陰道海綿物、陰道塞和宮內裝置。一般認為內抑制素的使用將干擾胎盤正常血管的進一步形成，另外也干擾成功植入的囊胚泡、發(fā)育胚和胎兒血管的發(fā)育。
相反，用充當受體拮抗劑的內抑制素類似物阻塞內抑制素受體能促進內皮形成和血管形成。這樣作用在子宮內膜血管形成不足、與不育有關的情況、創(chuàng)傷修復、切口愈合、治療糖尿病的血管問題(尤其是視網膜和外周血管)、促進移植組織(包括肌肉和皮膚)的血管形成、促進心肌的血管形成(尤其是在心臟或心臟組織移植后及搭橋(bypass)手術后)、促進固形和相對流動的腫瘤的血管形成結果提高了細胞毒素的運輸、提高了神經系統(tǒng)(包括但不限于腦部皮質與脊髓)的血流量。
意外的發(fā)現是未折疊的和不可溶的重組內抑制素也是有力的抗血管生成化合物，這種化合物當施用給患者時可以作為持續(xù)的釋放源。
本發(fā)明也使用內抑制素、內抑制素的內皮細胞增殖抑制肽片段、對應于內抑制素及其活性肽片段的核酸序列、與內抑制素及其肽特異結合的抗體來診斷與內皮細胞有關的疾病和紊亂。
本發(fā)明還包括鑒定內抑制素特異受體的方法，及由此所確定和分離的受體分子。
本發(fā)明也提供了內抑制素受體的定量方法。
本發(fā)明的特別重要的方面是發(fā)現了一種新型、有效的治療患者的依賴于血管生成癌的方法。意外地發(fā)現了以足以抑制腫瘤生長并使腫瘤的大小減退到只有在顯微鏡下才能見到的大小的量配合施用內抑制素和血管抑制素能夠治療依賴于血管生成癌。因此，本發(fā)明也包括有效處理(或治療)依賴于血管生成癌和腫瘤的制劑.
更特別的是，來源于昆蟲細胞或者大腸桿菌的重組小鼠內抑制素能夠強烈地抑制血管生成及轉移的和初級腫瘤的生長。在一種新型持續(xù)釋放的方法中，以非折疊的懸液和足以抑制血管生成的量施用來源于大腸桿菌的重組內抑制素可以抑制腫瘤的生長。當以足以造成腫瘤消退的量施用重組內抑制素時，能夠減少腫瘤的大小。當使用內抑制素進行治療時，最初占體重1-2％的腫瘤的大小可以減少150倍以上，成為在顯微鏡下可見的休眠損傷。休眠腫瘤的免疫組織化學分析表明伴隨封鎖性血管生成的腫瘤細胞高速增殖與腫瘤細胞的高速編程性細胞死亡抵消(balance)。沒有發(fā)現任何內抑制素處理的小鼠發(fā)生毒性反應。
作為本發(fā)明的一部分，內抑制素可以從體液(患者的血液或者尿)中分離，或者通過本領域普通技術人員公知的重組DNA方法或者合成肽化學方法產生所說的內抑制素。蛋白質純化方法是本領域公知的，在下文的實施例中給出了純化內抑制素及分析其抑制活性的方法的特定例子。使用相似的技術分離人內源性內抑制素。
一個使用重組DNA技術產生內抑制素的方法的例子必需包括下列步驟(1)如上所述及下文的詳細描述鑒定和純化內抑制素，(2)測定純化的抑制劑的N-末端氨基酸序列，(3)合成相當于N-末端氨基酸序列的DNA寡核苷酸探針，(4)產生人或者其它哺乳動物的DNA基因庫，(5)用DNA寡核苷酸探針檢測基因庫，(6)選擇與寡核苷酸雜交的克隆，(7)從此克隆中分離抑制劑基因，(8)將此基因插入到適當的載體(如表達載體)中，(9)將包含基因的載體插入到能夠表達抑制劑基因的微生物或其它表達系統(tǒng)中，(10)分離重組產生的抑制劑。實驗室手冊(如“分子克隆實驗室手冊”Sambrook等編輯，第二版，冷泉港出版社，1989)中充分描述了上述的技術。
可以通過以下步驟從表達高水平內抑制素的細胞或者組織中分離內抑制素的基因(1)從組織中分離信使RNA，(2)使用逆轉錄酶產生相應的DNA序列和(3)使用適當的引物通過PCR擴增編碼活性內抑制素氨基酸序列的DNA序列。
產生內抑制素或者它地生物活性片段的另一種的方法是通過肽合成。一旦使用下面詳細描述的測定系統(tǒng)發(fā)現內抑制素生物活性片段，就可以通過，例如自動肽測序方法對它進行測序。另外，一旦通過，例如以上描述的方法分離出編碼內抑制素的基因或者DNA序列，就可以測定DNA序列，然后可以提供了有關氨基酸序列的信息。因此，如果通過特定的方法(例如胰蛋白酶消化)產生具有生物活性的片段，或者如果這種片段是N-末端序列，可以通過相應的DNA序列確定余下的氨基酸序列。
一旦了解了肽的氨基酸序列(例如N-末端的20個氨基酸)，可以通過本領域熟知的技術合成這個片段，例如通過E.Atherton和R.C.Sheppard在“固相肽合成一種切實可行的方法”(IRL出版社，牛津大學，英國)中的描述進行。同樣地，可以合成多個片段，這些片段最好連接到一起以便形成更大的片段。可以用在特定位置的氨基酸取代，進行這些肽片段的合成以便體外和體內檢測刺激和拮抗活性?？梢允褂门c組織具有高度親和性的肽片段在親和性柱上分離內抑制素受體。對于闡明內抑制素活性機理，內抑制素受體的分離和純化是根本步驟。這種方法有利于產生調節(jié)內抑制素受體活性的藥物，最終產生生物活性。這種受體的分離使得可以構建使用原位和溶液雜交技術監(jiān)測受體位置及合成的核苷酸探針。
內抑制素在治療血管生成介導的或與血管生成有關的疾病和過程中是有效的。本發(fā)明包括以有效的量的內抑制素或內抑制素興奮劑和拮抗劑治療血管生成介導的疾病的方法。血管生成介導的疾病包括(但不限于)固形腫瘤；血生性(blood born)腫瘤(如白血病)；腫瘤轉移；良性腫瘤(如血管瘤、神經瘤、神經纖維瘤、沙眼、生膿肉芽瘤)；風濕性關節(jié)炎；牛皮癬；眼睛血管生成疾病(例如糖尿病性視網膜病、早熟視網膜病、視網膜黃斑變性、角膜移植排斥、新血管性青光眼、特里氏綜合征、潮紅)；Osler-Webber綜合征；心肌血管生成；噬斑新血管生成；毛細管擴張；血友病性關節(jié)；血管纖維瘤和創(chuàng)傷肉芽。本發(fā)明的內皮細胞增殖抑制蛋白質在治療內皮細胞過量或反常刺激的疾病是有用的。這些疾病包括(但不限于)腸粘連、粥樣硬化、硬皮病和肥厚性疤痕(即瘢痕瘤)。通過抑制囊胚泡植入和胎盤、囊胚泡、胚、胎兒的發(fā)育所需的血管形成，內抑制素可以作為避孕劑。
內抑制素的合成肽片段具有多種功能。將與內抑制素受體以高度特異性和親合力結合的肽進行放射性標記，并可用于通過放射自顯影和膜結合技術顯現和定量結合位點。本申請?zhí)峁┝酥匾\斷和研究工具。內抑制素受體結合特性的知識有利于研究與受體相關的轉導機制。
此外，用短的活性同位素標記這些肽可以通過使用正電子發(fā)射斷層攝影術和其它現代放射自顯影技術體內顯示受體結合位點以便定位帶有內抑制素結合位點的腫瘤。
在這些合成的肽中進行氨基酸的系統(tǒng)取代產生與內抑制素受體具有高親和性的肽興奮劑和拮抗劑，它們可以促進或減弱內抑制素受體的結合。這些興奮劑可用來抑制小的轉移性腫瘤的生長，因此限制了癌癥的擴散。內抑制素的拮抗劑可以用于定位小量的血管形成以便抑制血管抑制素的抑制作用并可能促進血管生成。這種處理可能具有治療作用，促進糖尿病患者的創(chuàng)傷愈合。
內抑制素肽可以用于開發(fā)親和性柱以便從培養(yǎng)的腫瘤細胞分離內抑制素受體。內抑制素受體分離和純化后進行氨基酸測序。接下來合成核苷酸探針以便插入到表達此受體的載體中。這些技術對本領域技術人員來說是公知的。將這些內抑制素受體轉染到腫瘤細胞中能夠提高這些細胞對內源或外源內抑制素的反應，因此降低了轉移性腫瘤的生長速率。
細胞毒性劑(如蓖麻毒蛋白)與內抑制素和高親和性的內抑制素肽片段結合，因此能夠提供了破壞與內抑制素結合的細胞的工具?？梢栽谠S多位置發(fā)現這些細胞，這些位置包括(但不限于)小的轉移性腫瘤和初期腫瘤。以能夠將這些肽最大限度地輸送到所需位置的方式注入與細胞毒性劑結合的肽。例如，把與蓖麻毒蛋白結合的高親和性內抑制素片段通過插輸送到提供了靶位點的血管中或者直接輸送到靶上。也可以以可控的方式通過與注入插管結合的滲透泵輸送這些試劑?？梢詫纫种扑剞卓箘┖脱苌傻拇碳の锝M合使用來增加組織的血管形成。這種治療方法提供了一種破壞轉移性癌的有效手段。
按照本發(fā)明，內抑制素可以與其它治療疾病的組合物及方法組合使用。例如，腫瘤可以通過外科手術、放射或化療與內抑制素結合來進行常規(guī)治療，然后向患者施用內抑制素以便延長小的轉移性腫瘤的休眠并且穩(wěn)定任何剩余的初期腫瘤。
本發(fā)明的內抑制素也可以用來產生抑制劑特異的抗體。所說的抗體可以是多克隆抗體或者單克隆抗體。這些與所說的內抑制素特異結合的抗體可以用于本領域普通技術人員公知的檢測或定量體液或者組織中的內抑制素的診斷方法和試劑盒中。這些實驗的結果可以用于診斷或預測癌及其它血管生成介導的疾病的發(fā)生或者復發(fā)。
所說的內抑制素也可以用于檢測和定量能夠與內抑制素結合的抗體的診斷方法和試劑盒。這些試劑盒可以檢測循環(huán)的內抑制素抗體，這些抗體在原位上表明在初期腫瘤分泌的內抑制素存在下微轉移腫瘤的擴散，具有這種循環(huán)抗內抑制素抗體的患者很有可能發(fā)展成腫瘤和癌，并且在治療或消退期后癌很有可能復發(fā)。這些抗內抑制素抗體的Fab片段可以用作抗原以便產生抗內抑制素Fab-片段抗血清，這種抗血清可以用于抵消由抗內抑制素抗體除去的循環(huán)對內抑制素。
本發(fā)明的另一個方面是抑制過量內源內抑制素活性的方法。這可以通過由系統(tǒng)中不需要的內抑制素的特異抗體對人或動物進行被動免疫而完成。在治療反常排卵、月經和胎盤形成、血管發(fā)生方面這種處理是重要的。這種方法提供了一種有用的檢測轉移過程中內抑制素消除效果的工具。內抑制素抗體的Fab片段包含內抑制素的結合位點。使用本領域技術人員公知的技術從內抑制素抗體中分離此片段。內抑制素抗血清的Fab片段用作抗原以便產生抗Fab片段血清。注入抗內抑制素的Fab片段的抗血清能夠抑制內抑制素與內抑制素抗體的結合。通過阻止內抑制素與抗內抑制素的Fab片段結合而抵消內源抗內抑制素抗體，從而可以達到治療目的。這種治療的最終效果有利于增加內源循環(huán)內抑制素到達靶細胞的能力，因此減少了腫瘤的擴散。
應該理解本發(fā)明包括具有內皮抑制活性的內抑制素的任何衍生物。本發(fā)明包括完整的內抑制素蛋白質、所說的內抑制素蛋白的衍生物和內抑制素蛋白的生物活性片段。這些蛋白質包括具有內抑制素活性且發(fā)生氨基酸取代或包含與氨基酸功能基團結合的糖或者其它分子的蛋白質。本發(fā)明也包括編碼內抑制素和內抑制素受體的基因，和由這些基因表達的蛋白質。
可以在藥學上可接受的制劑(使用本領域普通技術人員公知的方法配制)中以分離的或實質上純化的蛋白質和蛋白質片段提供了上述具有內抑制素活性的蛋白質和蛋白質片段。可以將這些制劑通過標準途徑施用。一般來說，組合使用局部、經皮膚、腹膜內、顱內、腦室內、大腦內、陰道內、宮內、口服、直腸、或腸胃外(例如靜脈內、脊柱內、皮下或者肌內)途徑給藥。此外，內抑制素可以與生物降解聚合物組合使用，這種聚合物可以使內抑制素持續(xù)釋放，所說的聚合物植入到需要藥物運輸的附近(例如腫瘤位點)或者植入聚合物以便內抑制素在全身進行慢慢釋放。滲透微型泵也可以用來控制高濃度內抑制素，通過插管達到興趣位點的運輸，例如直接運輸到生長的轉移腫瘤內或向此腫瘤供血的血管中。例如，Brem等(神經外科雜志74441-446(1991))詳細描述了生物降解的聚合物和它們的用途，其全部內容本文一并參考。
本發(fā)明內抑制素的劑量取決于疾病狀態(tài)、或治療狀態(tài)、其它臨床因素(如人或動物體重和狀態(tài))和給藥途徑。對于治療人或動物，可以施用大約0.5mg/Kg-500mg/Kg的內抑制素。更優(yōu)選地范圍是1mg/Kg-100mg/Kg，最優(yōu)選的范圍是2mg/Kg-50mg/Kg。根據內抑制素在特定動物或人中的半衰期，可以一天幾次到一周一次施用所說的內抑制素。應該理解本發(fā)明的申請包括人和獸醫(yī)用途兩部分。本發(fā)明的方法考慮到單一或多種途徑給藥，這些給藥方法同時進行或在一段時間內。
所說的內抑制素制劑包括適于口服、直腸、眼睛(包括脈絡膜內或者眼房內)、鼻、局部(包括口腔和舌下)、宮內、陰道或胃腸外(包括皮下、腹膜內、肌內、靜脈內、真皮內、顱內、氣管內、硬膜外)給藥的內抑制素。所說的內抑制素制劑可以以方便的單位劑量的形式存在，并且可以通過常規(guī)的藥物技術制備。這些技術包括將活性成分與藥物載體或者賦形劑(可以有幾種)組合到一起的步驟。一般來說，通過將所說的活性成分與液體載體或充分分散的固體載體或者二者均一地且密切地組合到一起而制備所說的制劑，然后如果需要將產品作成一定的形狀。
適于腸胃外施用的制劑包括含水和不含水的無菌注射液(包括抗氧化劑、緩沖液、制菌劑和能夠使此制劑與將要治療的患者的血液達到等滲的溶質)；含水和不含水的無菌懸液(包含延緩劑和增厚劑)。此制劑可以存放在單位劑量或者多劑量的容器(如安瓿和藥水瓶)中，并貯存在冷凍干燥(凍干)條件下，在使用前加入無菌液體載體(如注射用水)?？梢詮纳衔拿枋龅臒o菌粉沫、顆粒劑和丸劑制備臨時使用的注射液和懸液。
如上所述優(yōu)選的單位劑量制劑是包含日使用劑量或單位(每次使用的劑量)的制劑，或者是施用成分的合適部分。應該理解除了上文特別提到的成分外，本發(fā)明的制劑可以包括其它的與討論的制劑類型有關的常規(guī)試劑。
可以合成完整的內抑制素分子的不同肽片段用于其它幾種用途，所說的用途包括但不限于作為產生特異抗血清的抗原；在內抑制素結合位點作為活性興奮劑和拮抗劑；作為與細胞毒性劑結合的肽，以便定向殺死與內抑制素結合的細胞。以這些肽在該分子外部區(qū)的位置為基礎選擇包含這些肽的氨基酸序列，這些氨基酸序列可以于抗血清結合。內抑制素的氨基與羧基末端分子的中部區(qū)分別存在于將要合成的片段中。內抑制素第20個氨基酸的氨基末端和羧基末端可以包含(或者通過調節(jié)使之包含)酪氨酸和賴氨酸殘基，并用許多技術標記所說的氨基末端和羧基末端。將酪氨酸或者賴氨酸加入到不含這些殘基的片段中，以便有利于此肽中反應氨基和羥基基團的標記。使用序列數據庫將這些肽序列于已知序列比較以便測定潛在的序列同源性。這些信息有利于除去與其它分子具有高度序列同源性的序列，因此在產生內抑制素的抗血清、興奮劑和拮抗劑時提高了高特異性的潛力。
可以用標準的微量化學設備，以HPLC和質譜檢測的純度合成肽。通常肽合成、HPLC純化和質譜方法對這些領域的技術人員是公知的。
也可以在下文描述的重組大腸桿菌、或者昆蟲或酵母表達系統(tǒng)中產生肽和內抑制素，并用柱層析進行純化。
可以使用標準方法將內抑制素和內抑制素衍生肽與其它分子結合。內抑制素的第20個氨基酸遠端和羧基末端都可以包含酪氨酸和賴氨酸殘基，并通過許多技術進行同位素和非同位素標記，例如使用常規(guī)技術進行放射性標記(酪氨酸殘基-氯胺T，生碘，乳過氧化物酶；賴氨酸殘基-Bolton-Hunter試劑)。這些結合技術對本領域技術人員是公知的。基于可以存在于氨基酸上的功能基團(氨基、巰基、羧基，酰胺、苯酚、咪唑)選擇所說的結合技術。其它的對這些結合有效的各種試劑包括戊二醛、重氮化聯苯胺、碳二亞胺和對苯醌。
將內抑制素肽與同位素、酶、載體蛋白質、細胞毒性劑、熒光分子和其它具有多種用途的化合物通過化學方法結合。通過使用特定反應的合適的技術測定結合反應的有效性。例如，通過使用氯胺T和高特異性活性的Na125I用125I對內抑制素肽或者蛋白質進行放射性標記。用偏亞硫酸氫鈉終止反應，在一次性柱上對混合物脫鹽。從柱中洗脫標記的肽，并收集組分。從每個組分中取出等分試樣，在γ計數器中測量放射活性。在這種情況下，從標記的內抑制素肽中分離未反應的Na125I。貯存具有最高特異放射活性的肽組分，以便使用(例如用于結合內抑制素抗血清的能力的分析)。
肽綴合物的另一個的應用是產生多克隆抗血清。例如，使用戊二醛將包含賴氨酸殘基的內抑制素肽連接到純化的牛血清白蛋白上。通過測量加入的放射性標記肽來確定此反應的效率。通過透析分離未反應的戊二醛和肽。貯存綴合物以便使用。
可以產生抗內抑制素的抗血清。在合成和純化肽之后，使用本領域技術人員公知的現有技術培養(yǎng)單克隆和多克隆抗血清。例如，可以在兔、山羊、綿羊或者其它動物上培養(yǎng)多克隆抗血清。將連接到載體分子(例如牛血清白蛋白或者內抑制素本身)上的內抑制素肽與佐劑混合物結合，將其乳化，并在多個部位(背、頸、脅腹、有時可以在腳趾(footpads)上)進行皮下注射。在一定的間隔內進行加強注射，例如每2-4周注射一次。在每次注射后大約7-10天通過靜脈穿刺術獲得血液樣品(例如在擴張后，由耳邊緣靜脈獲得血液樣品)。4℃下使血液樣品過夜凝塊，并且4℃下在大約2400Xg下離心30分鐘。除去血清，將樣品分成等分試樣，如立即使用則貯存在4℃；如用于以后分析則貯存在-20℃至-90℃。
對多克隆抗血清產生的所有血清樣品或者單克隆抗血清產生的培養(yǎng)基樣品進行滴度測定分析。通過幾種方法(例如點印跡和密度分析)進行滴度測定，也可以使用蛋白質A、次級抗血清、冷乙醇或者炭-葡聚糖沉淀放射標記的肽-抗體復合物，然后用微克計數器測量活性。在市售的親和性柱上純化最高滴度的抗血清。在親和性柱上將內抑制素肽于凝膠結合。將抗血清樣品通過柱，抗內抑制素抗體仍然與柱結合。然后洗脫、收集這些抗體，并且評價滴度測定和特異性測定。
檢驗最高滴度的內抑制素抗血清以便確定下列各項a)與所說的抗原具有最高特異性結合和最低非特異性結合的最佳抗血清稀釋度，b)在標準位移曲線中與數量不斷增加的內抑制素肽結合的能力，c)與有關的肽和蛋白質(包括相關種類的內抑制素)潛在的交叉反應，d)檢測血漿、尿、組織和細胞培養(yǎng)基提取物的內抑制素肽的能力。
測量內抑制素的試劑盒也是本發(fā)明的一部分。還檢測了具有最高滴度、特異性和能夠檢測血漿、尿、組織和細胞培養(yǎng)基提取物的內抑制素肽的抗血清，以建立容易使用的、快速、可靠、靈敏和特異地測量和定位血管抑制素的試劑盒。這些測定試劑盒包括但不限于下面的技術競爭性和非競爭性分析、放射免疫分析、生物發(fā)光和化學發(fā)光分析、熒光分析、夾層分析、免疫放射分析、點印跡、酶聯分析(包括ELISA)、微量滴定板、抗體包衣的帶或者用于快速檢測尿或血液的量油計、免疫細胞化學。對于每種試劑盒，都確定了分析范圍、敏感性、精確度、可靠性、特異性和重復性。在標準的位移或化學曲線中以20％、50％和80％點確定了分析內和分析間的變量。
通常在研究和臨床中使用的測定試劑盒的一個例子是放射免疫測定(RLA)試劑盒。下文具體描述了內抑制素RIA。在對內抑制素或者內抑制素肽進行成功放射性碘化和純化后，將最高滴度的抗血清以不同的稀釋濃度加入到于合適的緩沖系統(tǒng)中包含相對連續(xù)量的放射性(如10,000cpm)的試管中。其它的試管包含緩沖液或預免疫的血清以便測定非特異性結合。4℃下溫育24小時后，加入蛋白質A，將試管進行渦旋，室溫下溫育90分鐘，4℃下在大約2000-2500Xg離心以便沉淀于標記的抗原結合的抗體復合物。通過抽吸除去上清液，并在γ計數器上計算沉淀中的放射性。減去非特異性結合后，進一步確定與大約10-40％標記的肽結合的抗血清稀釋濃度。
接下來，通過向包含放射性標記肽和抗血清的試管中加入已知量的所說的肽來評價用于產生抗血清的內抑制素肽的稀釋范圍(大約0.1pg-10ng)。另外培養(yǎng)一段時間(24-48小時)后，加入蛋白質A，將試管離心，除去上清液，并計算沉淀中的放射性。放射標記的內抑制素肽的結合與未標記的內抑制素肽(標準)的位移給出標準曲線。將幾種不同濃度的其它內抑制素肽片段、纖溶酶原、其它物種的內抑制素、和同源肽加入到分析試管中以便確定內抑制素抗血清的特異性。
使用已經成功地用于提取內抑制素的提取技術制備各種組織的提取物，所說的組織包括(但不限于)原始和次級腫瘤、路易士肺癌、產生內抑制素的細胞培養(yǎng)物、胎盤、子宮和其它組織(如腦、肝和腸)。將組織提取物進行凍干或者快速真空干燥加入分析緩沖液，并將不同的等分試樣加入到RIA管中，已知產生內抑制素細胞的提取物產生了與標準曲線平行的位移曲線，而不產生內抑制素的組織提取物沒有從內抑制素抗血清轉移放射標記的內抑制素。此外，將患有路易士肺癌動物的尿、血漿和腦脊液提取物以不斷增加的量加入到分析試管中。平行位移曲線表明可以利用內抑制素測定來測量組織和體液中的內抑制素。
通過將等分試樣進行反相HPLC分析，來另外定性包含內抑制素的組織提取物。收集洗脫的組分，在快速真空干燥中干燥，在RIA緩沖液中重建，并用內抑制素RIA進行分析。在相當于內抑制素洗脫位置的組分中，確定了最大量的內抑制素免疫反應性。
測定試劑盒提供了包括說明、抗血清內抑制素或者內抑制素肽、用于沉淀結合的內抑制素-內抑制素抗體復合物的可能進行放射性標記的內抑制素和/或試劑。此試劑盒對于測量患有和未患有腫瘤的動物和人的生物液體和組織提取物中的內抑制素是有用的。
另一種試劑盒用于定位組織和細胞中的血管抑制素，這種內抑制素免疫組織化學試劑盒包括說明書、內抑制素抗血清、可能的封阻血清、與熒光分子(如熒光素異硫氰酸鹽)或一些其它用于顯示一級抗血清的試劑結合的次級抗血清。免疫組織化學技術對本領域技術人員是公知的。這種內抑制素免疫組織化學試劑盒使得可以使用光學和電子顯微鏡都可以定位組織切片和培養(yǎng)的細胞中的內抑制素。這種試劑盒可以用于研究和臨床目的。例如，對腫瘤進行活組織檢查或者收集，用切片機獲得組織切片以便檢查內抑制素的產生位點。在檢測和治療癌癥時，這些信息對診斷是有用的，對治療也可能是有用的。
另外，下列實施例具體說明了本發(fā)明，這些實施例決不是用來限制本發(fā)明的范圍。相反，很清楚可以采取這些實施例的其它的實施方案、改進的方案和等同的方案，在閱讀完此說明書后，本領域技術人員將明白這些變化沒有離開本發(fā)明的宗旨和/或所附權利要求的范圍。
實施例1來源于血管內皮瘤細胞的毛細管內皮細胞增殖抑制劑的鑒定評價了鼠血管內皮瘤細胞系EOMA(0beso等，1990)產生內皮細胞增殖抑制劑的情況。許多已知內源的血管生成抑制劑在體外抑制內皮細胞的增殖。
條件培養(yǎng)基的收集37℃下于10％CO2的培養(yǎng)箱中將鼠血管內皮瘤細胞系EOMA的細胞保存在添加了10％牛血清(BCS)和1％谷氨酰胺-青霉素-鏈霉素(GPS)的DMEM中。將EOMA細胞的條件培養(yǎng)基(即生長EOMA細胞的培養(yǎng)基)加入到牛毛細管內皮細胞中，并用bFGF刺激，進行72小時的增殖測定。和對照相比，條件培養(yǎng)基可逆地抑制毛細管內皮細胞的增殖。抑制作用的模式與內皮細胞增殖抑制和刺激活性的存在一致(圖1)。
實施例2內皮細胞增殖抑制活性與血管抑制素無關為了測定由EOMA細胞產生的毛細管內皮細胞增殖抑制劑是否是血管抑制素，把混合的條件培養(yǎng)基加入到賴氨酸柱(與瓊脂糖凝膠TM結合的層析珠上的賴氨酸)中。賴氨酸瓊脂糖凝膠和血管抑制素結合，并用于它的純化(O’Reilly等，1996)。只在流出物組分中發(fā)現內皮細胞抑制活性，而在結合的組分中尚未發(fā)現(數據未列出)。結合賴氨酸瓊脂糖凝膠的抑制活性的缺乏表明新的內皮細胞增殖抑制劑不是血管抑制素。
實施例3來源于EOMA細胞條件培養(yǎng)基的特異地抑制內皮細胞增殖的20kDa蛋白質的純化由于一些血管生成抑制劑具有與肝素的親和性，我們將賴氨酸瓊脂糖凝膠柱的流出物加入到肝素瓊脂糖凝膠柱中，抑制活性物以相對高的親和性和肝素結合，然后用溶解在10mM Tris(pH7.4)中的0.6-0.8M NaCl洗脫(如圖2所示)。為了進一步純化抑制活性物，將樣品濃縮，并加入到凝膠過濾(Bio-Rad Bio-Gel P-100精制凝膠或Pharmacia聚丙烯酰胺葡聚糖S-200HR凝膠)柱中(見圖3)，然后用C4柱進行幾次循環(huán)的反相HPLC。用溶解在0.1％三氟乙酸中的40-45％乙腈從C4柱中洗脫抑制活性物(如圖4所示)。在經過最后的C4柱后，所說的抑制活性物和分子量大約為18kDa(非還原)-20kDa(還原)的蛋白質(通過SDS-PAGE純化至表觀均一性)相結合。
在實施例2和3中的賴氨酸瓊脂糖凝膠、肝素瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺葡聚糖S-200HR凝膠(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、Bio-GelP-100精制聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Rad實驗室，Richmond，CA)和SynChropak RP-4(100x4.6mm)C4反相柱(Synchrom公司，Lafayette，IN)是按照廠商推薦的方法制備的。用50mM NaCl 10mM Tris-HCl(pH7.4)平衡肝素-瓊脂糖凝膠柱(50X2.5cm)。將混合的條件培養(yǎng)基加入到柱中，并用平衡緩沖液洗滌此柱。用溶解在10mM Tris-HCl(pH7.4)中的連續(xù)梯度50mM-2M NaCl(總體積為200ml)洗脫此柱，然后用溶解在10mM Tris-HCl(pH7.4)中的100ml 2M NaCl洗脫。收集組分，并將每一個等份試樣加入到毛細管內皮細胞中。將抑制毛細管內皮細胞增殖的組分用PBS透析(MWCO＝6,000-8,000)，并且用4000 MWCO Nanospin濃縮器濃縮(Gelman科學，Ann Arbor，Mi)。
用PBS平衡Bio-Gel P-100柱和聚丙烯酰胺葡聚糖SR-200 HR柱(75X1.5cm)。將來源于肝素瓊脂糖凝膠層析柱的樣品加入到柱中，并且用平衡緩沖液洗脫此柱。收集組分，并將每一個等份試樣加入到毛細管內皮細胞中。按照以上的方法將抑制毛細管內皮細胞增殖的組分進行濃縮和透析。
用水/0.1％三氟乙酸(TFA)平衡SynChropak RPG(100X4.6mm)柱。使用HPLC-等級試劑(Pierce，Rockford，IL)。將凝膠過濾層析的樣品加入到柱中，將此柱用1％TFA的乙腈梯度溶液以0.5ml/分鐘洗脫并收集組分。將每個等份試樣通過真空離心蒸發(fā)，并且懸浮在PBS中，然后加入到毛細管內皮細胞中。SynChropak C4柱上通過至少兩次連續(xù)循環(huán)來純化抑制活性物以達到表觀均一。
為了進一步鑒定20kDa的抑制劑，我們在一些內皮和非內皮起源的細胞系中進行檢驗。在BCE測定中，得到了牛毛細管內皮細胞，并如以前所述的方法(Folknan等，1979)進行培養(yǎng)。在增殖測定中，用PBS洗滌細胞，并將細胞分散在0.05％的胰蛋白酶溶液中。用DMEM+10％BCS+1％GPS制備細胞懸液(25000細胞/ml)，然后加入到在明膠化的24孔培養(yǎng)皿(0.5mewed)并培養(yǎng)24小時(37℃，10％CO2)。用0.25ml的DMEM+5％BCS+1％GPS代替原來的培養(yǎng)基并加入檢驗樣品。在培養(yǎng)20分鐘后，加入培養(yǎng)基和bFGF以使最終體積為0.5ml的DMEM+5％BCS+1％GPS+1ng/ml bFGF。在72小時后，將細胞分散在胰蛋白中，然后懸浮在Hematall(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)中，并通過Coulter計數器計數。
非內皮細胞增殖測定在37℃下，將牛主動脈平滑肌(SMC)、牛視黃醛色素上皮(RPE)、貂肺上皮(MLE)、路易士肺癌(LLC)、EOMA細胞和3T3成纖維細胞保存在10％CO2的培養(yǎng)箱中。為了進行增殖測定，用PBS洗滌，并將細胞分散在0.05％的胰蛋白酶溶液中。對于每一種不同的細胞類型建立了細胞增殖測定的最佳條件。將胎牛血清(FCS)用于RPE、MLE和LLC細胞，將BCS用于其它類型的細胞。用DMEM+10％牛血清+1％GPS制成細胞懸液(SMC、RPE、MLE為20,000細胞/ml；3T3為15,000細胞/ml；LLC和EOMA為10,000細胞/ml)，并且加入到在24孔的培養(yǎng)皿(0.5m/孔)上，然后培養(yǎng)24小時(37℃，10％CO2)。用0.5ml的DMEM+5％牛血清+1％GPS代替原來的培養(yǎng)基并加入檢驗的樣品。在72小時后，將細胞分散在胰蛋白中，然后懸浮在Hematall(FisherScientific，Pittsburgh，PA)中，并通過Coulter計數器計數。
如表2所示，只有內皮細胞被明顯地抑制了。
表2內抑制素對內皮和非內皮細胞增殖的作用

在劑量為100ng/ml時首先觀察到了抑制作用；在劑量為600ng/ml或者更大時觀察到了最大抑制作用。對于非內皮起源的細胞，在所使用的劑量(1 log單位)高于抑制毛細管內皮細胞增殖所使用的劑量時，仍沒有觀察到明顯的抑制作用(數據未列出)。
實施例420kDa蛋白質的微量測序分析表明與膠原XVIII的片段具有同源性如以上實施例所述，將來源于條件培養(yǎng)基的20kDa毛細管內皮細胞增殖的抑制劑純化至均一。經SDS-PAGE分離，并電印跡到PVDF(Bio-Rad，Richmond，CA)上，然后通過Ponceau S染色檢測，將其從膜中切除。通過氣相三氟乙酸的輸送來操作PE/ABD Model 470A蛋白質測序儀(Foster City，CA)將自動Edman降解來確定N-末端序列。
與組合的GenBank、Brookhaven蛋白質、SWISS-PROT和PIR數據庫進行序列文庫研究和比較。研究是在國家生物技術信息中心通過使用Blast網絡進行的。
20kDa蛋白質的微量測序分析表明與膠原XVIII的片段具有同源性。分子克隆和膠原XVIII的序列最早是由Olsen和他的同事以及Rehn和Pihlajaniemi(Oh等，1994；Rehn和Pihlajaniemi，1994)描述的。膠原XVIII是由具有3個剪接變體(Muragaki等，1995；Rehn和Pihlajaniemi，1995)、一系列具有中斷的類似膠原的區(qū)域、35 kDa C-末端非膠原(NCL)區(qū)域構成的新型膠原。經純化的內皮細胞增殖抑制劑的18個氨基酸的N-末端微量測序分析確認了所說的抑制劑和這個NC1區(qū)C-末端片段具有同一性(圖5)。我們將此膠原XVIII命名為＂內抑制素＂，并且此片段包含在具有內抑制素活性的分子集合中。
實施例5重組鼠內抑制素(桿狀病毒或者大腸桿菌)體外抑制內皮細胞增殖和體內抑制血管生成可以在任何用來表達蛋白質的系統(tǒng)中重組表達本發(fā)明的內皮細胞增殖抑制劑。這樣的表達系統(tǒng)的非限制例子包括細菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)和昆蟲病毒表達系統(tǒng)。
使用BacPAK桿狀病毒表達系統(tǒng)(CLONTECH實驗室)按照廠商的方案表達重組鼠內抑制素。簡言之，把編碼信號序列和小鼠膠原XVIII的C-末端部分(內抑制素區(qū))的cDNA片段插入到pBacPAK8轉移載體中。然后將BacPAK6病毒的DNA(表達載體)和pBacPAK8內抑制素克隆的質粒DNA(改良的轉移載體)共轉染到昆蟲Sf21細胞中，并收集包含表達的鼠內抑制素的培養(yǎng)基。首先用BSU36酶消化BacPAK6以使它不能獨立復制。將包含表達的小鼠內抑制素培養(yǎng)基加入到用50mM NaCl的10mMTris(pH7.4)溶液平衡的1.5×40cm肝素瓊脂糖凝膠柱中。用平衡緩沖液洗滌此柱，然后依次用0.2M NaCl、0.4M NaCl、0.6M NaCl和1M NaCl的10mM Tris(pH7.4)溶液洗脫。所有的層析都是在4℃下進行的。用PBS將0.6M NaCl洗脫物(在72小時增殖測定中，其抑制牛毛細管內皮細胞)透析(6-8000 MWCO)，然后再加入到肝素瓊脂糖凝膠柱中。用溶解在10mM Tris(pH7.4)中的50mM NaCl-1.2M NaCl的梯度洗脫此柱。如上所述將每個組分的等份試樣加入到牛毛細管內皮細胞中，收集抑制毛細管內皮細胞增殖的組分，用PBS透析，并用NanospinPlus(Gelman科學)離心濃縮器(MWCO＝10,000)濃縮。濃縮樣品的SDS-PAGE表明20kDa的表觀Mγ為不連續(xù)帶。
大腸桿菌的重組鼠內抑制素的表達和純化將膠原XVIII的cDNA的C-末端部分用來擴增已克隆到pETKH1載體(pET11d的衍生物)(Studier等，1990)上的鼠內抑制素的cDNA。通過誘導產生了攜帶氨基酸序列MARRASVGTD(RRAS-蛋白激酶A識別序列)和在N-末端有6個組氨酸殘基的融合蛋白，然后產生了鼠內抑制素序列(pTB01#8)。將pTB01#8質粒轉化到BL21DE3中，并如QiaExpressionist手冊(Qiagen)所述在Ni2+-NTA-珠上純化融合蛋白。簡言之，將大腸桿菌培養(yǎng)到OD600值為0.8-0.9，然后用1mM IPTG誘導3小時以表達所說的融合蛋白。將細菌沉淀并懸浮在包含10mM咪唑的8M尿素、10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液中，并在室溫下培養(yǎng)1小時。在20,000g下將懸液離心15分鐘，然后在室溫下將上清液與Ni2+-NTA-珠溫育1小時。將懸液轉移到柱中，并用10mM咪唑的8M尿素、0.1M磷酸鈉、10mM Tris-HCl(pH6.25)溶液洗滌此柱。用包含250mM咪唑的同一緩沖液洗脫此柱。另外用PBS透析包含內抑制素的組分。在透析期間內抑制素發(fā)生沉淀。將沉淀的內抑制素懸浮在PBS中，并將蛋白質濃度調整到2-4mg/ml，使用前將內抑制素貯存在-20℃。將用于小鼠研究的內抑制素轉化為懸液(在PBS中)。為了進行雞絨毛尿囊膜測定，將內抑制素用水進一步透析，然后凍干。
在桿狀病毒和大腸桿菌表達系統(tǒng)中產生重組鼠內抑制素。使用順序肝素瓊脂糖凝膠層析在昆蟲細胞培養(yǎng)基中把重組鼠內抑制素純化至表觀均一性。使用Ni2+NTA瓊脂糖純化源于大腸桿菌的鼠內抑制素。
SDS-PAGE顯示出分別來源于桿狀病毒和大腸桿菌的大約20kD或大約22kDa(還原凝膠測定的)的純化至表觀均一的重組內抑制素的不連續(xù)的帶(數據未列出)。在使用前用PBS將二者透析。透析后把來源于大腸桿菌系統(tǒng)的物質沉淀，并轉化為懸液以用于以后的體內研究。來源于桿狀病毒的重組內抑制素特異地抑制牛毛細管內皮細胞的增殖(使用量取決于所用的方式)。在100ng/ml的劑量時，觀察到有抑制作用發(fā)生，劑量超過600ng/ml發(fā)生最大的抑制作用。對于非內皮起源的細胞或EOMA細胞，當試驗的內抑制素劑量(1 log單位)高于抑制內皮細胞增殖所使用的劑量時，仍沒有觀察到明顯的增殖抑制作用。
不能在體外檢測沉淀的物質(未折疊形式)，因為這種物質不能溶解。然而，在透析期間有少量的這種物質能溶于PBS中，可將這些組分用于內皮細胞測定。此外，在重新折疊后所說的物質是可溶性的，并且能夠抑制內皮細胞增殖(數據未列出)。當將這種可溶的物質加入到內皮細胞時，發(fā)現這種物質在相當于天然的和來源于桿狀病毒的內抑制素的濃度時都具有抑制作用。
為了檢驗重組鼠內抑制素在體內抑制血管生成的能力，我們使用了雞絨毛尿囊膜(CAM)測定(Folkman，1985；Nguyen等，1994，本文一并參考)。簡言之，把三天大的受精白來亨雞雞卵(Spafas，Norwich，CT)打碎，把具有完整蛋黃的胚放置在100×20mM的培養(yǎng)皿(Follanan，1985)中。培養(yǎng)(37℃和3％CO2)3天后，將一塊包含內抑制素的甲基纖維素(Fisher Scientific，Fair Lawn，N.J.)加入到單個胚的CAM上。此塊甲基纖維素是在特氟隆棒上將內抑制素在10μl的0.45％的甲基纖維素(在水中)中干燥制成的。培養(yǎng)48小時后，通過立體顯微鏡觀察胚和CAM。
用10-20μg/10μl劑量的圓盤，在所有檢驗的CAM(n＝5/組)中，來源于桿狀病毒和大腸桿菌的內抑制素在體內對血管生成具有較強的抑制作用。來源于大腸桿菌的沉淀物溶解5天以上，對接種的CAM產生連續(xù)的抗血管生成作用。而來源于桿狀病毒的可溶的內抑制素在24小時之內溶解，并在48小時之內表現出最大的抗血管生成作用。在所檢驗的任一個雞胚中都沒有發(fā)現毒性。
使用相同的方式重組產生了人內抑制素。
實施例6重組小鼠內抑制素抑制轉移性腫瘤的生長因為腫瘤的生長依賴于血管生成，我們使用桿狀病毒系統(tǒng)中表達的重組小鼠內抑制素來對路易士肺癌轉移性腫瘤進行全身性治療。將具有600-1200mm3的路易士肺癌的動物殺死后，用betadine和乙醇清洗帶有腫瘤的皮膚。在層狀通風櫥中，在無菌條件下切除腫瘤組織。使用篩，然后使用一些小的直徑為22-30規(guī)格(gauge)的皮下注射針頭通過活腫瘤細胞來制備0.9％的生理鹽水的腫瘤細胞懸液。將最終濃度調節(jié)到1X107細胞/ml，并將懸液置于冰上。在將鼠背用乙醇清洗后，在鼠背接近中線處皮下注射1X106細胞(溶于0.1ml的鹽水中)。
在接種大約14天后，腫瘤達到1500mm3時，對小鼠進行手術以切除腫瘤。用簡單的中斷縫線縫合切口。從手術開始的那天起，將小鼠每天腹膜內注射重組(由桿狀病毒系統(tǒng)產生)鼠內抑制素或鹽水。通過皮下給小鼠每天注射(0.3mg/kg/天)一次內抑制素。當對照小鼠因轉移性腫瘤而發(fā)病(即在處理13天后)，將所有的小鼠殺死，并進行尸體解剖。通過立體顯微鏡(4x)計算肺表面轉移性腫瘤的大小。
通過以0.3mg/kg/天的劑量由皮下全身施用內抑制素幾乎完全抑制了路易士肺癌轉移性腫瘤的生長(7±3轉移性腫瘤/鼠，n＝4，p＜0.001)。而用鹽水處理的小鼠在切除路易士肺癌初期腫瘤后，肺轉移性腫瘤生長迅速(77±7轉移性腫瘤/鼠)。用內抑制素處理的小鼠的肺臟重量(這反映了腫瘤量)240±25mg，而對照小鼠的肺臟重量760±30mg(p＜0.001)。此外，用內抑制素處理的小鼠中沒有一個體重減少或表現出毒性。
實施例7重組鼠內抑制素抑制初期腫瘤的生長由桿狀病毒系統(tǒng)產生的內抑制素的量(1-2mg/升)比由大腸桿菌系統(tǒng)產生的量(30-40mg/升)低。因此我們使用來源于大腸桿菌的內抑制素來研究內抑制素對初期腫瘤生長的效應。我們由大腸桿菌產生了足夠量的重組鼠內抑制素來治療路易士肺癌初期腫瘤。以沉淀的純化蛋白質的懸液的形式將內抑制素施用到患有至少100-200mm3路易士肺癌腫瘤的小鼠。通過常規(guī)的方法純化所說的蛋白質，但是在將其施用給小鼠前沒有進行再折疊。注射到體內的沉淀物緩慢地吸收需要24-48小時以上。
對于在動物中使用未折疊的重組蛋白來進行持續(xù)釋放的方法的注射部位，我們無先例可尋。然而，內抑制素在體內是被逐漸吸收的，并已經證明其具有較強的抗血管生成活性，延長了內抑制素抗腫瘤和抗血管生成的活性。因此，這些實據表明了一種控制釋放重組蛋白的新的普通方法?；谶@些原理，我們同樣成功地施用了來源于大腸桿菌的未折疊重組內抑制素。
因此，本發(fā)明的一方面是以未折疊的形式施用重組內抑制素或者內抑制素類似物，以便提供內皮細胞增殖抑制蛋白質持續(xù)釋放的部位，依據患者和要治療的疾病不同，釋放時間至少8小時以上，優(yōu)選的至少12小時，更優(yōu)選的至少24小時或至少48小時。也可以以同樣的方式施用未折疊的重組血管抑制素，以便提供能持續(xù)釋放蛋白質的部位，依據患者和要治療的疾病不同，使血管抑制素蛋白質釋放時間至少8小時以上，優(yōu)選的至少12小時，更優(yōu)選的至少24小時或至少48小時。
使用雙卡尺測量如上所述的用路易士肺癌接種小鼠的腫瘤，使用公式寬度2X長度X0.52來計算腫瘤的體積，測量了最后測量點處理和對照腫瘤比(T/C)。在3-7天內，在腫瘤達到100-200mm3(體重的0.5-1％)后，把小鼠隨機分成兩組。一組以懸液(在PBS中)的形式在非腫瘤部位每天一次皮下注射重組鼠內抑制素(來源于大腸桿菌)。另一組小鼠作為對照只注射載體。當對照小鼠開始死亡時停止實驗，并殺死小鼠進行尸體解剖。
通過使用內抑制素的全身治療有效地抑制了路易士肺癌初期腫瘤的生長。增加內抑制素的劑量后效果也隨之提高(數據未列出)。和只用載體的對照小鼠相比，在10mg/kg的劑量時對腫瘤生長的抑制達97％。在2個獨立的實驗中，以20mg/kg的劑量每日施用一次時，幾乎全部已有的初期腫瘤都消退了(抑制達99％，P＜0.001)。這些驚奇和意想不到的結果列于圖6和7。
圖8、9、10和11表明重組鼠內抑制素對各種不同的腫瘤生長抑制的效果。也顯示來源于人的內抑制素抑制腫瘤生長的作用。
殘余的少量腫瘤的免疫組織化學分析(圖12)表明在內抑制素處理的腫瘤中，血管生成受到了較強的抑制。此外，兩個組中用內抑制素和鹽水處理的小鼠，其腫瘤增殖指數都處于同樣的水平，而用內抑制素處理后編程性細胞死亡指數增加了8倍。因此，內抑制素治療與以前我們描述(Holmgren等，1995；O′Reilly等，1996)的血管抑制素產生了相似的腫瘤休眠模式。而且，在任一個治療的小鼠中沒有表現出與藥物相關的毒性。
在中斷內抑制素治療后，5-14天內在初期腫瘤的位置上又產生了腫瘤，血管形成并最后使小鼠致死(數據未列出)。值得注意的是來源于大腸桿菌的具有C-末端多組氨酸尾的重組鼠內抑制素(和如上所述的N-末端尾產物相似的方式表達、純化和使用)在CAM測定中不能抑制血管生成，對路易士肺癌的生長沒有作用(數據未列出)。這些數據明顯表明重組內抑制素的抗腫瘤和抗血管生成活性是由于內抑制素的特異結構而不是由于樣品中的雜質所致。
圖13顯示用源于大腸桿菌的重組鼠內抑制素循環(huán)治療路易士肺癌的結果。這些結果清楚地表明繼發(fā)性的依賴于內抑制素消退的腫瘤量，在停止內抑制素治療后腫瘤繼續(xù)生長。
這些結果表明鼠血管內皮瘤在體外產生一種新的特異性的20kDa的內皮細胞增殖抑制劑，這種抑制劑是體內血管生成和腫瘤生長的強烈抑制劑。內抑制素這種抑制劑的N-末端序列和膠原XVIII的C-末端片段具有同一性。全身施用重組內抑制素能夠較強地抑制血管生成、控制轉移腫瘤(在顯微鏡水平上)以及使初期腫瘤的消退到小于1mm3(減少到原來的150多倍)。只要是用內抑制素治療的小鼠，它的腫瘤就沒有再生長，也沒有表現出抗藥性和毒性。令人感興趣的是比內抑制素長的XVIII型膠原的C-末端區(qū)域的一些片段不能抑制細胞增殖(數據未列出)。
通過使用與發(fā)現血管抑制素(0′Reilly等，1994)的相同方案發(fā)現了內抑制素，即從腫瘤分離得到。因為腫瘤應該是血管生成抑制劑的來源的說法是反直觀的，本文所報道的結果看起來證實了這種方法。
這就會使人們提出為什么血管生成抑制劑應該存在于血管生成的腫瘤中，一種可能性是抑制劑在通過腫瘤細胞打開血管生成表型的開關而產生負調節(jié)后可能會“過剩”。這似乎與Li-Fraumeni細胞(細胞中第二等位基因p53發(fā)生突變或缺失(Dameron等，1994))產生的血小板反應蛋白的情況相同。
第二種可能性是和腫瘤生長相伴隨的分解蛋白活性物，這種物質是毛細血管生長的重要組分，也可以由前體物(并不是抑制物本身)蛋白固定循環(huán)血管生成抑制劑。例如，血管抑制素抑制血管生成和內皮細胞增殖，而纖溶酶原卻不能(O’Reilly等，1996；O’Reilly等，1994)。內抑制素也表現出相同的模式。
在用內抑制素治療后消退的腫瘤的組織學結構表現出腫瘤細胞的周圍血管成套，腫瘤細胞周圍的一個或多個微血管的血管生成受到了抑制。腫瘤細胞由于高編程性細胞死亡抵消了高增殖性，最終腫瘤大小沒有增加。這些數據和最近提出(Holmgren等，1995)的新型腫瘤休眠的方式相同。此外，內抑制素在體外抑制內皮細胞增殖，但對路易士肺癌細胞或其它細胞類型(包括平滑肌、上皮、成纖維細胞、由EOMA純化的EOMA細胞系)沒有作用。
內皮細胞增殖的特異性抑制劑可以將腫瘤消退至顯微鏡水平，并能抑制腫瘤使之處于休眠狀態(tài)(盡管腫瘤細胞從開始就對抑制劑予以抵抗)，這種情況表明內皮細胞可以進行強有力的生長調節(jié)控制而戰(zhàn)勝腫瘤細胞。
內抑制素的檢驗結果支持了用于治療目的的理論(Folkman，1996)，根據兩個明顯的細胞群考慮腫瘤是富有成效的腫瘤細胞群和內皮細胞群，其中每一種都可以刺激其它的細胞生長。每一種細胞群的生長都可以首先受到選擇性或特異性針對某一細胞類型的試劑的抑制，即細胞毒性化療和抗血管生成療法。此外，將兩種細胞群組合在一起進行治療可以比只用一種細胞群單獨治療效果好。
為了檢驗這一理論，把用路易士肺癌細胞接種并且腫瘤長至大約300mm3大小的小鼠用血管抑制素和內抑制素組合治療25天，每個劑量均為20mg/kg/天。通過大約10天的治療腫瘤消退至顯微鏡水平。即使所有的治療都停止，完全意想不到的結果是腫瘤保持消退和休眠大約三個月(如圖4所示)。持續(xù)時間更長的實驗表明將血管抑制素和內抑制素組合在一起進行的的初始治療產生了一個時間較長的休眠，此時，實際的休眠時間還不知道。
本領域技術人員認為這樣長的休眠期即為治愈。例如，確定治愈癌癥的治療是有效的NIH指標為腫瘤保持休眠(例如在大小上不增加)的時間為正常增殖一倍所需時間的10倍。使用血管抑制素和內抑制素的組合治療達到的休眠時間遠遠超過這個標準。
因此，本發(fā)明的一個重要的方面是提供了一種包含組合在一起的血管抑制素和內抑制素(或內抑制素類似物)的組合物，將所說的組合物以足以產生依賴于血管生成的癌的長時間休眠或治愈的量施用給患有依賴于血管生成癌的患者，使用可以是全身性的，例如注射，病例中使用的劑量取決于患者和具體的癌，但是一般至少為0.2mg/kg/天，優(yōu)選的至少2.0mg/kg/天，更優(yōu)選的至少20mg/kg/天。一般地，如果每天施用組合物，至少需要施用10天，優(yōu)選的為至少20天，更優(yōu)選的為至少25天。另外可以選擇的全身治療方法包括口服(其中將組合物制備成，例如包衣的藥丸以保護蛋白質防止其在消化性的環(huán)境中失活)、經皮膚和經泵施用。
另外，如果對依賴于血管生成的部位(例如腫瘤)局部施用組合物，可以使用不同的劑量和治療期。這種施用方法可以是在，例如在腫瘤附近手術植入或者局部注射。
實施例8內抑制素的推定的受體的分離內抑制素和血管抑制素可以認為是內皮細胞增殖的特異性地抑制劑。因此，內抑制素很可能和在內皮細胞表面專門表達的特定結構結合。我們對于是否存任何其它的內皮細胞增殖的的抑制劑還不了解。
通過本領域公知的方法來確定和分離特異結合內抑制素的蛋白質，例如親和層析和表達克隆。
親和層析.用[35S]-甲硫氨酸放射標記牛毛細管內皮細胞(BCE)來制備總細胞和膜的提取物，并且加入到用內抑制素制備的親和柱中。以相同的方式分離成纖維細胞蛋白提取物作為陰性對照。使用NaCl梯度從柱中洗脫結合蛋白，并使用標準的SDS-PAGE和放射自顯影術分析不同的組分。這種方法產生了緊密結合到內抑制素柱且只存在于內皮細胞組分中的蛋白質。比較兩種細胞類型的凝膠電泳模型表明，表達的蛋白質只存在于BCE細胞中。其后測定蛋白質序列和相應的克隆基因。制備了牛毛細管內皮細胞的cDNA文庫，并用基于變性的寡核苷酸的PCR技術來篩選以定位特異結合蛋白質的內抑制素的cDNA。也使用了變性的寡核苷酸和相應的cDNA進行雜交來確定結合蛋白的內抑制素基因。另一種方法是通過使用以前詳細描述的方法和免疫篩選同一文庫來培養(yǎng)肽序列的抗體。
表達克隆.制備BCE細胞的cDNA文庫。從增殖已受到內抑制素抑制的BCE細胞中分離Poly-A mRNA，這些細胞表達與蛋白結合的內抑制素。將相應的cDNA文庫轉染到允許各種cDNAS高度表達的細胞中。把內抑制素和在細胞表面上表達受體蛋白質的細胞結合的活性作為這些細胞的陽性選擇標記。為了選擇這些細胞，用生物素標記純化的內抑制素，其后使用偶聯磁性珠的鏈霉抗生物素蛋白或者FAGS分揀來進行檢測。另外在篩選時可以使用內抑制素的抗體。在選擇了陽性細胞后，分離、純化相應的質粒，并轉染到高度表達的細胞中。在進行幾輪陽性選擇后，使用核酸內切酶消化和PCR分析質粒的同一插入物。使用這些數據，用Blast網絡程序形成、測序和分析互補組。除計算機分析之外，把單個的cDNAs再次轉染到高度表達的細胞中，并在不同的條件(例如，與未標記的內抑制素競爭、結合的時間、Scatchard分析等，換句話說，使用本領域技術人員熟知的“傳統(tǒng)”的受體鑒定方法)下檢驗內抑制素結合活性。
實施例9鼠內抑制素蛋白的抗血管生成活性的最小區(qū)域的確定設計了不同的PCR引物，將相應的cDNA克隆到大腸桿菌表達系統(tǒng)中，并將不同的內抑制素片段純化至均一。從N-末端和C-末端切下全長的cDNA。使用毛細管內皮增殖測定和雞胚測定作為第一次篩選以測定剩余活性(和全長片段相比)。
實施例10可以從膠原XVIII釋放內抑制素的推定的酶的測定膠原XVIII屬于非原纖維膠原類型成員，可以在編碼具有1315、1527和1774個氨基酸殘基的三個不同的剪接變體中發(fā)現膠原XVIII(Rehn，PNAS 914234，1994)。這種差別是由基因N-末端部分的改變引起的，因此所有三個剪接變體都可以成為內抑制素(本身就是非膠原區(qū)域11(NC11)的片段)潛在的來源。膠原XVIII的功能尚不清楚，但是，因為它的信息實質上是在高度形成血管的組織中表達出來，因此有人(Oh等，基因組學，19494，1994)提出它在周圍血管基質裝配和/或結構中的作用。關于膠原XVIII的功能第一條線索來自于作為內皮細胞增殖有效抑制劑的內抑制素的純化。
從原始數據和我們最初的觀察，我們從血管內皮瘤(EOMA)的條件培養(yǎng)基中純化內抑制素，我們提出是否可以確定從膠原XVIII釋放內抑制素的酶？在大腸桿菌和昆蟲細胞桿狀病毒系統(tǒng)表達了編碼NC11區(qū)域的325個氨基酸殘基。把純化的蛋白質用作為底物來確定克隆膠原XVIII此區(qū)域的酶。通過PCR將編碼NCll區(qū)域的cDNA片段克隆到大腸桿菌表達載體(pET系列)中，此載體使得在IPTG誘導后使靶蛋白質高度表達。另外，使用了合適的昆蟲細胞表達載體。所說的蛋白質用HIS6-Tag加尾，所說的尾端位于C-末端，用于經Ni2+-NTA-珠的純化。通過Western印跡使用Ni2+-NTA-堿性磷酸酶綴合物可以檢測C-末端。構建了另一個構建體，此構建體不僅具有C-末端的HIS6-Tag，而且也編碼血凝素(N-末端的HA-Tag)。這可以通過Western印跡用HA-特異的單克隆抗體來檢測。在使用EOMA上清液和不同的金屬蛋白酶提取物溫育之后，檢測所說的蛋白質的N-末端和C-末端。
由SDS-PAGE分析或者Western印跡檢測切割產物發(fā)現，使用Ni2+-NTA-珠再次純化所說的蛋白質，用咪唑洗脫，用PBS透析，并且在各種體內和體外的測定(例如內皮細胞增殖、雞胚和小鼠角膜測定)中檢測抑制劑活性。如果切割產物顯示出抑制活性物，對N-末端氨酸進行測序并將它與從EOMA上清液獲得的內抑制素的原來起始序列相比較。因此，切割方法可以按比例放大，以純化用于患有腫瘤小鼠的實驗中的足夠量的蛋白質。并將這種活性和全長NC11區(qū)域的活性相比較。
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序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名兒童醫(yī)學中心公司(B)街道300 Longwood大街(C)城市波士頓(D)州Massachusetts(E)國家美國(F)郵編代碼(ZIP)02115(G)電話(617)735-7050(H)電傳(617)232-7485(ii)發(fā)明名稱治療血管生成的組合物和方法(iii)序列數目1(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0. Version #1.30
(2)SEQ ID No1信息(i)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(iii)假設結構沒有(iv)反義鏈沒有(vi)最初來源(A)有機體鼠(F)組織類型膠原(xi)序列描述SEQ ID No1His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser5 10 15 20(2)SEQ ID No1信息(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(iii)假設結構沒有(iv)反義鏈沒有(vi)最初來源(A)有機體鼠(F)組織類型膠原(xi)序列描述SEQ ID No1His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser5 10 15 20
權利要求
1.分離的內抑制素。
2.權利要求1的分離的內抑制素，這種內抑制素包括分子量為18kDa(通過非還原凝膠電泳測定的，如果通過還原凝膠電泳測定則為20kDa)的分離的蛋白質，其中所說的蛋白質可以從鼠的血管內皮瘤EOMA細胞系中分離，并且所說的蛋白質還具有特異性地抑制培養(yǎng)的內皮細胞增殖的能力的特征。
3.權利要求1的內抑制素，其中所說的蛋白質的N-末端氨基酸序列與Seq ID No1的序列實質上具有同源性。
4.權利要求1的內抑制素，其中所說的蛋白質的序列與XVIII型膠原的C-末端肽片段的序列實質上具有同源性。
5.權利要求1的內抑制素，這種內抑制素是通過下面的方法產生的在重組表達系統(tǒng)中重組產生權利要求1的蛋白質，并以未折疊的形式分離重組產生的蛋白質。
6.權利要求5的內抑制素，其中所說的重組表達系統(tǒng)是大腸桿菌或者桿狀病毒。
7.一種化合物，這種化合物包含編碼內抑制素蛋白質的分離的核酸序列。
8.權利要求7的化合物，其中所說的內抑制素蛋白質的分子量為18kDa(通過非還原凝膠電泳測定的，如果通過還原凝膠電泳測定則為20kDa)，其中所說的蛋白質可以從鼠的血管內皮瘤EOMA中分離，并且所說的蛋白質還具有特異性地抑制培養(yǎng)的內皮細胞增殖的能力的特征。
9.權利要求7的化合物，其中所說的蛋白質的N-末端氨基酸序列和Seq ID No1的序列實質上具有同源性。
10.權利要求7的化合物，其中所說的蛋白質的序列與XVIII型膠原的C-末端肽片段的序列實質上具有同源性。
11.一種化合物，這種化合物包含能夠特異性地結合內抑制素蛋白質的分離的抗體。
12.權利要求11的化合物，其中所說的內抑制素蛋白質的分子量為18kDa(通過非還原凝膠電泳測定的，如果通過還原凝膠電泳測定則為20kDa)，其中所說的蛋白質可以從鼠的血管內皮瘤EOMA中分離，并且所說的蛋白質還具有特異性地抑制培養(yǎng)的內皮細胞增殖的能力的特征。
13.權利要求11的化合物，其中所說的抗體是單克隆抗體。
14.權利要求11的化合物，其中所說內抑制素蛋白質的N-末端氨基酸序列實質上和Seq ID No1的序列具有同源性。
15.權利要求11的化合物，其中所說的蛋白質的序列與XVIII型膠原的C-末端肽片段序列實質上具有同源性。
16.一種分離的內抑制素，其是通過包含以下步驟的方法制備的a.收集用于培育鼠血管內皮瘤細胞系EOMA的培養(yǎng)基；和b.用肝素柱層析分級分離所得的培養(yǎng)基，其中所說的分離的內抑制素是分子量為18kDa(通過非還原凝膠電泳測定的，如果通過還原凝膠電泳測定則為20kDa)的蛋白質，并且所說的蛋白質還具有特異性地抑制培養(yǎng)的內皮細胞增殖的能力的特征。
17.一種治療與血管生成有關的疾病的方法，這種方法包括在需要使用權利要求1的內抑制素進行治療時，以足以抑制血管生成的量向患者施用權利要求1的內抑制素。
18.權利要求17的方法，其中所說的內抑制素是重組產生的蛋白質，并且以未折疊的形式施用所說的重組產生的蛋白質。
19.權利要求18的方法，其中所說的重組產生的內抑制素在至少8小時內能夠持續(xù)釋放此蛋白質。
20.權利要求17的方法，其中所說的與血管生成有關的疾病選自由依賴于血管生成的癌、良性腫瘤、風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、眼睛血管生成疾病、Osler-Webber綜合征、心肌血管生成、噬斑新血管生成、毛細管擴張、血友病性關節(jié)、血管纖維瘤、創(chuàng)傷肉芽、腸粘連、粥樣硬化、硬皮病、肥厚性疤痕、貓抓疾病和Helobacter pylori潰瘍組成的組。
21.權利要求20的方法，其中與血管生成有關的疾病是依賴于血管生成的癌。
22.一種治療與血管生成有關的腫瘤的方法，這種方法包括在需要使用權利要求1的內抑制素進行治療時，以足以引起腫瘤消退的量向患者施用權利要求1的內抑制素。
23.權利要求22的方法，其中所說的內抑制素是重組產生的蛋白質，并且以未折疊的形式施用所說的重組產生的蛋白質。
24.權利要求23的方法，其中所說的重組產生的蛋白質在至少8小時內能夠持續(xù)釋放此蛋白質。
25.一種治療患有依賴于血管生成癌的患者的方法，這種方法包括在需要治療依賴于血管生成癌時，以能夠治療此疾病的量向患者施用一種組合物，所說的組合物包含與權利要求1的內抑制素組合使用的血管抑制素，所說的血管抑制素和內抑制素的使用量足以使所說的組合物能夠有效地抑制依賴于血管生成癌的血管生成(當將此組合物施用給患有依賴于血管生成癌的患者時)。
26.權利要求25的方法，其中所說的血管抑制素和內抑制素至少一種是重組產生的蛋白質，并且以未折疊的形式施用所說的重組產生的蛋白質。
27.權利要求25的方法，其中所說的重組產生的蛋白質在至少8小時內能夠持續(xù)釋放此蛋白質。
28.一種避孕的方法，這種方法包括以足以抑制胚胎植入的量向女性施用權利要求1的內抑制素。
29.權利要求28的方法，其中內抑制素是重組產生的蛋白質，并且以未折疊的形式施用所說的重組產生的蛋白質。
30.權利要求25的方法，其中所說的重組產生的蛋白質在至少8小時內能夠持續(xù)釋放此蛋白質。
31.一種組合物，這種組合物包含與權利要求1的內抑制素組合使用的血管抑制素，所說的血管抑制素和內抑制素的使用量足以使所說的組合物能夠有效地消退依賴于血管生成的腫瘤的量(當將此組合物施用給患有依賴于血管生成腫瘤的患者)。
32.一種產生內抑制素蛋白的方法，這種方法包括重組表達一種分子量為18kDa(通過非還原凝膠電泳測定的，如果通過還原凝膠電泳測定則為20kDa)的蛋白質，這種蛋白質實質上具有與內抑制素同源的序列，其還具有特異性地抑制培養(yǎng)的內皮細胞增殖的能力的特征。
33.權利要求32的方法，其中所說的內抑制素蛋白是在細菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)和昆蟲表達系統(tǒng)之一中產生的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠抑制血管生成和引起腫瘤消退的內皮細胞增殖抑制劑(所說的抑制劑大約為20kDa,并且相當于XⅧ型膠原的C－末端片段)及治療與血管生成有關的疾病的方法。
文檔編號C12N7/00GK1202932SQ96198480
公開日1998年12月23日 申請日期1996年10月23日 優(yōu)先權日1995年10月23日
發(fā)明者M·S·奧萊利, M·J·佛克曼 申請人:兒童醫(yī)學中心公司