專利名稱：血管生成肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及引起靶細胞中細胞內(nèi)鈣釋放并從而誘發(fā)原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的增殖、 遷移和毛細血管樣管形成的血管生成肽。另外，所述血管生成肽可以用于預(yù)防和/或治療 血管發(fā)生相關(guān)病癥，尤其是創(chuàng)傷愈合、治療受試者的足腿潰瘍，等。另外，所述血管生成肽可 以用于化妝品，作為針對皮膚老化的化妝品組分，例如用于抗皺和皮膚美白。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生——從已有血管系統(tǒng)長出新血管——是多種生理和病理狀況下的 基本過程，所述生理和病理狀況包括創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育、慢性炎癥和腫瘤進展和轉(zhuǎn)移 (J. Folkman, Nat. Med. 1 (1995)，pp. 27-31 ；W. Risau, Nature 386 (1997)，pp. 671-674)。在 血管發(fā)生過程中會發(fā)生復(fù)雜的細胞過程，包括內(nèi)皮細胞的細胞外基質(zhì)降解、增殖、遷移和形 態(tài)分化以形成管。該整個過程受調(diào)節(jié)新血管形成的局部因子的協(xié)調(diào)(F.BUSS0lin0，et al.， Trends Biochem. Sci. 22 (1997)，pp. 251-256)，血管生成平衡的變化可以介導(dǎo)“血管生成開 關(guān)”。對血管生成開關(guān)的干擾可以引起嚴(yán)重的血管問題。鈣在由多種細胞外刺激誘發(fā)的信號傳遞事件中以及對大量不同細胞功能的協(xié)調(diào) 過程中起到關(guān)鍵作用(M. J. Berridge, Nature 361(1993)，pp. 315-325 ；K. Kiselyov, et al. , Cell Signal 15(2003), pp. 243-253).細胞內(nèi)Ca2+增加是人內(nèi)皮細胞的粘附、溶膠 原活性、遷移和增殖以及體內(nèi)毛細血管生長必不可少的(E. C. Kohn, et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995)，pp. 1307-131)。實際上，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)——一種受 體酪氨酸激酶(RTK)配體一一和1-磷酸鞘氨醇(SlP)——一種G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)配 體——通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+水平誘導(dǎo)新血管形成(M. i^aehling，et al.，F(xiàn)ASEB J. 16(2002)， pp. 1805-1807 ；Μ. Guidoboni, et al.，Cancer Res. 65(2005), pp. 587—595)。因此，對內(nèi)皮 細胞中的Ca2+動員特性進行研究可能提供重要的信息，用于全面地理解血管發(fā)生涉及的生 理過程。合成肽組合文庫位置掃描策略(PS-SPCL)已經(jīng)被用于分離具有血管生成潛力的 肽(R. A. Houghten, et al.，Nature 354(1991)，pp. 84-86)。而且，所述 PS-SPCL 方法已被 成功地應(yīng)用于篩選參與多種生物過程的有用肽，由此鑒定出數(shù)種肽，如，白細胞介素-8特 異性拮抗物(S. Hayashi, et al.，J Immunol. 154(1995)，pp. 814-824)、激活的 T 細胞的 核因子的抑制物(J. Aramburu, et al, Science 285(1999)，pp. 2129-2133)和免疫調(diào)節(jié)肽 (Y. S. Bae, et al.，Blood 97 (2001)，pp. 2854-2862)。

發(fā)明內(nèi)容
進行合成肽文庫篩選以得到作用于內(nèi)皮細胞的生物活性合成肽，本發(fā)明人已鑒定 出在體外(in vitro)和離體(ex vivo)條件下強力誘導(dǎo)血管生成活性的新型肽。而且，本 發(fā)明人提供了這樣的證據(jù)，即SraLRY-NH2的血管生成活性受到內(nèi)皮細胞中VEGF-A誘導(dǎo)的 介導(dǎo)。
本發(fā)明的一個實施方案提供了一種選定的長度為6-15個氨基酸的血管生成肽序 列，所述血管生成肽序列具有如下活性促進細胞遷移、血管發(fā)生或膠原合成，或者抑制黑 色素形成。所述血管生成肽包括基本六肽以及由1-9個氨基酸組成的連接肽。任選地，所 述血管生成肽通過以-NH2取代C末端羧基而被修飾。所述血管生成肽的血管生成活性受 到血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)上調(diào)的介導(dǎo)。本發(fā)明的另一個實施方案提供了一種用于治愈創(chuàng)傷、促進膠原合成或抑制黑色素 合成的包含血管生成肽的組合物。所述組合物是一種用于創(chuàng)傷愈合的藥物組合物，其包含 作為活性成分的血管生成肽和可藥用載體。所述組合物是一種用于改善老化皮膚狀況的化 妝品組合物，其包含作為活性成分的血管生成肽和化妝品可用載體。所述化妝品組合物是 具有抗皺和皮膚美白活性的活性組合物。又一實施方案提供了一種促進哺乳動物中血管發(fā)生的方法，所述方法包括對有需 要的受試者給予有效量的血管生成肽。再一實施方案提供了一種治愈受試者的創(chuàng)傷的方法，包括如下步驟對有需要的 所述受試者給予創(chuàng)傷愈合有效量的血管生成肽或其肽模擬物。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種改善皺紋的方法，包括對有需要的受試者給予有 效量的血管生成肽或其肽模擬物。在又一方面中，本發(fā)明涉及一種減少皮膚色素沉著的方法，包括對有需要的受試 者給予有效量的血管生成肽或其肽模擬物。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種鑒定抗血管生成分子的方法，包括如下步驟提供 一種內(nèi)皮細胞；將所述細胞與候選拮抗化合物相接觸；以及如果所述候選拮抗化合物抑制 上述多肽或其肽模擬物的血管生成活性，則將所述候選拮抗化合物鑒定為拮抗化合物。


通過下文對本發(fā)明的描述、參照的其附圖和其隨附的權(quán)利要求書，將可以更全面 地理解本發(fā)明的這些目標(biāo)和其他目標(biāo)。通過本文下文給出的詳細描述以及附圖將可以更全面地理解本發(fā)明，所述附圖僅 僅是以示例的方式給出，因此不是對本發(fā)明的限制，其中圖1A-1F示出針對使MS-I細胞的細胞內(nèi)鈣升高的肽進行的初始PS-SPCL篩查， 其中每幅圖示出了已知氨基酸在所述六肽的6個位置中的每一位置上的肽庫(peptide pool)得到的結(jié)果。所述6個位置由19個L-氨基酸中的一個分別定義(例如01、02)。剩 余的5個位置由所述19個L-氨基酸(不包括半胱氨酸(cystein))的混合物(X)組成。 所述文庫由114個肽庫組成；PS-SPCL總共由47，045，881種不同肽構(gòu)成。如“材料和方法” 中所述，使用Fura-2/AM通過熒光分析測定[Ca2^i升高。該結(jié)果表示3次獨立實驗中的一 次。圖2A-2C示出SFKLRY-NH2 (SEQ ID NO :2)誘導(dǎo)HUVEC增殖、遷移和管形成。將細 胞以不同濃度的SraLRY-NH2 (SEQ ID NO 2) (0. 1-10 μ Μ)處理。在孵育48小時后，以液體 閃爍計數(shù)器對DNA合成的活性計數(shù)。豎條代表3次獨立實驗的平均值士S. D.。乍< 0. 05。 (B)不同劑量Si7KLRY-NH2 (SEQ ID NO 2)引起的HUVEC遷移率。在創(chuàng)傷后，將HUVEC以標(biāo) 明濃度的SraLRY-NH2 (SEQ ID NO 2) (0. 1-10 μ Μ)孵育16小時，然后對超出參考線的遷移HUVEC計數(shù)。值代表了進行2次重復(fù)的3次獨立實驗(平均值士S. D.)。乍< 0. 05。(C) SFKLRY-NH2 (SEQ ID NO 2)對HUVEC管形成的影響。將HUVEC接種于減少生長因子的基質(zhì) 膠(Matrigel)上并以 SFKLRY-NH2 (SEQ ID NO 2) (1 μ Μ) ,FYSRLK-NH2 (10 μ Μ)和 SlP (IOOnM) 處理，以進行比較。在孵育M小時后，對所述管樣結(jié)構(gòu)照相并測量管形成的長度。值代表 進行2次重復(fù)的3次獨立實驗(平均值士 S. D.)。
< 0. 05。圖 3Α-;3Β 示出 BAPTA、U73122 和 PTX 抑制 MS-1 細胞中 SFKLRy-NH2 誘導(dǎo)的[Ca2Ii 升高。在存在和不存在細胞內(nèi)鈣螯合劑BAPTA-AM(A)、PLC抑制劑U73122及其無活性類似物 U7!3433 W&PTX(B)的情況下，測量SraLRY-NH2 (SEQ ID NO : 誘導(dǎo)的細胞內(nèi)Ca2+動員活性。 (A)在37 °C下，將所述細胞在包含10 μ M BAPTA-AM的DMEM中以Fluo-4/AM預(yù)孵育30分鐘。 將細胞懸浮于包含0. 2mM EGTA的無Ca2+的Locke溶液中，并以標(biāo)明濃度的SraLRY-NH2 (SEQ ID NO 2)處理。通過在488nm下激發(fā)并在520nm下發(fā)射來確定熒光強度的變化。⑶將細 胞以Fura-2分別在有或無U73122 (10 μ Μ)、U73433 (10 μ Μ)下預(yù)孵育30分鐘，以及在有或 無PTX(100ng/mL)下預(yù)孵育2小時。然后，將載有Fura_2的細胞懸浮于無Ca2+的Locke溶 液中，然后以1 μ M SFKLRY-NH2(SEQ ID NO :2)處理。數(shù)據(jù)代表進行3次重復(fù)的3次獨立實 驗的平均值士 S. D.。*P < 0. 05。圖4示出Si7KLRY-NH2 (SEQ ID NO :2)誘導(dǎo)離體血管萌芽。在基質(zhì)膠中將大鼠 主動脈外植體以含有 SFKLRY-Nh2 (SEQ ID NO 2) (1 μ M)、FYSRLK-NH2 (1 μ Μ)，SlP(IOnM)、 VEGF(10ng/mL)、含U73122 (10 μ Μ)或PTX (50ng/mL)的 SFKLRY-NH2 (SEQ ID NO :2) (1 μ M)或 者10% FBS的M-199孵育，并在孵育7天后照相。然后進行3次獨立實驗，每次實驗重復(fù)兩 次。圖 5A-5B 示出 SFKLRY-NH2 (SEQ ID NO 2)引起的 VEGF 和 VEGFR-I mRNA 的上調(diào)。 對從以Si7KLRY-NH2 (SEQ ID NO 2)處理的原代培養(yǎng)的HUVEC中分離的mRNA進行RT-PCR分 析。所示數(shù)據(jù)代表3次獨立實驗。在HUVEC中以Si7KLRY-NH2 (SEQ ID NO 2) (10 μ Μ)處理 0、1、2、3、4、8或12小時(A)，以及以0,0. 01,0. 1或10 μ M處理2小時(B)，使用VEGF-A的 特異性引物擴增它。將GAPDH用作參照基因。圖 6Α-6Β 示出抗 VEGF 抗體在 HUVEC 中抑制 SFKLRY-NH2 (SEQ ID NO 2)誘導(dǎo) 的管形成。在存在抗VEGF-A中和抗體(0.1、1或10yg/mL)的情況下，將細胞在包含 SFKLRY-Nh2 (SEQ ID NO :2)(10 μ M)或 VEGF-A(10ng/mL)的培養(yǎng)基中孵育 M 小時。在孵育 24小時后，對所述管樣結(jié)構(gòu)照相并測量管形成的長度。數(shù)據(jù)表示為2次獨立實驗的一次實 驗，值是2次獨立實驗的平均值。與載體處理相比 < 0. 05。圖7Α-7Β示出愈合創(chuàng)傷組織在第14天時的組織學(xué)。(A)假處理的創(chuàng)傷表現(xiàn)出重度 水腫和雜亂的微結(jié)構(gòu)。⑶通過以SraLRY-NH2 (SEQ ID NO 2) (10 μ Μ)處理觀察到了微結(jié)構(gòu) 幾乎完全恢復(fù)正常。圖8示出SH(LRY-NH2 (SEQ ID NO :2)對I型膠原合成的影響。將人成纖維細胞以 SFKLRY-NH2 (SEQ ID NO 2) (0. 1、1、10μΜ)處理。圖9Α-9Β示出SH(LRY-NH2 (SEQ ID NO 2)對B16黑色素瘤細胞中黑色素含量的影 響。
具體實施例方式通過提供合成肽組合文庫的位置掃描方法(PS-SPCL)公開了一系列在內(nèi)皮細胞 中誘導(dǎo)[Ca2+] 1升高的新型肽。在這些肽中，原型肽SraLRY-NH2 (SEQ ID NO 2)被證明在內(nèi) 皮細胞中通過PTX敏感性G蛋白/PLC介導(dǎo)的[Ca2+] i升高來誘導(dǎo)DNA合成、遷移和管形成， 這些是血管發(fā)生的關(guān)鍵步驟。作為小肽的SraLRY-NH2 (SEQ ID NO 2)的鑒定在血管發(fā)生研 究中是值得注意的。SraLRY-NH2(SEQ ID NO 2)不但在體外和離體條件下顯示出血管生成 活性，而且在大鼠模型中具有顯著的創(chuàng)傷愈合活性。而且，所述肽的處理在皮膚成纖維細胞 中刺激了膠原合成并抑制了黑色素合成。本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列的原型肽和其保守變體或功能性片 段。所述血管生成肽的長度可以是約6-15個氨基酸、6-10個氨基酸、6-7個氨基酸或6個 氨基酸，包含氨基酸序列^C1FX2LRX3作為基本部分，以及連接于^C1FX2LRX3的C末端的由1_9 個氨基酸組成的肽。所述血管生成肽可以通過以-NH2取代末端羧基進行修飾。血管生成 肽的實例包括由SEQ ID NO :1、2、8、12、14或15-24組成的肽。本文使用的血管生成肽是指長度可以是約6-約15個氨基酸且包含具有化學(xué)式I 的氨基酸序列的六肽的寡肽。此外，所述肽是刺激內(nèi)皮細胞中[Ca2+]i升高并從而誘導(dǎo)毛細 血管樣管形成的化合物。X1FX2LRX3其中Xl是絲氨酸或蘇氨酸；X2是賴氨酸、精氨酸或異亮氨酸；并且X3是苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、精氨酸或組氨酸。在每個位置活性最大的氨基酸是第一位置kr(S)和Thr(T)；第二位置Wie(F)； 第三位置lie (I)、Lys⑷和Arg(R)；第四位置Leu (L)；第五位置Arg(R)；第六位置Arg(R)、 Phe (F)、Trp (W)、Tyr (Y)和 His (H)。本文使用的術(shù)語“血管發(fā)生”是指新血管的生長或“新血管形成”，包括由內(nèi)皮細 胞構(gòu)成的管徑相對較小的新血管的生長。血管發(fā)生是許多重要生物過程的一個不可缺少的 部分，所述生物過程包括癌細胞增殖實體瘤形成、炎癥、創(chuàng)傷愈合、受損缺血組織的修復(fù)、心 肌血管重建和重塑、卵泡成熟、月經(jīng)周期和胎兒發(fā)育。新血管形成對于任何新組織的發(fā)育都 是需要的，不管是正常的還是病理的新組織發(fā)育，因此它不僅代表促進正常組織生長和“正 ?！毖馨l(fā)生的治療良機，也代表許多疾病狀態(tài)調(diào)控中的潛在控制點。血管發(fā)生的完整過程還不是完全清楚，但已知它以如下方式影響毛細血管的內(nèi)皮細胞(1)內(nèi)皮細胞和周圍細胞外基質(zhì)(ECM)之間的附著被改變，據(jù)推測受到蛋白酶和 糖苷酶的介導(dǎo)，這使得微血管內(nèi)皮細胞周圍的基底膜被破壞，從而使得內(nèi)皮細胞朝趨化因 子的方向伸出細胞質(zhì)芽；(2)存在所述內(nèi)皮細胞向待血管形成的組織遷移的“趨化過程”；以及(3)存在“有絲分裂過程”(例如，所述內(nèi)皮細胞增殖以提供另外的細胞用于新血 管)。這些血管生成活性的每一種均可以利用體外內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物獨立地測量。創(chuàng)傷是由物理途徑例如機械途徑、化學(xué)途徑、細菌途徑或熱途徑引起的內(nèi)部或外 部身體損傷或損害，它們可破壞結(jié)構(gòu)的正常連續(xù)性。這類身體損傷包括挫傷——皮膚未破 的創(chuàng)傷；割傷——皮膚被切割器械割破的創(chuàng)傷；以及裂傷——皮膚因不鋒利的或鈍的器械破損的創(chuàng)傷。創(chuàng)傷可以由意外引起或者由手術(shù)操作引起。創(chuàng)傷愈合由一系列過程組成，經(jīng)由這些過程，損傷組織得到修復(fù)，特化的組織得以 再生，并且新組織得以重組。創(chuàng)傷愈合通?？煞殖?個階段炎癥階段、增殖階段和重塑階 段。纖連蛋白已被報道參與創(chuàng)傷愈合過程的每個階段，特別是通過生成侵入細胞可附著的 支架。最初，許多調(diào)節(jié)因子，例如纖連蛋白和血纖蛋白原，被釋放至創(chuàng)傷位點。此后，發(fā)生血 管發(fā)生和上皮再形成(美國專利5，641，48 。由缺血造成的損傷組織的修復(fù)是一種需要廣 泛重塑和血管再形成的創(chuàng)傷愈合形式。梗死以及組織區(qū)域缺血性壞死實際上是由局部血液 循環(huán)阻塞引起的。所形成的壞死損害使得受損組織缺乏氧和營養(yǎng)物。在心臟中，特別是冠 狀循環(huán)的阻塞可形成心肌梗死。隨著缺血性心肌膜出現(xiàn)快速缺氧，受影響心肌的低氧微環(huán) 境導(dǎo)致血管生成因子的合成，以試圖進行血管再形成。例如，已知在出現(xiàn)梗死形成(Ref)的 心肌膜區(qū)域會產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及對刺激內(nèi)皮細胞中[Ca2+] 1升高并從而誘導(dǎo)毛細血 管樣管形成的化合物例如多肽、肽模擬物或化學(xué)上的化合物進行篩選。所述化合物預(yù)計將 治療患有由血液供應(yīng)受損誘發(fā)的疾病的患者，所述疾病包括與糖尿病或創(chuàng)傷相關(guān)的足和腿 潰瘍以及視網(wǎng)膜病變?？梢允褂冒ㄊ删w展示文庫或化學(xué)文庫的多種文庫來篩選刺激內(nèi)皮細胞中 [Ca2+] 1升高的化合物。另一方法利用了雙雜交系統(tǒng)(例如酵母或哺乳動物雙雜交系統(tǒng))來 鑒定誘導(dǎo)在所述受試者中形成血管的化合物，包括治療由血液供應(yīng)受損誘發(fā)的疾病，包括 與糖尿病或創(chuàng)傷相關(guān)的足和腿潰瘍以及視網(wǎng)膜病變。這些方法中有許多可用于高通量分 析。另外，提供了這樣的方法，即這些方法使得可鑒定另外的血管生成化合物，并且這些方 法還可治療和/或預(yù)防足和腿潰瘍、視網(wǎng)膜病變和創(chuàng)傷。一種方法涉及應(yīng)用合理藥物設(shè)計 技術(shù)。因此，使用基于計算機的同源搜索、蛋白質(zhì)建模和組合化學(xué)來設(shè)計并形成與鑒定出 的化合物以及這些分子的片段或衍生物相似的分子。例如，通過一個搜索程序訪問包含與 X1FX2LRX3肽或者這些分子的片段或衍生物對應(yīng)的核酸或蛋白序列的數(shù)據(jù)庫，所述搜索程 序?qū)⑺鲂蛄信c公共或商業(yè)數(shù)據(jù)庫中的其他序列對比，以鑒定同源配體。通過另一種合理 性方法，將蛋白建模技術(shù)(例如X射線晶體學(xué)、NMR和計算機建模)用于構(gòu)建所述化合物的 模型。從這些模型可實現(xiàn)合理藥物設(shè)計。一旦設(shè)計并生成所述候選化合物，優(yōu)選評估它們 刺激內(nèi)皮細胞中[Ca2Ii升高的能力。評估候選物的能力以及產(chǎn)生的對血管形成的誘導(dǎo)作 用的方法可以使用多種測定例如基質(zhì)膠測定完成。變體和突變體多肽為了改善或改變所述多肽的特征，可以采用氨基酸工程。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 重組DNA技術(shù)可以用于產(chǎn)生包含單個或多個氨基酸置換、缺失、插入的新型突變體多肽或 融合蛋白。類似的突變體多肽還可以通過化學(xué)合成產(chǎn)生，尤其是短肽。這類修飾的多肽可 以表現(xiàn)出例如活性增加/降低或者穩(wěn)定性增加/降低。另外，至少在某些純化和保存條件 下，它們與相應(yīng)的天然多肽相比可以以更高的產(chǎn)率純化并且表現(xiàn)出更好的溶解性。與X1FX2LRX3肽以及這些分子的片段或衍生物(例如X1FX2LRX3肽模擬物)相似 的化合物，不僅包括那些包含整個或部分的血管生成肽氨基酸序列作為一級氨基酸序列的 分子以及這些分子的天然片段或衍生物，而且還包括如下改變的序列其中以功能等價的 氨基酸殘基置換所述序列中的殘基，從而產(chǎn)生沉默的改變。因此，血管生成肽以及這些分子的片段或衍生物的序列中的一個或多個氨基酸殘基可以被作為功能等價物發(fā)揮作用的極 性相似的另一氨基酸置換，從而產(chǎn)生沉默的改變。所述序列中的氨基酸置換物可以選自所 述氨基酸所屬類別的其他成員。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨 酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。不帶電的極性中性氨基酸包括甘氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)的氨基酸包括 精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。芳香族氨 基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在本 發(fā)明的另一方面中，考慮到了 X1FX2LRX3肽以及這些分子的片段或衍生物，它們在翻譯過 程中或翻譯之后被差異修飾，例如通過磷酸化、糖基化、交聯(lián)、?；⒌鞍姿馇懈?、連接于 抗體分子、膜分子或其他配體。因此，對應(yīng)于X1FX2LRX3肽或者這些分子的片段或衍生物的 蛋白質(zhì)序列可以與已知序列進行比較。大于或等于X1FX2LRX3肽的候選化合物被鑒定并隨 后使用鈣動員測定進行檢查。樽擬物用于本發(fā)明的一些方面中的肽還可以被修飾，例如所述肽可以具有正常不存在于 肽上的取代基，或者所述肽可以具有正常存在于所述肽上、但被引入至非正常肽區(qū)域的取 代基。例如，用于本發(fā)明的一些方面中的肽可以被乙酰化、?；虬坊榱诵揎?，所述肽 上可以包括的取代基包括但不限于H、烷基、芳基、烯基、炔基、芳香族基團、醚、酯、未被取代 或取代的胺、酰胺、鹵素、未被取代或取代的磺?；蛘?元或6元脂肪環(huán)或芳環(huán)?！癝FKLRY 肽模擬物”是一種類似于所述SH(LRY肽的化合物。SH(LRY肽模擬物可以是擬肽、肽、修飾 肽和衍生肽。另外的衍生化合物包括類似于目的多肽的擬肽。參與肽生物學(xué)生成的天然氨基 酸都具有L構(gòu)型。利用L氨基酸、D氨基酸或者兩種不同構(gòu)型的氨基酸的各種結(jié)合，應(yīng)用常 規(guī)合成方法可以制備合成肽。如下這樣的合成化合物被稱為“擬肽”即一種具體肽(例如 寡肽)一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，該化合物模擬這種肽的構(gòu)象和所需特征，但回避不需要的特征，例如柔性 (失去構(gòu)象)和鍵斷裂。一般而言，擬肽的設(shè)計和合成包括以所述肽的序列和所需肽(例如最可能的模擬 的肽)的構(gòu)象數(shù)據(jù)(例如幾何數(shù)據(jù)，如鍵長和鍵角)開始，并使用這類數(shù)據(jù)來確定應(yīng)設(shè)計到 所述擬肽中的幾何參數(shù)。本領(lǐng)域中已知有多種用于實施該步驟的方法和技術(shù)，可以使用它 們中的任一種。雖然根據(jù)肽模擬物的定義，模擬物被表征為非肽配體，但是存在許多處于天然氨 基酸組成的真正的肽和肽模擬物之間的結(jié)構(gòu)。對于肽模擬物是由什么構(gòu)成的爭論仍在持 續(xù)，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠區(qū)分模擬物和肽。肽模擬物通?？梢员徽J(rèn)為是改良的肽形式。 對肽的化學(xué)修飾，例如肽鍵的減少，可以提高其酶穩(wěn)定性。摻入非天然氨基酸還可以提高肽 的活性和選擇性。肽在結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)上變化越多，它就越符合真正的肽模擬物。肽模擬物 包括肽、蛋白及其衍生物，例如包含非肽有機部分的肽、可以包含或不包含氨基酸和/或 肽鍵但保持肽配體結(jié)構(gòu)和功能特征的合成肽、以及包含N取代的甘氨酸的分子即類肽和寡 類肽，例如 Simon et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367(1992)描述的那些；以及抗 體，包括抗獨特型抗體。在本發(fā)明的另一方面中，本發(fā)明的化合物可以通過合成引入多種可選化合物例如支架、翻轉(zhuǎn)模擬物和結(jié)合肽的替代物來制備?？梢允褂眠@樣的氨基酸合成，即使用多種線性 和雜環(huán)支架代替肽骨架。化學(xué)過程和方法包括將帶電荷的肽短暫保護形成中性前藥用于改 善血腦屏障的穿透，以及以諸如雜環(huán)、烯烴、氟烯烴和酮亞甲基(ketomethylene)的基團代 替肽鍵。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述模擬物對其靶是高度特異的，毒性低，并且是指 穿透皮膚屏障以促進創(chuàng)傷愈合的肽模擬物。因此，本發(fā)明涵蓋這樣的化合物，即該化合物被 修飾，使得其能夠穿透皮膚屏障。藥物組合物本文使用的“載體”包括在使用劑量和濃度下對暴露于其下的細胞或哺乳動物無 毒的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑。所述可藥用載體一般是PH緩沖水溶液?？伤幱幂d體 的實例非限制地包括諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機酸的緩沖劑；包括抗壞血酸的抗氧 化劑；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白； 親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酰、精氨酸或賴 氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA ；糖醇， 例如甘露醇或山梨糖醇；形成鹽的反荷離子例如鈉；以及/或者非離子型表面活性劑例如 TWEEN ⑧、聚乙二醇(PEG)和 PLUR0NICS 。本文使用的“有效量”是指足以獲得有益或所需臨床或生物化學(xué)結(jié)果的量?？梢?將有效量給藥1次或多次。對于本發(fā)明，抑制劑化合物的有效量是足以緩和、改善、穩(wěn)定、反 轉(zhuǎn)、放慢或延緩疾病狀態(tài)進展的量。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，“有效量”被定義為能 夠在給定的一組實驗中誘發(fā)反應(yīng)的化合物量。本文使用的“受試者”是脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。本文使用的術(shù)語“治療”是一種用于得到有益或所需臨床結(jié)果的方法。對于本發(fā) 明，有益或所需臨床結(jié)果包括但不限于，減輕癥狀、降低疾病程度、穩(wěn)定疾病狀態(tài)(即不惡 化)、延緩或放慢疾病發(fā)展、改善或緩和疾病狀態(tài)以及(部分或完全)緩解，無論這些結(jié)果是 可檢測的還是不可檢測的?！爸委煛边€可以是指與不接受治療的預(yù)計存活時間相比延長存活 時間?！爸委煛笔侵钢委熜灾委熞约邦A(yù)防性或防御性措施。需要治療的受試者包括已具有病 癥的受試者，以及要預(yù)防所述病癥的受試者?！熬徍汀奔膊∈侵概c未治療的情形相比，疾病狀 態(tài)的程度和/或不利臨床表現(xiàn)減輕以及/或者其發(fā)展的時間過程變緩或延長。在本公開內(nèi)容中提供了多個新血管生成肽的發(fā)現(xiàn)。這些藥物可通過任何常規(guī)途徑 送遞，所述途徑包括但不限于經(jīng)皮途徑、局部方式、腸胃外途徑、腸胃途徑、經(jīng)支氣管途徑和 經(jīng)肺泡途徑。本發(fā)明的實施方案還包括生物技術(shù)工具、預(yù)防法、治療法，以及使用前述各項 的方法，以研究、治療和/或預(yù)防與糖尿病、創(chuàng)傷和皮膚老化相關(guān)的足和腿潰瘍及視網(wǎng)膜病 變。治療化合物的制劑是本領(lǐng)域中公知的，可方便地參考Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences, 17th ed. , Mack Publishing Co. , Easton, Pa. , USA。例如，每 千克體重每天可以給予約0. 05 48至約20!1^?？梢哉{(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳治療反應(yīng)。例 如，可以每天給予多個分開的劑量，或者根據(jù)治療情況的緊急程度的指示可以按比例減少 劑量?？梢砸院啽愕姆绞浇o予所述活性化合物，例如通過口服、靜脈內(nèi)(可溶于水的情況 下)、肌肉、皮下、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)或栓塞途徑或植入(例如使用通過腹膜內(nèi)途徑的緩釋分子，
9或者通過使用細胞如單核細胞或樹突細胞，所述細胞在體外致敏并過繼性轉(zhuǎn)移至受體中)。 根據(jù)給藥途徑，可能需要將所述肽包被于一種物質(zhì)中，以保護它免受酶、酸和其他可能使所 述成分失活的其他天然條件的作用。例如，所述肽的低親脂性會使得它們在胃腸道內(nèi)可被能夠切割肽鍵的酶破壞以及 在胃中被酸水解破壞。為了通過除腸胃外給藥之外的途徑給予肽，肽將被一種物質(zhì)包被或 者與一種物質(zhì)一塊給藥，以防止其失活。例如，肽可以在輔料中給藥、與酶抑制劑共給藥或 者在脂質(zhì)體中給藥。本文考慮的輔料包括間苯二酚、非離子型表面活性劑如聚氧乙烯油基 醚和正十六基聚乙烯醚。酶抑制劑包括胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟磷酸酯(DEP)和特斯 樂(trasylol)。脂質(zhì)體包括常規(guī)的脂質(zhì)體和水包油包水CGF乳劑。所述活性化合物還可以通過腸胃外或腹膜內(nèi)給藥。還可在丙三醇、液體聚乙二醇 及其混合物中，以及在油中制備分散系。在通常的保存和使用條件下，這些制品包含防腐劑 以防止微生物的生長。適用于注射使用的藥物形式包括無菌水性溶液(可溶于水的情況下)或分散系， 以及用于臨用時制備無菌注射溶液或分散系的無菌粉末。在所有情況下，所述形式必須是 無菌的，并且流動性必須達到注射器容易排出的程度。它必須在制造和保存條件下穩(wěn)定，并 且必須是經(jīng)防腐處理的以抵抗微生物例如細菌和真菌的污染。所述載體可以是溶劑或分散 介質(zhì)，包括例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、液體聚乙二醇等)及其合適混合物， 以及植物油。例如，通過使用包衣如卵磷脂，對于分散系而言通過保持所需的粒度，以及通 過使用表面活性劑，可以保持合適的流動性。對微生物作用的預(yù)防可以通過多種抗細菌劑 和抗真菌劑實現(xiàn)，例如氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(theomersal)等。在許多情況下，它優(yōu) 選包含等張劑，例如糖或氯化鈉。注射組合物的吸收延長可以通過在所述組合物中使用延 遲吸收劑例如單硬脂酸鋁和明膠實現(xiàn)。如果所述肽被合適地保護，那么所述活性化合物可以與例如惰性稀釋劑或與可 吸收的可食用載體口服；或者可以將它包在硬殼或軟殼明膠膠囊中；或者可以將它壓成片 劑；或者可以將它直接摻入膳食中。對于口服治療給藥，所述活性化合物可以與賦形劑一起 摻合，并以可攝取的片劑、含片、糖錠、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、薄片等的形式使用。這類 組合物和制品應(yīng)包含至少1份重量的活性化合物。所述組合物和制品的百分比當(dāng)然可以變 化?；钚曰衔镌谶@類治療上可用的組合物中的量使得可以獲得合適的劑量。制備本發(fā)明 的優(yōu)選組合物或制品，使得口服劑量單位形式包含約0. 1 μ g至2000mg的活性化合物。所述片劑、丸劑、膠囊劑等還可以包含如下粘合劑，例如西黃蓍膠、阿卡膠、玉米 淀粉或明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等；潤滑 劑，例如硬脂酸鎂；以及甜味劑，例如可加入蔗糖、乳糖或糖精，或者調(diào)味劑，例如薄荷油、冬 青油或櫻桃味調(diào)味劑。如果劑量單位形式是膠囊劑，那么除以上類型的物質(zhì)外，它還可以包 含液體載體。多種其他物質(zhì)可作為包衣存在，或者改變所述劑量單位的物理形式。例如，片 劑、丸劑或膠囊劑可以被蟲膠和/或糖包被。糖漿或酏劑可包含所述活性化合物、作為甜味 劑的蔗糖、作為防腐劑的尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、染料和調(diào)味劑如櫻桃味調(diào)味劑或橙味 調(diào)味劑。當(dāng)然，用于制備任何劑量單位形式的任何物質(zhì)應(yīng)該是藥學(xué)純的，并且所應(yīng)用的量是 基本無毒的。另外，所述活性化合物可以摻入至緩釋制品和制劑中。本文使用的“可藥用載體和/或稀釋劑”包括任意和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣抗細菌劑和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑等。將這類介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)是本領(lǐng)域 中公知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與所述活性成分不相容的情況，考慮了常規(guī)介質(zhì)或試 劑在所述治療組合物中的使用。補充活性成分也可以摻入至所述組合物中。多種送遞體系是已知的，并且可以用于給予本發(fā)明的化合物，例如脂質(zhì)體、微顆 粒、微膠囊的包封，受體介導(dǎo)的胞吞作用。引入方法包括但不限于真皮內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑、腹 膜內(nèi)途徑、靜脈內(nèi)途徑、皮下途徑、鼻內(nèi)途徑、硬膜外途徑和口服。所述化合物或組合物可以 通過任何常規(guī)途徑給藥，例如通過輸注或推注，通過經(jīng)上皮或粘膜被覆層(例如口腔粘膜、 直腸和腸粘膜等)的吸收，并且可以與其他生物活性劑一塊給藥?？梢匀斫o藥或局部給 藥。另外，可能需要將本發(fā)明的藥物化合物或組合物通過任何合適途徑導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng) 中，所述途徑包括腦室內(nèi)注射和鞘內(nèi)注射；腦室內(nèi)注射可以通過腦室內(nèi)導(dǎo)管幫助進行，所述 腦室內(nèi)導(dǎo)管例如連接至一容器如奧馬耶貯器(Ommaya reservoir) 0還可以使用肺部給藥， 例如通過使用吸入器或噴霧器，以及含霧化劑的制劑?；瘖y品組合物本文使用的“化妝品可用，，是指所述成分適合用于與組織(例如皮膚或毛發(fā))接 觸而無過分毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、刺激、變態(tài)反應(yīng)等。本文使用的“有效量”是指足以改善人老化皮膚如皺紋和變暗、但低至足以避免嚴(yán) 重副作用的量。所述組合物的安全且有效的量可以隨以下因素而不同治療的區(qū)域、最終使 用者的年齡和皮膚類型、治療的持續(xù)時間和性質(zhì)、應(yīng)用的具體成分或組合物、使用的具體的 化妝品可用載體等。在一個實施方案中，除了所述聚合物之外，所述局部組合物還包含另一化妝品活 性劑?！盎瘖y品活性劑”指的是一種對皮膚或毛發(fā)具有美容或治療作用的化合物(例如合成 化合物或從天然源或天然提取物分離的化合物)，包括但不限于抗痤瘡劑、控油劑、抗微生 物劑、抗炎劑、遮光劑、光防護劑、抗氧劑、角質(zhì)層分離劑、去污劑/表面活性劑、增濕劑、營 養(yǎng)物、維生素、能量增強劑、防汗劑、收斂劑、除臭劑、固化劑、抗角質(zhì)劑以及用于調(diào)整毛發(fā)和 /或皮膚狀況的試劑。參考如下的實施例進一步更詳細地描述本發(fā)明。然而，這些實施例不應(yīng)以任何方 式被解釋為對本發(fā)明范圍進行限制。實施例1用于表征FPRLl拮抗肽的材料和方法1. 1.材料Fura-2 戊乙酰氧甲基酉旨(pentaacetoxymethylester) (Fura_2_AM)禾口 1, 2_ 雙 (2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N ‘，N ‘-四乙酰氧甲酯(BAPTA-AM)購自Molecular Probes (Eugene, OR)。百日咳毒素(PTX)、U73122 和 U73433 來自 Calbiochem (San Diego, CA)?；|(zhì)膠(Matrigel)來自 Becton Dickinson (Bedford, ΜΑ)。重組人 VEGF 和抗-VEGF 中和抗體來自 R&D systems (Minneapolis, MN) 肽由 P 印 tron Inc.(韓國)合成。PS-SPCL 在浦項科技大學(xué)的P印tide Library Support Facility (韓國)按前人所述(S. H. Baek，et al, J Biol Chem 271(1996)，pp. 8170—8175 ；R. A. Houghten，et al.，Nature 354(1991)， pp. 84-86)準(zhǔn)備。1. 2.細胞培養(yǎng)
11
在37°C下，在供應(yīng)95%空氣和5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中，將MS-1細胞和B16F1鼠 黑色素瘤細胞在包含10% FBS的DMEM中培養(yǎng)。如以前的描述(E. A. Jaffe，et al. ,J Clin Invest 52 (1973)，pp. 2745-2756)，通過膠原酶消化從新鮮人臍帶制備HUVEC，并且維持在 含20% FBS的M-199培養(yǎng)基中。該研究中使用的所有HUVEC不超過第5次傳代。人正常 成纖維細胞購自美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC)。在37°C下，在5% CO2的潮濕氣氛中，將所述 細胞培養(yǎng)在包含10% FBS和抗生素的DMEM中。然后，在每2天或3天更換新鮮培養(yǎng)基 后，將所述細胞以0. 05%胰蛋白酶-0. 53mM EDTA進行次代培養(yǎng)。1. 3.使用[Ca2+] i動員測定在MS-1細胞中反復(fù)進行PS-SPCL篩選在37°C下，在無血清DMEM培養(yǎng)基中將細胞以4 μ M Fura-2 AM和250 μ M磺吡酮 (sulfinpyrazone)在連續(xù)攪拌下孵育30min。然后，將所述細胞以Locke溶液(M. Faehling, et al.，F(xiàn)ASEB J 16(2002), pp. 1805-1807)洗滌，并稀釋至 2 X IO6 細胞/mL。將 50 μ L 等 分的細胞懸液加入96孔板的每個孔中，并在加入肽后測定340和380nm雙激發(fā)波長下以 及在500nm發(fā)射波長下的熒光比率變化。在加入肽庫后立即對板進行讀數(shù)，在加入肽和 FLEXstation (Molecular Devices)檢測之間有大約5秒的時間延遲。陰性對照和陽性對照 與測試樣品同時進行，以確保所有樣品的條件相同。依照Grynkiewicz et al. J Biol Chem 260(1985), pp. 3440-3450 以[Ca2+]i 校正熒光比率。1. 4. [3H]-胸苷摻入測定將HUVEC以2X IO4個細胞/孔的密度鋪于M孔培養(yǎng)皿，并使之貼附過夜。在血清 饑餓12小時后，將所述細胞用或不用標(biāo)明濃度的SH(LRY-NH2 (SEQ ID NO 2)下處理48小 時。在進行所述測定之前，將細胞以[3H]-胸苷(25mCi/mmol ；Amersham，Aylesbury，United Kingdom)豐示i己 4/J、0^ (Μ. Guidoboni, et al. ， Cancer Res 65(2005), pp. 587—595) 。 ilil 以10%三氯乙酸洗滌除去未摻入的[3H]-胸苷，然后在37°C下在0. 2M NaOH和0. 1% SDS 中提取摻入的[3H]-胸苷1小時。以液體閃爍計數(shù)器(Beckman Instruments, Fullerton， CA)對細胞的放射性進行計數(shù)。1. 5.管形成測定如先前的M. S. Lee，et al.，J Immunol 177 Q006)，pp. 5585-5594 中所述，在存在 或不存在VEGF中和抗體的條件下，將HUVEC以及SH(LRY-NH2 (SEQ ID NO 2)、其打亂的序 列FYSRLK-NH2、SIP或VEGF —起接種于已經(jīng)聚合的基質(zhì)膠層上。在孵育M小時后，通過相 差顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化并照相。為了測量毛細血管網(wǎng)絡(luò)的形成，在40X放大倍數(shù)下 以標(biāo)尺測量每個視野中的管總長度。每孔分析3個不同的視野。1. 6.創(chuàng)傷遷移測定為了確定 SFKLRY-NH2 (SEQ ID NO 2)對 HUVEC 遷移的影響，如先前的 M. S. Lee, et al.，J Immunol 177 (2006)，pp. 5585-5594中所述進行了體外創(chuàng)傷愈合修復(fù)測定。簡而言 之，將鋪板于35-mm培養(yǎng)皿上90%匯合的HUVEC以2_mm寬的剃刀刀片進行創(chuàng)傷，并標(biāo)記損 傷線。在進行創(chuàng)傷后，將所述細胞以無血清培養(yǎng)基洗滌，并在包含血清和/或標(biāo)明量的 SFKLRY-NH2 (SEQ ID NO :2)的M199中進一步孵育。使HUVEC遷移16小時，以無血清培養(yǎng) 基沖洗，以無水甲醇固定并以姬姆薩染料(Giemsa)染色。通過對移動到所述損傷線以外的 細胞數(shù)目進行計數(shù)來對遷移進行定量。1. 7.主動脈環(huán)測定
使用Nicosia 和 Ottinetti 在 In Vitro Cell Dev Biol 26(1990), pp. 119-128 中開發(fā)的方法，稍有改動。從6周齡Sprague-Dawley大鼠采集主動脈。在除去周圍纖維脂 肪組織后，將主動脈環(huán)浸于培養(yǎng)皿的孔中的基質(zhì)膠中。在存在或不存在PTX或U73122的情 況下，將所述主動脈環(huán)培養(yǎng)于包含SH(LRY-NH2 (SEQ ID NO 2)、SIP、FYSRLK-NH2或VEGF的 無血清M199中(5% CO2, 370C )。在第7天，測量主動脈外植體的萌芽情況。1.8. RT-PCR 分析使用easy-BLUE 總 RNA 提取試劑盒(Intron Biotechnology, Inc.)依照生產(chǎn) 商的說明書從HUVEC分離總RNA。由莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)以3yg 不含DNA的總RNA和寡聚(dT)15引物(ftOmega)合成單鏈cDNA。使用的引物的序列是 人 VEGF (150-bp 產(chǎn)物)正向，5 ‘ -GAGGAGGGCAGAATCATCACG-3 ‘ (SEQ ID NO :25)；反向， 5' -ATCGCATGAGGGGCACACAGG-3‘ (SEQ ID NO :26)。將 PCR 產(chǎn)物在 2%瓊脂糖凝膠上進行 電泳，并通過溴化乙錠染色顯示。1. 9.條件培養(yǎng)基和ELISA按如下產(chǎn)生條件培養(yǎng)基向6孔皿中的80%匯合的HUVEC中加入每皿2mL的無血 清M199，并孵育標(biāo)明的時間。將收集的培養(yǎng)基離心以除去任何殘留細胞并在-80°C下冷凍。 依照制造商說明書對VEGF (R&D系統(tǒng))進行酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)分析。1. 10.統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)表示為平均值士S. D。先使用Sigma Plot，再使用Mudent' s t_檢驗在組 間進行統(tǒng)計學(xué)比較。實施例22. 1.鑒定誘導(dǎo)MS-I細胞中[Ca2+] i升高的肽為了鑒定刺激鼠內(nèi)皮細胞(MS-1細胞)中細胞內(nèi)的鈣動員的肽，發(fā)明人篩查了 114 個C末端酰胺化的合成六肽庫。肽文庫在MS-I細胞中的初始篩查結(jié)果顯示于圖1A-1F。圖1A-1F示出針對使MS-I細胞的細胞內(nèi)鈣升高的肽進行的初始PS-SPCL篩查。每 幅圖示出了已知氨基酸在所述六肽的6個位置中的每一位置上的肽庫得到的結(jié)果。所述6 個位置由19個L-氨基酸中的一個分別定義(例如01、02)。剩余的5個位置由所述19個 L-氨基酸(不包括半胱氨酸(cystein))的混合物(X)組成。所述文庫由114個肽庫組成； PS-SPCL總共由47，045，881種不同肽構(gòu)成。如實施例1中所述，使用Fura-2/AM通過熒光 分析測定[Ca2Ii升高。該結(jié)果表示3次獨立實驗中的一次。在每個位置活性最大的氨基酸是第一位置Ser⑶和Thr⑴；第二位置Phe (F)； 第三位置是Ile(I)、Lys(K)和Arg(R)；第四位置Leu(L)；第五位置Arg(R)；第六位置 Arg (R)、Phe (F)、Trp (W)、Tyr (Y)和 His (H)。基于從所述肽文庫的初始篩查得到的結(jié)果，選出SH(LRY-NH2 (SEQ ID NO 2)并合 成作為原型肽用于進一步分析。C末端酰胺化形式的SH(LRY-NH2(SEQ ID NO 2)顯示出 比羧化的肽(SH(LRY-C00H)更強的活性，并且對首個氨基末端殘基的修飾(缺失或被D型 氨基酸置換)導(dǎo)致了細胞內(nèi)鈣動員活性完全失去，這表明細胞內(nèi)鈣動員活性是序列特異性 的，并且對于活性而言，氨基末端殘基比C末端殘基更重要。而且，其他六肽的結(jié)果也與初 始篩查結(jié)果(表1)相互關(guān)聯(lián)。許多肽配體以C末端酰胺化的形式存在，該修飾對于一些情 況下活性的表達是至關(guān)重要的(Y. In, M. Fujii, et al.，Acta Crystallogr B 57(2001)，pp. 72-81)；因此，本發(fā)明的肽具有作為細胞中的某個(些)受體的配體的特征。表 1在MS-I細胞上測試的肽的EC5tl，這從細胞內(nèi)Ca2+的劑量依賴性變化測定。肽序列 與來自3次實驗的EC5tl和S. Ε. M 一起示出。
SEQ ID NO序列平均 EC5tl(PM)S. Ε. M.1SFKLRY-C00H> 10N/A2SFKLRY-NH21. 210. 013SFKLRY-NH2 (d 型)N/DN/A4SfKLRY-NH2 (d 型)N/DN/A5SFkLRY-NH2 (d 型)N/DN/A6SFKIRY-NH2 (d 型)> 100N/A7SFKLrY-NH2 (d 型)> 100N/A8SFKLRy-NH2 (d 型)1. 140. 099FKLRY-NH2N/DN/A10KLRY-NH2N/DN/A11LRY-NH2N/DN/A12SFKLR-NH26. 190. 8413SFKL-NH2> 50N/A14SFK-NH2N/DN/A15SFRLRY-NH20. 970. 1416SFKLRR-NH22. 660. 3617SFILRY-NH20. 990. 2
1權(quán)利要求
1.一種血管生成肽序列，選自長度為6-15個氨基酸且包含氨基酸序列^C1FX2LRX3作為 基本部分的肽X1FX2LRX3其中Xi是絲氨酸或蘇氨酸；X2是賴氨酸、精氨酸或異亮氨酸；并且X3是苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、精氨酸或組氨酸。
2.權(quán)利要求1的血管生成肽，其中所述血管生成肽包含由1-9個氨基酸組成的連接肽， 所述連接肽連接于^C1FX2LRX3的C末端。
3.權(quán)利要求1或2的血管生成肽，其中所述血管生成肽通過以-NH2取代C末端羧基而 被修飾。
4.權(quán)利要求1的血管生成肽，其中所述血管生成肽的氨基酸序列是SEQID NO :1,2,8, 12,14 或 15-24。
5.權(quán)利要求1的血管生成肽，其中所述血管生成肽具有如下活性促進細胞遷移、血管 發(fā)生或膠原合成，或者抑制黑色素形成。
6.權(quán)利要求1的血管生成肽，其中所述血管生成肽的血管生成活性受血管內(nèi)皮生長因 子(VEGF)上調(diào)的介導(dǎo)。
7.一種用于治愈創(chuàng)傷、促進膠原合成或抑制黑色素合成的組合物，包含權(quán)利要求1-6 任一項的血管生成肽。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述組合物促進細胞遷移、血管發(fā)生或膠原合成。
9.權(quán)利要求7的組合物，其中所述組合物是一種用于創(chuàng)傷愈合的藥物組合物，其包含 作為活性成分的權(quán)利要求1-6任一項的血管生成肽和可藥用載體。
10.權(quán)利要求7的組合物，其中所述組合物是一種用于改善老化皮膚狀況的化妝品組 合物，其包含作為活性成分的權(quán)利要求1-6任一項的血管生成肽作為活性成分和化妝品可 用載體。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述化妝品組合物具有抗皺和皮膚美白活性。
12.一種促進哺乳動物血管發(fā)生的方法，所述方法包括對有需要的受試者給予有效量 的權(quán)利要求1-6任一項的血管生成肽。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述受試者需要血管發(fā)生用于上皮創(chuàng)傷愈合。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述受試者需要血管發(fā)生用于誘導(dǎo)膠原合成。
15.權(quán)利要求12的方法，其中通過局部、全身、口服或腸胃外途徑給予所述肽。
全文摘要
本申請公開了這樣的血管生成肽，即其引起靶細胞中細胞內(nèi)鈣釋放，從而誘發(fā)原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和毛細血管樣管形成。所述血管生成肽可以用于預(yù)防和/或治療血管生成相關(guān)病癥，尤其是創(chuàng)傷愈合、治療受試者的足腿潰瘍，等。另外，所述血管生成肽可以用于化妝品，作為針對皮膚老化的化妝品組分，例如用于抗皺和皮膚美白。
文檔編號C07K14/515GK102066404SQ200980123954
公開日2011年5月18日 申請日期2009年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日
發(fā)明者李泰勛 申請人:諾娃細胞科技公司